Artykuł metodologiczny

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61778

⸱

9 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, 2Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology, Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science, Brown University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Streszczenie

W chorobie Alzheimera (AD) i innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych, niewydolność oligodendroglialna jest powszechną wczesną cechą patologiczną, ale jak przyczynia się do rozwoju i progresji choroby, szczególnie w istocie szarej mózgu, pozostaje w dużej mierze nieznane. Dysfunkcja komórek linii oligodendrocytów charakteryzuje się niedoborami mielinizacji i upośledzoną samoodnową komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC). Te dwie wady są przynajmniej częściowo spowodowane zakłóceniem interakcji między neuronami a oligodendrocytami wzdłuż narastania patologii. OPC powodują powstawanie mielinizujących oligodendrocytów podczas rozwoju OUN. W dojrzałej korze mózgowej OPC są głównymi komórkami proliferacyjnymi (stanowiącymi ~ 5% wszystkich komórek mózgowych) i kontrolują tworzenie nowej mieliny w sposób zależny od aktywności neuronalnej. Takie połączenia neuron-oligodendrocyty są znacznie niedostatecznie zbadane, zwłaszcza w kontekście schorzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, ze względu na brak odpowiednich narzędzi. W ostatnich latach nasza grupa i inni poczynili znaczne postępy w ulepszaniu obecnie dostępnych protokołów generowania funkcjonalnych neuronów i oligodendrocytów indywidualnie z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. W tym manuskrypcie opisujemy nasze zoptymalizowane procedury, w tym ustanowienie systemu kohodowli w celu modelowania połączeń neuron-oligodendrocyty. Nasze ilustracyjne wyniki sugerują nieoczekiwany wkład OPC/oligodendrocytów w amyloidozę mózgu i integralność synaps oraz podkreślają użyteczność tej metodologii w badaniach nad chorobą Alzheimera. To redukcjonistyczne podejście jest potężnym narzędziem do analizowania specyficznych interakcji heterokomórkowych z nieodłącznej złożoności wewnątrz mózgu. Oczekuje się, że opisane przez nas protokoły ułatwią w przyszłości badania nad defektami oligodendroglialnymi w patogenezie neurodegeneracji.

Wprowadzenie

Komórki linii oligodendrocytów - w tym komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC), oligodendrocyty mielinizujące i typy przejściowe pomiędzy - stanowią główną grupę komórek ludzkiego mózgu1, które aktywnie uczestniczą w wielu krytycznych funkcjach dla prawidłowego działania i utrzymania naszego ośrodkowego układu nerwowego podczas rozwoju i starzenia się neuronów2,3,4. Podczas gdy oligodendrocyty są dobrze znane z produkcji mieliny, która ułatwia przekazywanie aktywności neuronalnej i wspiera zdrowie aksonów w istocie białej, OPC są obfite (~5%) w istocie szarej, gdzie mielinizacja jest rzadkością i pełnią funkcje sygnalizacyjne zależne od aktywności, regulując zachowanie związane z uczeniem się i tworzeniem pamięci5,6,7,8. Funkcjonowanie i dysfunkcja komórek oligodendroglialnych w patogenezie choroby Alzheimera (AD) i innych chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem była niedostatecznie zbadana9. Niedoskonałości odpowiedniego systemu modelowego i braki w ogólnej wiedzy, która mogłaby pokierować eksperymentalną ścieżką naprzód, są głównymi przyczynami tej luki.

W świetle najnowszych przełomów w pozyskiwaniu ludzkich komórek mózgowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym embrionalnych komórek macierzystych (ES) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), takie modele komórkowe w połączeniu z nowoczesnymi narzędziami do edycji genów okazały się solidnymi narzędziami do radzenia sobie z zawiłym węzłem interakcji komórkowych w mózgu i są w stanie wykazać specyficzne dla człowieka objawy choroby10, 11. Biorąc pod uwagę, że poszczególne typy komórek mózgowych mogą wykazywać różne, a nawet sprzeczne efekty w obliczu tych samych warunków sprzyjających chorobie Alzheimera12,13, ta metodologia komórek macierzystych w unikalny sposób oferuje informacje specyficzne dla typu komórki, które wcześniej były pomijane przy użyciu ustalonych modeli in vivo lub in vitro, które dostarczają tylko zagregowanych odczytów z kolekcji typów komórek mózgowych. W ciągu ostatniej dekady opracowano wiele niezawodnych protokołów generowania ludzkich neuronów z trans-różnicowania komórek ES / iPS lub bezpośredniej konwersji z innych terminalnie zróżnicowanych typów komórek (np. fibroblastów)14,15. W szczególności zastosowanie kluczowych neurogennych czynników transkrypcyjnych (np. neurogeniny 2, Ngn2)16 do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych może wygenerować jednorodną populację dobrze scharakteryzowanych typów komórek neuronalnych dla czystych kultur bez konieczności kokulturacji z komórkami glejowymi12,17,18. W przypadku indukowanych ludzkich oligodendrocytów istnieje kilka opublikowanych protokołów, które mogą generować funkcjonalne komórki bardzo przypominające ich pierwotne odpowiedniki, o szerokim zakresie wydajności i zapotrzebowania na czas i zasoby19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Do tej pory żaden z tych protokołów nie został zastosowany do zbadania, w jaki sposób komórki oligodendroglialne reagują i wpływają na patogenezę choroby Alzheimera.

Tutaj opisujemy nasze ulepszone protokoły dla pojedynczych i mieszanych kultur ludzkich neuronów indukowanych (iN) oraz OPC/oligodendrocytów (iOPCs/iOL). Opisany tutaj protokół iN jest oparty na powszechnie stosowanym podejściu Ngn216 i ma dodatkową cechę braku gleju. Powstałe w ten sposób iN są jednorodne i bardzo przypominają neurony pobudzające warstwy korowej 2/3, z charakterystyczną morfologią piramidalną, wzorcem ekspresji genów i cechami elektrofizjologicznymi17,18 (Rysunek 1). Aby przezwyciężyć niektóre z podstawowych barier w ukierunkowanym różnicowaniu pluripotencjalnych komórek macierzystych, opracowaliśmy prostą i skuteczną metodę wstępnego traktowania niską dawką dimetylosulfotlenku (DMSO)29,30, i odnotowaliśmy zwiększoną skłonność ludzkich komórek ES/iPS do transróżnicowania się w iOPC i iOLs31, w oparciu o szeroko dostosowany protokół Douvarasa i Fossati32. Jeszcze bardziej uprościliśmy protokół i włączyliśmy solidny związek promujący różnicowanie, clemastine7,33,34, aby przyspieszyć proces dojrzewania oligodendroglialnego. W rezultacie (Rysunek 2), iOPC mogą być generowane w ciągu 2 tygodni (~95% dodatnie dla markera O4), a iOL w ciągu czterech tygodni (wyrażające dojrzałe markery MBP i PLP1). Co ciekawe, odkryliśmy, że same iOPC wydzielają niezwykłą ilość β amyloidu (Aβ), co jest zgodne z niezależnymi danymi transkryptomicznymi wykazującymi obfitą ekspresję białka prekursorowego amyloidu (APP) i proteazy procesującej β-sekretazy (BACE1) w komórkach linii oligodendrocytów35,36. Co więcej, nasz system kohodowli iN-iOPC promuje otaczanie aksonów procesami iOL MBP-dodatnimi i zapewnia znaczące wsparcie w tworzeniu synaps (Rysunek 3). W związku z tym protokoły, które szczegółowo opisaliśmy poniżej, mają techniczną i biologiczną przewagę nad wcześniej skatalogowanymi metodami kohodowli neuronów i oligodendroglii i dają nadzieję na lepsze modelowanie neurodegeneracji w chorobie Alzheimera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Indukcja ludzkich neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Przygotowanie lentiwirusa (~5 dni, szczegółowy protokół opisany wcześniej16)
    1. Płytka ~ 1 milion komórek HEK293T każda kolba T75, aby zlewały się ~ 40% podczas wykonywania transfekcji. Transfekcja ich plazmidami eksprymującymi indukowany tetracykliną Ngn2 i gen oporny na puromycynę (PuroR; pod tą samą kontrolą promotora TetO), rtTA i trzema plazmidami pomocniczymi pRSV-REV, pMDLg / pRRE i VSV-G (12 μg DNA wektora lentiwirusowego i 6 μg każdego z DNA plazmidu pomocniczego). Przygotować co najmniej trzy kolby na preparat lentiwirusa. Użyj PEI do transfekcji zgodnie z instrukcją producenta. Wymień nośnik po 16 godzinach i wyrzuć.
    2. Zbierz uwolnione cząsteczki wirusa, zbierając pożywki hodowlane codziennie i zastępując je świeżymi pożywkami przez 3 dni. Zebrać zebrane pożywki zawierające cząstki wirusa do oczyszczenia. Przefiltrować wirusa przez filtr 0,22 μm i odwirować przy 49 000 x g przez 90 minut. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości PBS-glukozy (~150 μL).
  2. Indukcja neuronów (~5 dni)
    UWAGA: Ten protokół indukcji (Rysunek 1A; diagram przepływu) jest wysoce skuteczny zarówno dla komórek iPS, jak i ES o potwierdzonej pluripotencji (którą można oznaczyć za pomocą barwienia immunohistochemicznego dobrze scharakteryzowanych markerów pluripotencji; Rysunek 1B).
    1. Należy użyć dostępnych w handlu ludzkich komórek ES H1 w czasie 52 (patrz tabela materiałów). Hodować komórki na płytkach 6-dołkowych pokrytych roztworem macierzy zewnątrzkomórkowej (~ 0,5 mg roztworu matrycy na płytkę 6-dołkową; patrz tabela materiałów) przy użyciu pożywki do konserwacji komórek ES (patrz tabela materiałów) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. W dniu -2 odłączyć komórki ES (80% zlewające się) z 1 ml roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieść komórki do probówki; umyć studzienkę 2 ml pożywki i połączyć w tej samej probówce. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce i umieścić komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą o gęstości wysiewu 1 x 105 komórek na studzienkę.
    3. W dniu -1 dodać lentiwirusy eksprymujące Ngn2 plus PuroR i rtTA wraz z polibrenem (8 μg/ml) do komórek ES w świeżej pożywce podtrzymującej komórki ES (patrz tabela materiałów). Dokładna ilość wirusów powinna być określona na podstawie rzeczywistych mian lub miareczkowania. Zazwyczaj dodajemy 5 μl każdego wirusa na studzienkę do płytki 6-dołkowej.
    4. W dniu 0 dodaj Doksycyklinę (2 μg / ml, w celu aktywacji ekspresji Ngn2) w pożywce DMEM-F12 z suplementem N2 bez morfogenów.
    5. W dniu 1 dodać Puromycynę do świeżej pożywki DMEM-F12 plus N2 i doksycykliny, do końcowego stężenia 1 μg/ml pożywki. Selekcjonować transdukowane komórki w Puromycynie przez co najmniej 24 godziny. Wyższe stężenie puromycyny (do 5 μg/ml) i dłuższy okres selekcji (do 48 godzin) mogą być wymagane w celu odpowiedniego usunięcia niedostatecznie transdukowanych komórek, jeśli miano wirusa jest niskie.
    6. W dniu 2 odłącz różnicujące neurony za pomocą roztworu do odłączania komórek (patrz Tabela materiałów) i ponownie plateruj je na 24-dołkowych płytkach (między 80 000-200 000 komórek / dołek) pokrytych roztworem matrycy (patrz Tabela materiałów) i utrzymuj je w pożywce NBA/B27 bez doksycykliny. Gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie.
    7. Na tym etapie odłączone neurony można zamrozić w specjalistycznym komercyjnym podłożu zamrażającym (patrz Tabela Materiałów) i przechowywać w ciekłym azocie przez okres do 3 miesięcy. Czyste neurony można posiać, biorąc pod uwagę typową ~15%-20% śmierć komórki po rozmrożeniu, hodować samodzielnie lub współhodować z innymi typami komórek mózgowych (patrz krok 3.2.3. dla wspólnej hodowli z OPC).
    8. Hodowlę czystych iNs na płytkach pokrytych roztworami na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnie z instrukcją producenta (patrz tabela materiałów). Charakterystyczna morfologia piramidalna powinna być widoczna w 4 dniu (i 6 dniu; Rysunek 1C). Tworzenie synaps można wykryć już w dniach od 14 do 16 i jest widoczne w dniu 24 za pomocą barwienia immunohistochemicznego standardowymi markerami pre- i postsynaptycznymi. (Rysunek 1D; oznaczony markerem presynaptycznym Synapsin 1 i markerem dendrytycznym Map2).

2. Indukcja ludzkich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z pluripotencjalnych komórek macierzystych i dojrzewanie oligodendrocytów

  1. Generowanie neuronalnych komórek progenitorowych (NPC): protokół jednowarstwowy (~7 dni). Zobacz Rysunek 2A dla diagramu przepływu.
    1. Hoduj ludzkie komórki ES H1, jak opisano wcześniej (patrz krok 1.2.1.) i zróżnicuj je w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) za pomocą ustalonego podejścia zwanego podwójnym SMADi, z małocząsteczkowymi inhibitorami dla wielu szlaków sygnałowych. W tym przypadku używamy powszechnie akceptowanego zestawu komercyjnego i postępujemy zgodnie z protokołem monowarstwowym dostarczonym przez producenta (patrz Tabela materiałów).
    2. W dniu -1 płytka 0,5–1 x 106 komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej pokrytej roztworem matrycy o zredukowanym czynniku wzrostu (patrz Tabela materiałów; ~ 0,5 mg roztworu matrycy na płytkę 6-dołkową) z pożywką do konserwacji komórek ES (patrz Tabela materiałów). Ten roztwór matrycy o zredukowanym czynniku wzrostu służy do pokrycia wszystkich płytek, które zostaną użyte w kolejnych krokach.
    3. W dniu 0 traktuj komórki przez 24 godziny pożywką do konserwacji komórek ES (patrz Tabela materiałów) uzupełnioną 2% DMSO.
    4. W dniach 1-6 należy wymienić całe podłoże na ciepłe (37 °C) podłoże do indukcji neuronalnej zawierające inhibitory SMAD z zestawu dostępnego w sprzedaży (patrz Tabela materiałów). Jeśli komórki dzielą się i osiągają konfluencję przed 7 dniem, przejdź je do gęstości wysiewu 0,5–1 x 106, jak opisano wcześniej w kroku 2.1.2.
    5. W dniu 7 pasaż NPC za pomocą roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela materiałów) i płytki o gęstości wysiewu 1-2 x 105 komórek/dołek na 24-dołkowej płytce.
    6. Oznacz skuteczność różnicowania za pomocą barwienia immunohistochemicznego (IHC) pod kątem braku markera pluripotencji, na przykład OCT4 i obecności markerów NPC, takich jak PAX6, Nestin i Sox1.
    7. Na tym etapie oderwane NPC mogą zostać zamrożone w specjalistycznym komercyjnym medium do zamrażania NPC (patrz Tabela Materiałów) i przechowywane w ciekłym azocie przez okres do 3 miesięcy. Po zamrożeniu i rozmrożeniu NPC nadal zachowują wielomoc, aby dać początek neuronom, astrocytom i OPC z niezawodnymi protokołami.
  2. Wytwarzanie komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) (~7 dni). Zobacz Rysunek 2A dla diagramu przepływu.
    1. W dniu 7 pasaż NPC za pomocą roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela materiałów) i płytka z gęstością wysiewu 1-2 x 105 komórek na dołek na 24-dołkowej płytce w ciepłym (37 °C) podłożu do indukcji neuronalnej oraz inhibitory SMAD z zestawu handlowego (patrz Tabela materiałów).
    2. W dniu 8 przygotuj roztwór 1% DMSO w pożywce różnicującej OPC i traktuj posiane NPC przez 24 godziny. Pożywka różnicująca OPC składa się z: pożywki DMEM/F12, 1% suplementu N2, 1% suplementu B27, bFGF w stężeniu 20 ng/ml, SAG w stężeniu 1 μM, PDGF-AA w stężeniu 10 ng/ml (patrz tabela materiałów).
    3. W dniu 9 zastąp media świeżymi nośnikami różnicującymi OPC bez DMSO. Karmić komórki co drugi dzień aż do 15 dnia. Jeśli komórki osiągną konfluencję przed 15 dniem, należy je przepchnąć do gęstości wysiewu 1–2 x 105 komórek na studzienkę, jak opisano w kroku 2.2.1.
    4. W dniu 14 umieść OPC w pożywce różnicującej OPC o gęstości 1-2 x 105 komórek/dołek na 24-dołkowej płytce.
    5. Na tym etapie (dzień 15) należy przetestować komórki na obecność markerów specyficznych dla OPC za pomocą barwienia IHC lub qPCR (np. O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Rysunek 2B) oraz za brak markerów NPC (Pax6 lub Nestin; Rysunek 2D). Zazwyczaj wykrywamy immunoreaktywność O4 w ponad 95% komórek w dniu 15. Szczególnie istotne dla choroby Alzheimera jest to, że ekspresja APP (białka prekursorowego amyloidu), BACE1 (proteazy przetwarzającej β-secreatazę 1) i peptydu amyloidu-β (Aβ) jest obfita w OPC (Figura 2F).
  3. Dojrzewanie oligodendrocytów (OL) (~7–20 dni)
    1. W dniu 15 zastąp pożywkę pożywką do dojrzewania OL: pożywką Neurobasal-A, 2% suplementem B27, 1 μM cAMP, 200 ng/ml trójjodotyroniny T3 i klemastyną 1 μM (patrz tabela materiałów). Zmieniaj podłoże co drugi dzień lub codziennie, jeśli to konieczne.
    2. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, podziel je w stosunku 1:3 do 2 przejść lub do momentu, gdy podział komórek znacznie spowolni. Jeśli OPC dzielą się zbyt szybko i osiągają konfluencję w czasie krótszym niż 3 dni, dodaj Ara-C (patrz Tabela Materiałów) w stężeniu 2-5 μM przez 1-3 dni. Aktywna proliferacja wskazuje na obniżoną wydajność dojrzewania.
    3. Zbadaj skuteczność dojrzewania oligodendroglialnego, oceniając ekspresję markerów OL, np. CLDN11, PLP1, MBP za pomocą qPCR, barwienia IHC lub immunoblottingu. Charakterystyczna morfologia wysoce złożonych struktur (Figura 2C) i ekspresja markerów OL (Figura 2E) powinny być łatwo wykryte do 28 dnia.

3. Hodowla ludzkich neuronów indukowanych (iNs) i komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC)

  1. Poszycie iOPC (~3 dni)
    1. Płytka iOPC w dniu 14 o gęstości 1 x 10 5 komórek na basenik w płytce 24-dołkowej (jak opisano powyżej w kroku 2.2.4.) w pożywce różnicującej OPC (jak opisano w kroku 2.2.2.).
  2. Ustanowienie wspólnej kultury iN-iOPC
    1. W dniu 15 odłącz indukowane neurony ludzkie na etapie dnia 2 po selekcji Puromycyny (jak opisano w kroku 1.2.6.) roztworem do odłączania komórek (patrz tabela materiałów).
    2. Dodaj neurony do hodowanych OPC, posiewając z gęstością wysiewu 2 x 105 komórek na dołek na 24-dołkowej płytce z rosnącymi OPC (od kroku 3.1.1). Użyj pożywki do kohodowli zawierającej pożywkę Neurobasal-A, 2% suplement B27 i 100 ng/ml trójjodotyroniny T3. Zmień podłoże następnego dnia, a następnie co drugi dzień. Jeśli OPC rozmnażają się zbyt szybko i osiągają konfluencję w czasie krótszym niż 3 dni, dodaj Ara-C w stężeniu 2-5 μM. Reprezentatywny obraz neuronów iN i iOPC wyhodowanych w kokulturze po 7 dniach jest pokazany w Rysunek 3A.
    3. Użyj zamrożonych neuronów przygotowanych w sposób opisany powyżej w kroku 1.2.7 do jednoczesnej hodowli z OPC. Płytki zamrażają i rozmrażają neurony o większej gęstości 3 x 105 komórek na dołek.
    4. Po dniach 14-16 w kokulturach tworzenie synaps w iNs można zaobserwować poprzez barwienie IHC markerów pre- i postsynaptycznych, a do 21 dnia punkta synaptyczna powinna być obfita (Figura 3C), a aktywność neuronalna może być wiarygodnie rejestrowana.
    5. Począwszy od 21 dnia, testuj komórki pod kątem markerów specyficznych dla OL (na przykład MBP i PLP1). Do 28 dnia zwykle obserwujemy zjawisko powlekania aksonów iN przez procesy iOL, oznaczone barwieniem IHC dla określonych markerów (Rysunek 3B; neurofilament NF dla aksonów iN i MBP dla procesów iOPC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bezpośrednia generacja ludzkich indukowanych neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Dla sukcesu generacji iNs lub iOPCs/iOLs bardzo ważne jest, aby wyjściowe ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste wykazywały wysoki stopień pluripotencji. Dlatego przed rozpoczęciem któregokolwiek z protokołów indukcji opisanych w niniejszym artykule należy przeprowadzić barwienie komórek na markery specyficzne, takie jak Oct4 i SOX2 (Rysunek 1A). W celu uzyskan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oprócz fizycznego i metabolicznego wsparcia w celu stabilizacji struktur synaps i ułatwienia przewodzenia sygnału solnego przez mielinizację, komórki linii oligodendrocytów mogą kształtować wzorzec aktywności neuronów poprzez szybkie i dynamiczne rozmowy z neuronami 5,6,7. Podczas gdy w patologii AD reakcje oligodendroglialne były początkowo uważane za jedynie wtórne do stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego, obecnie istnieją ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (R00 AG054616 dla Y.A.H. i T32 GM136566 dla K.C.), Stanford University School of Medicine oraz Siebel Fellowship (przyznane S.C.). Y.A.H. jest profesorem translacyjnym GFL z Center for Translational Neuroscience w Brown Institute for Translational Sciences.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Suplement AccutaseSTEMCELL Technologies7920
B27ThermoFisher17504044
bFGF ThermoFisherPHG 0266
cAMPMilliporeSigmaA9501
ClemastineMilliporeSigmaSML0445
DMEM/F12 mediumSTEMCELL Technologies36254
DMSOThermoFisherD12345
DoksycyklinaMilliporeSigmaD3072
Surowica bydlęcapłodu ScienCell10
H1 ludzkie komórki ESWiCellWA01
MatrigelCorning354234
mTeSR plusSTEMCELL Technologies5825
Suplement N2ThermoFisher17502001
Neurobasal A mediumThermoFisher10888-022
Aminokwasy endogenneThermoFisher11140-050
PDGF-AAR& D Systems221-AA-010
PEIVWR71002-812
pMDLg/pRREAddgene12251
PolybreneMilliporeSigmaTR-1003-G
pRSV-REVAddgene12253
PuromycinThermoFisherA1113803
ROCK Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72302
SAGTocris4366
STEMdiff Neuronalne środki zamrażające progenitorySTEMCELL Technologies5838
Zestaw do indukcji neuronów STEMdiff SMADi STEMCELLTechnologies8581
T3 trójjodotyroninaMilliporeSigmaT6397
Tempo-iOlogo: OPC pochodzące z ludzkiego iPSCTempo BioScienceSKU102
TetO-NG2-PuroAddgene52047
VSV-GAddgene12259

Bibliografia

  1. Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
  2. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  3. De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer's disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
  4. Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  5. Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
  6. Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304(2014).
  7. Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
  8. Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916(2020).
  9. Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
  10. Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer's disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503(2019).
  11. Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
  12. Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294(2018).
  13. TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
  14. Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
  15. Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer's disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
  16. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  17. Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer's Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
  18. Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
  19. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
  20. Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
  21. Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
  22. Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
  23. Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
  24. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
  25. Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
  26. Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947(2017).
  27. Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
  28. Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
  29. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  30. Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110(2018).
  31. Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
  32. Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
  33. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
  34. Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
  35. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  36. Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer's disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
  37. Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
  38. Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
  39. Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
  40. Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
  41. Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
  42. Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.

Figure 3 was updated from:

IN-OPC co-culture results; neurofilament staining, synaptic density diagram, marker expression graph.
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Microscopy analysis, astrocyte markers, iOPC-neuron interaction, fluorescence labeling.
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.

The fourth paragraph was updated from:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).

to:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F). 

Tagi

System kokulturyneurony indukowanekom rki prekursorowe oligodendrocyt wdojrzewanie oligodendrocyt wtworzenie synapsmodelowanie choroby Alzheimera

Powiązane artykuły