Artykuł metodologiczny

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61802

⸱

28 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg, 2Dow Silicones Belgium SRL, 3Department of Biomedical and Specialist Surgical Sciences, University of Ferrara, 4Department of Animal Sciences, Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Streszczenie

Przedstawiono trójwymiarowy model ludzkiego naskórka zrekonstruowany z pierwotnych keratynocytów noworodków. W tym artykule opisano protokół procesu uprawy i charakterystykę modelu. Keratynocyty pierwotne noworodków są hodowane zanurzone w przepuszczalnych wkładkach poliwęglanowych i przenoszone do granicy faz powietrze-ciecz trzy dni po wysianiu. Po czternastu dniach stymulacji zdefiniowanymi czynnikami wzrostu i kwasem askorbinowym w pożywce o wysokiej zawartości wapnia, model jest w pełni zróżnicowany. Analiza histologiczna wykazała całkowicie rozwarstwiony naskórek, naśladujący morfologię rodzimej ludzkiej skóry. Aby scharakteryzować model i jego funkcje barierowe, za pomocą immunofluorescencji oceniano poziomy białek i lokalizację specyficzne dla różnicowania keratynocytów we wczesnym stadium (tj. keratyny 10), różnicowania w późnym stadium (tj. inwolukryny, lorykryny i filagryny) oraz adhezji tkanek (tj. desmogleiny 1). Integralność bariery tkankowej poddano dalszej ocenie poprzez pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego. R econstructed human epidermus reagował na bodźce prozapalne (tj. lipopolisacharyd i czynnik martwicy nowotworu alfa), co prowadziło do zwiększonego uwalniania cytokin (tj. interleukiny 1 alfa i interleukiny 8). Protokół ten stanowi prostą i powtarzalną metodę in vitro do kultywowania zrekonstruowany ludzki naskórek jako narzędzie do oceny skutków środowiskowych i szeroki zakres badań związanych ze skórą.

Wprowadzenie

Naskórek jest najbardziej zewnętrzną warstwą skóry, na bezpośrednim styku między ciałem ludzkim a środowiskiem zewnętrznym. Jego główne funkcje to ochrona i nawilżenie1. Naskórek działa jak skuteczna bariera fizyczna przed czynnikami zewnętrznymi i zapobiega nadmiernej utracie wody z organizmu. Te funkcje skóry zależą głównie od układu komórkowego w najbardziej zewnętrznych warstwach skóry, składu i organizacji lipidów międzykomórkowych2. Naskórek składa się przede wszystkim z keratynocytów, które migrują w górę na zewnętrzną stronę tkanki i ulegają różnicowaniu. Istnieje 4-5 warstw naskórka, które charakteryzują się stopniem różnicowania. Od wewnątrz na zewnątrz warstwy naskórka zaczynają się od żywotnego naskórka, tj. warstwy podstawowej (SB), warstwy kolczastej (SS) i warstwy ziarnistej (SG), do nieżywotnej warstwy najwyższej, tj. warstwy rogowej naskórka (SC)3. Warstwa podstawowa składa się głównie z proliferujących keratynocytów wzbogaconych w keratynę, które migrują przez SS po różnicowaniu4. Podczas dojrzewania keratynocytów zachodzą różne zmiany w ekspresji i strukturze białek. Keratynocyty przylegają poprzez tworzenie połączeń desmosomalnych5. W SG inicjowane jest wytwarzanie korpusów płytkowych. Składają się z prekursorów lipidów i enzymów, które są kluczowe dla tworzenia funkcji bariery skórnej6. SG charakteryzuje się również obecnością granulek keratohialiny w cytoplazmie keratynocytów. Na styku z SC zawartość ciał blaszkowatych jest wytłaczana do przestrzeni międzykomórkowych, a niepolarne lipidy, takie jak ceramidy, cholesterol i wolne kwasy tłuszczowe, organizują się w ułożone w stos blaszkowate dwuwarstwy lipidowe, tworząc zewnątrzkomórkową matrycę lipidową7. W SC komórki tracą wszystkie organelle komórkowe, w tym jądro, w wyniku enzymatycznych procesów degradacji i przyjmują spłaszczoną morfologię. Są one otoczone zrogowaciałą otoczką utworzoną z usieciowanych warstw białka i są określane jako korneocyty8, 9. Składniki desmosomalne są usieciowane z rogową otoczką, tworząc korneodesmosomy i wiążąc ze sobą korneocyty. Powstały w ten sposób nabłonek jest stale odnawiany z komórek macierzystych, a czas obrotu wynosi około 5-6 tygodni10. Proces różnicowania keratynocytów, w wyniku którego powstaje w pełni rozwarstwiony naskórek, ma kluczowe znaczenie dla tworzenia funkcji barierowej skóry11.

Podczas zranień i stanów zapalnych, keratynocyty wywołują zmiany w cząsteczkach adhezyjnych i receptorach powierzchniowych oraz wywołują reakcje prozapalne poprzez wydzielanie cytokin, chemokin i peptydów przeciwdrobnoustrojowych12. Skóra stanowi nie tylko fizyczną barierę przed substancjami egzogennymi; Działa również jako czujnik immunologiczny po ekspozycji na patogeny. Ponadto reguluje dyfuzję kilku substancji w swoich warstwach, takich jak zawartość wody, aby chronić organizm ludzki przed odwodnieniem. Skóra bierze również udział w syntezie witaminy D i pełni różne inne funkcje metaboliczne3, 13, 14.

Aby ocenić niekorzystne skutki substancji egzogennych, toksykolodzy od dziesięcioleci polegają na testach na zwierzętach, ale obecnie nie jest to preferowane podejście. Oprócz ograniczonej zdolności przewidywania toksyczności dla ludzi, modele zwierzęce wiążą się z licznymi kwestiami etycznymi. Zakaz testowania na zwierzętach w przemyśle kosmetycznym oraz zalecenie przestrzegania zasady 3R (tj. Replacement, Reduction, and Refinement) w badaniach doprowadziły do opracowania alternatywnych metod badawczych opartych na podejściach in vitro15. Pierwsze modele komórek skóry in vitro zostały już opisane w latach 90-tych, a imponujący rozwój od prostych ludzkich monokultur keratynocytów do w pełni zróżnicowanych modeli naskórka i pełnej grubości został osiągnięty16. W dzisiejszych czasach inżynieria tkanki skórnej zyskała na znaczeniu zarówno w dziedzinie farmacji, jak i dermatokosmetyki. W ciągu ostatnich dwóch dekad kilka firm skomercjalizowało trójwymiarowe (3D) zrekonstruowane ludzkie naskórek (RhE), które stanowią ustandaryzowane i powtarzalne narzędzia do badań związanych ze skórą. Kilka komercyjnych modeli RhE jest akceptowanych do badań skórnych in vitro substancji chemicznych zgodnie z wytycznymi OECD dotyczącymi badania działania drażniącego na skórę17, 18 (tj. wytyczne dotyczące badań 43919) i działania na skórę20 (tj. wytyczne dotyczące badań 43121). Test in vitro pod kątem działania uczulającego na skórę22 (tj. test SENS-IS) jest obecnie w trakcie zatwierdzania i recenzowania23. Opracowano również wiele innych testów, które wykorzystują komercyjne modele RhE do oceny fototoksyczności24, do testowania preparatów leków25, preparatów kosmetycznych i składników aktywnych26, do badania funkcji bariery skórnej27 oraz do testowania biologicznej odpowiedzi na stresory środowiskowe28,29,30,31.

Oprócz dostępnych na rynku modeli skórek 3D, wiele grup badawczych opracowało własne RhEs32,33,34,35,36,37. Wewnętrzne RhE oferują przewagę w kontrolowaniu warunków hodowli zgodnie z celem badania. W szczególności naukowcy mogą wybrać rodzaj i źródło keratynocytów, które zostaną użyte do odtworzenia ich modelu naskórka 3D (tj. pierwotne vs. unieśmiertelnione, noworodki vs. stare, pojedynczych vs. pula losowych dawców, płeć, pochodzenie etniczne, indywidualne nawyki życiowe, takie jak palenie itp.). Mają one możliwość zmiany składu pożywki hodowlanej i włączenia czynników wzrostu, witamin lub innych związków, które mogą modulować ekspresję docelowych białek lub lipidów. Dzięki własnym RhE naukowcy mogą również badać reakcje biologiczne i właściwości biomechaniczne w funkcji stanu różnicowania modelu 3D. Oprócz tych intuicyjnych parametrów podejmowane są ciągłe wysiłki w celu zwiększenia złożoności modeli skóry 3D i uczynienia ich bardziej istotnymi fizjologicznie, na przykład poprzez dodanie innych typów komórek naskórka (np. melanocytów i komórek odpornościowych)38, 39, poprzez hodowlę keratynocytów na powierzchni macierzy kolagenowej wypełnionej fibroblastami40,41,42oraz poprzez uwzględnienie składników sieci naczyniowej43,44,45.

Chociaż możliwe jest dostosowanie warunków hodowli do konkretnych potrzeb, istnieją parametry, które muszą być przestrzegane, aby zagwarantować zarówno jakość, jak i przydatność RhE. Aby wyhodować tkanki RhE, normalne ludzkie keratynocyty naskórka (NHEK) są wysiewane do specyficznych przepuszczalnych wkładek hodowlanych, których porowata syntetyczna membrana dzieli studzienki na dwa przedziały, tj. Przedział wierzchołkowy i podstawno-boczny. Porowatość błony (tj. wielkość porów 0,4 μm) jest taka, że umożliwia tworzenie monowarstwy komórek w przedziale wierzchołkowym bez migracji komórek na stronę wkładki podstawnej oraz karmienie keratynocytów niezbędnymi składnikami odżywczymi z pożywki hodowlanej zawartej w przedziale podstawno-bocznym. Na początku procesu rekonstytucji NHEK są hodowane w warunkach zanurzonych przez kilka dni, aby umożliwić ich przyleganie do membrany. Poziom wapnia w obu przedziałach jest zwiększony w porównaniu ze stężeniem wapnia stosowanym w hodowli 2D NHEK, aby spowolnić proliferację komórek i zamiast tego promować ich różnicowanie46. Naskórkowy gradient wapnia jest niezbędny do regulacji tworzenia bariery i homeostazy47, 48. Wysoki poziom wapnia (tj. do 1,5 mM) sprzyja tworzeniu połączeń międzykomórkowych i moduluje tworzenie zrogowaciałej otoczki podczas różnicowania końcowego49. Gdy keratynocyty utworzą ciągłą i ściśle przylegającą monowarstwę na membranie nośnej, pożywka z przedziału wierzchołkowego jest usuwana, a proces hodowli jest kontynuowany na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) w celu stymulacji stratyfikacji i ustanowienia bariery naskórkowej50, 51. Specyficzne warunki hodowli mają kluczowe znaczenie dla uzyskania w pełni stratyfikowanego nabłonka36. Podczas procesu rekonstytucji w ALI pożywka w przedziale podstawno-bocznym jest uzupełniana czynnikiem wzrostu keratynocytów (KGF), insuliną, wapniem i kwasem askorbinowym. Kwas askorbinowy odgrywa główną rolę w tworzeniu odpowiedniej bariery lipidowej SC, bardzo przypominającej barierę rodzimej ludzkiej skóry52. Keratynocyty hodowane w pożywce uzupełnionej kwasem askorbinowym wykazują zróżnicowany fenotyp, ze zwiększoną liczbą granulek keratohialiny, a także zorganizowanymi międzykomórkowymi blaszkami lipidowymi w szczelinach korneocytów52. Taka suplementacja jest niezbędna do poprawy funkcji bariery naskórkowej poprzez zwiększenie zawartości zrogowaciałej otoczki i uniknięcie wyczerpania hydrofilowych zapasów przeciwutleniaczy53, 54. KGF, ważny parakrynny mediator proliferacji i różnicowania naskórka, jest używany do stymulacji NHEKs55.

Główne wady wewnętrznych RhE to utrata standaryzacji między instytucjami badawczymi oraz zwiększona pracochłonność i czasochłonność (do 3 tygodni w porównaniu do gotowych do użycia modeli komercyjnych). Celem niniejszego artykułu jest zaradzenie tym wadom i stworzenie podstaw do produkcji na większą skalę. Oprócz wyżej wymienionych zalet wewnętrznych RhE, obecny protokół ma na celu zmniejszenie zmienności wewnętrznej i krzyżowej między tkankami, zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia oraz usprawnienie procesu hodowli.

Obecny protokół opisuje powtarzalną i solidną metodę hodowli RhE przy użyciu noworodkowych NHEK. Ponadto przedstawiono reprezentatywne wyniki charakterystyki morfologii RhEs, integralności bariery i ekspresji białek specyficznych dla różnicowania naskórka. Strukturę morfologiczną RhEs badano za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Aby ocenić integralność bariery, zmierzono przeznaskórkową oporność elektryczną (TEER) i czas ekspozycji na Triton X-100 w celu zmniejszenia o 50% żywotności tkanek (ET50). Tworzenie połączeń desmosomalnych (tj. desmogleiny 1) analizowano za pomocą immunofluorescencji (IF) w celu oceny adhezji keratynocytów. Tworzenie białek strukturalnych naskórka (tj. inwolukryny, lorykryny i filagryny) oceniano i wykrywano za pomocą IF. Białka te biorą udział w tworzeniu wysoce usieciowanej otoczki białkowej, która otacza korneocyty SC i w rezultacie są ważnymi markerami późnego stadium różnicowania naskórka56, 57. Dodatkowo, IF został wykorzystany do analizy keratyny 10, białka indukowanego we wczesnym stadium różnicowania komórek w klasie SS58 i znajdującego się we wszystkich zróżnicowanych warstwach. Na koniec zbadano odpowiedź RhE na bodźce prozapalne (tj. lipopolisacharyd i czynnik martwicy nowotworu alfa). Poziomy interleukiny 1 alfa (IL-1α) i interleukiny 8 (IL-8) mierzono w pożywkach do hodowli komórkowych za pomocą testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Protokół

Przejrzyj i przestrzegaj krajowych i międzynarodowych rozważań etycznych i warunków związanych z wykorzystaniem ludzkich tkanek lub komórek przed planowaniem i wykonywaniem jakichkolwiek działań badawczych związanych z tym protokołem.
UWAGA: Wszystkie etapy tego protokołu muszą być wykonywane w warunkach aseptycznych. Praktyki bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2 są minimalnym wymogiem dla uprawy RhEs. Podczas obchodzenia się z chemikaliami/odczynnikami opisanymi w niniejszym protokole należy podjąć wszelkie niezbędne środki ostrożności.

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych

UWAGA: Istnieją trzy różne rodzaje pożywek hodowlanych bez surowicy używanych do uprawy RhEs (Tabela 1): (i) podstawowa pożywka o niskim poziomie wapnia (60 μM Ca2+) używana do hodowli 2D NHEK; (ii) zanurzoną pożywkę o wysokim poziomie wapnia (1,5 mMCa2+) używaną do wysiewu NHEK do systemu wstawiania do hodowli komórkowych; oraz (iii) pożywka na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) o wysokim poziomie wapnia (1,5 mMCa2+), kwasem askorbinowym i czynnikiem wzrostu keratynocytów (KGF).

ŚredniNośnik informacjiWymagana ilość
Podstawowy średniPożywka wzrostowa keratynocytów36 mL/24 dołki
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antybiotyk-antybiotyk
Zanurzony nośnikPożywka wzrostowa keratynocytów36 mL/24 dołki
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antybiotyk-antybiotyk
+ 1,5 mM Ca2+
Medium interfejsu powietrze-cieczPożywka wzrostowa keratynocytów216 mL/24 dołki
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antybiotyk-antybiotyk
+ 1,5 mM Ca2+
+ 50 μg/ml kwasu askorbinowego
+ 10 ng/ml czynnika wzrostu keratynocytów

Tabela 1. Tabela podsumowująca różne podłoża hodowlane używane do uprawy RhEs. Lista różnych pożywek hodowlanych wraz z suplementami.

  1. Przygotuj podłoże podstawowe.
    1. Uzupełnij butelkę z 500 ml pożywki wzrostowej keratynocytów (tabela materiałów) 5 ml ludzkich suplementów wzrostu keratynocytów (HKGS) w celu osiągnięcia końcowych stężeń 0,2% [v/v] ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE), 0,2 ng/ml ludzkiego rekombinowanego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 0,18 μg/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml bydlęcej transferyny, i 0,01 μg/ml rekombinowanego ludzkiego insulinopodobnego czynnika wzrostu-I (IGF-I).
    2. Dodać 5 ml 100x roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego zawierającego 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B.
  2. Przygotować zanurzone podłoże.
    1. Uzupełnij butelkę z 500 ml pożywki wzrostowej keratynocytów (tabela materiałów) 5 ml HKGS, aby osiągnąć końcowe stężenia 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml ludzkiego rekombinowanego EGF, 0,18 μg/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml transferyny bydlęcej i 0,01 μg/ml ludzkiego rekombinowanego IGF-I.
    2. Dodaj 5 ml 100x roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
    3. Dodać 5 ml 0,144 M roztworu podstawowego CaCl2 (chlorek wapnia), aby osiągnąć końcowe stężenie 1,5 mM Ca2 + < br / > UWAGA: Stężenie wapnia jest już zwiększone podczas fazy zanurzenia, aby stymulować różnicowanie keratynocytów i zainicjować proces stratyfikacji49.
  3. Przygotować medium na granicy faz powietrze-ciecz (ALI).
    1. Uzupełnij jedną butelkę 500 ml pożywki wzrostowej keratynocytów (tabela materiałów) 5 ml HKGS, aby osiągnąć końcowe stężenia 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml ludzkiego rekombinowanego EGF, 0,18 μg/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml transferyny bydlęcej i 0,01 μg/ml ludzkiego rekombinowanego IGF-I.
    2. Dodaj 5 ml 100x roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
    3. Dodać 5 ml 0,144 M roztworu podstawowego CaCl2, aby osiągnąć końcowe stężenie 1,5 mM Ca2+.
    4. Dodać 1 ml roztworu podstawowego kwasu askorbinowego o stężeniu 25 mg/ml, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 μg/ml kwasu askorbinowego.
    5. Dodać 50 μl 100 μg/ml KGF do 1% [w/v] albuminy surowicy bydlęcej w roztworze podstawowym soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng/ml KGF.
      UWAGA: Ponieważ kwas askorbinowy jest wrażliwy na utlenianie, zaleca się stosowanie stabilnej pochodnej kwasu askorbinowego, takiej jak l-askorbyl-2-fosforan magnezu59 lub kwas L-askorbinowy 2-fosforan sesquimagnesium60. W przypadku stosowania kwasu askorbinowego zaleca się świeże uzupełnienie podłoża ALI kwasem askorbinowym przed każdym odświeżeniem.

2. Kultura NHEKs

UWAGA: Ponieważ pierwotne ludzkie keratynocyty pozostają proliferacyjne przy czwartym lub piątym przejściu61, NHEK w trzecim przejściu są używane do uprawy RhEs. Z keratynocytami pierwotnymi należy obchodzić się bardzo ostrożnie ze względu na ich wysoką wrażliwość. Bardzo ważne jest ostrożne i powolne pipetowanie zawiesin komórkowych w dowolnym momencie, aby nie zakłócić stanu komórek.

  1. Rozmrozić fiolkę z 1 x 106 kriokonserwowanymi NHEK w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, zanurzając część fiolki w wodzie. Inkubować fiolkę przez 1-2 minuty w łaźni wodnej, aż będzie widoczny tylko mały kawałek lodu.
    UWAGA: Nie zanurzać całej fiolki w łaźni wodnej, aby uniknąć zanieczyszczenia. Nie rozmrażaj komórek dłużej niż 2 minuty; Może to zmniejszyć żywotność komórek. Przetrzeć fiolkę 70% roztworem etanolu przed przeniesieniem probówki do pokrywy laminarnej.
  2. Ponownie zawiesić komórki bardzo ostrożnie, pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Przenieść zawiesinę komórek do dwóch kolb T75 zawierających łącznie 15 ml wstępnie podgrzanego podłoża do rozmrażania, co daje gęstość wysiewu 6,7 x 104 komórki/cm2,
    UWAGA: Do pierwszych dwóch pasaży i rozmrażania kriokonserwowanych NHEK stosuje się pożywkę do hodowli komórkowych zgodnie z zaleceniami dostawcy.
  3. Umieścić kolby w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności względnej (RH)).
  4. Po około 24 godzinach zastąp pożywkę do rozmrażania pożywką podstawową, aby usunąć dimetylosulfotlenek (DMSO) z roztworu zamrażającego keratynocytów.
  5. Odświeżaj podłoże podstawowe co dwa dni.
  6. Po 4-6 dniach uprawy komórki powinny być w około 80% zlewane i gotowe do wysiewu we wkładach do uprawy RhEs.
    UWAGA: Keratynocyty powinny być uprawiane do maksymalnie 80% zbieżności, aby zachować ich zdolność do proliferacji62. Liczba komórek do rozmrożenia musi uwzględniać kilka parametrów, takich jak liczba pasaży komórkowych, żywotność komórek po rozmrożeniu, wydajność wysiewu, a także czas podwajania.

3. Rozstawienie NHEK

UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony do użytku w formacie 24-dołkowej płytki nośnej. Jeśli wymagane są inne formaty płytek (np. 12-dołkowy lub 6-dołkowy), należy rozważyć optymalizację gęstości wysiewu i objętości podłoża. Rysunek 1 podsumowuje proponowany harmonogram uprawy RhE i pokazuje warunki uprawy.

Schemat procesu różnicowania keratynocytów, metoda granicy faz powietrze-ciecz, wzrost ludzkiego naskórka.
Rysunek 1: Schematyczny harmonogram protokołu rekonstytucji.Prezentacja przygotowania modelu RhE, procesu uprawy i aplikacji (narażenie na działanie substancji chemicznej). Schemat zawiera odpowiednie typy pożywek do hodowli komórkowych dla każdego etapu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Wstępnie napełnij płytki 24-dołkowe 1,5 ml zanurzonego podłoża, najlepiej za pomocą pipety dozownika.
  2. Usunąć podłoże podstawowe z kolb T75 używanych do hodowli NHEK.
  3. Przepłukać komórki, dodając 5 ml wstępnie podgrzanego PBS do każdej kolby T75.
  4. Usuń PBS z kolb.
    UWAGA: Ten krok jest kluczowy, ponieważ pożywka zawiera białka i wapń, które hamują aktywność trypsyny.
  5. Dodać 2-3 ml wstępnie podgrzanego 0,05% [v/v] trypsyny/etylenodiaminotetraoctowego kwasu (EDTA) do każdej kolby T75. Upewnij się, że roztwór trypsyny jest równomiernie rozprowadzony w obszarze hodowli komórkowej kolby.
    UWAGA: Objętość 2 ml opiera się na wspomnianej powyżej 80% konfluencji. Użyj 3 ml dla kolb o większej konfluencji.
  6. Umieścić kolby na 4 minuty w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO 2 i 95% CO2 i 95% wilgotności względnej). Sprawdź, czy komórki odrywają się za pomocą mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu. Uderzyć kolbą o dłoń, aby pomóc komórkom uwolnić się z powierzchni kolby. Oderwane komórki można zaobserwować jako zaokrąglone komórki unoszące się w roztworze trypsyny.
    UWAGA: Nie inkubuj komórek w trypsynie dłużej niż 6 minut. Nadmierna trypsyna może uszkodzić komórki i zmniejszyć ich przyleganie63.
  7. Po odłączeniu wszystkich komórek dodać równą objętość (tj. 2-3 ml) wstępnie podgrzanego inhibitora trypsyny do każdej kolby T75.
  8. Przenieść zawiesinę komórkową z kolb do probówki wirówkowej.
  9. Przepłukać kolby 5 ml wstępnie podgrzanego PBS i przenieść go do probówki wirówkowej zawierającej zawiesinę komórek.
    UWAGA: Upewnij się, że większość komórek została zebrana, sprawdzając liczbę pozostałych komórek w kolbach pod mikroskopem. Powierzchnia kolby powinna być pusta w 95%. Jeśli tak nie jest, możliwe jest powtórzenie etapu trypsynizacji (3.3-3.9). Należy jednak pamiętać, że należy unikać ponownej trypsynizacji.
  10. Odwirować zebrane komórki przy 400 x g przez 5 minut.
  11. Ostrożnie wyrzucić większość supernatantu, pozostawiając około 100-200 μl w probówce.
    UWAGA: Nie zasysać osadu podczas tej procedury. 
  12. Delikatnie zawiesić osad komórek w małej objętości zanurzonego podłoża, pipetować w górę i w dół 5-10 razy, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek. Zacznij od małej objętości (tj. 500 μl), aby uniknąć tworzenia się agregatów komórkowych i dodaj łącznie do 1 ml zanurzonego podłoża na początkową kolbę T75.
    UWAGA: Delikatnie przesunąć probówkę palcami, aby ostrożnie rozpuścić część osadu komórkowego w supernatancie.
  13. Policz komórki w zawiesinie, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego.
    1. Rozcieńczyć 0,4% [v/v] barwienie błękitem trypanowym i zawiesinę komórek w stosunku 1:1, dodając 10 μl 0,4% [v/v] barwienia błękitem trypanowym do 10 μl zawiesiny komórek. Dodać 10 μl roztworu do szkiełka do liczenia. Zmierz liczbę komórek natychmiast po zmieszaniu zawiesiny komórek z błękitem trypanowym, ponieważ błękit trypanowy zaczyna zmniejszać żywotność komórek po ekspozycji dłuższej niż 1 min65.
      UWAGA: Wykazano, że błękit trypanowy jest potencjalnym czynnikiem mutagennym, rakotwórczym i teratogenowym64. Z barwnikiem należy obchodzić się ostrożnie i utylizować odpady w bezpieczny sposób zgodnie z lokalnymi przepisami laboratoryjnymi.
      UWAGA: Alternatywnym podejściem do stosowania błękitu trypanowego jest bezpieczny barwnik Erythrosin B66.
  14. Rozcieńczyć zawiesinę komórek dodatkowym zanurzonym podłożem, aby osiągnąć stężenie 3,525 x 105 komórek/ml w zanurzonym podłożu, dodając objętość V2, jak pokazano w równaniu 1:
    Równanie ilustrujące równowagę statyczną, V2=C1*(V1/C2)-V1, kluczowe w analizie obwodu.
    C1 = stężenie liczonych komórek w zawiesinie komórek otrzymane w 3,12 (komórek/ml)
    V1 = objętość użyta do ponownego zawieszenia osadu komórek w 3,12 (ml)
    C2 = docelowe stężenie komórek w zawiesinie (tj. 3,525 x 105 komórek/ml)
    V2 = objętość, którą należy dodać, aby osiągnąć docelowe stężenie komórek (ml)
    UWAGA: Powierzchnia zalecanej wkładki hodowlanej wynosi 0,47cm2; Dlatego odpowiednia gęstość wysiewu wynosi 3,75 x 105 komórek/cm2.
  15. Wykonać drugie zliczanie komórek (C3) rozcieńczonego roztworu otrzymanego w kroku 3.14. Użyj równania 2, aby obliczyć objętość zawiesiny komórkowej (V4), która ma zostać wysiana do wkładki hodowlanej:
    Równanie transformacji napięcia, V4 = C3 * (V3 / C4), wzór na obwód elektryczny.
    C3 = docelowe stężenie komórek w zawiesinie (tj. 3,525 x 105 komórek/ml)
    V3 = docelowa objętość zawiesiny komórkowej do wysiewu we wkładce hodowlanej (tj. 0,5 ml)
    C4 = stężenie policzonych komórek w rozcieńczonej zawiesinie otrzymanej w 3,14 (komórek/ml)
    V4 = rzeczywista objętość zawiesiny komórkowej do wysiewu we wkładce hodowlanej (ml)
  16. Zawiesić wkładki do hodowli 24-komórkowych w najwyższym położeniu zalecanej płytki nośnej i przenieść płytkę nośną na płytkę 24-dołkową wstępnie wypełnioną zanurzonym podłożem (patrz 3.1).
    UWAGA: Podczas przenoszenia płytki nośnej na płytkę wielodołkową należy upewnić się, że między membraną wkładki a zanurzonym medium z komory podstawowej nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza, ponieważ wpłynie to na odżywianie komórek i ostatecznie zagrozi żywotności i morfologii RhE.
  17. Dodać oznaczoną objętość V4 (z równania 2) zawiesiny komórek do każdej wkładki.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie techniki odwróconego pipetowania w celu dokładnego dozowania zawiesiny komórkowej do wkładek hodowlanych.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić membrany podczas dozowania zawiesiny komórkowej do wkładki hodowlanej. Środkiem ostrożności jest dozowanie zawiesiny komórek wzdłuż ścianki systemu wkładek bez dotykania powierzchni membrany.
  18. Po wysianiu inkubuj 24-dołkowe płytki przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej, aby przezwyciężyć efekt krawędzi (tj. nierównomierny rozkład temperatury między wszystkimi dołkami67). W tym czasie nie przesuwaj talerzy.
  19. Przenieść płytki do inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO 2 i 95% CORH). Komórki są utrzymywane w warunkach zanurzonych przez trzy dni.
    UWAGA: Aby uniknąć zmienności tkanek, nie należy układać płytek w inkubatorze po wysiewie, aby upewnić się, że każda wkładka otrzymuje taką samą ilość ciepła. Po trzech dniach (tj. podczas uprawy ALIA) możliwe jest układanie talerzy w stosy.

4. Uprawa na granicy powietrze-ciecz

  1. Po trzydniowej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności względnej) należy wystawić komórki, które przylgnęły do powierzchni błony, na działanie ALI, usuwając zanurzoną pożywkę z komory wierzchołkowej, najlepiej za pomocą systemu aspiracji i szklanej pipety Pasteura.
    UWAGA: Alternatywnie, zanurzone medium z komory wierzchołkowej można usunąć za pomocą ręcznej mikropipety.
  2. Napełnij nowe płytki 24-dołkowe 1,5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki ALI i przenieś płytki nośne z wkładkami hodowlanymi na nowe płytki wielodołkowe.
  3. Przenieść płytki wielodołkowe z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności względnej).
  4. Odświeżaj pożywkę ALI co 2-3 dni przez 14 dni.
  5. Wykonaj odświeżanie w dwóch krokach: 1) przygotuj nową płytkę zawierającą 1,5 ml/studzienkę świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki ALI i 2) przenieś płytkę nośną na nową płytkę.
    UWAGA: Podczas całej procedury rozpuszczania najlepiej nie zdejmować pokrywy zakrywającej płytkę nośną, aby chronić RhE przed potencjalnym zanieczyszczeniem.
    UWAGA: Etap ALI ma kluczowe znaczenie dla opracowania warstwowego modelu naskórka, ponieważ umożliwia końcowe różnicowanie keratynocytów68. Po udaniu się do ALI wymagana jest kontrola wzrokowa wkładek, aby sprawdzić, czy nie ma "nieszczelnych tkanek": średnich kropelek na powierzchni tkanki pochodzących z przedziału podstawno-bocznego. Jeśli wyciek nastąpi w 3. dniu ALI, delikatnie wyjmij pożywkę z wkładki hodowlanej, nie dotykając powierzchni tkanki. Jeśli nieszczelność utrzymuje się, zaleca się odrzucenie nieszczelnych tkanek, ponieważ wskazuje to na to, że w modelu RhE nie ma prawidłowego tworzenia bariery.
  6. Pod koniec procesu rekonstytucji tkanki mogą być narażone na różne czynniki stresogenne, aby wywołać na przykład stres oksydacyjny lub stan zapalny. Równolegle można je leczyć związkami chemicznymi lub składnikami kosmetycznymi. UWAGA: Podczas ekspozycji/leczenia tkanki są zwykle utrzymywane w zanurzonym podłożu, począwszy od ALI D14. W przypadku gdy oczekuje się, że tkanki będą poddawane działaniu promieniowania przez długi okres czasu (tj. 48-72 godziny), zaleca się (i) rozpoczęcie ekspozycji/leczenia na wcześniejszym etapie procesu hodowli ALI, takiego jak D7-D9, aby uniknąć ścieńczenia żywotnych warstw i pogrubienia SC, oraz (ii) inkubacji tkanek w pożywce ALI, aby nadal stymulować proliferację komórek.
  7. W przypadku zbioru RhE należy zebrać tkanki i pożywkę do hodowli komórkowych w interesującym ich punkcie czasowym w celu analizy histologicznej, testów żywotności, ekstrakcji białka/RNA i testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Wyniki

NHEKs hodowane w 2D wykazują tradycyjną morfologię o spójnym kształcie wielokąta (Rysunek 2A). Jak opisano powyżej, NHEKs są umieszczane we wkładkach hodowlanych po osiągnięciu konfluencji około 80%. Morfologię RhEs analizowano za pomocą barwienia H&E i TEM. Po 15 dniach w ALI uzyskuje się w pełni warstwową tkankę, na co wskazują jej cztery główne warstwy naskórka: SB, SS, SG i SC (Figura 2B). W warstwie SB komórki mają kształt kolumnowy. Od drugiej warstwy w kierunku górnych warstw RhE, NHEK różnicują się, co obserwuje się na podstawie zmian w morfologii komórek (od kształtu kolumnowego w warstwie SB w kierunku kształtu kolczystego w warstwie SS). W warstwie SG komórki mają bardziej spłaszczony kształt i wyświetlają granulki keratohialiny (KG), które są reprezentowane jako fioletowe kropki w cytoplazmie. Ich charakterystyczny okrągły i gwiaździsty kształt podkreślony jest białymi strzałkami na obrazie H&E (Rysunek 2C). Komórki w SC są ostatecznie zróżnicowane i są całkowicie spłaszczone i nie mają jądra komórkowego. Warstwowe RhE mają całkowitą grubość 84,3 ± 2,4 μm, a ich SC ma grubość 19,6 ± 3,2 μm (Rysunek 2D). Wartości te są porównywalne z tymi podawanymi dla rodzimej ludzkiej skóry, tj. odpowiednio 60-120 μm i 10-20 μm69. Liczba żywotnych warstw wynosi 6-7, czyli mniej niż w przypadku rodzimej ludzkiej skóry, wynosząc około 7-1470. Analiza ultrastrukturalna RhEs w różnych punktach czasowych protokołu rekonstytucji (tj. 7, 10, 13 i 15 dni) ujawnia proces rogowacenia RhEs ze zwiększoną liczbą warstw korneocytów w czasie (Figura 2E). Po 15 dniach w ALI, SC tkanki RhE składa się z około 15-25 warstw, co jest porównywalne z wartością podaną dla rodzimej ludzkiej skóry (tj. 15-20 warstw)69.

Histologia warstw skóry i wzrostu komórek; Zawiera obrazy mikroskopowe i wykres słupkowy do analizy grubości.
Rysunek 2: Pierwotne keratynocyty i zrekonstruowany ludzki naskórek.(A) Obraz z mikroskopii z kontrastem fazowym pierwotnych keratynocytów przed wysiewem na wkładki. Podziałka wynosi 50 μm. (B-C) Obraz RhE z mikroskopu jasnego pola H&E. Podziałka wynosi 50 μm (B) i 25 μm (C). (D) Kwantyfikacja grubości RhE i SC (średnia ± SEM, n=3). (E) Obrazy przekrojów czynnych RhE z transmisyjnej mikroskopii elektronowej po 7, 10, 13 i 15 dniach w ALI. Podziałka skali wynosi 4 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zgodnie z ich etapem różnicowania, NHEK rosnące w 3D wykazują różne profile ekspresji białek w zależności od ich etapu różnicowania. Ekspresję białek specyficznych dla różnicowania keratynocytów we wczesnym stadium (tj. keratyny 10), różnicowania keratynocytów w późnym stadium (tj. inwolukryny, lorykryny i filagryny) oraz adhezji keratynocytów (tj. desmogleiny 1) w RhEs określono za pomocą barwienia IF. Ekspresja inwolukryny wydaje się być bardziej zlokalizowana w warstwie SG, ponieważ jej ekspresja jest inicjowana wcześniej podczas procesu różnicowania (Rysunek 3D), podczas gdy filagryna i lorykryna ulegają ekspresji w górnych warstwach ( Rysunek 3B-C). Ekspresję keratyny 10 stwierdzono we wszystkich żywotnych warstwach, z wyjątkiem warstwy SB (Rysunek 3E). RhE wykazują funkcjonalne połączenia desmosomalne, na co wskazuje ekspresja desmogleiny 1 w przestrzeni międzykomórkowej żywotnych warstw naskórka (Rysunek 3F). Podsumowując, wszystkie pięć markerów ulega ekspresji i jest zlokalizowanych w odpowiednich warstwach naskórka i przekłada się na zdrowy proces różnicowania naskórka.

Histologia i mikroskopia immunofluorescencyjna warstw naskórka; Markery H&E i białkowe.
Rysunek 3: Różnicowanie naskórka, adhezja tkanek i integralność tkanek zrekonstruowanego ludzkiego naskórka.(A) Obraz RhE z mikroskopii jasnego pola H&E. Obrazy z mikroskopii fluorescencji konfokalnej (B) filagryny (FLG), (C) lorykryny (LOR), (D) inwolukryny (INV), (E) keratyny 10 (K10) i (F) desmogleiny 1 (DSG-1) reprezentowanej w kolorze magenta. Barwienie jąder (DAPI) jest reprezentowane na niebiesko. Podziałka skali wynosi 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Właściwości barierowe modelu RhE zostały zbadane poprzez ocenę zarówno żywotności tkanki, jak i jej integralności. Integralność tkanek określono po 15 dniach, mierząc TEER za pomocą woltoomomierza. Wartości 2567 ± 415 Ω.cm2 zarejestrowane dla RhEs tłumaczą tworzenie się ciągłej bariery (Rysunek 4A). Te wartości mieszczą się w zakresie wartości raportowanych dla modeli RhE71,72,73,74. Ponadto za pomocą testu tiazolylo-niebieskiego bromku tetrazolu (MTT) określono wymagany czas ekspozycji dla cytotoksycznej referencyjnej substancji chemicznej (tj. Triton X-100) w celu zmniejszenia żywotności tkanek o 50% (ET50). Wartość ET50 zmierzona dla RhE wynosiła 2,1 godziny. Wartość ta mieści się w zakresie akceptacji innych modeli 3D naskórka, które kwalifikują się do wiarygodnego przewidywania klasyfikacji działania drażniącego (wytyczna OECD 439)19.

Wykres pudełkowy i wykres liniowy przedstawiający oporność i żywotność tkanek w funkcji czasu ekspozycji; ET50=2.1h.
Rysunek 4: Właściwości barierowe zrekonstruowanego ludzkiego naskórka.(A) Integralność tkanek mierzona za pomocą przeznabłonkowego oporu elektrycznego (średnia ± SEM, n=6). (B) ET50 określony przez pomiar żywotności tkanek (tj. test MTT) po miejscowej ekspozycji na 78,3 μl 1% Triton X-100 (średnia ± SEM, n = 3).

Zbadano reakcję RhEs na znane bodźce prozapalne. RhE leczono ogólnoustrojowo, tj. dodając bodźce w pożywce przedziału podstawno-bocznego, stosując 100 μg/ml lipopolisacharydu Escherichia coli (LPS) i czynnika martwicy nowotworu alfa 40 ng/ml (TNF-α). Po 24 godzinach bodźców pobrano pożywkę do hodowli komórkowych. Cytotoksyczność mierzono za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i porównywano z wartościami znanego czynnika zaburzającego błonę, detergentu Triton X-100 (Rysunek 5). Wykazano istotny wzrost (p < 0,05, jednoczynnikowa ANOVA, wielokrotny test porównawczy Dunnetta) wykazano aktywność LDH w RhEs leczonych Triton X-100. Leczenie LPS i TNF-α wykazało, że nie są cytotoksyczne.

Wykres słupkowy aktywności LDH; TX-100, LPS, TNF-α porównanie; wyniki testów enzymatycznych; analiza statystyczna.
Rysunek 5: Cytotoksyczność mierzona za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Dane są prezentowane jako wartości względne dla kontrolnych, nieleczonych tkanek (CTRL); średnia ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Istotność została przetestowana za pomocą jednoczynnikowego ANOVA, testu wielokrotnych porównań Dunnetta. Gwiazdka oznacza statystycznie istotną różnicę w porównaniu do CTRL, ****p < 0,0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Uwalnianie interleukiny 1 alfa (IL-1α) i interleukiny 8 (IL-8) w pożywce RhE zostało określone ilościowo za pomocą testów ELISA. Rysunek 6 pokazuje zarówno ilościowe, jak i względne uwalnianie IL-1α i IL-8 przez RhEs po próbie z LPS i TNF-α. Leczenie LPS skutkowało statystycznie istotnym (p < 0,05, niesparowany test T Studenta) indukowanym uwalnianiem IL-8 (9,6 ± 1,0-krotny wzrost) i IL-1α (2,7 ± 1,3-krotny wzrost). TNF-α nie indukował istotnie uwalniania IL-8, mimo że obserwowano tendencję do zwiększonego poziomu IL-8 (wzrost od 2,3 ± 0,8 krotny). Jednak TNF-α znacząco (p < 0,05, niesparowany test Studenta) wyzwalał uwalnianie IL-1α (1,8 ± 0,5-krotny wzrost).

Porównanie wykresów słupkowych poziomów ekspresji IL-8, IL-1α; Efekty LPS, TNF-α; analiza statystyczna.
Rysunek 6: Reakcje prozapalne w zrekonstruowanym ludzkim naskórku.Stężenia IL-8 uwalniane przez RhE po 24-godzinnym prowokowaniu LPS (A) i TNF-α (B). Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Dane są przedstawiane jako średnia wartości względnej w porównaniu z kontrolnymi, nietraktowanymi tkankami (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Stężenie IL-1α uwalnia RhE po 24-godzinnym prowokacji LPS (D) i TNF-α (E). Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Dane są reprezentowane jako średnia wartości względnej w porównaniu do CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). Istotność została przetestowana za pomocą niesparowanego testu T Studenta. Gwiazdka oznacza statystycznie istotne różnice w porównaniu do CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

RhE są szeroko stosowane jako narzędzia przesiewowe w branży farmaceutycznej i dermatokosmetycznej36, 75,76,77,78. Chociaż kilka firm wprowadziło takie RhE na rynek, są one nadal kosztowne i ograniczają możliwość zmiany parametrów uprawy w zależności od potrzeb związanych z nowymi pytaniami badawczymi. W artykule opisano procedurę produkcji wewnętrznych RhE w solidny i wiarygodny sposób oraz przedstawiono szczegółową charakterystykę uzyskanych tkanek, aby potwierdzić przydatność modelu jako alternatywnego podejścia do testów na zwierzętach.

Niektóre z etapów protokołu mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego różnicowania keratynocytów i odtwarzalności RhE. Można to osiągnąć, wykorzystując optymalne komórki, typy pożywki i warunki uprawy. W proponowanym modelu RhE noworodki NHEK zostały wybrane ze względu na brak ekspozycji na antygen, w porównaniu z dorosłymi NHEK. Co więcej, keratynocyty ograniczono do pochodzenia kaukaskiego, aby uniknąć zmienności międzygatunkowej. Pierwotne keratynocyty są zwykle używane ze względu na ich zdolność do różnicowania i stratyfikacji79. Można je uzyskać komercyjnie lub poprzez izolację wewnętrzną od skóry osoby dorosłej80. Hodowla linii komórkowej (tj. HaCaT) na membranie poliwęglanowej wykazała, że nie udaje się różnicować i wykazano upośledzoną zdolność do syntezy lipidów, które są niezbędne do tworzenia bariery81. Jednak włączenie różnych matryc hodowlanych, takich jak hydrożele, kolagen, fibryny i sferoidy, zaowocowało pomyślnym opracowaniem modeli skóry3D 78,82,83,84,85,86. Wykazano, że unieśmiertelnione linie komórkowe, N/TERT, są odpowiednie do rozwoju RhEs35. Keratynocyty pierwotne pozostają proliferacyjne po czwartym lub piątym pasażu61, dlatego obecny protokół obejmuje użycie keratynocytów w ich trzecim pasażu. De Vuyst i wsp. wykazali, że gęstość wysiewu komórek ma znaczenie i musi być wystarczająca (tj. ≥ 2,5x105 komórek/cm2), aby zapewnić, że podłoże z przedziału podstawno-bocznego nie dyfunduje do przedziału wierzchołkowego. Niewystarczająca gęstość wysiewu (tj. < 2,5x105 komórek/cm2) może powodować niezdolność do wytworzenia właściwej bariery, na co wskazuje dyfuzja pożywki z przedziału podstawno-bocznego do wierzchołkowego, co skutkuje warunkami hodowli zanurzonej zamiast ALI62. Pożywka wzrostowa keratynocytów bez surowicy (patrz tabela materiałów) została wybrana ze względu na odtwarzalność, ponieważ oferuje ona zaletę pracy z chemicznie zdefiniowanym podłożem i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. Pożywka ta ma niższe stężenie wapnia (tj. 60 μM) i dlatego stymuluje proliferację keratynocytów87. Zwiększenie stężenia wapnia (tj. 1,5 mM) od pierwszego etapu hodowli RhE sprzyja różnicowaniu keratynocytów oraz tworzeniu bariery skórnej i homeostazy49. Ponadto pożywka ALI jest uzupełniana kwasem askorbinowym, który, jak wykazano, ma kluczowe znaczenie dla tworzenia lipidów SC i promowania różnicowania 52,53,54. Pożywka ALI zawiera również KGF, który jest czynnikiem wzrostu wydzielanym przez fibroblasty, który może wiązać się z receptorami transbłonowymi keratynocytów, a po aktywacji odgrywa podwójną rolę w różnicowaniu i gojeniu ran55, 88. Ważne jest, aby odświeżać pożywkę ALI w określonych odstępach czasu, aby zapewnić stały dopływ świeżych składników odżywczych do RhEs. Zastosowanie systemu płyt nośnych ma kluczowe znaczenie dla uprawy RhE na większą skalę (tj. 24 wkładki/płytkę). Zaletą jest oszczędność czasu, zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia i pozostawia mniej miejsca na wprowadzenie błędów ludzkich. Daje również możliwość hodowli RhE w dużej objętości pożywki (tj. 1,5 ml), co zmniejsza wymaganą liczbę odświeżeń pożywki ALI. Dodatkowo oferuje możliwość przeniesienia pełnej płytki wkładek na płytkę ze świeżym podłożem, unikając kontaktu z wkładkami pojedynczo lub odsłonięcia pokrywy płyty.

Istnieje kilka ograniczeń modelu RhE, na które należy zwrócić uwagę. W rodzimej skórze ludzkiej istnieje równowaga między proliferacją keratynocytów w warstwie podstawnej a oderwaniem korneocytów w SC (tj. złuszczaniem)89. Jednak in vitro złuszczanie nie ma miejsca. Dlatego korneocyty pozostają przyłączone do RhE i tworzą gruby SC, który jest mniej istotny fizjologicznie. W związku z tym czas uprawy RhEs jest ograniczony. Co więcej, ten model RhE jest prosty i nieskomplikowany, ponieważ składa się z pojedynczego typu komórek, tj. keratynocytu, który jest najliczniejszym typem komórek naskórka. Istnieją jednak inne typy komórek rezydujące w naskórku, takie jak melanocyty, komórki dendrytyczne (tj. Komórki Langerhansa), limfocyty T (np. Komórki CD8 +) i komórki Merkla13. Aby zwiększyć fizjologiczne znaczenie modelu skóry, naukowcy uczynili modele skóry bardziej złożonymi, dodając melanocyty38 , komórki odpornościowe39 lub komórki pochodzące od pacjenta90. Należy pamiętać, że właściwości barierowe modeli ludzkiej skóry są inne w porównaniu z rodzimą ludzką skórą, ze względu na znacznie inny skład lipidów SC i wyższą przepuszczalność bariery 91,92,93,94,95. Jednak kilka badań wykazało zmiany właściwości barierowych ludzkich modeli skóry przez hodowlę w warunkachniedotlenienia 96 lub zmniejszonej wilgotności względnej97, modulację macierzy skórnej za pomocą chitozanu98 oraz zmianę wolnych kwasów tłuszczowych w pożywcehodowlanej 99. Co więcej, zarówno w prostych, jak i bardziej złożonych RhE, warunki hodowli i skład pożywki mogą być modulowane w celu naśladowania cech patologicznych. Rzucając wyzwanie modelowi za pomocą cytokin, można ustalić nieprawidłową morfologię100 oraz zmiany w poziomach ekspresji genów i białek, które są zwykle obserwowane w powszechnych chorobach skóry, takich jak atopowe zapalenie skóry i łuszczyca35, 101,102,103,104,105 . Wyciszenie określonych genów w keratynocytach przed rozpoczęciem procesu rekonstytucji modelu 3D jest kolejnym podejściem stosowanym do naśladowania cech chorób skóry i badania nowych rozwiązań terapeutycznych106, 107. Oprócz modelowania samej warstwy naskórka, w modelu można uwzględnić przedział skórny (tj. Nazwane odpowiedniki ludzkiej skóry lub modele o pełnej grubości) poprzez osadzenie fibroblastów w macierzy kolagenowej przed rekonstytucją RhE, dzięki czemu jest ona bardziej fizjologicznie istotna i odpowiednia do badań związanych ze starzeniem się i gojeniem się ran 108,109,110. Dodatkowo, sferoidy guza zostały dodane do odpowiedników ludzkiej skóry w celu zbadania progresji czerniaka111, 112. Najnowszymi osiągnięciami w dziedzinie modelowania skóry są biodruk i skóra na chipie. Wielu grupom badawczym udało się ostatnio opracować (perfuzyjne) biodrukowane odpowiedniki skóry45, 113, 114. Proponowany protokół wykorzystuje format 24-dołkowy i płytkę nośną, co pozwala uniknąć indywidualnego obchodzenia się z wkładkami. Jednak skala badania jest nadal dość ograniczona i brakuje jej automatyzacji. Dzięki zastosowaniu biodruku lub skin-on-a-chip, mniejsze modele skóry mogą być wykorzystywane w bardziej zautomatyzowanych procesach i na większą skalę.

RhE opisany w tym protokole ma wiele podobieństw do już opracowanych i dobrze scharakteryzowanych komercyjnych modeli naskórka. Analiza morfologiczna wykazała, że chociaż liczba żywotnych warstw w proponowanym modelu RhE jest mniejsza w porównaniu z rodzimą skórą ludzką (tj. 6-7 w porównaniu z 7-14), jest ona porównywalna z liczbą warstw w modelu EpiDerm RhE (tj. 8-12)70. Podobnie jak w modelach EpiDerm, EpiSkin i SkinEthic, górna warstwa RhE wykazuje wzór splotu koszyczkowego gęsto upakowanych warstw korneocytów28. Co więcej, analiza TEM wykazała, że liczba warstw SC w proponowanym modelu RhE (tj. 15-25) jest porównywalna z liczbą warstw EpiDerm (tj. 16-25)70. Ogólnie rzecz biorąc, proponowany model RhE wykazuje podobną strukturę do innych skomercjalizowanych modeli naskórka, naśladując natywny ludzki naskórek. Integralność tkanek mierzona za pomocą TEER mieści się w zakresie komercyjnych modeli RhE (tj. między 3000-5600 Ω.cm2) 71,72,73 i innymi wewnętrznymi RhE (tj. około 5000 Ω.cm 2) 74, 115. Proponowany model RhE okazuje się być dobrze zróżnicowany, na co wskazuje obecność i prawidłowa lokalizacja markerów różnicowania i adhezji tkankowej. Co więcej, proponowany model RhE wykazuje reaktywność na bodźce prozapalne (tj. LPS i TNF-α).

Podsumowując, obecny protokół pokazuje, w jaki sposób wytwarzać RhE w niezawodny sposób i na stosunkowo dużą skalę, aby zaspokoić potrzeby naukowców zarówno w instytucjach akademickich, jak i prywatnych. Proponowany model RhE wykazuje podobną morfologię, zróżnicowanie naskórka i reakcję biologiczną do innych istniejących modeli komercyjnych. Stanowi alternatywne narzędzie zarówno dla branży farmaceutycznej, jak i dermatokosmetycznej, gdy wymagany jest dostęp do odpowiedniego modelu skóry.

Oświadczenia

Marc Eeman i Benedetta Petracca są pracownikami Dow Silicones Belgium. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach grantu Marie Skłodowska-Curie z umową o grant nr 765602 sfinansował tę pracę. Wszyscy autorzy wyrażają uznanie dla wsparcia Fundacji Adolphe'a Merkle'a i Uniwersytetu w Ferrarze oraz wyrażają wdzięczność dla Dow Silicones Belgium. Dr Miguel Spuch-Calvar jest znany z przygotowania graficznych obrazów procesu uprawy RhE. Autorzy dziękują dr Barbarze Drasler, dr Franco Cervellati i dr Agnès Tessier za wsparcie techniczne i dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma AldrichA6283Zakwasić roztwór eozyny 1 ml kwasu octowego na 100 ml.
Antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy (100x)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15240062
Wodny roztwór eozyny YSigmaAldrich HT110280Zakwasz roztwór eozyny 1 ml kwasu octowego na 100 ml.
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma Aldrich lub MerckC8106 lub 1.02378.0500Przygotować roztwór podstawowy 0,144 M, przefiltrować, sterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Zaleca się przygotowywanie nowych porcji co 6 miesięcy.
DAPIRoche10236276001Przygotuj zapas na 100 μ g / ml i przechowywać porcje w temperaturze -20 & deg;C. Warunki pracy to 1 μ g/ml.
Entellan medium montażoweMerck1.07960.0500Medium montażowe do H& Barwienie E.
Pożywka EpiLife (określana jako pożywka wzrostowa keratynocytów)Thermo Fisher Scientific (Gibco)MEPI500CAZawiera 0,06 mM Ca2+.
Absolutny etanolDowolny dostawcaNie dotyczy
Formalina 10%Leica Biosystems3800770
Suplement na wzrost ludzkich keratynocytów (HKGS) (100x) ThermoFisher Scientific (Gibco)S0015Aby osiągnąć końcowe stężenia 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml ludzkiego rekombinowanego EGF, 0,18 μ g/ml hydrokortyzonu,5 i mu; g/ml transferyny bydlęcej oraz 0,01 i mikro; g/ml ludzkiego rekombinowanego insulinopodobnego czynnika wzrostu-I.
IsopropanolBiosolve B.V.0016264102BS
Żelatyna glicerolowa Kaisera, bez fenoluMerck1.08635.0100Podłoże montażowe do barwienia IF.
Czynnik wzrostu keratynocytów (KGF)R& D Systems251-KG-050Rozpuść białko KGF w 100 μ g/ml w sterylnym 0,1% [w/v] BSA w PBS. Przygotuj porcje i przechowuj w temperaturze -20°C. 
Zestaw do oznaczania dehydrogenazy mleczanowej (LDH)Roche4744926001
2-fosforan soli seskwimagnezowej kwasu L-askorbinowego hydrat  Sigma-AldrichA8960Przygotować roztwór podstawowy 25 mg/ml, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20& stopni C. Zaleca się przygotowywanie nowych porcji co 6 miesięcy. Przechowywać w ciemności.
Lipopolisacharyd (LPS), szczep E.coli O55:B5Sigma-AldrichL4524Przygotować zapas 1 mg/ml w sterylnym PBS i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Stężenie robocze wynosi 100  �; g/ml. 
Mayer' powiedział: s HematoksylinaSigma-AldrichMHS80
Normalne ludzkie keratynocyty naskórkowe (NHEK)Lonza00192906Ludzkie pierwotne keratynocyty wyizolowane z napletka noworodka, zebrane od co najmniej trzech dawców.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo Fisher Scientific (Gibco)10010056 lub 10010-015Numery referencyjne mogą się różnić w zależności od kraju.
Rekombinowany czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α)ImmunoTools11344483Przygotuj zapas 100 μ g/ml w sterylnej ultraczystej wodzie. Stężenie robocze wynosi 40 ng / ml
Sterylna ultraczysta wodaDowolny dostawcaNie dotyczy
Niebieski bromek tetrazolowy tiazolylu (MTT)Sigma-AldrichM5655Przygotuj zapas 5 mg/ml MTT w sterylnym PBS. Stężenie robocze wynosi 1 mg/ml.
Triton X-100Sigma-Aldrich93426
Trypan niebieski (0.4% [v/v])Dowolny dostawcaNie dotyczy
Inhibitor trypsynyThermo Fisher Scientific (Gibco)R007100
Trypsyna/EDTA (0,05% [v/v])Thermo Fisher Scientific (Gibco)25300054
Tween 20Sigma-AldrichP1379
KsylenSigma-Aldrich214736
Kozia Anty-Mysia IgG H& L (Alexa Fluor 488)AbcamAb150113
Cytrynian trisodu dwuwodnyMerck1.06448.0500Do buforu do odzyskiwania antygenu do barwienia IF. 
Kozia Anty-Królicza IgG H& L (Dylight 488)AgriseraAS09 633
Filaggrin Przeciwciało myszyBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-53243
Involucrin Rabbit przeciwciałoBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-33742
Keratyna 10 Mysie przeciwciałoBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-32962
Desmoglein-1 Przeciwciało mysie BioTechne (Novus Biologicals)MAB944
Przeciwciało królika LoricrinBioTechne (Novus Biologicals)NBP1-33610

Bibliografia

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Antioxidants & Redox Signaling. , (2002).
  2. Pouillot, A., Dayan, N., Polla, A. S., Polla, L. L., Polla, B. S. The stratum corneum: a double paradox. Journal of Cosmetic Dermatology. 7 (2), 143-148 (2008).
  3. Moore, K. L., Dalley, A. F. Clinically Orientated Anatomy. , (2010).
  4. Barthel, R., Aberdam, D. Epidermal stem cells. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 19 (4), 405-413 (2005).
  5. Green, K. J., Simpson, C. L. Desmosomes: new perspectives on a classic. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2499-2515 (2007).
  6. Feingold, K. R. Lamellar bodies: the key to cutaneous barrier function. Journal of Investigative Dermatology. 132 (8), 1951-1953 (2012).
  7. Elias, M. P., Feingold, K. R., Fartasch, M. The epidermal lamellar body as a multifunctional secretory organelle. Skin Barrier. , 261-272 (2006).
  8. Tobin, D. J. Biochemistry of human skin-our brain on the outside. Chemical society reviews. 35 (1), 52-67 (2006).
  9. Bouwstra, J. A., Ponec, M. The skin barrier in healthy and diseased state. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1758 (12), 2080-2095 (2006).
  10. Weinstein, G. D., McCullough, J. L., Ross, P. Cell proliferation in normal epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 623-628 (1984).
  11. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'être" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  12. Suter, M. M., et al. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Veterinary Dermatology. 20 (5-6), 515-532 (2009).
  13. McLafferty, E., Hendry, C. The integumentary system: anatomy, physiology and function of skin. Nursing Standard. 27 (7), 35-43 (2012).
  14. Monteiro-Riviere, N. A. Toxicology of the skin. , (2010).
  15. Dellambra, E., Odorisio, T., D'Arcangelo, D., Failla, C. M., Facchiano, A. Non-animal models in dermatological research. ALTEX. 36 (2), 177-202 (2019).
  16. Gordon, S., et al. Non-animal models of epithelial barriers (skin, intestine and lung) in research, industrial applications and regulatory toxicology. Altex. 32 (4), 327-378 (2015).
  17. Kandárová, H., et al. The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests - An assessment of the performance of the optimised test. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 33 (4), 351-367 (2005).
  18. Kandárová, H., et al. Assessment of the skin irritation potential of chemicals by using the SkinEthic reconstructed human epidermal model and the common skin irritation protocol evaluated in the ECVAM skin irritation validation study. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 34 (4), 393-406 (2006).
  19. OECD. Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. , (2019).
  20. Alépée, N., Grandidier, M. H., Cotovio, J. Sub-categorisation of skin corrosive chemicals by the EpiSkinTM reconstructed human epidermis skin corrosion test method according to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicology in Vitro. 28 (2), 131-145 (2014).
  21. OECD. Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. , (2019).
  22. Mehling, A., et al. In vitro RHE skin sensitisation assays: applicability to challenging substances. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 108, 104473(2019).
  23. SENS-IS | EURL ECVAM - TSAR. , Available from: https://tsar.jrc.ec.europa.eu/test-method/tm2011-11 (2020).
  24. Lelièvre, D., et al. The episkin phototoxicity assay (EPA): development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency. Toxicology in Vitro. 21 (6), 977-995 (2007).
  25. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  26. Pellevoisin, C., Bouez, C., Cotovio, J. Cosmetic industry requirements regarding skin models for cosmetic testing. Skin Tissue Models. , 3-37 (2018).
  27. Niehues, H., et al. 3D skin models for 3R research: the potential of 3D reconstructed skin models to study skin barrier function. Experimental Dermatology. 27 (5), 501-511 (2018).
  28. Netzlaff, F., Lehr, C. -M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin®, SkinEthic® and EpiDerm®: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 167-178 (2005).
  29. Prieux, R., Eeman, M., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G. Mimicking cigarette smoke exposure to assess cutaneous toxicity. Toxicology in Vitro. 62, 104664(2020).
  30. Petracca, B., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G., Eeman, M. Bench approaches to study the detrimental cutaneous impact of troposperic ozone. Journal of Exposure Science and Environmental Epidemiology. 31, 137-148 (2021).
  31. Dijkhoff, I. M., et al. Impact of airborne particulate matter on skin: a systematic review from epidemiology to in vitro studies. Particle and fibre toxicology. 17 (1), 35(2020).
  32. El Ghalbzouri, A., Siamari, R., Willemze, R., Ponec, M. Leiden reconstructed human epidermal model as a tool for the evaluation of the skin corrosion and irritation potential according to the ECVAM guidelines. Toxicology in Vitro. 22 (5), 1311-1320 (2008).
  33. Chacón, M., et al. Development of an in-house reconstructed human epidermis model as an alternative method in skin corrosion assessment. Toxicology in Vitro. 65, 104779(2020).
  34. Pedrosa, T. doN., et al. A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicology in Vitro. 42, 31-37 (2017).
  35. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838(2017).
  36. Poumay, Y., Coquette, A. Modelling the human epidermis in vitro: tools for basic and applied research. Archives of dermatological research. 298 (8), 361-369 (2007).
  37. Rikken, G., Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Organotypic 3D skin models: human epidermal equivalent cultures from primary keratinocytes and immortalized keratinocyte cell lines. Methods in Molecular Biology. 2154, 45-61 (2020).
  38. Duval, C., et al. Human skin model containing melanocytes: essential role of keratinocyte growth factor for constitutive pigmentation-functional response to α-melanocyte stimulating hormone and forskolin. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (12), 947-957 (2012).
  39. Hutter, V., Kirton, S. B., Chau, D. Y. S. Immunocompetent human in vitro skin models. Skin Tissue Models. , 353-373 (2018).
  40. Kinsner, A., Lesiak-Cyganowska, E., Śladowski, D. In vitro reconstruction of full thickness human skin on a composite collagen material. Cell and Tissue Banking. 2 (3), 165-171 (2001).
  41. Black, A. F., Bouez, C., Perrier, E., Schlotmann, K., Chapuis, F., Damour, O. Optimization and characterization of an engineered human skin equivalent. Tissue Engineering. 11 (5-6), 723-733 (2005).
  42. Reijnders, C. M. A., et al. Development of a full-thickness human skin equivalent in vitro model derived from TERT-immortalized keratinocytes and fibroblasts. Tissue Engineering. Part A. 21 (17-18), 2448-2459 (2015).
  43. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 352-366 (2011).
  44. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  45. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. 3D cell printing of perfusable vascularized human skin equivalent composed of epidermis, dermis, and hypodermis for better structural recapitulation of native skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019(2019).
  46. Pittelkow, M. R., Scott, R. E. New techniques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and perspectives on their use for grafting of patients with extensive burns. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 771-777 (1986).
  47. Elias, P. M., Ahn, S. K., Brown, B. E., Crumrine, D., Feingold, K. R. Origin of the epidermal calcium gradient: regulation by barrier status and role of active vs passive mechanisms. Journal of Investigative Dermatology. 119 (6), 1269-1274 (2002).
  48. Elias, P. M., et al. Modulations in epidermal calcium regulate the expression of differentiation-specific markers. Journal of Investigative Dermatology. 119 (5), 1128-1136 (2002).
  49. Lee, S. E., Lee, S. H. Skin barrier and calcium. Annals of Dermatology. 30 (3), 265-275 (2018).
  50. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  51. Poumay, Y., et al. A simple reconstructed human epidermis: preparation of the culture model and utilization in in vitro studies. Archives of Dermatological Research. 296 (5), 203-211 (2004).
  52. Ponec, M., et al. The formation of competent barrier lipids in reconstructed human epidermis requires the presence of vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  53. Savini, I., et al. Characterization of keratinocyte differentiation induced by ascorbic acid: Protein kinase C involvement and vitamin C homeostasis. Journal of Investigative Dermatology. 118 (2), 372-379 (2002).
  54. Pasonen-Seppänen, S., et al. Vitamin C enhances differentiation of a continuous keratinocyte cell line (REK) into epidermis with normal stratum corneum ultrastructure and functional permeability barrier. Histochemistry and Cell Biology. 116 (4), 287-297 (2001).
  55. Beer, H. D., et al. Expression and function of keratinocyte growth factor and activin in skin morphogenesis and cutaneous wound repair. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 34-39 (2000).
  56. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of structural biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  57. Rice, R. H., Thacher, S. M. Involucrin: a constituent of cross-linked envelopes and marker of squamous maturation. Biology of the Integument. , 752-761 (1986).
  58. Elias, P. M., Barrier Feingold, K. R. Skin Barrier. , (2011).
  59. Marionnet, C., et al. Morphogenesis of dermal-epidermal junction in a model of reconstructed skin: beneficial effects of vitamin C. Experimental Dermatology. 15 (8), 625-633 (2006).
  60. Frikke-Schmidt, H., Lykkesfeldt, J. Keeping the intracellular vitamin C at a physiologically relevant level in endothelial cell culture. Analytical Biochemistry. 397 (1), 135-137 (2010).
  61. Castro-Muñozledo, F., Hernández-Quintero, M., Marsch-Moreno, M., Kuri-Harcuch, W. Cultivation, serial transfer, and differentiation of epidermal keratinocytes in serum-free medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 236 (1), 167-172 (1997).
  62. De Vuyst, E., et al. Reconstruction of normal and pathological human epidermis on polycarbonate filter. Epidermal Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 191-201 (2013).
  63. Chen, R. H., Zhu, J., Zhang, R. Z., Wang, S. Y., Li, Y. The tolerance of human epidermal cells to trypsinization in vitro. Cell and Tissue Banking. 21 (2), 257-264 (2020).
  64. Pohanish, R. P. Sittig's Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and Carcinogens. 2, (2012).
  65. Tsaousis, K. T., et al. Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clinical and Experimental Ophthalmology. 41 (5), 484-490 (2013).
  66. Kim, S. I., et al. Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters. Analytical Biochemistry. 492, 8-12 (2016).
  67. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  68. Fartasch, M., Ponec, M. Improved barrier structure formation in air-exposed human keratinocyte culture systems. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 366-374 (1994).
  69. Bouwstra, J. A., Honeywell-Nguyen, P. L., Gooris, G. S., Ponec, M. Structure of the skin barrier and its modulation by vesicular formulations. Progress in Lipid Research. 42 (1), 1-36 (2003).
  70. Ponec, M., Boelsma, E., Gibbs, S., Mommaas, M. Characterization of reconstructed skin models. Skin Pharmacology and Physiology. 15 (1), 4-17 (2002).
  71. Hubaux, R., Wauters, A., Chrétien, A., Poumay, Y., Salmon, M. Reconstructed human epidermis response to urban particulate matter activates multiple stress-related pathways and impacts the skin barrier function. 23th IFSCC Conference. , 125-134 (2017).
  72. Lin, Y. -C., et al. Testing method development and validation for in vitro skin irritation testing (SIT) by using reconstructed human epidermis (RhE) skin equivalent - EPiTRI®. Alternatives to Animal Testing. , 8-19 (2019).
  73. Alexander, F. A., Eggert, S., Wiest, J. Skin-on-a-chip: Transepithelial electrical resistance and extracellular acidification measurements through an automated air-liquid interface. Genes. 9 (2), 114(2018).
  74. van den Bogaard, E., et al. Perspective and consensus opinion: good practices for using organotypic skin and epidermal equivalents in experimental dermatology research. Journal of Investigative Dermatology. 141 (1), 203-205 (2021).
  75. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An in vitro skin irritation test (SIT) using the EpiDerm reconstructed human epidermal (RHE) model. Journal of Visualized Experiments. (29), e1366(2009).
  76. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical pharmacology advances and applications. 8, 163-176 (2016).
  77. De Wever, B., Kurdykowski, S., Descargues, P. Human skin models for research applications in pharmacology and toxicology: introducing nativeSkin, the "missing link" bridging cell culture and/or reconstructed skin models and human clinical testing. Applied In Vitro Toxicology. 1 (1), 26-32 (2015).
  78. Klicks, J., von Molitor, E., Ertongur-Fauth, T., Rudolf, R., Hafner, M. In vitro skin three-dimensional models and their applications. Journal of Cellular Biotechnology. 3 (1), 21-39 (2017).
  79. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 22 (12), 695-705 (1986).
  80. Johansen, C. Generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Journal of Visualized Experiments. (130), e56863(2017).
  81. Boelsma, E., Verhoeven, M. C. H., Ponec, M. Reconstruction of a human skin equivalent using a spontaneously transformed keratinocyte cell line (HaCaT). Journal of Investigative Dermatology. 112 (4), 489-498 (1999).
  82. Zhao, X., et al. Photocrosslinkable gelatin hydrogel for epidermal tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (1), 108-118 (2016).
  83. Peura, M., et al. Paracrine factors from fibroblast aggregates in a fibrin-matrix carrier enhance keratinocyte viability and migration. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (2), 658-664 (2010).
  84. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCat keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology. 112 (3), 343-353 (1999).
  85. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue engineering. Part C, Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  86. Alameda, J. P., et al. IKKα regulates the stratification and differentiation of the epidermis: Implications for skin cancer development. Oncotarget. 7 (47), 76779-76792 (2016).
  87. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology and Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  88. Staiano-Coico, L., et al. Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing. Journal of Experimental Medicine. 178 (3), 865-878 (1993).
  89. Egelrud, T. Desquamation in the stratum corneum. Acta Dermato-Venereologica. 80, Supp 208 44-45 (2000).
  90. Jean, J., Lapointe, M., Soucy, J., Pouliot, R. Development of an in vitro psoriatic skin model by tissue engineering. Journal of Dermatological Science. 53 (1), 19-25 (2009).
  91. Lotte, C., Patouillet, C., Zanini, M., Messager, A., Roguet, R. Permeation and skin absorption: reproducibility of various industrial reconstructed human skin models. Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 15, Suppl 1 18-30 (2002).
  92. Ponec, M., Weerheim, A., Lankhorst, P., Wertz, P. New acylceramide in native and reconstructed epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 581-588 (2003).
  93. Thakoersing, V. S., et al. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  94. Thakoersing, V. S., et al. presence of monounsaturated fatty acids in the stratum corneum of human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  95. Van Smeden, J., et al. Combined LC/MS-platform for analysis of all major stratum corneum lipids, and the profiling of skin substitutes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (1), 70-79 (2014).
  96. Mieremet, A., et al. Human skin equivalents cultured under hypoxia display enhanced epidermal morphogenesis and lipid barrier formation. Scientific Reports. 9 (1), 7811(2019).
  97. Mieremet, A., et al. Unravelling effects of relative humidity on lipid barrier formation in human skin equivalents. Archives of Dermatological Research. 311 (9), 679-689 (2019).
  98. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., Van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by Chitosan modulated dermal matrices. PLoS ONE. 12 (3), 0174478(2017).
  99. Mieremet, A., et al. Contribution of palmitic acid to epidermal morphogenesis and lipid barrier formation in human skin equivalents. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6069(2019).
  100. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal fifferentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  101. De Vuyst, E., Salmon, M., Evrard, C., Lambert de Rouvroit, C., Poumay, Y. Atopic dermatitis studies through in vitro models. Frontiers in Medicine. 4, 119(2017).
  102. Danso, M. O., et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 134 (7), 1941-1950 (2014).
  103. Soboleva, A. G., Mezentsev, A., Zolotorenko, A., Bruskin, S., Pirusian, E. Three-dimensional skin models of psoriasis. Cells Tissues Organs. 199 (5-6), 301-310 (2014).
  104. Desmet, E., Ramadhas, A., Lambert, J., Gele, M. Van In vitro psoriasis models with focus on reconstructed skin models as promising tools in psoriasis research. Experimental Biology and Medicine. 242 (11), 1158-1169 (2017).
  105. Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Past, present and future of in vitro 3D reconstructed inflammatory skin models to study psoriasis. Experimental Dermatology. 27 (5), 512-519 (2018).
  106. Pendaries, V., et al. Knockdown of filaggrin in a three-dimensional reconstructed human epidermis impairs keratinocyte differentiation. Journal of Investigative Dermatology. 134 (12), 2938-2946 (2014).
  107. Niehues, H., et al. Epidermal equivalents of filaggrin null keratinocytes do not show impaired skin barrier function. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (6), 1979-1981 (2017).
  108. Reuter, C., Walles, H., Groeber, F. Preparation of a three-dimensional full thickness skin equivalent. Methods in Molecular Biology. 1612, 191-198 (2017).
  109. Bataillon, M., et al. Characterization of a new reconstructed full thickness skin model, t-skinTM, and its application for investigations of anti-aging compounds. International Journal of Molecular Sciences. 20 (9), 2240(2019).
  110. Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding. Journal of Visualized Experiments. (96), e52576(2015).
  111. Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. Journal of Visualized Experiments. (54), e2937(2011).
  112. Müller, I., Kulms, D. A 3D organotypic melanoma spheroid skin model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57500(2018).
  113. Wei, Z., et al. Two-dimensional cellular and three-dimensional bio-printed skin models to screen topical-use compounds for irritation potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 109(2020).
  114. Derr, K., et al. Fully three-dimensional bioprinted skin equivalent constructs with validated morphology and barrier function. Tissue Engineering - Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  115. Frankart, A., et al. Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface. Experimental Dermatology. 21 (11), 871-875 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neonatalne keratynocytygranica powietrze ciecztransepithelialna oporno elektrycznaanaliza immunofluorescencyjnamarkery r nicowania nask rkaocena funkcji barierowejpomiar uwalniania cytokintr jwymiarowy model sk ryprotok hodowli in vitro

Powiązane artykuły