Komórki macierzyste raka jajnika (OCSC) są odpowiedzialne za inicjację, nawrót, oporność terapeutyczną i przerzuty. Uważa się, że nisza naczyniowa OCSC sprzyja samoodnowie OCSC, co prowadzi do chemooporności. Protokół ten stanowi podstawę do ustanowienia odtwarzalnego modelu niszy naczyniowej OCSC in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, NICO-1
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rakowe komórki macierzyste (CSC) znajdują się w bezpiecznej niszy, stanowiąc mikrośrodowisko składające się z sąsiednich komórek zrębu, naczyń i macierzy zewnątrzkomórkowej. Zdolność CSC do udziału w rozwoju śródbłonka stanowi ważną cechę, która bezpośrednio przyczynia się do ogólnego zrozumienia mechanizmów nowotworzenia i przerzutów nowotworowych. Celem tej pracy jest ustanowienie powtarzalnej metodologii badania zdolności komórek macierzystych raka jajnika (OCSC) do inicjacji nowotworu. W tym artykule zbadaliśmy mechanizm neowaskularyzacji między komórkami śródbłonka a OCSC wraz ze zmianami morfologicznymi komórek śródbłonka przy użyciu modelu kohodowli in vitro NICO-1. Protokół ten umożliwia wizualizację etapu neowaskularyzacji otaczającego OCSC w sposób przebiegu czasowego. Technika ta może dostarczyć informacji na temat właściwości angiogenetycznych OCSC w przerzutach nowotworowych.
Wprowadzenie
Rak jajnika jest ósmym najczęściej występującym nowotworem złośliwym u kobiet na świecie, z około 300 000 nowych diagnoz i szacunkowo 180 000 zgonów rocznie1. Przy wstępnym rozpoznaniu rak jajnika często objawia się ciężkimi objawami, u około 75% pacjentek jest już w stadium III-IV. W związku z tym 5-letni wskaźnik przeżycia wynosi <30%, a wskaźnik śmiertelności jest najwyższy wśród nowotworów ginekologicznych2, przy czym skuteczność leczenia raka jajnika jest w dużym stopniu zależna od czynników klinicznych, takich jak pomyślne przeprowadzenie operacji odciążającej, oporność na chemioterapię i nawrót po początkowej terapii.
Tkanki raka jajnika są zorganizowane hierarchicznie, przy czym nie wszystkie składniki guza są jednakowo zdolne do generowania potomstwa. Uważa się, że jedyne komórki zdolne do samoodnawiania się i wytwarzania heterogenicznej populacji komórek nowotworowych reprezentują rakowe komórki macierzyste (CSCs)3. Samoodnowie CSC i inicjacji guza towarzyszy promowanie angiogenezy w celu przebudowy mikrośrodowiska guza w celu utrzymania wspierającej niszy. Jednak poprzednie modele nie mogły być wykorzystane do analiz in vitro ze względu na ograniczoną odtwarzalność hodowli CSC pochodzących z próbek klinicznych ze względu na rozerwanie sferoid po wielokrotnym pasażowaniu. Ostatnio opracowano eksperymentalne metody hodowli CSC od pacjentów dla kilku zastosowań4,5,6,7. W szczególności, wykorzystując charakterystykę CSC do wzrostu poprzez tworzenie sferoid w płytkach o bardzo niskim przyczepie z pożywką wolną od surowicy, hodowane CSC są indukowane do ekspresji markera powierzchniowego komórek macierzystych, który nie ulega ekspresji w normalnych komórkach nowotworowych o potencjale różnicowania wieloliniowego8,9.
Ostatnie dane wykazały, że utrzymywanie się uśpionych (O)CSC jajników, które są wizualizowane jako rozsiew w otrzewnej, jest związane z ich regeneracją jako nawracających nowotworów10. Zrozumienie molekularnych i biologicznych cech OCSC może zatem pozwolić na skuteczne ukierunkowanie i eliminację tych komórek, co skutkuje potencjalną remisją guza. W szczególności niewiele wiadomo na temat komórkowych i molekularnych cech mechanistycznych ról CSCs w angiogenezie11. Dlatego w niniejszym protokole wykorzystaliśmy OCSC pochodzące od pacjentów w warunkach in vitro w celu zbadania właściwości angiogennych komórek śródbłonka przy użyciu modelu kohodowli, który może naśladować mikrośrodowisko guza CSC i komórek śródbłonka w miejscu przerzutów w warunkach klinicznych. Ostatecznie, ponieważ neowaskularyzacja stanowi krytyczny proces niezbędny do wspierania wzrostu guza i przerzutów, lepsze zrozumienie jej mechanizmu pozwoli na opracowanie nowej terapii celowanej dla OCSC w miejscu przerzutów.
Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji etapu neowaskularyzacji otaczającego CSC w sposób przebiegu czasowego. Zaletą protokołu jest umożliwienie w pełni odtwarzalnych badań przy użyciu systemu kohodowli 3D, NICO-1, co pozwala na obserwację wpływu na pacjentów zdolności do inicjacji guza pochodzącej z OCSC podczas angiogenezy komórek śródbłonka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet Etyki ds. Dobra Człowieka. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie ich próbek do badań, a pobranie i wykorzystanie tkanek do tego badania zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań nad Ludzkim Genomem i Analizą Genów na Uniwersytecie Teikyo.
1. Izolacja i hodowla komórek macierzystych raka jajnika (OCSC) od pacjentów z rakiem jajnika i wodobrzuszem w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2
- Wyizoluj rakowe komórki macierzyste z wodobrzusza ludzkiego raka jajnika uzyskane za pomocą paracentezy. Zbierz co najmniej 100-250 ml wodobrzusza od pacjentów, aby pobrać wystarczającą liczbę rakowych komórek macierzystych. Dodatkowo oceń profile ekspresji markerów rakowych komórek macierzystych (tj. EpCAM, Kalretinina, CD133, CD44, CD45, ALDH1 i Oct4) oraz markerów raka jajnika (pAX-8, WT-1) za pomocą cytometrii przepływowej.
- Odwirować wodobrzusze ludzkiego raka jajnika przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin po aspiracji wodobrzusza.
- Usunąć supernatant i dodać 2 ml pożywki OCSC i 8 ml 30% roztworu Histodenz/roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4).
- Przygotuj pożywkę OCSC: suplement StemPro hESC, DMEM⁄F-12 z L-glutaminą (pożywka GlutaMAX), 25% BSA, 100 μM 2-merkaptoetanolu, 8 ng/mL FGF BASIC, 10 μM insuliny i 20 μM Y-27632.
- Ostrożnie nałożyć 2 ml pożywki OCSC na roztwór komórkowy w kroku 1.1.2 w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 450 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w wirniku z wiadrem wahadłowym bez hamowania.
- Ostrożnie przenieść warstwę OCSC (niezakłóconą na interfazie) do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety transferowej.
- Napełnij PBS do 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w pożywce OCSC i nasiona na naczyniu hodowlanym o bardzo niskim stopniu przylegania; kultury powinny być utrzymywane w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
- Zmieniaj podłoże co trzy dni. Ostrożnie odstaw naczynie hodowlane na około 1 minutę, wyrzuć część supernatantu i dodaj nową pożywkę.
- Przejście BOK
- Zebrać OCSC w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant, napełnić PBS i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant, dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek składającego się z enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych (np. AccuMax) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Dobrze wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Upewnij się, że komórki znajdują się w jednej zawiesinie.
- Dobrze wymieszać pipetując, napełnić PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce OCSC w celu późniejszego wysiewu na szalkach hodowlanych o bardzo niskim przyleganiu i utrzymania w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
2. Hodowla komórek śródbłonka HUEhT-1
- Pasaż komórek HUEhT-1
- Usunąć pożywkę z naczynia hodowlanego HUEhT-1 i umyć komórki PBS.
- Dodaj 1 ml 0,025% trypsyny i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
- Dodać 5 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka 2, zebrać komórki w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce HUEhT-1 i wysiać komórki na szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem, a następnie utrzymać w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
- Zmieniaj podłoże co trzy dni.
3. Przygotowanie płytki do kokultury NICO-1 do testu formowania probówek przy użyciu komórek HUEhT-1
- Zmontuj NICO-1 i pokryj hydrożelem na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (Matrigel Matrix).
- Zamontuj jedną stronę NICO-1 zgodnie z instrukcjami producenta i trzymaj na lodzie.
- Przykryj powierzchnię NICO-1 300 μl zimnego PBS, a następnie usuń bufor.
- Dodać 300 μl schłodzonego hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
- Aby zrównoważyć, zanurz filtr w 100% etanolu, a następnie umyj 13-milimetrowy filtr ICCP (0,6 μm) PBS przez 1 minutę.
- Zamontuj NICO-1, w tym obie główne części korpusu A (prawa komora) i B (lewa komora) wraz z O-ringiem i filtrem zrównoważonym.
4. Wprowadzanie komórek HUEhT-1 i CSC do systemu NICO-1
- Przygotuj zawiesiny komórek HUEhT-1 poprzez trypsynizację monowarstw komórek i ponowne zawieszenie komórek w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka z 2% płodową surowicą cielęcą.
- Dodaj 1,2 ml zawiesiny komórkowej (1,5 x 105 komórek) do każdej studzienki pokrytej hydrożelem na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Dodaj 1,5 ml OCSC hodowanych przez pięć dni do drugiego dołka.
- Inkubować NICO-1 w temperaturze 37 °C w 5% CO2 ; tworzenie się probówek można zaobserwować pod mikroskopem i tworzenie sieci na hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej mierzone za pomocą liczby rozgałęzień.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zebraliśmy płyny z wodobrzusza pobrane od pacjentek z zaawansowanym rakiem jajnika podczas operacji lub paracentezy w celu przeprowadzenia długoterminowej stabilnej hodowli sferoidów. Przedstawiamy tutaj przypadki długoterminowej hodowli sferoidowej jajnikowych CSC, określonych jako CSC1 i CSC2. Obie linie komórkowe mają tę samą diagnozę i profile histologiczne. Mechaniczne role OCSC leżące u podstaw interakcji z komórkami śródbłonka, niezbędnej do indukcji neowaskularyzacji komórek śródb...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Prezentowany protokół opisuje, w jaki sposób naśladować mikrośrodowisko guza OCSC w warunkach in vitro. Podstawowym elementem metody jest wysoce powtarzalny model kokultury uzyskany przy użyciu systemu NICO-1, pośredniego systemu kokultury Transwell. Wiele z obecnie dostępnych modeli kokultury bada wpływ bezpośredniego kontaktu komórka-komórka na kohodowane populacje komórek 12,13,14,15,16,17,18.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez Grant-in-Aid for Scientific Research C (grant nr 19K09834 dla K.N.) z Ministerstwa Edukacji, Nauki i Kultury, Japonia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,025% Trypsyna | Thermo | R001100 | |
| 10 ml Pipeta | Thermo | 170356N | |
| 1250 µ L Końcówka do pipety | QSP | T112XLRS-Q | |
| Probówka 15 ml | Nunc | 339650 | |
| 200 µ L Końcówka do pipety | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 ml | tubka Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Naczynie | Corning | 356401 | |
| Wirówka KUBOTA | 2800 | ||
| Costar 6 Well Clear Płaskie dno Ultra niskie nasadki Płytki wielodołkowe | Corning | 3471 | |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2 | Komórka PromoCell | C-22011 | |
| Etanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| Filtr ICCP 0,6 i mikro; m | Laboratorium Ginrei. | 2525-06 | |
| Insulina, ludzka | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometr | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Mikroskop | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | Pipet transferowy OptiPlate-96 PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| Pipet transferowy StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| FALCON | 357575 | ||
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
Bibliografia
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413(2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
