Artykuł metodologiczny

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

15K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61802

⸱

28 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg, 2Dow Silicones Belgium SRL, 3Department of Biomedical and Specialist Surgical Sciences, University of Ferrara, 4Department of Animal Sciences, Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Streszczenie

Przedstawiono trójwymiarowy model ludzkiego naskórka zrekonstruowany z pierwotnych keratynocytów noworodków. W tym artykule opisano protokół procesu uprawy i charakterystykę modelu. Keratynocyty pierwotne noworodków są hodowane zanurzone w przepuszczalnych wkładkach poliwęglanowych i przenoszone do granicy faz powietrze-ciecz trzy dni po wysianiu. Po czternastu dniach stymulacji zdefiniowanymi czynnikami wzrostu i kwasem askorbinowym w pożywce o wysokiej zawartości wapnia, model jest w pełni zróżnicowany. Analiza histologiczna wykazała całkowicie rozwarstwiony naskórek, naśladujący morfologię rodzimej ludzkiej skóry. Aby scharakteryzować model i jego funkcje barierowe, za pomocą immunofluorescencji oceniano poziomy białek i lokalizację specyficzne dla różnicowania keratynocytów we wczesnym stadium (tj. keratyny 10), różnicowania w późnym stadium (tj. inwolukryny, lorykryny i filagryny) oraz adhezji tkanek (tj. desmogleiny 1). Integralność bariery tkankowej poddano dalszej ocenie poprzez pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego. R econstructed human epidermus reagował na bodźce prozapalne (tj. lipopolisacharyd i czynnik martwicy nowotworu alfa), co prowadziło do zwiększonego uwalniania cytokin (tj. interleukiny 1 alfa i interleukiny 8). Protokół ten stanowi prostą i powtarzalną metodę in vitro do kultywowania zrekonstruowany ludzki naskórek jako narzędzie do oceny skutków środowiskowych i szeroki zakres badań związanych ze skórą.

Wprowadzenie

Naskórek jest najbardziej zewnętrzną warstwą skóry, na bezpośrednim styku między ciałem ludzkim a środowiskiem zewnętrznym. Jego główne funkcje to ochrona i nawilżenie1. Naskórek działa jak skuteczna bariera fizyczna przed czynnikami zewnętrznymi i zapobiega nadmiernej utracie wody z organizmu. Te funkcje skóry zależą głównie od układu komórkowego w najbardziej zewnętrznych warstwach skóry, składu i organizacji lipidów międzykomórkowych2. Naskórek składa się przede wszystkim z keratynocytów, które migrują w górę na zewnętrzną stronę tkanki i ulegają różnicowaniu. Istnieje 4-5 warstw naskórka, które charakteryzują się stopniem różnicowania. Od wewnątrz na zewnątrz warstwy naskórka zaczynają się od żywotnego naskórka, tj. warstwy podstawowej (SB), warstwy kolczastej (SS) i warstwy ziarnistej (SG), do nieżywotnej warstwy najwyższej, tj. warstwy rogowej naskórka (SC)3. Warstwa podstawowa składa się głównie z proliferujących keratynocytów wzbogaconych w keratynę, które migrują przez SS po różnicowaniu4. Podczas dojrzewania keratynocytów zachodzą różne zmiany w ekspresji i strukturze białek. Keratynocyty przylegają poprzez tworzenie połączeń desmosomalnych5. W SG inicjowane jest wytwarzanie korpusów płytkowych. Składają się z prekursorów lipidów i enzymów, które są kluczowe dla tworzenia funkcji bariery skórnej6. SG charakteryzuje się również obecnością granulek keratohialiny w cytoplazmie keratynocytów. Na styku z SC zawartość ciał blaszkowatych jest wytłaczana do przestrzeni międzykomórkowych, a niepolarne lipidy, takie jak ceramidy, cholesterol i wolne kwasy tłuszczowe, organizują się w ułożone w stos blaszkowate dwuwarstwy lipidowe, tworząc zewnątrzkomórkową matrycę lipidową7. W SC komórki tracą wszystkie organelle komórkowe, w tym jądro, w wyniku enzymatycznych procesów degradacji i przyjmują spłaszczoną morfologię. Są one otoczone zrogowaciałą otoczką utworzoną z usieciowanych warstw białka i są określane jako korneocyty8, 9. Składniki desmosomalne są usieciowane z rogową otoczką, tworząc korneodesmosomy i wiążąc ze sobą korneocyty. Powstały w ten sposób nabłonek jest stale odnawiany z komórek macierzystych, a czas obrotu wynosi około 5-6 tygodni10. Proces różnicowania keratynocytów, w wyniku którego powstaje w pełni rozwarstwiony naskórek, ma kluczowe znaczenie dla tworzenia funkcji barierowej skóry11.

Podczas zranień i stanów zapalnych, keratynocyty wywołują zmiany w cząsteczkach adhezyjnych i receptorach powierzchniowych oraz wywołują reakcje prozapalne poprzez wydzielanie cytokin, chemokin i peptydów przeciwdrobnoustrojowych12. Skóra stanowi nie tylko fizyczną barierę przed substancjami egzogennymi; Działa również jako czujnik immunologiczny po ekspozycji na patogeny. Ponadto reguluje dyfuzję kilku substancji w swoich warstwach, takich jak zawartość wody, aby chronić organizm ludzki przed odwodnieniem. Skóra bierze również udział w syntezie witaminy D i pełni różne inne funkcje metaboliczne3, 13, 14.

Aby ocenić niekorzystne skutki substancji egzogennych, toksykolodzy od dziesięcioleci polegają na testach na zwierzętach, ale obecnie nie jest to preferowane podejście. Oprócz ograniczonej zdolności przewidywania toksyczności dla ludzi, modele zwierzęce wiążą się z licznymi kwestiami etycznymi. Zakaz testowania na zwierzętach w przemyśle kosmetycznym oraz zalecenie przestrzegania zasady 3R (tj. Replacement, Reduction, and Refinement) w badaniach doprowadziły do opracowania alternatywnych metod badawczych opartych na podejściach in vitro15. Pierwsze modele komórek skóry in vitro zostały już opisane w latach 90-tych, a imponujący rozwój od prostych ludzkich monokultur keratynocytów do w pełni zróżnicowanych modeli naskórka i pełnej grubości został osiągnięty16. W dzisiejszych czasach inżynieria tkanki skórnej zyskała na znaczeniu zarówno w dziedzinie farmacji, jak i dermatokosmetyki. W ciągu ostatnich dwóch dekad kilka firm skomercjalizowało trójwymiarowe (3D) zrekonstruowane ludzkie naskórek (RhE), które stanowią ustandaryzowane i powtarzalne narzędzia do badań związanych ze skórą. Kilka komercyjnych modeli RhE jest akceptowanych do badań skórnych in vitro substancji chemicznych zgodnie z wytycznymi OECD dotyczącymi badania działania drażniącego na skórę17, 18 (tj. wytyczne dotyczące badań 43919) i działania na skórę20 (tj. wytyczne dotyczące badań 43121). Test in vitro pod kątem działania uczulającego na skórę22 (tj. test SENS-IS) jest obecnie w trakcie zatwierdzania i recenzowania23. Opracowano również wiele innych testów, które wykorzystują komercyjne modele RhE do oceny fototoksyczności24, do testowania preparatów leków25, preparatów kosmetycznych i składników aktywnych26, do badania funkcji bariery skórnej27 oraz do testowania biologicznej odpowiedzi na stresory środowiskowe28,29,30,31.

Oprócz dostępnych na rynku modeli skórek 3D, wiele grup badawczych opracowało własne RhEs32,33,34,35,36,37. Wewnętrzne RhE oferują przewagę w kontrolowaniu warunków hodowli zgodnie z celem badania. W szczególności naukowcy mogą wybrać rodzaj i źródło keratynocytów, które zostaną użyte do odtworzenia ich modelu naskórka 3D (tj. pierwotne vs. unieśmiertelnione, noworodki vs. stare, pojedynczych vs. pula losowych dawców, płeć, pochodzenie etniczne, indywidualne nawyki życiowe, takie jak palenie itp.). Mają one możliwość zmiany składu pożywki hodowlanej i włączenia czynników wzrostu, witamin lub innych związków, które mogą modulować ekspresję docelowych białek lub lipidów. Dzięki własnym RhE naukowcy mogą również badać reakcje biologiczne i właściwości biomechaniczne w funkcji stanu różnicowania modelu 3D. Oprócz tych intuicyjnych parametrów podejmowane są ciągłe wysiłki w celu zwiększenia złożoności modeli skóry 3D i uczynienia ich bardziej istotnymi fizjologicznie, na przykład poprzez dodanie innych typów komórek naskórka (np. melanocytów i komórek odpornościowych)38, 39, poprzez hodowlę keratynocytów na powierzchni macierzy kolagenowej wypełnionej fibroblastami40,41,42oraz poprzez uwzględnienie składników sieci naczyniowej43,44,45.

Chociaż możliwe jest dostosowanie warunków hodowli do konkretnych potrzeb, istnieją parametry, które muszą być przestrzegane, aby zagwarantować zarówno jakość, jak i przydatność RhE. Aby wyhodować tkanki RhE, normalne ludzkie keratynocyty naskórka (NHEK) są wysiewane do specyficznych przepuszczalnych wkładek hodowlanych, których porowata syntetyczna membrana dzieli studzienki na dwa przedziały, tj. Przedział wierzchołkowy i podstawno-boczny. Porowatość błony (tj. wielkość porów 0,4 μm) jest taka, że umożliwia tworzenie monowarstwy komórek w przedziale wierzchołkowym bez migracji komórek na stronę wkładki podstawnej oraz karmienie keratynocytów niezbędnymi składnikami odżywczymi z pożywki hodowlanej zawartej w przedziale podstawno-bocznym. Na początku procesu rekonstytucji NHEK są hodowane w warunkach zanurzonych przez kilka dni, aby umożliwić ich przyleganie do membrany. Poziom wapnia w obu przedziałach jest zwiększony w porównaniu ze stężeniem wapnia stosowanym w hodowli 2D NHEK, aby spowolnić proliferację komórek i zamiast tego promować ich różnicowanie46. Naskórkowy gradient wapnia jest niezbędny do regulacji tworzenia bariery i homeostazy47, 48. Wysoki poziom wapnia (tj. do 1,5 mM) sprzyja tworzeniu połączeń międzykomórkowych i moduluje tworzenie zrogowaciałej otoczki podczas różnicowania końcowego49. Gdy keratynocyty utworzą ciągłą i ściśle przylegającą monowarstwę na membranie nośnej, pożywka z przedziału wierzchołkowego jest usuwana, a proces hodowli jest kontynuowany na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) w celu stymulacji stratyfikacji i ustanowienia bariery naskórkowej50, 51. Specyficzne warunki hodowli mają kluczowe znaczenie dla uzyskania w pełni stratyfikowanego nabłonka36. Podczas procesu rekonstytucji w ALI pożywka w przedziale podstawno-bocznym jest uzupełniana czynnikiem wzrostu keratynocytów (KGF), insuliną, wapniem i kwasem askorbinowym. Kwas askorbinowy odgrywa główną rolę w tworzeniu odpowiedniej bariery lipidowej SC, bardzo przypominającej barierę rodzimej ludzkiej skóry52. Keratynocyty hodowane w pożywce uzupełnionej kwasem askorbinowym wykazują zróżnicowany fenotyp, ze zwiększoną liczbą granulek keratohialiny, a także zorganizowanymi międzykomórkowymi blaszkami lipidowymi w szczelinach korneocytów52. Taka suplementacja jest niezbędna do poprawy funkcji bariery naskórkowej poprzez zwiększenie zawartości zrogowaciałej otoczki i uniknięcie wyczerpania hydrofilowych zapasów przeciwutleniaczy53, 54. KGF, ważny parakrynny mediator proliferacji i różnicowania naskórka, jest używany do stymulacji NHEKs55.

Główne wady wewnętrznych RhE to utrata standaryzacji między instytucjami badawczymi oraz zwiększona pracochłonność i czasochłonność (do 3 tygodni w porównaniu do gotowych do użycia modeli komercyjnych). Celem niniejszego artykułu jest zaradzenie tym wadom i stworzenie podstaw do produkcji na większą skalę. Oprócz wyżej wymienionych zalet wewnętrznych RhE, obecny protokół ma na celu zmniejszenie zmienności wewnętrznej i krzyżowej między tkankami, zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia oraz usprawnienie procesu hodowli.

Obecny protokół opisuje powtarzalną i solidną metodę hodowli RhE przy użyciu noworodkowych NHEK. Ponadto przedstawiono reprezentatywne wyniki charakterystyki morfologii RhEs, integralności bariery i ekspresji białek specyficznych dla różnicowania naskórka. Strukturę morfologiczną RhEs badano za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Aby ocenić integralność bariery, zmierzono przeznaskórkową oporność elektryczną (TEER) i czas ekspozycji na Triton X-100 w celu zmniejszenia o 50% żywotności tkanek (ET50). Tworzenie połączeń desmosomalnych (tj. desmogleiny 1) analizowano za pomocą immunofluorescencji (IF) w celu oceny adhezji keratynocytów. Tworzenie białek strukturalnych naskórka (tj. inwolukryny, lorykryny i filagryny) oceniano i wykrywano za pomocą IF. Białka te biorą udział w tworzeniu wysoce usieciowanej otoczki białkowej, która otacza korneocyty SC i w rezultacie są ważnymi markerami późnego stadium różnicowania naskórka56, 57. Dodatkowo, IF został wykorzystany do analizy keratyny 10, białka indukowanego we wczesnym stadium różnicowania komórek w klasie SS58 i znajdującego się we wszystkich zróżnicowanych warstwach. Na koniec zbadano odpowiedź RhE na bodźce prozapalne (tj. lipopolisacharyd i czynnik martwicy nowotworu alfa). Poziomy interleukiny 1 alfa (IL-1α) i interleukiny 8 (IL-8) mierzono w pożywkach do hodowli komórkowych za pomocą testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Protokół

Przed zaplanowaniem i przeprowadzeniem jakichkolwiek działań badawczych z wykorzystaniem niniejszego protokołu należy zapoznać się i przestrzegać krajowych oraz międzynarodowych zasad i warunków etycznych dotyczących wykorzystania tkanek lub komórek ludzkich.
UWAGA: Wszystkie etapy niniejszego protokołu muszą być wykonywane w warunkach aseptycznych. Praktyki poziomu biosafety 2 stanowią minimalne wymaganie dla hodowli RhEs. Podczas pracy z chemikaliami/odczynnikami opisanymi w niniejszym protokole należy zachować wszelkie niezbędne środki ostrożności.

1. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowych

UWAGA: Do hodowli RhE stosuje się trzy różne rodzaje bezeserumowych pożywek hodowlanych (Tabela 1): (i) pożywkę podstawową o niskim poziomie wapnia (60 µM Ca2+), stosowaną do hodowli 2D NHEK; (ii) pożywkę do hodowli zanurzonej o wysokim poziomie wapnia (1.5 mM Ca2+), stosowaną do wysiewu NHEK do systemu wkładki do hodowli komórkowej; oraz (iii) pożywkę do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) o wysokim poziomie wapnia (1.5 mM Ca2+), zawierającą kwas askorbinowy oraz czynnik wzrostu keratynocytów (KGF).

PożywkaInformacje o pożywceWymagana ilość
Pożywka podstawowaPożywka do wzrostu keratynocytów36 ml/24 dołki
+ 1% [v/v] HKGS
+ 1% [v/v] 100x antybiotyk-antymykotyk
Podłoże zanurzeniowePożywka do wzrostu keratynocytów36 ml/24 dołki
+ 1% [v/v] HKGS
+ 1% [v/v] 100x antybiotyk-antymykotyk 
+ 1,5 mM Ca2+
Pożywka do hodowli na granicy faz powietrze-cieczPożywka do wzrostu keratynocytów216 ml/24 dołki
+ 1% [v/v] HKGS
+ 1% [v/v] 100x antybiotyk-antymykotyk 
+ 1,5 mM Ca2+
+ 50 µg/mL kwas askorbinowy
+ 10 ng/mL czynnika wzrostu keratynocytów

Tabela 1. Tabela podsumowująca różne pożywki stosowane do hodowli RhEs. Lista różnych pożywek hodowlanych wraz z suplementami.

  1. Przygotuj pożywkę podstawową.
    1. Do butelki zawierającej 500 mL pożywki do wzrostu keratynocytów (Tabela materiałów) dodaj 5 mL suplementów do wzrostu ludzkich keratynocytów (HKGS), aby uzyskać stężenia końcowe: 0,2% [v/v] ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE), 0,2 ng/mL ludzkiego rekombinowanego czynnika wzrostu naskórka (EGF), 0,18 µg/mL hydrokortyzonu, 5 µg/mL transferryny bydlęcej oraz 0,01 µg/mL rekombinowanego ludzkiego insulinopodobnego czynnika wzrostu-I (IGF-I).
    2. Dodaj 5 mL 100x roztworu antybiotyków i przeciwgrzybików zawierającego 10 000 jednostek/mL penicyliny, 10 000 µg/mL streptomycyny oraz 25 µg/mL amfoterycyny B.
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli zanurzonej.
    1. Do butelki zawierającej 500 mL pożywki do wzrostu keratynocytów (Tabela materiałów) dodaj 5 mL HKGS, aby uzyskać stężenia końcowe: 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/mL ludzkiego rekombinowanego EGF, 0,18 µg/mL hydrokortyzonu, 5 µg/mL transferryny bydlęcej oraz 0,01 µg/mL ludzkiego rekombinowanego IGF-I.
    2. Dodaj 5 mL 100x roztworu antybiotyków i przeciwgrzybików.
    3. Dodaj 5 mL roztworu stokowego 0,144 M CaCl2 (chlorku wapnia), aby uzyskać stężenie końcowe 1,5 mM Ca2+.
      UWAGA: Stężenie wapnia jest zwiększone już w fazie zanurzonej, aby stymulować różnicowanie keratynocytów i zainicjować proces stratyfikacji49.
  3. Przygotuj pożywkę do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI).
    1. Do jednej butelki zawierającej 500 mL pożywki do wzrostu keratynocytów (Tabela materiałów) dodaj 5 mL HKGS, aby uzyskać stężenia końcowe: 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/mL ludzkiego rekombinowanego EGF, 0,18 µg/mL hydrokortyzonu, 5 µg/mL transferryny bydlęcej oraz 0,01 µg/mL ludzkiego rekombinowanego IGF-I.
    2. Dodaj 5 mL 100x roztworu antybiotyków i przeciwgrzybików.
    3. Dodaj 5 mL roztworu stokowego 0,144 M CaCl2, aby uzyskać stężenie końcowe 1,5 mM Ca2+.
    4. Dodaj 1 mL roztworu stokowego kwasu askorbinowego o stężeniu 25 mg/mL, aby uzyskać stężenie końcowe 50 µg/mL kwasu askorbinowego.
    5. Dodaj 50 µL roztworu stokowego KGF o stężeniu 100 µg/mL w 1% [w/v] albuminie surowicy bydlęcej w buforze fosforanowym (PBS), aby uzyskać stężenie końcowe 10 ng/mL KGF.
      ​UWAGA: Ponieważ kwas askorbinowy jest podatny na utlenianie, zaleca się stosowanie stabilnej pochodnej kwasu askorbinowego, takiej jak l-askorbylio-2-fosforan magnezu59 lub seskwimagnezja L-askorbianu 2-fosforanu60. W przypadku stosowania kwasu askorbinowego zaleca się świeże uzupełnianie pożywki ALI kwasem askorbinowym przed każdą wymianą medium.

2. Hodowla NHEKs

UWAGA: Ponieważ pierwotne ludzkie keratynocyty zachowują zdolność do proliferacji do czwartego lub piątego pasażu61, do hodowli RhE wykorzystuje się NHEK w trzecim pasażu. Z pierwotnymi keratynocytami należy obchodzić się bardzo ostrożnie ze względu na ich wysoką wrażliwość. Bardzo ważne jest, aby na każdym etapie pipetować zawiesiny komórkowe powoli i z najwyższą starannością, aby nie pogorszyć stanu komórek.

  1. Rozmrozić fiolkę zawierającą 1 x 106 krio konserwowanych NHEKs w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, zanurzając część fiolki w wodzie. Inkubować fiolkę w kąpieli wodnej przez 1-2 minuty, aż pozostanie jedynie niewielki odłamek lodu.
    OSTRZEŻENIE: Aby uniknąć kontaminacji, nie należy zanurzać całej fiolki w kąpieli wodnej. Nie rozmrażać komórek dłużej niż przez 2 minuty; może to obniżyć żywotność komórek. Przed przeniesieniem probówki do komory z laminarnym przepływem powietrza należy przetrzeć fiolkę 70% roztworem etanolu.
  2. Bardzo ostrożnie resuspendować komórki, pipetując je w górę i w dół 2-3 razy. Przenieść zawiesinę komórkową do dwóch kolb T75 zawierających łącznie 15 mL podgrzanego medium do rozmrażania, co pozwoli uzyskać gęstość wysiewu 6.7 x 104 komórek/cm2.
    UWAGA: W przypadku dwóch pierwszych pasażów oraz rozmrażania krio konserwowanych NHEKs stosuje się pożywkę do hodowli komórkowej zgodnie z zaleceniami dostawcy.
  3. Umieścić kolby w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 oraz 95% wilgotności względnej (RH)).
  4. Po około 24 godzinach zastąpić medium do rozmrażania medium podstawowym, aby usunąć dimetylosulfotlenek (DMSO) z roztworu do mrożenia keratynocytów.
  5. Wymieniać medium podstawowe co dwa dni.
  6. Po 4-6 dniach hodowli komórki powinny osiągnąć około 80% konfluencji i być gotowe do wysiewu na wkładki do hodowli RhEs.
    ​UWAGA: Keratynocyty powinny być hodowane do maksymalnie 80% konfluencji, aby zachować ich zdolność do proliferacji62. Liczba rozmrażanych komórek musi uwzględniać kilka parametrów, takich jak numer pasażu komórek, żywotność komórek po rozmrożeniu, wydajność wysiewu oraz czas podwojenia.

3. Wysiew NHEK

UWAGA: Niniejszy protokół został opracowany do stosowania w formacie 24-dołkowej płytki nośnej. W przypadku konieczności zastosowania innych formatów płytek (np. 12- lub 6-dołkowych), należy rozważyć optymalizację gęstości wysiewu oraz objętości medium. Rycina 1 przedstawia proponowany harmonogram hodowli RhE oraz warunki hodowli.

Schemat różnicowania keratynocytów; proces hodowli komórkowej, interfejs powietrze-ciecz, wymiany pożywki.
Rycina 1: Schematyczny harmonogram protokołu rekonstytucji. Przedstawienie przygotowania modelu RhE, procesu hodowli oraz aplikacji (ekspozycji na substancję chemiczną). Schemat obejmuje odpowiednie rodzaje pożywek do hodowli komórkowych dla każdego etapu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wypełnij wcześniej płytki 24-dołkowe 1,5 mL pożywki do hodowli zanurzonej, najlepiej używając pipety dozującej.
  2. Usuń pożywkę podstawową z kolb T75 używanych do hodowli NHEK.
  3. Przepłucz komórki, dodając 5 mL uprzednio ogrzanego PBS do każdej kolby T75.
  4. Usuń PBS z kolb.
    UWAGA: Krok ten jest kluczowy, ponieważ pożywka zawiera białka i wapń, które hamują aktywność trypsyny.
  5. Dodaj 2-3 mL uprzednio ogrzanego 0,05% [v/v] roztworu trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do każdej kolby T75. Upewnij się, że roztwór trypsyny jest równomiernie rozprowadzony na obszarze hodowli komórkowej w kolbie.
    OSTROŻNIE: Objętość 2 mL opiera się na wspomnianej wcześniej 80% konfluencji. W przypadku kolb o wyższej konfluencji użyj 3 mL.
  6. Umieść kolby na 4 minuty w inkubatorze do hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO2 i 95% RH). Sprawdź pod mikroskopem przy powiększeniu 10x, czy komórki się odłączyły. Opukaj kolbę o wnętrze dłoni, aby pomóc komórkom uwolnić się z powierzchni kolby. Odłączone komórki są widoczne jako zaokrąglone komórki pływające w roztworze trypsyny.
    OSTROŻNIE: Nie inkubuj komórek w trypsynie dłużej niż 6 minut. Nadmierna trypsynizacja może uszkodzić komórki i zmniejszyć ich przyleganie63.
  7. Gdy wszystkie komórki zostaną odłączone, dodaj równą objętość (tj. 2-3 mL) uprzednio ogrzanego inhibitora trypsyny do każdej kolby T75.
  8. Przenieś zawiesinę komórkową z kolb do probówki wirówkowej.
  9. Przepłucz kolby 5 mL uprzednio ogrzanego PBS i przenieś go do probówki wirówkowej zawierającej zawiesinę komórkową.
    UWAGA: Upewnij się, że większość komórek została zebrana, sprawdzając liczbę pozostałych komórek w kolbach pod mikroskopem. Powierzchnia kolby powinna być w 95% pusta. Jeśli tak nie jest, można powtórzyć etap trypsynizacji (3.3-3.9). Należy jednak pamiętać, że ponownej trypsynizacji należy unikać.
  10. Wwirowuj zebrane komórki przy 400 x g przez 5 min.
  11. Ostrożnie odlej większość supernatantu, pozostawiając w probówce około 100-200 µL.
    OSTROŻNIE: Podczas tej procedury nie aspiruj osadu komórkowego. 
  12. Delikatnie resuspenduj osad komórek w małej objętości pożywki do hodowli zanurzonej, pipetując w górę i w dół 5-10 razy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową. Zacznij od małej objętości (tj. 500 µL), aby uniknąć tworzenia agregatów komórkowych, i dodaj łącznie do 1 mL pożywki do hodowli zanurzonej na każdą początkową kolbę T75.
    UWAGA: Delikatnie stuknij probówkę palcami, aby ostrożnie rozpuścić część osadu komórkowego w supernatancie.
  13. Policz komórki w zawiesinie metodą wykluczania błękitu trypanu.
    1. Rozcieńcz 0,4% [v/v] barwnik błękit trypanu i zawiesinę komórkową w stosunku 1:1, dodając 10 µL 0,4% [v/v] błękitu trypanu do 10 µL zawiesiny komórkowej. Nanieś 10 µL roztworu na szkiełko do liczenia. Zmierz liczbę komórek natychmiast po zmieszaniu zawiesiny komórkowej z błękitem trypanu, ponieważ błękit trypanu zaczyna obniżać żywotność komórek po ekspozycji dłuższej niż 1 min65.
      ​OSTROŻNIE: Wykazano, że błękit trypanu jest potencjalnym mutagenem, kancerogenem i teratogenem64. Należy ostrożnie obchodzić się z barwnikiem i bezpiecznie utylizować odpady zgodnie z lokalnymi przepisami laboratoryjnymi.
      UWAGA: Alternatywą dla stosowania błękitu trypanu jest nietoksyczny barwnik Erytrozyna B66.
  14. Rozcieńcz zawiesinę komórkową dodatkową pożywką do hodowli zanurzonej, aby osiągnąć stężenie 3,525 x 105 komórek/mL w pożywce do hodowli zanurzonej, dodając objętość V2 zgodnie z równaniem 1:
    Równanie rozcieńczenia chemicznego: V2 = C1 * (V1/C2) - V1; formuła, obliczanie stężenia.
    C1 = policzone stężenie komórek w zawiesinie komórkowej uzyskanej w punkcie 3.12 (komórki/mL)
    V1 = objętość użyta do resuspensji osadu komórek w punkcie 3.12 (mL)
    C2 = docelowe stężenie komórek w zawiesinie (tj. 3,525 x 105 komórek/mL)
    V2 = objętość, którą należy dodać, aby osiągnąć docelowe stężenie komórek (mL)
    UWAGA: Powierzchnia zalecanego insertu hodowlanego wynosi 0,47 cm2; zatem odpowiadająca mu gęstość wysiewu to 3,75 x 105 komórek/cm2.
  15. Wykonaj drugie przeliczenie komórek (C3) rozcieńczonego roztworu uzyskanego w kroku 3.14. Użyj równania 2, aby obliczyć objętość zawiesiny komórkowej (V4), która zostanie wysiana do insertu hodowlanego:
    Formuła dzielnika napięcia V4=C3*(V3/C4); równanie do badania analizy obwodów.
    C3 = docelowe stężenie komórek w zawiesinie (tj. 3,525 x 105 komórek/mL)
    V3 = docelowa objętość zawiesiny komórkowej do wysiania w insercie hodowlanym (tj. 0,5 mL)
    C4 = policzone stężenie komórek w rozcieńczonej zawiesinie uzyskanej w punkcie 3.14 (komórki/mL)
    V4 = rzeczywista objętość zawiesiny komórkowej do wysiania w insercie hodowlanym (mL)
  16. Zawieś 24 inserty do hodowli komórkowej w najwyższej pozycji zalecanej płytki nośnej i przenieś płytkę nośną do płytki 24-dołkowej uprzednio wypełnionej pożywką do hodowli zanurzonej (por. 3.1).
    OSTROŻNIE: Podczas przenoszenia płytki nośnej do płytki wielodołkowej upewnij się, że między membraną insertu a pożywką do hodowli zanurzonej w komorze podstawowej nie uwięzły pęcherzyki powietrza, ponieważ wpłynie to na odżywianie komórek i ostatecznie naruszy żywotność i morfologię RhE.
  17. Dodaj wyznaczoną objętość V4 (z równania 2) zawiesiny komórkowej do każdego insertu.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie techniki pipetowania odwrotnego w celu dokładnego dozowania zawiesiny komórkowej do insertów hodowlanych.
    OSTROŻNIE: Upewnij się, że nie uszkodziłeś membrany podczas dozowania zawiesiny komórkowej do insertu hodowlanego. Środkiem ostrożności jest dozowanie zawiesiny komórkowej wzdłuż ścianki systemu insertów bez dotykania powierzchni membrany.
  18. Po wysiewie inkubuj płytki 24-dołkowe przez 10-15 min w temperaturze pokojowej, aby zniwelować efekt brzegowy (tj. nierównomierny rozkład temperatury między wszystkimi dołkami67). Nie przesuwaj płytek w tym czasie.
  19. Przenieś płytki do inkubatora do hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO2 i 95% RH). Komórki są utrzymywane w warunkach zanurzenia przez trzy dni.
    ​UWAGA: Aby uniknąć zmienności tkanek, nie układaj płytek w stosy w inkubatorze po wysiewie, aby upewnić się, że każdy insert otrzymuje taką samą ilość ciepła. Po trzech dniach (tj. podczas hodowli ALI) układanie płytek w stosy jest możliwe.

4. Hodowla na granicy faz powietrze-ciecz

  1. Po trzechdniowej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% RH), poddaj komórki, które przywarły do powierzchni membrany, warunkom ALI poprzez usunięcie medium z komory apikalnej, najlepiej przy użyciu systemu aspiracyjnego i szklanej pipety Pasteura.
    UWAGA: Alternatywnie medium z komory apikalnej można usunąć za pomocą ręcznej mikropipety.
  2. Napełnij nowe płytki 24-dołkowe 1,5 mL świeżego, uprzednio ogrzanego medium ALI i przenieś płytki nośne z insertami hodowlanymi do nowych płytek wielodołkowych.
  3. Przenieś płytki wielodołkowe z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% RH).
  4. Wymieniaj medium ALI co 2-3 dni przez okres 14 dni.
  5. Wymianę przeprowadź w dwóch krokach: 1) przygotuj nową płytkę zawierającą 1,5 mL/dołek świeżego, uprzednio ogrzanego medium ALI i 2) przenieś płytkę nośną do nowej płytki.
    OSTROŻNIE: Podczas całej procedury rekonstytucji najlepiej nie zdejmować pokrywy z płytki nośnej, aby chronić RhE przed potencjalnym zanieczyszczeniem.
    UWAGA: Etap ALI jest kluczowy dla rozwoju warstwowego modelu naskórka, ponieważ umożliwia on różnicowanie końcowe keratynocytów68. Po przejściu na ALI wymagana jest wizualna kontrola insertów w celu sprawdzenia, czy nie występują „przeciekające tkanki”: krople medium na powierzchni tkanki pochodzące z komory bazolateralnej. Jeśli wyciek wystąpi w 3. dniu ALI, delikatnie usuń medium z insertu hodowlanego, nie dotykając powierzchni tkanki. Jeśli wyciek utrzymuje się, zaleca się odrzucenie przeciekających tkanek, ponieważ jest to oznaka braku prawidłowego tworzenia bariery w modelu RhE.
  6. Po zakończeniu procesu rekonstytucji tkanki mogą być poddane działaniu różnych stresorów w celu wywołania np. stresu oksydacyjnego lub stanu zapalnego. Równolegle mogą być traktowane związkami chemicznymi lub składnikami kosmetycznymi. UWAGA: Podczas ekspozycji/traktowania tkanki są zazwyczaj utrzymywane w medium zanurzonym, począwszy od 14. dnia ALI (ALI D14). W przypadku planowanej ekspozycji/traktowania tkanek przez dłuższy czas (tj. 48-72 godziny), zaleca się (i) rozpoczęcie ekspozycji/traktowania wcześniej w procesie hodowli ALI, np. w dniach D7-D9, aby uniknąć cieńczenia warstw żywych i pogrubienia SC oraz (ii) inkubację tkanek w medium ALI, aby nadal stymulować proliferację komórek.
  7. W celu zbioru RhE, pobierz tkanki i medium do hodowli komórkowych w wybranym punkcie czasowym do analizy histologicznej, testów żywotności, ekstrakcji białek/RNA oraz testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Wyniki

NHEK hodowane w 2D wykazują tradycyjną morfologię o spójnym wielobocznym kształcie (Rysunek 2A). Jak opisano powyżej, NHEK są wysiewane do insertów hodowlanych po osiągnięciu konfluencji na poziomie około 80%. Morfologię RhE analizowano przy użyciu barwienia H&E oraz TEM. Po 15 dniach w warunkach ALI uzyskuje się w pełni zróżnicowaną tkankę, na co wskazuje obecność czterech głównych warstw naskórka: SB, SS, SG i SC (Rysunek 2B). W warstwie SB komórki mają kształt kolumnowy. Od drugiej warstwy w górę RhE, NHEK ulegają różnicowaniu, co obserwuje się poprzez zmiany w morfologii komórek (od kształtu kolumnowego w warstwie SB w stronę kształtu kolczystego w warstwie SS). W warstwie SG komórki mają bardziej spłaszczony kształt i wykazują obecność ziarn keratohialinowych (KG), które są reprezentowane jako fioletowe kropki w cytoplazmie. Ich charakterystyczny okrągły i gwieździsty kształt został zaznaczony białymi strzałkami na obrazie H&E (Rysunek 2C). Komórki w warstwie SC są terminalnie zróżnicowane, całkowicie spłaszczone i pozbawione jądra komórkowego. Zróżnicowane RhE mają całkowitą grubość 84,3 ± 2,4 µm, a ich warstwa SC ma grubość 19,6 ± 3,2 µm (Rysunek 2D). Wartości te są porównywalne z wartościami raportowanymi dla natywnej skóry ludzkiej, tj. odpowiednio 60-120 µm i 10-20 µm69. Liczba warstw żywych wynosi 6-7, co jest wartością niższą w porównaniu do natywnej skóry ludzkiej, gdzie wynosi ona około 7-1470. Analiza ultrastrukturalna RhE w różnych punktach czasowych protokołu rekonstrukcji (tj. 7, 10, 13 i 15 dni) ujawnia proces cornifikacji RhE z rosnącą liczbą warstw korneocytów w czasie (Rysunek 2E). Po 15 dniach w warunkach ALI warstwa SC tkanki RhE składa się z około 15-25 warstw, co jest porównywalne z wartością raportowaną dla natywnej skóry ludzkiej (tj. 15-20 warstw)69.

Analiza histologiczna i mikroskopowa, tkanka nabłonkowa i fazy wzrostu, wykres słupkowy porównania grubości.
Rycina 2: Pierwotne keratynocyty i zrekonstruowany ludzki naskórek. (A) Obraz mikroskopii kontrastowej pierwotnych keratynocytów przed wysianiem na wkłady. Pasek skali to 50 µm. (B-C) Obraz mikroskopii w polu jasnym RhE barwiony H&E. Pasek skali to 50 µm (B) i 25 µm (C). (D) Ilościowe oznaczenie grubości RhE i SC (średnia ± SEM, n=3). (E) Obrazy transmisyjnej mikroskopii elektronowej przekrojów poprzecznych RhE po 7, 10, 13 i 15 dniach w warunkach ALI. Pasek skali to 4 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

NHEK hodowane w 3D wykazują różne profile ekspresji białek w zależności od stopnia różnicowania. Ekspresję białek specyficznych dla wczesnego etapu różnicowania keratynocytów (tj. keratyny 10), późnego etapu różnicowania keratynocytów (tj. inwolukryny, lorykryny i filagryny) oraz adhezji keratynocytów (tj. desmogleiny 1) w RhE określono za pomocą barwienia IF. Ekspresja inwolukryny wydaje się być zlokalizowana głównie w warstwie SG, ponieważ jej ekspresja rozpoczyna się wcześniej w procesie różnicowania (Ryc. 3D), podczas gdy filagryna i lorykryna są eksponowane w warstwach górnych (Ryc. 3B-C). Ekspresję keratyny 10 stwierdzono we wszystkich warstwach żywych, z wyjątkiem warstwy SB (Ryc. 3E). RhE wykazują funkcjonalne złącza desmosomalne, co wskazuje ekspresja desmogleiny 1 w przestrzeniach międzykomórkowych żywych warstw naskórka (Ryc. 3F>). Podsumowując, wszystkie pięć markerów jest eksponowanych i zlokalizowanych w odpowiednich warstwach naskórka, co świadczy o prawidłowym procesie różnicowania naskórka.

Obrazy histologiczne i immunofluorescencyjne przedstawiające warstwy tkanki skóry, z zaznaczonymi markerami białkowymi.
Rycina 3: Różnicowanie naskórka, adhezja tkankowa i integralność tkanki zrekonstruowanego ludzkiego naskórka. (A) Obraz mikroskopii świetlnej RhE barwiony H&E. Obrazy konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej dla (B) filagryny (FLG), (C) lorykryny (LOR), (D) inwolukryny (INV), (E) keratyny 10 (K10) oraz (F) desmogleiny 1 (DSG-1) przedstawionych w kolorze purpurowym. Barwienie jąder (DAPI) przedstawiono w kolorze niebieskim. Pasek skali wynosi 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Właściwości barierowe modelu RhE zbadano poprzez ocenę zarówno żywotności, jak i integralności tkanki. Integralność tkanki określono po 15 dniach, mierząc TEER za pomocą woltomierza. Wartości 2567 ± 415 Ω.cm2 zarejestrowane dla RhE świadczą o powstaniu ciągłej bariery (Rysunek 4A). Wartości te są zgodne z wynikami raportowanymi dla modeli RhE71,72,73,74. Dodatkowo, za pomocą testu MTT (thiazolyl blue tetrazolium bromide), wyznaczono czas ekspozycji na cytotoksyczną substancję referencyjną (tzn. Triton X-100) wymagany do zmniejszenia żywotności tkanki o 50% (ET50). Wartość ET50 zmierzona dla RhE wyniosła 2,1 godziny. Wartość ta mieści się w zakresie akceptowalnym dla innych 3D modeli epidermalnych, które są kwalifikowane do wiarygodnego przewidywania klasyfikacji drażnienia (Wytyczna OECD 439)19.

Wykres pudełkowy oporności RhE i wykres żywotności tkanki w czasie, przedstawiające analizę ET<sub>50</sub>.
Rycina 4: Właściwości barierowe zrekonstruowanego ludzkiego naskórka. (A) Integralność tkanki mierzona za pomocą transepithelial electrical resistance (średnia ± SEM, n=6). (B) ET50 wyznaczony poprzez pomiar żywotności tkanki (tj. test MTT) po miejscowej ekspozycji na 78,3 µL 1% Triton X-100 (średnia ± SEM, n=3). 

Reaktywność RhEs zbadano w odpowiedzi na znane bodźce prozapalne. RhEs poddano stymulacji systemowej, tj. poprzez dodanie bodźców do pożywki w komorze podstawnej, stosując 100 µg/mL lipopolisacharydu (LPS) Escherichia coli oraz 40 ng/mL czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α). Po 24 godzinach stymulacji zebrano pożywkę hodowlaną. Cytotoksyczność zmierzono za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i porównano z wartościami dla znanego czynnika niszczącego błony, detergentu Triton X-100 (Rysunek 5). Wykazano istotny wzrost (p < 0,05, jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA, test wielokrotnych porównań Dunnetta) aktywności LDH w RhEs traktowanych Triton X-100. Obie formy stymulacji, LPS oraz TNF-α, nie wykazały cytotoksyczności.

Wykres słupkowy aktywności LDH; TX-100, LPS, TNF-α; w stosunku do CTRL; porównanie statystyczne.
Rycina 5: Cytotoksyczność zmierzona za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH).Dane przedstawiono jako wartości względne w stosunku do kontroli, tkanek niepoddanych działaniu czynników (CTRL); średnia ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Istotność sprawdzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testu wielokrotnych porównań Dunnetta. Gwiazdka oznacza statystycznie istotną różnicę w porównaniu z CTRL, ****p < 0.0001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ilość wydzielonej interleukiny 1 alfa (IL-1α) oraz interleukiny 8 (IL-8) do pożywki RhE oznaczono metodą ELISA. Rysunek 6 przedstawia zarówno ilościowe, jak i względne wydzielanie IL-1α i IL-8 przez RhE po stymulacji LPS i TNF-α. Leczenie LPS spowodowało statystycznie istotny (p < 0.05, nieparzysty test t Studenta) wzrost wydzielania IL-8 (wzrost 9,6 ± 1,0 razy) oraz IL-1α (wzrost 2,7 ± 1,3 razy). TNF-α nie indukował istotnie wydzielania IL-8, mimo zaobserwowanej tendencji do wzrostu poziomu IL-8 (wzrost 2,3 ± 0,8 razy). Jednakże TNF-α istotnie (p < 0.05, nieparzysty test t Studenta) wywołał wydzielanie IL-1α (wzrost 1,8 ± 0,5 razy).

Wykresy słupkowe ekspresji IL-8 i IL-1α; wpływ LPS i TNF-α na stężenie; analiza statystyczna.
Rycina 6: Odpowiedzi prozapalne w zrekonstruowanym ludzkim naskórku. Stężenia IL-8 uwalnianego przez RhE po 24-godzinnej ekspozycji na LPS (A) oraz TNF-α (B). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Dane przedstawiono jako średnia wartości względnej w porównaniu do kontrolnych tkanek niepoddanych działaniu czynników (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Stężenie IL-1α uwalnianego przez RhE po 24-godzinnej ekspozycji na LPS (D) oraz TNF-α (E). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Dane przedstawiono jako średnia wartości względnej w porównaniu do CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). Istotność sprawdzono za pomocą nieparzystego testu t Studenta. Gwiazdka oznacza różnice istotne statystycznie w porównaniu do CTRL, *p < 0.05, ****p < 0.0001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

RhE są szeroko stosowane jako narzędzia przesiewowe w branży farmaceutycznej i dermatokosmetycznej36, 75,76,77,78. Chociaż kilka firm wprowadziło takie RhE na rynek, są one nadal kosztowne i ograniczają możliwość zmiany parametrów uprawy w zależności od potrzeb związanych z nowymi pytaniami badawczymi. W artykule opisano procedurę produkcji wewnętrznych RhE w solidny i wiarygodny sposób oraz przedstawiono szczegółową charakterystykę uzyskanych tkanek, aby potwierdzić przydatność modelu jako alternatywnego podejścia do testów na zwierzętach.

Niektóre z etapów protokołu mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego różnicowania keratynocytów i odtwarzalności RhE. Można to osiągnąć, wykorzystując optymalne komórki, typy pożywki i warunki uprawy. W proponowanym modelu RhE noworodki NHEK zostały wybrane ze względu na brak ekspozycji na antygen, w porównaniu z dorosłymi NHEK. Co więcej, keratynocyty ograniczono do pochodzenia kaukaskiego, aby uniknąć zmienności międzygatunkowej. Pierwotne keratynocyty są zwykle używane ze względu na ich zdolność do różnicowania i stratyfikacji79. Można je uzyskać komercyjnie lub poprzez izolację wewnętrzną od skóry osoby dorosłej80. Hodowla linii komórkowej (tj. HaCaT) na membranie poliwęglanowej wykazała, że nie udaje się różnicować i wykazano upośledzoną zdolność do syntezy lipidów, które są niezbędne do tworzenia bariery81. Jednak włączenie różnych matryc hodowlanych, takich jak hydrożele, kolagen, fibryny i sferoidy, zaowocowało pomyślnym opracowaniem modeli skóry3D 78,82,83,84,85,86. Wykazano, że unieśmiertelnione linie komórkowe, N/TERT, są odpowiednie do rozwoju RhEs35. Keratynocyty pierwotne pozostają proliferacyjne po czwartym lub piątym pasażu61, dlatego obecny protokół obejmuje użycie keratynocytów w ich trzecim pasażu. De Vuyst i wsp. wykazali, że gęstość wysiewu komórek ma znaczenie i musi być wystarczająca (tj. ≥ 2,5x105 komórek/cm2), aby zapewnić, że podłoże z przedziału podstawno-bocznego nie dyfunduje do przedziału wierzchołkowego. Niewystarczająca gęstość wysiewu (tj. < 2,5x105 komórek/cm2) może powodować niezdolność do wytworzenia właściwej bariery, na co wskazuje dyfuzja pożywki z przedziału podstawno-bocznego do wierzchołkowego, co skutkuje warunkami hodowli zanurzonej zamiast ALI62. Pożywka wzrostowa keratynocytów bez surowicy (patrz tabela materiałów) została wybrana ze względu na odtwarzalność, ponieważ oferuje ona zaletę pracy z chemicznie zdefiniowanym podłożem i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. Pożywka ta ma niższe stężenie wapnia (tj. 60 μM) i dlatego stymuluje proliferację keratynocytów87. Zwiększenie stężenia wapnia (tj. 1,5 mM) od pierwszego etapu hodowli RhE sprzyja różnicowaniu keratynocytów oraz tworzeniu bariery skórnej i homeostazy49. Ponadto pożywka ALI jest uzupełniana kwasem askorbinowym, który, jak wykazano, ma kluczowe znaczenie dla tworzenia lipidów SC i promowania różnicowania 52,53,54. Pożywka ALI zawiera również KGF, który jest czynnikiem wzrostu wydzielanym przez fibroblasty, który może wiązać się z receptorami transbłonowymi keratynocytów, a po aktywacji odgrywa podwójną rolę w różnicowaniu i gojeniu ran55, 88. Ważne jest, aby odświeżać pożywkę ALI w określonych odstępach czasu, aby zapewnić stały dopływ świeżych składników odżywczych do RhEs. Zastosowanie systemu płyt nośnych ma kluczowe znaczenie dla uprawy RhE na większą skalę (tj. 24 wkładki/płytkę). Zaletą jest oszczędność czasu, zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia i pozostawia mniej miejsca na wprowadzenie błędów ludzkich. Daje również możliwość hodowli RhE w dużej objętości pożywki (tj. 1,5 ml), co zmniejsza wymaganą liczbę odświeżeń pożywki ALI. Dodatkowo oferuje możliwość przeniesienia pełnej płytki wkładek na płytkę ze świeżym podłożem, unikając kontaktu z wkładkami pojedynczo lub odsłonięcia pokrywy płyty.

Istnieje kilka ograniczeń modelu RhE, na które należy zwrócić uwagę. W rodzimej skórze ludzkiej istnieje równowaga między proliferacją keratynocytów w warstwie podstawnej a oderwaniem korneocytów w SC (tj. złuszczaniem)89. Jednak in vitro złuszczanie nie ma miejsca. Dlatego korneocyty pozostają przyłączone do RhE i tworzą gruby SC, który jest mniej istotny fizjologicznie. W związku z tym czas uprawy RhEs jest ograniczony. Co więcej, ten model RhE jest prosty i nieskomplikowany, ponieważ składa się z pojedynczego typu komórek, tj. keratynocytu, który jest najliczniejszym typem komórek naskórka. Istnieją jednak inne typy komórek rezydujące w naskórku, takie jak melanocyty, komórki dendrytyczne (tj. Komórki Langerhansa), limfocyty T (np. Komórki CD8 +) i komórki Merkla13. Aby zwiększyć fizjologiczne znaczenie modelu skóry, naukowcy uczynili modele skóry bardziej złożonymi, dodając melanocyty38 , komórki odpornościowe39 lub komórki pochodzące od pacjenta90. Należy pamiętać, że właściwości barierowe modeli ludzkiej skóry są inne w porównaniu z rodzimą ludzką skórą, ze względu na znacznie inny skład lipidów SC i wyższą przepuszczalność bariery 91,92,93,94,95. Jednak kilka badań wykazało zmiany właściwości barierowych ludzkich modeli skóry przez hodowlę w warunkachniedotlenienia 96 lub zmniejszonej wilgotności względnej97, modulację macierzy skórnej za pomocą chitozanu98 oraz zmianę wolnych kwasów tłuszczowych w pożywcehodowlanej 99. Co więcej, zarówno w prostych, jak i bardziej złożonych RhE, warunki hodowli i skład pożywki mogą być modulowane w celu naśladowania cech patologicznych. Rzucając wyzwanie modelowi za pomocą cytokin, można ustalić nieprawidłową morfologię100 oraz zmiany w poziomach ekspresji genów i białek, które są zwykle obserwowane w powszechnych chorobach skóry, takich jak atopowe zapalenie skóry i łuszczyca35, 101,102,103,104,105 . Wyciszenie określonych genów w keratynocytach przed rozpoczęciem procesu rekonstytucji modelu 3D jest kolejnym podejściem stosowanym do naśladowania cech chorób skóry i badania nowych rozwiązań terapeutycznych106, 107. Oprócz modelowania samej warstwy naskórka, w modelu można uwzględnić przedział skórny (tj. Nazwane odpowiedniki ludzkiej skóry lub modele o pełnej grubości) poprzez osadzenie fibroblastów w macierzy kolagenowej przed rekonstytucją RhE, dzięki czemu jest ona bardziej fizjologicznie istotna i odpowiednia do badań związanych ze starzeniem się i gojeniem się ran 108,109,110. Dodatkowo, sferoidy guza zostały dodane do odpowiedników ludzkiej skóry w celu zbadania progresji czerniaka111, 112. Najnowszymi osiągnięciami w dziedzinie modelowania skóry są biodruk i skóra na chipie. Wielu grupom badawczym udało się ostatnio opracować (perfuzyjne) biodrukowane odpowiedniki skóry45, 113, 114. Proponowany protokół wykorzystuje format 24-dołkowy i płytkę nośną, co pozwala uniknąć indywidualnego obchodzenia się z wkładkami. Jednak skala badania jest nadal dość ograniczona i brakuje jej automatyzacji. Dzięki zastosowaniu biodruku lub skin-on-a-chip, mniejsze modele skóry mogą być wykorzystywane w bardziej zautomatyzowanych procesach i na większą skalę.

RhE opisany w tym protokole ma wiele podobieństw do już opracowanych i dobrze scharakteryzowanych komercyjnych modeli naskórka. Analiza morfologiczna wykazała, że chociaż liczba żywotnych warstw w proponowanym modelu RhE jest mniejsza w porównaniu z rodzimą skórą ludzką (tj. 6-7 w porównaniu z 7-14), jest ona porównywalna z liczbą warstw w modelu EpiDerm RhE (tj. 8-12)70. Podobnie jak w modelach EpiDerm, EpiSkin i SkinEthic, górna warstwa RhE wykazuje wzór splotu koszyczkowego gęsto upakowanych warstw korneocytów28. Co więcej, analiza TEM wykazała, że liczba warstw SC w proponowanym modelu RhE (tj. 15-25) jest porównywalna z liczbą warstw EpiDerm (tj. 16-25)70. Ogólnie rzecz biorąc, proponowany model RhE wykazuje podobną strukturę do innych skomercjalizowanych modeli naskórka, naśladując natywny ludzki naskórek. Integralność tkanek mierzona za pomocą TEER mieści się w zakresie komercyjnych modeli RhE (tj. między 3000-5600 Ω.cm2) 71,72,73 i innymi wewnętrznymi RhE (tj. około 5000 Ω.cm 2) 74, 115. Proponowany model RhE okazuje się być dobrze zróżnicowany, na co wskazuje obecność i prawidłowa lokalizacja markerów różnicowania i adhezji tkankowej. Co więcej, proponowany model RhE wykazuje reaktywność na bodźce prozapalne (tj. LPS i TNF-α).

Podsumowując, obecny protokół pokazuje, w jaki sposób wytwarzać RhE w niezawodny sposób i na stosunkowo dużą skalę, aby zaspokoić potrzeby naukowców zarówno w instytucjach akademickich, jak i prywatnych. Proponowany model RhE wykazuje podobną morfologię, zróżnicowanie naskórka i reakcję biologiczną do innych istniejących modeli komercyjnych. Stanowi alternatywne narzędzie zarówno dla branży farmaceutycznej, jak i dermatokosmetycznej, gdy wymagany jest dostęp do odpowiedniego modelu skóry.

Oświadczenia

Marc Eeman i Benedetta Petracca są pracownikami Dow Silicones Belgium. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach grantu Marie Skłodowska-Curie z umową o grant nr 765602 sfinansował tę pracę. Wszyscy autorzy wyrażają uznanie dla wsparcia Fundacji Adolphe'a Merkle'a i Uniwersytetu w Ferrarze oraz wyrażają wdzięczność dla Dow Silicones Belgium. Dr Miguel Spuch-Calvar jest znany z przygotowania graficznych obrazów procesu uprawy RhE. Autorzy dziękują dr Barbarze Drasler, dr Franco Cervellati i dr Agnès Tessier za wsparcie techniczne i dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma AldrichA6283Zakwasić roztwór eozyny 1 ml kwasu octowego na 100 ml.
Antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy (100x)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15240062
Wodny roztwór eozyny YSigmaAldrich HT110280Zakwasz roztwór eozyny 1 ml kwasu octowego na 100 ml.
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma Aldrich lub MerckC8106 lub 1.02378.0500Przygotować roztwór podstawowy 0,144 M, przefiltrować, sterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Zaleca się przygotowywanie nowych porcji co 6 miesięcy.
DAPIRoche10236276001Przygotuj zapas na 100 μ g / ml i przechowywać porcje w temperaturze -20 & deg;C. Warunki pracy to 1 μ g/ml.
Entellan medium montażoweMerck1.07960.0500Medium montażowe do H& Barwienie E.
Pożywka EpiLife (określana jako pożywka wzrostowa keratynocytów)Thermo Fisher Scientific (Gibco)MEPI500CAZawiera 0,06 mM Ca2+.
Absolutny etanolDowolny dostawcaNie dotyczy
Formalina 10%Leica Biosystems3800770
Suplement na wzrost ludzkich keratynocytów (HKGS) (100x) ThermoFisher Scientific (Gibco)S0015Aby osiągnąć końcowe stężenia 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml ludzkiego rekombinowanego EGF, 0,18 μ g/ml hydrokortyzonu,5 i mu; g/ml transferyny bydlęcej oraz 0,01 i mikro; g/ml ludzkiego rekombinowanego insulinopodobnego czynnika wzrostu-I.
IsopropanolBiosolve B.V.0016264102BS
Żelatyna glicerolowa Kaisera, bez fenoluMerck1.08635.0100Podłoże montażowe do barwienia IF.
Czynnik wzrostu keratynocytów (KGF)R& D Systems251-KG-050Rozpuść białko KGF w 100 μ g/ml w sterylnym 0,1% [w/v] BSA w PBS. Przygotuj porcje i przechowuj w temperaturze -20°C. 
Zestaw do oznaczania dehydrogenazy mleczanowej (LDH)Roche4744926001
2-fosforan soli seskwimagnezowej kwasu L-askorbinowego hydrat  Sigma-AldrichA8960Przygotować roztwór podstawowy 25 mg/ml, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20& stopni C. Zaleca się przygotowywanie nowych porcji co 6 miesięcy. Przechowywać w ciemności.
Lipopolisacharyd (LPS), szczep E.coli O55:B5Sigma-AldrichL4524Przygotować zapas 1 mg/ml w sterylnym PBS i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Stężenie robocze wynosi 100  �; g/ml. 
Mayer' powiedział: s HematoksylinaSigma-AldrichMHS80
Normalne ludzkie keratynocyty naskórkowe (NHEK)Lonza00192906Ludzkie pierwotne keratynocyty wyizolowane z napletka noworodka, zebrane od co najmniej trzech dawców.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo Fisher Scientific (Gibco)10010056 lub 10010-015Numery referencyjne mogą się różnić w zależności od kraju.
Rekombinowany czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α)ImmunoTools11344483Przygotuj zapas 100 μ g/ml w sterylnej ultraczystej wodzie. Stężenie robocze wynosi 40 ng / ml
Sterylna ultraczysta wodaDowolny dostawcaNie dotyczy
Niebieski bromek tetrazolowy tiazolylu (MTT)Sigma-AldrichM5655Przygotuj zapas 5 mg/ml MTT w sterylnym PBS. Stężenie robocze wynosi 1 mg/ml.
Triton X-100Sigma-Aldrich93426
Trypan niebieski (0.4% [v/v])Dowolny dostawcaNie dotyczy
Inhibitor trypsynyThermo Fisher Scientific (Gibco)R007100
Trypsyna/EDTA (0,05% [v/v])Thermo Fisher Scientific (Gibco)25300054
Tween 20Sigma-AldrichP1379
KsylenSigma-Aldrich214736
Kozia Anty-Mysia IgG H& L (Alexa Fluor 488)AbcamAb150113
Cytrynian trisodu dwuwodnyMerck1.06448.0500Do buforu do odzyskiwania antygenu do barwienia IF. 
Kozia Anty-Królicza IgG H& L (Dylight 488)AgriseraAS09 633
Filaggrin Przeciwciało myszyBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-53243
Involucrin Rabbit przeciwciałoBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-33742
Keratyna 10 Mysie przeciwciałoBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-32962
Desmoglein-1 Przeciwciało mysie BioTechne (Novus Biologicals)MAB944
Przeciwciało królika LoricrinBioTechne (Novus Biologicals)NBP1-33610

Bibliografia

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Antioxidants & Redox Signaling. , (2002).
  2. Pouillot, A., Dayan, N., Polla, A. S., Polla, L. L., Polla, B. S. The stratum corneum: a double paradox. Journal of Cosmetic Dermatology. 7 (2), 143-148 (2008).
  3. Moore, K. L., Dalley, A. F. Clinically Orientated Anatomy. , (2010).
  4. Barthel, R., Aberdam, D. Epidermal stem cells. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 19 (4), 405-413 (2005).
  5. Green, K. J., Simpson, C. L. Desmosomes: new perspectives on a classic. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2499-2515 (2007).
  6. Feingold, K. R. Lamellar bodies: the key to cutaneous barrier function. Journal of Investigative Dermatology. 132 (8), 1951-1953 (2012).
  7. Elias, M. P., Feingold, K. R., Fartasch, M. The epidermal lamellar body as a multifunctional secretory organelle. Skin Barrier. , 261-272 (2006).
  8. Tobin, D. J. Biochemistry of human skin-our brain on the outside. Chemical society reviews. 35 (1), 52-67 (2006).
  9. Bouwstra, J. A., Ponec, M. The skin barrier in healthy and diseased state. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1758 (12), 2080-2095 (2006).
  10. Weinstein, G. D., McCullough, J. L., Ross, P. Cell proliferation in normal epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 623-628 (1984).
  11. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'être" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  12. Suter, M. M., et al. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Veterinary Dermatology. 20 (5-6), 515-532 (2009).
  13. McLafferty, E., Hendry, C. The integumentary system: anatomy, physiology and function of skin. Nursing Standard. 27 (7), 35-43 (2012).
  14. Monteiro-Riviere, N. A. Toxicology of the skin. , (2010).
  15. Dellambra, E., Odorisio, T., D'Arcangelo, D., Failla, C. M., Facchiano, A. Non-animal models in dermatological research. ALTEX. 36 (2), 177-202 (2019).
  16. Gordon, S., et al. Non-animal models of epithelial barriers (skin, intestine and lung) in research, industrial applications and regulatory toxicology. Altex. 32 (4), 327-378 (2015).
  17. Kandárová, H., et al. The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests - An assessment of the performance of the optimised test. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 33 (4), 351-367 (2005).
  18. Kandárová, H., et al. Assessment of the skin irritation potential of chemicals by using the SkinEthic reconstructed human epidermal model and the common skin irritation protocol evaluated in the ECVAM skin irritation validation study. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 34 (4), 393-406 (2006).
  19. OECD. Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. , (2019).
  20. Alépée, N., Grandidier, M. H., Cotovio, J. Sub-categorisation of skin corrosive chemicals by the EpiSkinTM reconstructed human epidermis skin corrosion test method according to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicology in Vitro. 28 (2), 131-145 (2014).
  21. OECD. Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. , (2019).
  22. Mehling, A., et al. In vitro RHE skin sensitisation assays: applicability to challenging substances. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 108, 104473(2019).
  23. SENS-IS | EURL ECVAM - TSAR. , Available from: https://tsar.jrc.ec.europa.eu/test-method/tm2011-11 (2020).
  24. Lelièvre, D., et al. The episkin phototoxicity assay (EPA): development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency. Toxicology in Vitro. 21 (6), 977-995 (2007).
  25. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  26. Pellevoisin, C., Bouez, C., Cotovio, J. Cosmetic industry requirements regarding skin models for cosmetic testing. Skin Tissue Models. , 3-37 (2018).
  27. Niehues, H., et al. 3D skin models for 3R research: the potential of 3D reconstructed skin models to study skin barrier function. Experimental Dermatology. 27 (5), 501-511 (2018).
  28. Netzlaff, F., Lehr, C. -M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin®, SkinEthic® and EpiDerm®: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 167-178 (2005).
  29. Prieux, R., Eeman, M., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G. Mimicking cigarette smoke exposure to assess cutaneous toxicity. Toxicology in Vitro. 62, 104664(2020).
  30. Petracca, B., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G., Eeman, M. Bench approaches to study the detrimental cutaneous impact of troposperic ozone. Journal of Exposure Science and Environmental Epidemiology. 31, 137-148 (2021).
  31. Dijkhoff, I. M., et al. Impact of airborne particulate matter on skin: a systematic review from epidemiology to in vitro studies. Particle and fibre toxicology. 17 (1), 35(2020).
  32. El Ghalbzouri, A., Siamari, R., Willemze, R., Ponec, M. Leiden reconstructed human epidermal model as a tool for the evaluation of the skin corrosion and irritation potential according to the ECVAM guidelines. Toxicology in Vitro. 22 (5), 1311-1320 (2008).
  33. Chacón, M., et al. Development of an in-house reconstructed human epidermis model as an alternative method in skin corrosion assessment. Toxicology in Vitro. 65, 104779(2020).
  34. Pedrosa, T. doN., et al. A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicology in Vitro. 42, 31-37 (2017).
  35. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838(2017).
  36. Poumay, Y., Coquette, A. Modelling the human epidermis in vitro: tools for basic and applied research. Archives of dermatological research. 298 (8), 361-369 (2007).
  37. Rikken, G., Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Organotypic 3D skin models: human epidermal equivalent cultures from primary keratinocytes and immortalized keratinocyte cell lines. Methods in Molecular Biology. 2154, 45-61 (2020).
  38. Duval, C., et al. Human skin model containing melanocytes: essential role of keratinocyte growth factor for constitutive pigmentation-functional response to α-melanocyte stimulating hormone and forskolin. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (12), 947-957 (2012).
  39. Hutter, V., Kirton, S. B., Chau, D. Y. S. Immunocompetent human in vitro skin models. Skin Tissue Models. , 353-373 (2018).
  40. Kinsner, A., Lesiak-Cyganowska, E., Śladowski, D. In vitro reconstruction of full thickness human skin on a composite collagen material. Cell and Tissue Banking. 2 (3), 165-171 (2001).
  41. Black, A. F., Bouez, C., Perrier, E., Schlotmann, K., Chapuis, F., Damour, O. Optimization and characterization of an engineered human skin equivalent. Tissue Engineering. 11 (5-6), 723-733 (2005).
  42. Reijnders, C. M. A., et al. Development of a full-thickness human skin equivalent in vitro model derived from TERT-immortalized keratinocytes and fibroblasts. Tissue Engineering. Part A. 21 (17-18), 2448-2459 (2015).
  43. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 352-366 (2011).
  44. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  45. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. 3D cell printing of perfusable vascularized human skin equivalent composed of epidermis, dermis, and hypodermis for better structural recapitulation of native skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019(2019).
  46. Pittelkow, M. R., Scott, R. E. New techniques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and perspectives on their use for grafting of patients with extensive burns. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 771-777 (1986).
  47. Elias, P. M., Ahn, S. K., Brown, B. E., Crumrine, D., Feingold, K. R. Origin of the epidermal calcium gradient: regulation by barrier status and role of active vs passive mechanisms. Journal of Investigative Dermatology. 119 (6), 1269-1274 (2002).
  48. Elias, P. M., et al. Modulations in epidermal calcium regulate the expression of differentiation-specific markers. Journal of Investigative Dermatology. 119 (5), 1128-1136 (2002).
  49. Lee, S. E., Lee, S. H. Skin barrier and calcium. Annals of Dermatology. 30 (3), 265-275 (2018).
  50. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  51. Poumay, Y., et al. A simple reconstructed human epidermis: preparation of the culture model and utilization in in vitro studies. Archives of Dermatological Research. 296 (5), 203-211 (2004).
  52. Ponec, M., et al. The formation of competent barrier lipids in reconstructed human epidermis requires the presence of vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  53. Savini, I., et al. Characterization of keratinocyte differentiation induced by ascorbic acid: Protein kinase C involvement and vitamin C homeostasis. Journal of Investigative Dermatology. 118 (2), 372-379 (2002).
  54. Pasonen-Seppänen, S., et al. Vitamin C enhances differentiation of a continuous keratinocyte cell line (REK) into epidermis with normal stratum corneum ultrastructure and functional permeability barrier. Histochemistry and Cell Biology. 116 (4), 287-297 (2001).
  55. Beer, H. D., et al. Expression and function of keratinocyte growth factor and activin in skin morphogenesis and cutaneous wound repair. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 34-39 (2000).
  56. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of structural biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  57. Rice, R. H., Thacher, S. M. Involucrin: a constituent of cross-linked envelopes and marker of squamous maturation. Biology of the Integument. , 752-761 (1986).
  58. Elias, P. M., Barrier Feingold, K. R. Skin Barrier. , (2011).
  59. Marionnet, C., et al. Morphogenesis of dermal-epidermal junction in a model of reconstructed skin: beneficial effects of vitamin C. Experimental Dermatology. 15 (8), 625-633 (2006).
  60. Frikke-Schmidt, H., Lykkesfeldt, J. Keeping the intracellular vitamin C at a physiologically relevant level in endothelial cell culture. Analytical Biochemistry. 397 (1), 135-137 (2010).
  61. Castro-Muñozledo, F., Hernández-Quintero, M., Marsch-Moreno, M., Kuri-Harcuch, W. Cultivation, serial transfer, and differentiation of epidermal keratinocytes in serum-free medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 236 (1), 167-172 (1997).
  62. De Vuyst, E., et al. Reconstruction of normal and pathological human epidermis on polycarbonate filter. Epidermal Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 191-201 (2013).
  63. Chen, R. H., Zhu, J., Zhang, R. Z., Wang, S. Y., Li, Y. The tolerance of human epidermal cells to trypsinization in vitro. Cell and Tissue Banking. 21 (2), 257-264 (2020).
  64. Pohanish, R. P. Sittig's Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and Carcinogens. 2, (2012).
  65. Tsaousis, K. T., et al. Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clinical and Experimental Ophthalmology. 41 (5), 484-490 (2013).
  66. Kim, S. I., et al. Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters. Analytical Biochemistry. 492, 8-12 (2016).
  67. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  68. Fartasch, M., Ponec, M. Improved barrier structure formation in air-exposed human keratinocyte culture systems. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 366-374 (1994).
  69. Bouwstra, J. A., Honeywell-Nguyen, P. L., Gooris, G. S., Ponec, M. Structure of the skin barrier and its modulation by vesicular formulations. Progress in Lipid Research. 42 (1), 1-36 (2003).
  70. Ponec, M., Boelsma, E., Gibbs, S., Mommaas, M. Characterization of reconstructed skin models. Skin Pharmacology and Physiology. 15 (1), 4-17 (2002).
  71. Hubaux, R., Wauters, A., Chrétien, A., Poumay, Y., Salmon, M. Reconstructed human epidermis response to urban particulate matter activates multiple stress-related pathways and impacts the skin barrier function. 23th IFSCC Conference. , 125-134 (2017).
  72. Lin, Y. -C., et al. Testing method development and validation for in vitro skin irritation testing (SIT) by using reconstructed human epidermis (RhE) skin equivalent - EPiTRI®. Alternatives to Animal Testing. , 8-19 (2019).
  73. Alexander, F. A., Eggert, S., Wiest, J. Skin-on-a-chip: Transepithelial electrical resistance and extracellular acidification measurements through an automated air-liquid interface. Genes. 9 (2), 114(2018).
  74. van den Bogaard, E., et al. Perspective and consensus opinion: good practices for using organotypic skin and epidermal equivalents in experimental dermatology research. Journal of Investigative Dermatology. 141 (1), 203-205 (2021).
  75. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An in vitro skin irritation test (SIT) using the EpiDerm reconstructed human epidermal (RHE) model. Journal of Visualized Experiments. (29), e1366(2009).
  76. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical pharmacology advances and applications. 8, 163-176 (2016).
  77. De Wever, B., Kurdykowski, S., Descargues, P. Human skin models for research applications in pharmacology and toxicology: introducing nativeSkin, the "missing link" bridging cell culture and/or reconstructed skin models and human clinical testing. Applied In Vitro Toxicology. 1 (1), 26-32 (2015).
  78. Klicks, J., von Molitor, E., Ertongur-Fauth, T., Rudolf, R., Hafner, M. In vitro skin three-dimensional models and their applications. Journal of Cellular Biotechnology. 3 (1), 21-39 (2017).
  79. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 22 (12), 695-705 (1986).
  80. Johansen, C. Generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Journal of Visualized Experiments. (130), e56863(2017).
  81. Boelsma, E., Verhoeven, M. C. H., Ponec, M. Reconstruction of a human skin equivalent using a spontaneously transformed keratinocyte cell line (HaCaT). Journal of Investigative Dermatology. 112 (4), 489-498 (1999).
  82. Zhao, X., et al. Photocrosslinkable gelatin hydrogel for epidermal tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (1), 108-118 (2016).
  83. Peura, M., et al. Paracrine factors from fibroblast aggregates in a fibrin-matrix carrier enhance keratinocyte viability and migration. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (2), 658-664 (2010).
  84. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCat keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology. 112 (3), 343-353 (1999).
  85. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue engineering. Part C, Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  86. Alameda, J. P., et al. IKKα regulates the stratification and differentiation of the epidermis: Implications for skin cancer development. Oncotarget. 7 (47), 76779-76792 (2016).
  87. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology and Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  88. Staiano-Coico, L., et al. Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing. Journal of Experimental Medicine. 178 (3), 865-878 (1993).
  89. Egelrud, T. Desquamation in the stratum corneum. Acta Dermato-Venereologica. 80, Supp 208 44-45 (2000).
  90. Jean, J., Lapointe, M., Soucy, J., Pouliot, R. Development of an in vitro psoriatic skin model by tissue engineering. Journal of Dermatological Science. 53 (1), 19-25 (2009).
  91. Lotte, C., Patouillet, C., Zanini, M., Messager, A., Roguet, R. Permeation and skin absorption: reproducibility of various industrial reconstructed human skin models. Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 15, Suppl 1 18-30 (2002).
  92. Ponec, M., Weerheim, A., Lankhorst, P., Wertz, P. New acylceramide in native and reconstructed epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 581-588 (2003).
  93. Thakoersing, V. S., et al. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  94. Thakoersing, V. S., et al. presence of monounsaturated fatty acids in the stratum corneum of human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  95. Van Smeden, J., et al. Combined LC/MS-platform for analysis of all major stratum corneum lipids, and the profiling of skin substitutes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (1), 70-79 (2014).
  96. Mieremet, A., et al. Human skin equivalents cultured under hypoxia display enhanced epidermal morphogenesis and lipid barrier formation. Scientific Reports. 9 (1), 7811(2019).
  97. Mieremet, A., et al. Unravelling effects of relative humidity on lipid barrier formation in human skin equivalents. Archives of Dermatological Research. 311 (9), 679-689 (2019).
  98. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., Van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by Chitosan modulated dermal matrices. PLoS ONE. 12 (3), 0174478(2017).
  99. Mieremet, A., et al. Contribution of palmitic acid to epidermal morphogenesis and lipid barrier formation in human skin equivalents. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6069(2019).
  100. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal fifferentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  101. De Vuyst, E., Salmon, M., Evrard, C., Lambert de Rouvroit, C., Poumay, Y. Atopic dermatitis studies through in vitro models. Frontiers in Medicine. 4, 119(2017).
  102. Danso, M. O., et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 134 (7), 1941-1950 (2014).
  103. Soboleva, A. G., Mezentsev, A., Zolotorenko, A., Bruskin, S., Pirusian, E. Three-dimensional skin models of psoriasis. Cells Tissues Organs. 199 (5-6), 301-310 (2014).
  104. Desmet, E., Ramadhas, A., Lambert, J., Gele, M. Van In vitro psoriasis models with focus on reconstructed skin models as promising tools in psoriasis research. Experimental Biology and Medicine. 242 (11), 1158-1169 (2017).
  105. Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Past, present and future of in vitro 3D reconstructed inflammatory skin models to study psoriasis. Experimental Dermatology. 27 (5), 512-519 (2018).
  106. Pendaries, V., et al. Knockdown of filaggrin in a three-dimensional reconstructed human epidermis impairs keratinocyte differentiation. Journal of Investigative Dermatology. 134 (12), 2938-2946 (2014).
  107. Niehues, H., et al. Epidermal equivalents of filaggrin null keratinocytes do not show impaired skin barrier function. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (6), 1979-1981 (2017).
  108. Reuter, C., Walles, H., Groeber, F. Preparation of a three-dimensional full thickness skin equivalent. Methods in Molecular Biology. 1612, 191-198 (2017).
  109. Bataillon, M., et al. Characterization of a new reconstructed full thickness skin model, t-skinTM, and its application for investigations of anti-aging compounds. International Journal of Molecular Sciences. 20 (9), 2240(2019).
  110. Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding. Journal of Visualized Experiments. (96), e52576(2015).
  111. Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. Journal of Visualized Experiments. (54), e2937(2011).
  112. Müller, I., Kulms, D. A 3D organotypic melanoma spheroid skin model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57500(2018).
  113. Wei, Z., et al. Two-dimensional cellular and three-dimensional bio-printed skin models to screen topical-use compounds for irritation potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 109(2020).
  114. Derr, K., et al. Fully three-dimensional bioprinted skin equivalent constructs with validated morphology and barrier function. Tissue Engineering - Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  115. Frankart, A., et al. Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface. Experimental Dermatology. 21 (11), 871-875 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neonatalne keratynocytygranica powietrze-ciecztransepithelialna oporność elektrycznaanaliza immunofluorescencyjnamarkery różnicowania naskórkaocena funkcji barierowejpomiar uwalniania cytokintrójwymiarowy model skóryprotokół hodowli in vitro
Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.