Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61774

⸱

16 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanej ludzkiej IgG połączonej z GFP u Nicotiana benthamiana. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie i wizualizację wielu białek, które wykorzystują chromatografię kolumnową. Co więcej, protokół można dostosować do osobistego i wirtualnego laboratorium dydaktycznego w college'u, zapewniając eksplorację opartą na projektach.

Streszczenie

Wysokie zapotrzebowanie na przeciwciała jako interwencje terapeutyczne dla różnych chorób zakaźnych, metabolicznych, autoimmunologicznych, nowotworowych i innych stwarza rosnącą potrzebę opracowania skutecznych metod produkcji rekombinowanych przeciwciał. W 2019 r. istniało ponad 70 zatwierdzonych przez FDA przeciwciał monoklonalnych, a potencjał wzrostu jest wykładniczy. Pomimo ich obietnicy, czynnikami ograniczającymi powszechne stosowanie są koszty produkcji i złożoność. Potencjalnie zakłady oferują tanie, bezpieczne i łatwo skalowalne strategie produkcji białek. Rośliny takie jak Nicotiana benthamiana nie tylko mogą prawidłowo składać i składać złożone białka ssaków, ale także mogą dodawać krytyczne modyfikacje potranslacyjne podobne do tych oferowanych przez hodowle komórek ssaków. W tej pracy, wykorzystując natywny GFP i stabilny kwasowo wariant białka zielonej fluorescencji (GFP) połączony z ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi, byliśmy w stanie zwizualizować cały przejściowy proces ekspresji i oczyszczania przeciwciał z roślin N. benthamiana. W zależności od celu eksperymentu, natywna fuzja GFP może zapewnić łatwiejszą wizualizację podczas fazy ekspresji w roślinach, podczas gdy stabilna kwasowo fuzja GFP pozwala na wizualizację podczas dalszego przetwarzania. Ta skalowalna i prosta procedura może być wykonana przez jednego badacza w celu wyprodukowania miligramowych ilości wysoce czystych przeciwciał lub białek fuzyjnych przeciwciał w ciągu kilku dni przy użyciu zaledwie kilku małych roślin. Taką technikę można rozszerzyć na wizualizację dowolnego rodzaju procesu oczyszczania przeciwciał i potencjalnie wielu innych białek, zarówno w roślinach, jak i innych systemach ekspresyjnych. Co więcej, techniki te mogą przynieść korzyści z wirtualnych instrukcji i być wykonywane w laboratorium dydaktycznym przez studentów studiów licencjackich posiadających minimalne wcześniejsze doświadczenie z technikami biologii molekularnej, zapewniając podstawę do eksploracji opartej na projektach z zastosowaniami w świecie rzeczywistym.

Wprowadzenie

Raporty branżowe wskazują, że trzynaście z dwudziestu najbardziej dochodowych leków w Stanach Zjednoczonych to leki biologiczne (farmaceutyki oparte na białkach), z czego dziewięć to przeciwciała. W 2019 r. istniało ponad 570 terapii przeciwciałami (Ab) w różnych fazach rozwoju klinicznego1,2,3. Obecna globalna sprzedaż Ab przekracza 100 mld USD, a rynek terapeutyczny monoklonalnego Ab (mAb) ma wygenerować do 300 mld USD do 2025 r.1,4. Przy tak dużym popycie i przewidywanym wzroście przychodów, naukowcy pracują nad opracowaniem sposobów produkcji leków Ab na coraz większą skalę, o wyższej jakości i niższych kosztach. Roślinne systemy ekspresji mają kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi liniami komórkowymi ssaków w przystępnej cenie i na dużą skalę produkcji leków Ab5,6. Produkcja leków białkowych w roślinach ("farmacja molekularna") nie wymaga drogich bioreaktorów ani urządzeń do hodowli komórkowych, jak to ma miejsce w przypadku tradycyjnych technik hodowli komórek ssaków7,8. Rośliny nie mogą zarazić się ludzkimi patogenami, co minimalizuje potencjalne zanieczyszczenie9. Zarówno przejściowa, jak i transgeniczna ekspresja białek roślinnych może być wykorzystana jako tańsza alternatywa dla systemów produkcji ssaków lub bakterii10. Chociaż rośliny transgeniczne są preferowane do produkcji roślinnej, produkcja białka rekombinowanego przy użyciu tej metody może zająć tygodnie lub miesiące. Postępy w przejściowej ekspresji za pomocą wektorów wirusowych za pomocą strzykawki lub agroinfiltracji próżniowej pozwalają na produkcję pożądanego białka na małą i dużą skalę w ciągu kilku dni11,12,13,14. Produkcja mAb przeciwko wirusom Ebola, Denga i Zika oraz wielu innym rekombinowanym białkom została wyprodukowana i oczyszczona szybko i wydajnie przy użyciu przejściowej ekspresji w roślinach N. benthamiana 15,16,17,18,19. Okoliczności te sprawiają, że przejściowa ekspresja roślinna jest atrakcyjną opcją dla rozwoju wielu terapii Ab i metod zademonstrowanych w tym protokole20.

Przeciwciała mAb pierwszej generacji były pochodzenia mysiego, co skutkowało niespecyficzną immunogennością w badaniach na ludziach21. Z biegiem czasu chimeryczne, humanizowane i ostatecznie w pełni ludzkie Abs zostały wyprodukowane, aby zmniejszyć immunogenność indukowaną przez terapie Ab. Niestety, niektóre z tych Ab nadal powodują immunogenność gospodarza ze względu na różnice w glikozylacji21. Postęp w inżynierii roślinnej pozwolił na modyfikację glikanów Ab, co jest niezbędne, ponieważ na stabilność i funkcję Ab może znacząco wpływać jego stan glikozylacji22. Postępy umożliwiły produkcję w systemach roślinnych wysokiego poziomu ekspresji humanizowanych mAb, zawierających ludzkie glikany, a w rezultacie pożądane cechy biologiczne masowo produkowanego ludzkiego farmaceutyku19,21.

Oprócz rekombinowanych Abs, cząsteczki fuzyjne Ab (fuzje Ab) były badane do różnych celów w ostatnich dziesięcioleciach. Fuzje Ab często składają się z fragmentu Ab lub Ab połączonego z cząsteczką lub białkiem i mają na celu wywołanie odpowiedzi komórek efektorowych układu odpornościowego23. Cząsteczki te zostały stworzone jako potencjalne interwencje terapeutyczne w leczeniu różnych patologii, takich jak rak i choroby autoimmunologiczne24,25,26,27. Rekombinowane kompleksy immunologiczne (RIC) to kolejna klasa fuzji Ab, które zostały wykorzystane jako kandydaci na szczepionki28. RIC wykorzystują zdolność układu odpornościowego do rozpoznawania regionów Fc fuzji Ab i stwierdzono, że poprawiają immunogenność w połączeniu z innymi platformami szczepionkowymi29,30,31.

Zielone białko fluorescencyjne (GFP) to bioluminescencyjne białko pochodzące od meduzy Aequorea Victoria, która emituje zielone światło, gdy jest wzbudzone przez światło ultrafioletowe32,33. Z biegiem lat zastosowanie GFP jako wizualnego markera ekspresji genów rozszerzyło się z ekspresji w Escherichia coli na liczne systemy ekspresji białek, w tym rośliny N. benthamiana class34,35,36,37,38. Widoczne markery, takie jak GFP, mają liczne implikacje w nauczaniu i uczeniu się pojęć naukowych. Wielu uczniów na poziomie podstawowym opisuje trudności ze zrozumieniem pojęć naukowych, gdy nauczana idea nie jest widoczna gołym okiem, takich jak koncepcje biologii molekularnej i dziedzin pokrewnych39. Markery wizualne, takie jak GFP, mogą zatem przyczyniać się do przetwarzania informacji związanych z procesami naukowymi i mogą pomóc w zmniejszeniu trudności, jakie zgłaszają uczniowie w poznawaniu wielu pojęć naukowych.

Chociaż GFP jest często używany jako marker do oznaczania genu i ekspresji in vivo, trudno jest go zwizualizować w dalszych procesach, jeśli używa się kwaśnych warunków. Okoliczność ta wynika przede wszystkim z faktu, że GFP nie zachowuje swojej struktury i wynikowej fluorescencji przy niskim pH40. Tymczasowe środowisko kwaśne jest często wymagane w różnych procesach oczyszczania, takich jak chromatografia białek G, białek A i białek L, często wykorzystywanych do oczyszczania Ab41,42,43,44. Mutanty GFP zostały użyte do zachowania fluorescencji w środowisku kwaśnym45,46.

Tutaj opisujemy prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanych białek fuzyjnych IgG w roślinach N. benthamiana. Wyprodukowaliśmy tradycyjny GFP połączony z N-końcem humanizowanego łańcucha ciężkiego IgG, tworząc fuzję GFP-IgG. Jednocześnie opracowaliśmy fuzję sekwencji zoptymalizowanej pod kątem kodonów roślinnych dla stabilnego kwasowo GFP (asGFP) do N-końca humanizowanego łańcucha ciężkiego IgG, tworząc fuzję asGFP-IgG. Do zalet produkcji GFP-IgG należy możliwość wizualizacji obecności białka docelowego podczas ekspresji, podczas gdy asGFP-IgG pozwala dostrzec obecność białka rekombinowanego nie tylko na etapach ekspresji i ekstrakcji, ale także na etapach oczyszczania białka. Protokół ten można dostosować do produkcji, oczyszczania i wizualizacji szeregu białek fuzyjnych GFP wytwarzanych w N. benthamiana i oczyszczanych przy użyciu technik chromatograficznych, które wymagają niskiego pH. Proces ten można również dostosować do różnych ilości materiału liściowego. Chociaż Abs i białka fuzyjne oznaczone GFP lub jako GFP nie są przeznaczone do stosowania w terapiach, metody te mogą być przydatne jako kontrola podczas eksperymentów, a także mogą być dalej wykorzystywane jako narzędzie dydaktyczne dla biologii molekularnej i komórkowej oraz biotechnologii, zarówno osobiście, jak i wirtualnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uprawiaj rośliny N. benthamiana

  1. Ułóż granulki torfu na tacy i zalej je wcześniej ugotowaną, jeszcze gorącą (~40-45 °C) wodą w celu pełnego rozprężenia. Po całkowitym rozprężeniu granulek umieść 2-3 nasiona N. benthamiana na każdym granulowaniu torfu za pomocą pęsety.
  2. Wlej około 0,5 cala wody, aby przykryć dno tacy. Oznacz tacę datą wysiewu. Kontynuuj codzienne podlewanie sadzonek odpowiednią ilością nawozu. Stężenie nawozu (rozpuszczalnego w wodzie uniwersalnego nawozu roślinnego) wynosi zwykle 2,5-2,8 g/l.
  3. Przykryj tacę humidome górną pokrywą po umieszczeniu w komorze wzrostowej. Przechowuj wysiane granulki torfu w komorze wzrostowej w temperaturze 23-25 °C, z 16-godzinnym fotoperiodem i wilgotnością względną 60%.
  4. Po tygodniu usuń dodatkowe rośliny, pozostawiając każdą granulkę tylko z jedną sadzonką.
  5. Gdy rośliny osiągną wiek 2-3 tygodni, przenieś każdą granulkę torfu do indywidualnej doniczki zawierającej glebę kontrolującą wilgotność. W tej demonstracji wykorzystano ziemię doniczkową Miracle-Gro do kontroli wilgotności
    6. .
  6. Podlewaj codziennie 1 g/l nawozu. Nigdy nie pozostawiaj gleby całkowicie suchej. Rośliny są gotowe do infiltracji w wieku 5-6 tygodni.

2. Przygotowanie Agrobacterium tumefaciens do infiltracji

UWAGA: Konstrukty fuzyjne GFP-IgG można uzyskać zgodnie z opisem w tym artykule31. Gen asGFP został uzyskany i zoptymalizowany pod kątem roślin w tym badaniu45. Poniższe czynności należy wykonać obok palnika Bunsena i zastosować podstawowe techniki aseptyki, aby uniknąć zanieczyszczenia.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 zawiera wirusa żółtego karłowatego karłowatego bąb (BeYDV)19 wektor ekspresji roślinnej dla każdego konstruktu (asGFP-IgG, GFP-IgG, łańcuch lekki) z glicerolu na agarze LB (10 g/L trypton, 10 g/L NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 15 g/L agar, 50 μg/ml kanamycyny).
  2. Hodować przez jeden dzień w inkubatorze stojącym o temperaturze 30 °C. Wyizoluj pojedynczą kolonię w celu weryfikacji za pomocą standardowego protokołu PCR z ekranem kolonii.
  3. Użyj zweryfikowanej kolonii dla każdego konstruktu. Napełnij probówkę stożkową 10 ml pożywki LB (10 g/l tryptonu, 10 g/l NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 50 μg/ml). Następnie dodaj 10 μl 100 μg/ml kanamycyny. Dodać 10 μl 2,5 μg/ml ryfampicyny, aby zapobiec zanieczyszczeniu E. coli. Inkubować w temperaturze 30°C i 120-150 obr./min przez noc.
  4. Następnego dnia, jeśli kultura Agrobacterium zostanie wyhodowana do OD600 = 0,6-0,9, można ją wykorzystać do infiltracji. Jeśli jest przerośnięty (OD600 > 1), 1-2 ml należy przenieść do świeżego LB z antybiotykami i wyhodować do wymaganego OD600. W zależności od początkowego stężenia hodowli, może to zająć potencjalnie dwa dni, aby osiągnąć OD600 = 0,6-0,9.
  5. Po osiągnięciu odpowiedniego OD600 umieść kultury w wirówce i osadzaj bakterie przez odwirowanie przy 4,500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Zdekantować supernatant z obu próbek, a następnie ponownie zawiesić każdą osadkę w 1x buforze infiltracyjnym (10 mM kwas 2-(N-morfolino) etanosulfonowy, 10 mM siarczan magnezu, dostosowany do pH 5,5 za pomocą KOH), aby uzyskać końcowy OD600 = 0,4. Powinno to zająć około 15-45 ml buforu infiltracyjnego, w zależności od początkowej gęstości hodowli. Połącz równe objętości każdego konstruktu fuzyjnego IgG z konstruktem łańcucha lekkiego, aby uzyskać końcowy OD600 = 0,2 na konstrukt w każdej probówce.

3. Agroinfiltracja strzykawką bezigłową

  1. Weź wyprostowany spinacz do papieru i 5-6-tygodniowe rośliny N. benthamiana z kroku 1. Używając ostrej krawędzi spinacza do papieru, wykonaj małe nakłucie w pierwszej warstwie naskórka liścia na powierzchni adaksjalnej. Unikaj przebijania go na wylot.
    UWAGA: Dolne liście są łatwiejsze do infiltracji, podczas gdy liście na wierzchu rośliny są twardsze. Ogólnie rzecz biorąc, ekspresja rekombinowanych białek jest najwyższa w liściach znajdujących się w środku rośliny, a liście te również stają się mniej nekroztyczne.
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml bez dołączonej igły przygotowanym roztworem Agrobacterium z kroku 2. Zakryj otwór wykonany w poprzednim kroku końcem strzykawki i powoli dociśnij, aby wstrzyknąć bakterie do liścia, jednocześnie wywierając delikatny przeciwnacisk od tyłu liścia. Obserwuj, jak liść ciemnieje, gdy roztwór jest wstrzykiwany, bez wywierania zbyt dużego nacisku na strzykawkę.
  3. Staraj się infiltrować większość obszaru liści maksymalnie 3-4 razy – nadmierne uszkodzenie liści może utrudnić plon białka. Infiltrowany liść rośliny będzie wyglądał na przeważnie ciemny od dołu.
    UWAGA: Ten roztwór bakteryjny powinien wystarczyć na co najmniej 3-4 rośliny na konstrukt. Pozostały roztwór bakteryjny należy złożyć w autoklawie przed wyrzuceniem.

4. Uprawiaj i obserwuj infiltrowany N. benthamiana

  1. Umieść infiltrowane rośliny z powrotem w komorze wzrostowej i kontynuuj codzienne podlewanie.
  2. Obserwuj liście pod kątem chlorozy i nekrozy w infiltrowanych obszarach. Obserwuj rośliny pod kątem fluorescencji GFP (jeśli GFP jest obecny) pod długo- i krótkofalową lampą UV.
  3. Dzień 4-5 wykazuje najwyższą fluorescencję obu konstruktów GFP w liściach. Zbierz wszystkie liście w temperaturze 4-5 dpi (dni po infiltracji) i zważ cały materiał liści.
  4. Należy go natychmiast zużyć do dalszego przetwarzania lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

5. Ekstrakcja białka

  1. Przed użyciem należy przechowywać i kubki blendera na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 2-3 ml lodowatego buforu ekstrakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 z HCl) na 1 g materiału roślinnego. Dodać 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) z wywaru (100 mM) i 50 mM askorbinianu sodu do buforu ekstrakcyjnego bezpośrednio przed ekstrakcją.
  3. Umieść tkankę roślinną z kroku 4 w wstępnie schłodzonym kubku blendera. Dodać odmierzoną ilość schłodzonego buforu ekstrakcyjnego do kubka blendera (jak wskazano w kroku 5.2). Umieść kubek blendera na blenderze. Weź wstępnie przycięty arkusz parafilmu i rozciągnij go na górze kubka blendera. Miksuj do uzyskania jednorodności w 20-sekundowych odstępach, dobrze mieszając między cyklami miksowania w razie potrzeby.
  4. Przenieść zmieszany materiał do zlewki. Dodać mieszadło i mieszać w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby zwiększyć rozpuszczalność białek i umożliwić wytrącanie się ciał stałych.
  5. Umieść 2 warstwy Miracloth na czystej zlewce na lodzie i przelej przez nią ekstrakt, aby usunąć duże resztki liści. Po wylaniu całego ekstraktu złóż Miracloth, aby wycisnąć resztki ekstraktu z liści. Ekstrakt powinien być ciemnozielony bez widocznych cząstek.
  6. Przenieść 50 μl tej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i oznaczyć "ekstrakt całkowity" do późniejszej analizy. Przenieść ekstrakt do probówek wirówkowych. Odwirować pozostałą część ekstraktu roślinnego w temperaturze 16 000 x g przez 20 minut, w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do stożkowej probówki.
  7. Przefiltrować rozpuszczalny ekstrakt za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml i strzykawkowego filtra z włókna szklanego (0,75 μm).
  8. Zebrać 50 μl próbki po odwirowaniu, oznaczyć "ekstrakt rozpuszczalny" do późniejszej analizy.

6. Procedura chromatografii w kolumnie G białka

UWAGA: Opisany tutaj protokół dotyczy chromatografii grawitacyjno-przepływowej z użyciem żywicy agarozowej Pierce Protein G. Jeśli używasz innej żywicy, zapoznaj się z instrukcjami producenta dotyczącymi regulacji. Nigdy nie pozwól, aby żywica wyschła i nie pozwól całej cieczy spłynąć. W razie potrzeby zamknij gniazdko.

  1. Ustaw kolumnę polipropylenową, która mieści 20 ml próbki.
  2. Oszacuj potrzebną ilość gnojowicy w zależności od docelowego typu immunoglobuliny i jej powinowactwa do żywicy. Ogólnie rzecz biorąc, 3 ml całkowitej zawiesiny przy objętości złoża 1,5 ml wystarcza do oczyszczenia kilku miligramów Ab.
  3. Ostrożnie wlać wymaganą ilość zawieszonej gnojowicy do zakrytej kolumny. Otwórz wylot kolumny od dołu kolumny i pozwól mu spłynąć, aż większość bufora zniknie.
  4. Natychmiast wlej 10 ml buforu do płukania 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 z HCl) na wierzch. Pozwól mu spłynąć i powtórz ten krok prania 2 razy.
  5. Nanieść przefiltrowaną próbkę z kroku 5 do kolumny i zebrać przepływ - podwielokrotność 50 μl przepływu do późniejszej analizy. Zachowaj resztę przepływu na wypadek, gdyby Ab nie związał się z żywicą.
    UWAGA: Ponowne zastosowanie przepływu do nowej kolumny zwykle nie daje dobrej wydajności; Dlatego zaleca się rozpoczęcie od nowego materiału liściowego.
  6. Umyj żywicę dwukrotnie 10 ml 1x PBS, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie. W razie potrzeby należy podsycić 50 μl roztworu do płukania, gdy bufor przepływa przez kolumnę, aby sprawdzić, czy docelowy Ab nie jest eluowany za pomocą buforu do przemywania wody.
  7. Ustawić i oznaczyć pięć probówek 125 μl sterylnego 1 M Tris-HCl o pH 8. Ma to na celu zneutralizowanie Abs w kwaśnym buforze elucyjnym, aby uniknąć potencjalnych zmian strukturalnych. Alternatywnie, dodać 30 μl 2 M zasady Tris, aby uzyskać mniej rozcieńczoną próbkę.
    UWAGA: Podczas elucji do wizualizacji można użyć światła UV. Nie trzeba tego robić przez cały czas trwania elucji. Jeśli używane jest promieniowanie UV, należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć uszkodzenia oczu i skóry. Na etapie elucji nie trzeba używać światła UV
    8. .
  8. Eluować Abs, nakładając 5 ml buforu elucyjnego (100 mM glicyny, pH 2,5 z HCl) do kolumny i zebrać 1 ml frakcji do każdej wyznaczonej probówki z poprzedniego etapu.
  9. Natychmiast zregenerować kolumnę, nakładając 20 ml buforu do przemywania wody, a następnie 10 ml buforu do płukania. Upewnij się, że żywica nie jest pozostawiona w kwaśnym środowisku przez dłuższy czas. Elucje powinny wydawać się fluorescencyjne, często najwyższą fluorescencję obserwuje się w drugiej elucji, ale może się różnić w zależności od ekstrakcji.
  10. Do przechowywania umyj żywicę 10 ml 20% etanolu w PBS i pozwól jej spłynąć do połowy. Przykryj górną, a następnie dolną część kolumny i utrzymuj w pozycji pionowej w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, żywice białkowe G mogą być ponownie użyte do 10 razy bez znaczącej utraty wydajności. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z wytycznymi producenta.
  11. Oznaczyć stężenie Ab za pomocą spektrofotometru, mierząc absorbancję przy 280 nm, używając buforu elucyjnego jako próby ślepej. Przechowywać eluaty w temperaturze -80 °C i podwielokrotność 50 μl każdej frakcji do oddzielnej probówki w celu dalszej analizy.

7. SDS-PAGE do wykrywania fuzji GFP-Ig

  1. Przygotuj wszystkie próbki przed skonfigurowaniem SDS-PAGE.
    1. Dodać 4 μl buforu do próbek (6x redukujący bufor próbki: 3,0 ml glicerolu, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg błękitu bromofenolowego); (6x nieredukujący bufor próbki: 3,0 ml glicerolu, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg błękitu bromofenolowego) do 20 μl każdej próbki (ekstrakt całkowity, ekstrakt rozpuszczalny, przepływ, płukanie, wszystkie frakcje elucyjne) do analizy. Upewnij się, że zaślepki rurek są dobrze zamocowane.
    2. Przez 5 minut należy traktować tylko próbki redukcyjne we wrzącej łaźni wodnej, a następnie umieszczać próbki na 5 minut na lodzie. Odwirować próbki w mikrowirówce przez ~5 s i załadować 20 μl każdej próbki w kolejności pobierania do dołków żelowych. Załaduj 3 μl dwukolorowej drabinki białkowej do osobnego dołka.
  2. Uruchom żel SDS-PAGE przy stałym napięciu 100 V do pożądanej separacji pasm białkowych; zajmuje to około 1,5 godziny. Monitoruj drabinę jako wskaźnik separacji białek.
  3. Wizualizuj żel pod wpływem promieniowania UV, aby zaobserwować fluorescencję GFP.
  4. W razie potrzeby zabarwić żel barwnikiem Coomassie, aby ocenić całkowite białko w każdej próbce. Alternatywnie, wykonaj western blot, aby ocenić docelowe białko przy użyciu określonego Abs.
    UWAGA: Zarówno barwienie Coomassie, jak i western blot można wykonać zgodnie ze standardowymi protokołami47,48.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

To badanie demonstruje łatwą i szybką metodę produkcji białek rekombinowanych i ich wizualizacji w dalszych procesach. Stosując N. benthamiana i postępując zgodnie z dostarczonym protokołem, opisaną tutaj rekombinowaną produkcję białka można osiągnąć w czasie krótszym niż tydzień. Ogólny przebieg procesu ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania roślin jest pokazany na Rysunek 1. Etapy wzrostu roślin z siewek 2-tygodniowych, 4-tygodniowych i 6-tygodniowych są wyświetlane odpowiednio w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten może być wykorzystany do wizualnej weryfikacji dowolnego rekombinowanego białka Ab lub rekombinowanego białka wytwarzanego w roślinach N. benthamiana, w tym tych, które wymagają czasowego narażenia na kwaśne środowisko w celu oczyszczenia kolumny 42,43,44. Co więcej, fuzja asGFP z innymi białkami w różnych systemach ekspresji może być użytecznym narzędziem do eksperymentalnej wizualizacji i edukacji. Protok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Marii Pii DiPalma za montaż filmu. Dziękujemy również Biuru ds. Pomocy Edukacyjnej i Obsługi Studentów na Uniwersytecie Stanowym Arizony za hojną pomoc w opłatach za publikację. Badania nad tym protokołem były wspierane przez Szkołę Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Stanowego Arizony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 5 mldowolnaN/A
Strzykawka 50 mldowolnaN/A
AgarSIGMA-ALDRICHA5306
Blender z kubkamidowolnaN/A
Bromophenol blueBio-Rad1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)MP BIOMEDICALS219482101
EDTA ( Kwas etylenodinitrylo)tetraoctowySIGMA-ALDRICHE-6760
Etanolniedotyczy
GlicerolG-BiosciencesBTNM-0037
GlicynaSIGMA-ALDRICHG7126-500G
HCl (kwas solny)EMD MILLIPORE CORPORATIONHX0603-4
Blok grzewczydowolnego renomowanego dostawcyNr Dotyczy
: Jiffy-7 727 z otworem w pelety torfoweHummert International14237000
KanamycinGold Biotechnology IncK-120-100
KCl (chlorek potasu)SIGMA-ALDRICHP9541-500G
KH2PO4 (fosforan potasu)J.t.baker3248-05
KOH (wodorotlenek potasu)VWRBDH0262
Siarczan magnezu siedmiowodnySIGMA-ALDRICHM2773
MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy)SIGMA-ALDRICHM8250
MiraclothMillipore4 75855-1R
Mieszanka doniczkowa kontrolująca wilgotnośćMiracle-Gro755783
Na2HPO4 (fosforan sodu)J.t.baker3827-01
NaCl (chlorek sodu)Santa Cruz Biotechnologysc-203274C
Nasiona Nicotiana benthamianadowolny renomowany dostawcaNIE DOTYCZY
PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu)G-Biosciences786-787
Kolumna polipropylenowadowolnaN/A
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610394
Żywica białkowa GThermo Fisher Scientific20399
RifampicinGold Biotechnology IncR-120-25
SDS (dodecylosiarczan sodu)G-BiosciencesDG093
Askorbinian soduSIGMA-ALDRICHA7631-500G
Spektrofotometrdowolnego renomowanego dostawcyNie dotyczy
Tytan3 0,75 &mikro; m filtr z włókna szklanegoThermoScientific40725-GM
Taca na pelety torfowe z kopułądowolnaN/A
TRIS BaseJ.t.baker4109-02
Tris-HClAmrescoM108-1KG
TryptoneSIGMA-ALDRICH17221
Lampa UVdowolnaN/A
Rozpuszczalna w wodzie Uniwersalny Pokarm roślinnyMiracle-Gro2000992
Ekstrakt z drożdżySIGMA-ALDRICH9182

Bibliografia

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755(2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600(2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472(2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81(2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141(2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41(2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200(2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974(2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ekspresja przejściowafuzja z GFPoczyszczanie białekchromatografia kolumnowainfiltracja Agrobacteriumekstrakcja z tkanki liściowejproces wirowaniailościowe oznaczenie przeciwciał
Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.