Artykuł metodologiczny

Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61792

⸱

12 stycznia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Pediatric Gastroenterology Unit, Edmond and Lily Safra Children's Hospital, Sheba Medical Center, 2Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 4Molecular Hematology Laboratory, Sheba Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z próbek krwi i biopsji jelitowych, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR do sekwencjonowania nowej generacji, wykonywania przebiegu NGS i podstawowej analizy danych.

Streszczenie

Pamięć immunologiczna, cecha charakterystyczna odporności adaptacyjnej, jest zarządzana przez limfocyty T i B. W krążeniu i różnych narządach znajdują się miliardy unikalnych klonów komórek T i B, a każdy z nich może wiązać określony antygen, co prowadzi do proliferacji, różnicowania i/lub wydzielania cytokin. Ogromna heterogeniczność limfocytów T i B jest generowana przez losową rekombinację różnych segmentów genetycznych. Technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS), opracowane w ostatniej dekadzie, umożliwiają bezprecedensowy dogłębny wgląd w repertuar immunologiczny receptorów limfocytów T i B. Badania nad różnymi stanami zapalnymi, niedoborami odporności, infekcjami i nowotworami złośliwymi wykazały wyraźne zmiany w klonalności, wykorzystaniu genów i właściwościach biofizycznych repertuaru immunologicznego, dostarczając ważnych informacji na temat roli adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych w różnych zaburzeniach.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół dla NGS repertuaru immunologicznego limfocytów T i B z krwi i tkanek. Przedstawiamy proces rozwoju począwszy od izolacji DNA, poprzez przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie na sekwenatorze NGS, a skończywszy na podstawowych analizach. Metoda ta umożliwia eksplorację specyficznych limfocytów T i B na poziomie nukleotydów lub aminokwasów, a tym samym może identyfikować dynamiczne zmiany w populacjach limfocytów i parametry różnorodności w różnych chorobach. Technika ta powoli wchodzi do praktyki klinicznej i ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych biomarkerów, stratyfikacji ryzyka i medycyny precyzyjnej.

Wprowadzenie

Adaptacyjny układ odpornościowy, składający się z limfocytów T i B, wykorzystuje pamięć immunologiczną do rozpoznawania wcześniej napotkanego antygenu i inicjowania szybkiej odpowiedzi. Limfocyty są wytwarzane w szpiku kostnym i dojrzewają w grasicy (limfocyty T) lub szpiku kostnym (limfocyty B). Zarówno receptor limfocytów T (TCR), jak i receptor limfocytów B (BCR) wykazują unikalne konfiguracje, które umożliwiają rozpoznawanie określonych antygenów. W homeostazie limfocyty T i B stale krążą i badają biliony różnych peptydów prezentowanych na komórkach prezentujących antygen. Ligacja TCR lub BCR specyficznego antygenu o wysokim powinowactwie, wraz z odpowiednią kostymulacją, prowadzi do aktywacji komórek, w wyniku której dochodzi do wydzielania cytokin, ekspansji klonalnej i wytwarzania przeciwciał, w przypadku limfocytów B.

Ogromna liczba różnych limfocytów T lub B jest zbiorczo określana jako repertuar immunologiczny, umożliwiający rozpoznawanie niezliczonych różnych epitopów. Aby wygenerować tak szeroki repertuar, zachodzi złożony proces losowego składania różnych segmentów genów, tworzący niemal nieskończone kombinacje receptorów, które mogą wiązać unikalne antygeny1. Proces ten, zwany rekombinacją V(D)J, obejmuje rearanżacje różnych genów zmiennych (V), różnorodności (D) i łączenia (J), którym towarzyszą losowe delecje i insercje nukleotydów w złączach2.

Architektura adaptacyjnego układu odpornościowego od wielu dziesięcioleci interesuje naukowców z różnych dziedzin. W przeszłości sekwencjonowanie Sangera, komplementarne spekkratyzowanie regionu 3 (CDR3) i cytometria przepływowa były używane do charakteryzowania repertuaru immunologicznego, ale zapewniały niską rozdzielczość. W ciągu ostatniej dekady postępy w metodach sekwencjonowania nowej generacji (NGS) umożliwiły dogłębny wgląd w charakterystykę i skład indywidualnego repertuaru TCR i BCR3,4. Te wysokoprzepustowe systemy (HTS) sekwencjonują i przetwarzają jednocześnie miliony przegrupowanych produktów TCR lub BCR i umożliwiają analizę w wysokiej rozdzielczości określonych limfocytów T i B na poziomie nukleotydów lub aminokwasów. NGS zapewnia nową strategię badania repertuaru immunologicznego zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Badania z wykorzystaniem HTS wykazały zmieniony repertuar TCR i BCR w chorobach autoimmunologicznych5, primary immunodeficiencys6,7 i nowotworach złośliwych, takich jak ostra białaczka szpikowa8. Korzystając z NGS, my i inni wykazaliśmy oligoklonalną ekspansję specyficznych klonów komórek T i B u pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), w tym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i chorobą Leśniowskiego-Crohna9,10,11,12,13,14. Ogólnie rzecz biorąc, badania z różnych dziedzin sugerują, że zmiany w repertuarze odgrywają kluczową rolę w patogenezie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z biopsji jelita i krwi, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR dla NGS oraz wykonywania sekwencjonowania. Zapewniamy również podstawowe kroki w analizie danych z repertuaru immunologicznego. Protokół ten może być również stosowany do generowania bibliotek TCRα, TCRγ i IGL. Metoda jest również kompatybilna z innymi narządami (np. węzłami chłonnymi, nowotworami, płynem maziowym, tkanką tłuszczową itp.), o ile stosowane są protokoły trawienia specyficzne dla tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną w Sheba Medical Center, a wszyscy uczestniczący w nim uzyskali świadomą pisemną zgodę.

1. Izolacja i kwantyfikacja DNA

  1. Trawienie i liza komórek w biopsjach jelitowych
    1. Pobrać biopsje jelit, zarówno świeżo pobrane, jak i przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Jeśli używasz biopsji mrożonej, rozmrozić na lodzie.
    2. Dodać 600 μl roztworu do lizy jąder do sterylnej probówki mikrowirówki o pojemności 1,7 ml, schłodzonej na lodzie.
    3. Umieścić biopsję w probówce mikrowirówkowej z roztworem do lizy i inkubować w temperaturze 65 °C przez 15-30 minut.
    4. Dodać 17,5 μl 20 mg/ml proteinazy K i inkubować przez noc w temperaturze 55 °C, delikatnie wstrząsając.
    5. Pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 5 minut przed przejściem do kroku 1.3.
  2. Liza komórek krwi pełnej
    1. Uzyskać 3 ml krwi pełnej w probówce zawierającej EDTA, heparynę lub cytrynian.
    2. Delikatnie kołysz probówkę, aż dokładnie się wymiesza, i przenieś krew do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml roztworu do lizy komórek. Odwrócić kilka razy w ciągu 10-minutowego okresu inkubacji w temperaturze pokojowej.
    3. Wirować przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić jak najwięcej supernatantu, nie naruszając widocznego białego osadu. Pozostanie około 50–100 μl pozostałej cieczy.
    4. Energicznie obracaj rurkę przez 15 s, aż do całkowitego zawieszenia. Dodać 3 ml roztworu do lizy jąder i kilkakrotnie odpipetować. Roztwór powinien stać się lepki.
  3. Wytrącanie białek
    1. Dodać 200 μl buforu do wytrącania białek do tkanki lub 1 ml do krwi. Wirować energicznie przez 20 s i inkubować na lodzie przez 5 minut. Po wirowaniu mogą być widoczne małe grudki białka.
    2. Wirować przy 16 000 x g przez 4 min. Powinien powstać zwarty osad zawierający wytrącone białka.
    3. Ostrożnie przenieść supernatant, nie naruszając osadu, do nowej probówki o pojemności 1,7 ml.
      UWAGA: Jeśli osad nie jest szczelny, rozważ inną wirówkę o sile 16 000 x g przez 4 min.
  4. Wytrącanie i rehydratacja DNA
    1. Dodać 1 ml 2-propanolu do probówki zawierającej supernatant i delikatnie wymieszać przez odwrócenie. DNA powinno stać się widoczne jako biała substancja unosząca się na wodzie.
    2. Wirować przy 16 000 x g przez 1 min. Całkowicie usunąć supernatant za pomocą pipety.
    3. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć probówkę. Wirować przy 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant.
    4. Powtórz krok 1.4.3.
    5. Umieść otwartą rurkę odwróconą na czystym bibułze chłonnym na 10-15 minut. Ponownie odwróć probówkę i potwierdź całkowite nawodnienie. W razie potrzeby pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez dodatkowe 10-15 minut.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby pellet całkowicie wyschł.
    6. Dodać 50 μl ultraczystej wody (UPW). W razie potrzeby DNA można bardziej rozcieńczyć po kwantyfikacji.
    7. Inkubować przez 1 godzinę na bloku grzewczym w temperaturze 65 °C w celu ponownego nawodnienia DNA.
  5. Kwantyfikacja DNA
    UWAGA: DNA oznaczono ilościowo za pomocą fluorometru i wyznaczonych odczynników, jak określono w tabeli materiałów.
    1. Doprowadź wzorce do temperatury pokojowej i przygotuj zestaw, w tym wyznaczone probówki o pojemności 0,5 ml.
    2. Przygotować mieszaninę i barwników w probówce o pojemności 15 ml, w zależności od liczby próbek. Dodać 200 μl buforu i 1 μl barwnika na próbkę. Dołącz 2 próbki do standardów. Zaleca się obliczenie dodatkowej próbki, aby uniknąć sytuacji, w której bufor nie będzie wystarczający.
      1. Dla 2 wzorców umieść 190 μl wyżej przygotowanej mieszanki w probówce o pojemności 0,5 ml. Dodać 10 μl wzorca.
      2. Dla każdej próbki umieścić 199 μl wyżej przygotowanej mieszanki w probówce o pojemności 0,5 ml. Dodać 1 μl DNA.
    3. Zapoznaj się z próbkami. Wynik wskazuje stężenie DNA w próbce.
    4. Jeśli próbki przekraczają limit, rozcieńczyć DNA w stosunku 1:10 za pomocą UPW i powtórzyć odczyt.

2. Przygotowanie biblioteki

UWAGA: Obecny protokół wykorzystuje multipleksowy, oparty na PCR zestaw testowy kompatybilny z sekwencerami NGS. Zestaw zawiera 24 różne indeksy, z których każdy jest ukierunkowany na regiony konserwatywne w regionachβ V i Jβ. Umożliwia to jednoetapową reakcję PCR i łączenie różnych próbek. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.

  1. Przygotuj próbki DNA. Uzyskać 150 ng DNA i dodać UPW, co daje w sumie 5 μl.
    UWAGA: Możliwe jest użycie mniej niż 150 ng DNA do przygotowania biblioteki, przy minimalnym stężeniu 10 ng/μL.
  2. Umieść pipety i końcówki w kapturze ze światłem UV na 15 minut, aby rozbić resztki DNA. W międzyczasie pozwól, aby różne probówki indeksujące (do przygotowania biblioteki) i polimeraza DNA rozmroziły się na lodzie.
  3. W kapturze biologicznym dodaj 45 μl z różnych probówek indeksowych do probówek PCR. Następnie dodaj 0,2 μl polimerazy DNA i 5 μl DNA przygotowanego w kroku 2.1 do probówek PCR.
  4. Uruchom reakcję PCR za pomocą wcześniej ustawionego programu, zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Oczyszczanie i kwantyfikacja amplikonu

  1. Użyj kulek magnetycznych do usunięcia nadmiaru starterów, nukleotydów i enzymów.
    1. Podgrzej koraliki co najmniej 30 minut do temperatury pokojowej. Przygotować wystarczającą ilość świeżego 80% etanolu na 400 μl na próbkę.
    2. Dodać 50 μl (IGH) lub 35 μL (TCRβ) kulek do każdej probówki PCR i wymieszać pipetując 10 razy. Inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść zmieszaną próbkę na stojaku magnetycznym na 5 minut.
    4. Odessać 95 μl (IGH) lub 80 μL (TCRβ) klarownej cieczy i wyrzucić. Odessać pozostałą ciecz za pomocą końcówki o pojemności 10 μl.
    5. Do każdej próbki dodać 200 μl 80% etanolu. Inkubować 30 s. Odessać 195 μl etanolu i wyrzucić. Odessać pozostałą ciecz za pomocą końcówki o pojemności 10 μl.
    6. Powtórz krok 3.1.5. Otwórz nakrętki tubek i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.
    7. Natychmiast po upływie 5 minut zdjąć ze stojaka magnetycznego i dodać 25 μl buforu elucyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 8,0). Mieszać pipetując do uzyskania jednorodnej konsystencji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    8. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 5 minut. Przenieś 22 μl do nowej probówki PCR. Zmierzyć stężenie DNA (krok 1.5).
  2. Kwantyfikacja amplikonów
    UWAGA: Obecny protokół wykorzystuje zautomatyzowaną maszynę do elektroforezy do kontroli jakości stężenia, rozmiaru i integralności DNA. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
    1. Umieść odczynniki i taśmę sitową w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut.
    2. W nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml rozcieńczyć 1 ng/μl próbki DNA oznaczone ilościowo w kroku 3.1.8 za pomocą ultraczystej wody dla całkowitej objętości co najmniej 3 μl.
    3. Rozcieńczone DNA Vortex przed użyciem. Umieścić 2 μl buforu wraz z 2 μl rozcieńczonego DNA we wstępnie znakowanych specjalistycznych paskach PCR (dostarczonych w zestawie) i umieścić nakrętki. Umieść na shakerze na 1 minutę, a następnie odwiruj paski PCR.
      UWAGA: Ze względu na lepkość buforu, upewnij się, że nadmiar buforu został usunięty z końcówki przed przeniesieniem do probówek z próbką.
    4. Umieść w maszynie taśmę sitową i paski PCR bez nakrętek. Otwórz pokrywę pudełka na końcówki wewnątrz urządzenia. Przypisz pozycję za pomocą odpowiednich etykiet. Uruchom maszynę.
      UWAGA: Histogram wyjściowy powinien być pojedynczym pikiem o pożądanym rozmiarze amplikonów (Rysunek 1A). W próbkach o niskiej jakości będą obserwowane dodatkowe piki (Rysunek 1B), wskazujące na słabe czyszczenie ściegów lub tworzenie się dimerów starterowych.

4. Sekwencjonowanie nowej generacji

  1. Kwantyfikacja i łączenie bibliotek
    1. Obliczyć końcowe stężenie DNA w nM, używając wartości DNA z kroku 3.1.8 oraz wielkości piku produktu w parach zasad (bp), uzyskanej z wyników maszyny do elektroforezy (patrz Rysunek 1).
    2. Dla każdej próbki obliczyć objętość DNA, którą należy pobrać dla końcowego stężenia 4 nM, w końcowej objętości 10-20 μl buforu elucyjnego.
    3. Przygotować nową mieszaninę rozcieńczania dla każdej próbki i pobrać z niej 2 μl do nowej mieszanki zbiorczej.
      UWAGA: W przypadku próbek, które mają mniej niż 4 nM, należy dodać maksymalną możliwą ilość próbki.
  2. Przebieg NGS library
    UWAGA: Obecny protokół wykorzystuje platformę sekwencera laboratoryjnego. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
    1. Przygotować świeży roztwór 0,2 N NaOH. Dodać 10 μl 0,2 N NaOH do rozcieńczonej biblioteki przygotowanej w kroku 4.1.3. Dodaj 5% PhiX do probówki i krótko wiruj. Zakręć rurkę, aby upewnić się, że cały roztwór osiadł na dnie tubki.
    2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu denaturacji dwuniciowego DNA. Dodać 980 μl wstępnie schłodzonego buforu z zestawu do probówki z DNA i krótko przetrząsnąć.
    3. Umieść rozcieńczoną bibliotekę na lodzie i przygotuj bibliotekę w następujący sposób. Aby uzyskać mieszaninę 17 pM, dodać 425 μl DNA z kroku 4.2.2 i 575 μl buforu. Odwróć bibliotekę kilka razy i rozkręć w dół. Załaduj 600 μl biblioteki końcowej na wyznaczony wkład i umieść próbki w urządzeniu.
    4. Uruchom przebieg zgodnie z instrukcjami oprogramowania.

5. Analiza sekwencjonowania

  1. Pobierz metryki sekwencjonowania z sekwencera i sprawdź, czy dane sekwencjonowania mieszczą się w następujących zakresach (specyficznych dla zestawu używanego w bieżącym protokole). Próbki, które nie spełniają tych kryteriów, poddawane są ponownemu badaniu:
    Gęstość klastra (gęstość (K / mm2)): 945K - 1800K
    Procent odczytów przechodzących przez filtr (klastry PF (%)): >90%
    Wyniki jakości (%>=Q30): >85%
    Wyrównanie PhiX (wyrównanie%): 1,5% - 10%
    Wskaźnik błędów PhiX (%): <1.0%

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tutaj opisujemy metodę izolacji DNA z tkanki jelitowej i krwi, przygotowanie bibliotek dla NGS oraz podstawowe kroki sekwencjonowania dla sekwencjonowania repertuaru immunologicznego. Przebieg wygeneruje pliki fastq, które mogą być dalej konwertowane na pliki fasta do użytku na międzynarodowej platformie ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST. Ten HTS wykonuje i zarządza wieloma analizami dziesiątek tysięcy przegrupowanych sekwencji TCRβ i IGH na poziomie nukleotydów15. IMGT/HighV-QUEST umożliwia anali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmiany w liczebności i funkcji limfocytów B i T są często spotykane w różnych nowotworach złośliwych18, przewlekłych chorobach zapalnych (np. wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego i reumatoidalnym zapaleniu stawów)10,19 oraz w różnych niedoborach odporności17,20. Obecna metoda wykorzystuje NGS, aby ułatwić dogłębny wgląd w repertuar TCR i BCR, umożliwiając wykrycie subtelnych zmia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-propanolSigmaI9516-500ML
1,7 ml mikroprobówkiwirówkowe Axygen8187631104051
15 mlGreiner188261
Absolutny etanolMerck1.08543.0250
Koraliki Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XPBeckman CoulterA63881
Blok ciepłaBioerNie dotyczy
Bufor próbki o wysokiej czułości D1000Agilent5067-5603Do stacji taśmowej
Taśma ekranowa o wysokiej czułości D1000Agilent5067-5584Do stacji taśmowej. Probówki sprzedawane osobno
Zestaw do oznaczania LymphotrackInvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019Każdy zawiera 24 indeksy
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cykl)IlluminaMS-102-2003Zawiera standardowy typ komory przepływowej i wszystkie wymagane odczynniki
MiSeq SequencerIlluminaSY-410-1003
Paski PCR4titude4ti-0792
Proteinaza KInvitrogenEO0491
Fluorometr Qubit 4Thermo FisherQ33226
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo FisherQ32854Zawiera bufor, barwnik, wzorce i specjalistyczne probówki Shaker
BiosanNie dotyczy
Bioanalizator Tapestation 2100AgilentG2940CA
ultra czysta wodaBio-lab7501
Zestaw do izolacji DNA WizardPromegaA1120Zawiera roztwór do lizy komórek, roztwór do lizy jąder i bufor do wytrącania białek

Bibliografia

  1. Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
  2. Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
  3. Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
  4. Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
  5. Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
  6. Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
  7. Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109(2020).
  8. Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73(2019).
  9. Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
  10. Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
  11. Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
  12. Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
  13. Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
  14. Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
  15. Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333(2013).
  16. H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157(2015).
  17. Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
  18. Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688(2019).
  19. Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
  20. Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
  21. Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9(2018).
  22. Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962(2018).
  23. Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
  24. Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
  25. Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
  26. De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638(2018).
  27. Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
  28. Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Receptor limfocyt w Tizolacja DNAprzygotowanie bibliotekisekwenator NGSanaliza klonalno ciwykorzystanie gen w VDJpopulacje limfocyt w

Powiązane artykuły