Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA

Podsumowanie

Środowiskowe testy DNA wymagają rygorystycznego projektowania, testowania, optymalizacji i walidacji przed rozpoczęciem zbierania danych terenowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który przeprowadza użytkowników przez każdy etap projektowania specyficznego dla gatunku, opartego na sondzie testu qPCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA gatunku docelowego z próbek środowiskowych.

Streszczenie

Opracowywane są nowe, nieinwazyjne metody wykrywania i monitorowania obecności gatunków, które pomagają w zarządzaniu rybołówstwem i ochroną dzikiej przyrody. Wykorzystanie próbek środowiskowego DNA (eDNA) do wykrywania makrobioty jest jedną z takich metod, która szybko staje się popularna i jest wdrażana w krajowych programach zarządzania. W tym miejscu skupiamy się na opracowaniu specyficznych dla gatunku testów celowanych do zastosowań ilościowych PCR (qPCR) opartych na sondzie. Stosowanie qPCR opartego na sondzie zapewnia większą specyficzność niż jest to możliwe w przypadku samych starterów. Co więcej, możliwość ilościowego określenia ilości DNA w próbce może być przydatna w naszym zrozumieniu ekologii eDNA i interpretacji wzorców wykrywania eDNA w terenie. Przy opracowywaniu i testowaniu tych testów należy starannie rozważyć, aby zapewnić czułość i swoistość wykrywania gatunków docelowych w próbce środowiskowej. W tym protokole określimy kroki potrzebne do zaprojektowania i przetestowania testów opartych na sondach w celu wykrycia gatunku docelowego; w tym tworzenie baz danych sekwencji, projektowanie testów, wybór i optymalizacja testów, testowanie wydajności testów i walidacja w terenie. Wykonanie tych kroków pomoże uzyskać wydajny, czuły i specyficzny test, który może być używany z pewnością. Demonstrujemy ten proces za pomocą naszego testu przeznaczonego dla populacji błotnika (Actinonaias ligamentina), gatunku małża słodkowodnego występującego w rzece Clinch w USA.

Wprowadzenie

Badacze i menedżerowie coraz bardziej interesują się wykorzystaniem środowiskowych testów DNA do wykrywania gatunków. Przez trzy dekady ilościowy lub rzeczywisty PCR (qPCR/rtPCR) był stosowany w wielu dziedzinach do specyficznego dla sekwencji wykrywania i kwantyfikacji kwasów nukleinowych^1,2. W stosunkowo nowej dziedzinie badań nad eDNA stosowanie tych testów ze standardową krzywą do ilościowego oznaczania kopii docelowego DNA na objętość lub masę próbki eDNA stało się obecnie rutynową praktyką. Sekwencje mitochondrialnego DNA są na ogół ukierunkowane w testach eDNA, ponieważ genom mitochondrialny jest obecny w tysiącach kopii na komórkę, ale możliwe są również testy dla sekwencji jądrowego DNA lub RNA. Ważne jest, aby zrozumieć, że opublikowane testy próbek eDNA nie zawsze są równe pod względem wydajności. Wiarygodność testu w wykrywaniu tylko DNA gatunku docelowego (tj. swoistość) i wykrywaniu małych ilości docelowego DNA (tj. czułość) może się znacznie różnić ze względu na różnice w sposobie zaprojektowania, selekcji, optymalizacji i testowania testu. Raportowanie ilościowych miar wydajności testów było wcześniej w dużej mierze pomijane, ale ostatnio pojawiają się standardy mające na celu poprawę przejrzystości w opracowywaniu testów^3,4,5,6,7,8.

Optymalizacja i raportowanie pomocy w testach w projektowaniu badań i interpretacji wyników badań eDNA. Testy, które reagują krzyżowo z DNA gatunków niebędących gatunkami docelowymi, mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wykryć, podczas gdy testy o niskiej czułości mogą nie wykrywać DNA gatunku docelowego, nawet jeśli jest ono obecne w próbce (wyniki fałszywie ujemne). Zrozumienie czułości i selektywności testu pomoże w określeniu nakładu pracy związanego z pobieraniem próbek w celu wykrycia rzadkich gatunków. Ponieważ istnieje wiele naturalnych źródeł zmienności w eDNA, badania muszą w jak największym stopniu ograniczyć kontrolowane źródła zmienności, w tym w pełni zoptymalizować i scharakteryzować test eDNA³.

Warunki, które bezpośrednio wpływają na specyficzność lub czułość testu, zmienią jego działanie. Może się to zdarzyć w różnych warunkach laboratoryjnych (tj. różne odczynniki, użytkownicy, maszyny itp.). W związku z tym protokół ten powinien zostać ponownie przeanalizowany przy stosowaniu testu w nowych warunkach. Nawet testy dobrze scharakteryzowane w literaturze powinny być testowane i optymalizowane, gdy zostaną przyjęte przez nowe laboratorium lub przy użyciu różnych odczynników (np. roztwór master-mix)^5,9. Swoistość testu może ulec zmianie w przypadku zastosowania do innego regionu geograficznego, ponieważ test jest stosowany do próbek z nowej społeczności biotycznej, która może obejmować gatunki niebędące przedmiotem zwalczania, na których test nie został przetestowany, i może wystąpić zmienność genetyczna u gatunku docelowego. Ponownie, test powinien zostać ponownie oceniony, gdy jest używany w nowej lokalizacji. Warunki polowe różnią się od warunków laboratoryjnych, ponieważ w terenie istnieje większe prawdopodobieństwo, że inhibitory PCR będą obecne w próbkach. Inhibitory PCR bezpośrednio wpływają na reakcję amplifikacji, a tym samym wpływają na wydajność testu. Z tego powodu podczas opracowywania testu eDNA wymagana jest wewnętrzna kontrola pozytywna.

Na koniec, warunki środowiskowe w terenie mogą wpływać na cząsteczki DNA gatunku docelowego i ich przechwytywanie poprzez degradację, transport i zachowanie DNA. Co więcej, różne protokoły pobierania i ekstrakcji DNA różnią się pod względem skuteczności i zdolności do zatrzymywania DNA. Należy jednak zauważyć, że procesy te wpływają na wykrywalność eDNA, ale nie na wydajność testów molekularnych. W związku z tym wykrywalność DNA od gatunków docelowych w próbkach terenowych jest funkcją zarówno parametrów technicznych testu qPCR, jak i warunków terenowych oraz protokołów pobierania, przechowywania i ekstrakcji. Korzystając z dobrze scharakteryzowanego i wysoce wydajnego testu, użytkownicy mogą czuć się pewni jego możliwości; dzięki czemu naukowcy mogą teraz skupić się na zrozumieniu zewnętrznych czynników testowych (tj. zmiennych środowiskowych, różnic w protokołach wychwytywania lub ekstrakcji) wpływających na wykrywanie eDNA.

Tutaj skupiamy się szczególnie na wydajności technicznej testów poprzez rygorystyczne projektowanie i optymalizację. Demonstrujemy protokół za pomocą testu opartego na sondzie opracowanego do wykrywania małża słodkowodnego, mukleta (Actinonaias ligamentina), z wody pobranej w rzece Clinch w USA. Niedawno Thalinger i in. (2020) przedstawili wytyczne dotyczące walidacji celowanych testów eDNA. Projekt testu zgodny z naszym protokołem przyniesie test na poziomie 4 Thalingera i in. oraz dodatkowy krok w kierunku poziomu 5⁶. W tym momencie wydajność techniczna testu zostanie zoptymalizowana i będzie on gotowy do regularnego stosowania w zastosowaniach laboratoryjnych i terenowych. Dalsze wykorzystanie testu w eksperymentach laboratoryjnych, mezokosmicznych i terenowych może następnie odpowiedzieć na pytania dotyczące wykrywania eDNA i czynników wpływających na wykrywalność, co jest ostatnim krokiem walidacji na poziomie 5⁶.

Protokół

1. Generowanie bazy danych sekwencji mitochondrialnego DNA z docelowych i niedocelowych gatunków będących przedmiotem zainteresowania

1. Zdefiniuj pytanie, cele i system, do którego się odnosisz. Zidentyfikuj gatunki docelowe do wykrycia eDNA. Należy określić system geograficzny, w którym test będzie stosowany. Sporządź listę interesujących gatunków, w tym gatunków docelowych, gatunków sympatrycznych (współwystępujących) w obrębie tych samych taksonów (zwykle rzędu lub poziomu rodziny) oraz blisko spokrewnionych gatunków allopatrycznych, tych, które mogą nie znajdować się w tym samym położeniu geograficznym co cel (Rysunek 1).
   UWAGA: W tym przypadku celem były populacje gatunku A. ligamentina w rzece Clinch.
2. Wyszukaj i pobierz sekwencje z wielu regionów genów dla gatunków znajdujących się na liście z kroku 1. Można korzystać z baz danych sekwencji, takich jak NCBI (National Center for Biotechnology Information), BOLD (Barcode of Life Database), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) i DDBJ (DNA Data Bank of Japan). NCBI, EMBL i DDBJ udostępniają informacje o sekwencji.
   1. Korzystając z bazy danych nukleotydów NCBI, wyszukaj organizm docelowy (np. Actinonaias ligamentina) i region genu (np. oksydazę cytochromu c I (COI) lub dehydrogenazę NADH 1 (ND1); Przykładowy ciąg wyszukiwania: Actinonaias ligamentina AND ND1)
   2. Następnie wybierz wszystkie sekwencje, które są zgodne ze specyfikacjami, i wybierz opcję Wyślij do. Wybierz Kompletny rekord, Plik i format pobierania jako GenBank lub FAPSA, a następnie Utwórz plik. Te sekwencje są teraz zapisywane na komputerze.
   3. Powtórz te kroki dla wszystkich gatunków z wykazu zdefiniowanego w kroku 1. Sekwencje dla każdego regionu genu należy przechowywać w osobnym pliku, ponieważ będą one analizowane oddzielnie.
      1. Pobierz wszystkie istotne sekwencje (lub dużą, reprezentatywną część sekwencji) dla gatunków docelowych zidentyfikowanych w kroku 1. Jeśli to możliwe, uwzględnij warianty geograficzne.
      2. Powtórz sekwencje wyszukiwania i pobierania dla pokrewnych i sympatrycznych gatunków niebędących przedmiotem zwalczania z tej samej grupy taksonomicznej, które zostały zidentyfikowane w kroku 1 (np. jeśli gatunkiem docelowym jest muklet (A. ligamentina), sekwencje pobierania dla wszystkich innych gatunków małży słodkowodnych z rodziny Unionidae, które występują w systemie będącym przedmiotem zainteresowania).
      3. Powtórz wyszukiwanie i pobierz dla blisko spokrewnionych, ale allopatrycznych (geograficznie odrębnych) gatunków wymienionych w kroku 1.1.
         UWAGA: Nie wszystkie gatunki (docelowe i niedocelowe) będą dostępne w publicznych bazach danych. Zwiększenie lokalnej referencyjnej bazy danych poprzez amplifikację i sekwencjonowanie zweryfikowanych taksonomicznie okazów gatunków będących przedmiotem zainteresowania we własnym zakresie. Jeśli pracujesz z gatunkiem, który ma dużą różnorodność genetyczną wewnątrz gatunku lub pracujesz na dużym obszarze geograficznym, na którym można spodziewać się wariantów geograficznych, zbierz sekwencje z całego zakresu.

2. Projekt testu

1. Dopasuj sekwencje z każdego regionu genu osobno za pomocą oprogramowania do dopasowywania, które można znaleźć w różnych programach do edycji sekwencji genetycznych i bioinformatycznych. Wykonaj to wyrównanie dla każdego z różnych regionów genu.
   1. Na przykład za pomocą oprogramowania Geneious Prime (https://www.geneious.com) zaimportuj pobrane pliki sekwencji do programu.
   2. Utwórz osobne foldery dla każdego regionu genu.
   3. W folderze zawierającym sekwencje z jednego regionu genu zaznacz wszystkie sekwencje.
   4. Użyj narzędzia Wielokrotne wyrównanie, aby utworzyć wyrównanie nukleotydowe wybranych sekwencji. Może istnieć kilka opcji dla rodzaju wyrównania, użycie wyrównania Geneious lub MUSCLE i parametrów domyślnych działa dobrze.
2. Wybierz obiecujące regiony do zaprojektowania testu dzięki wizualizacji wyrównanych danych sekwencji. Region, w którym dostępnych jest wiele danych sekwencyjnych dla gatunków będących przedmiotem zainteresowania, jest wysoce rozbieżny między gatunkami i wykazuje niską zmienność wewnątrzgatunkową, jest dobrym kandydatem. Zwiększy to prawdopodobieństwo, że zaprojektowane startery i sondy będą w stanie odróżnić cel od gatunków niedocelowych, zapewniając jednocześnie wzmocnienie wariantów wewnątrzgatunkowych podczas testu.
3. Projektowanie starterów testowych i sondy.
   1. Użyj oprogramowania do projektowania testów qPCR i postępuj zgodnie z instrukcjami. Wykorzystano tu narzędzie PrimerQuest Tool (https://www.idtdna.com/) firmy IDT do zaprojektowania 5 zestawów testów qPCR.
   2. Wklej sekwencję zaznaczoną w kroku 2.2 w polu Sekwencja. Jeśli wyrównanie utworzyło odstępy, usuń je z sekwencji.
   3. Wybierz qPCR 2 Startery + sonda w opcji Wybierz swój projekt.
   4. Pobierz zalecane testy.
   5. Skopiuj sekwencje ze startera do przodu pierwszego testu i wyszukaj tę sekwencję startera w dopasowaniu utworzonym w kroku 2.1.4. Jeśli używasz Geneious Prime, użyj narzędzia Annotate and Predict (Adnotacja i przewidywanie), aby dodać region startera do wyrównania. Zrób to dla wszystkich kombinacji startera i sondy (Rysunek 2).
   6. Należy sprawdzić te obszary wyrównania pod kątem zmienności w obrębie gatunków docelowych, jak również w obrębie gatunków współwystępujących.
      1. Jeśli występuje wewnątrzgatunkowa zmienność genetyczna, należy poszukać testów, w których startery i sonda nie mieszczą się w tych regionach.
      2. Aby zapobiec namnażaniu się gatunków niedocelowych, należy szukać niezgodności z gatunkami niedocelowymi. Wybierz testy z największą liczbą niezgodności do dalszej walidacji. Currier i in. (2018) sugerują wybór zestawów z co najmniej dwoma z trzech regionów (dwoma starterami lub starterem i sondą) mających co najmniej dwie niezgodności ze wszystkimi gatunkami niedocelowymi. Należy jednak pamiętać, że niezgodności w sondzie w mniejszym stopniu przyczyniają się do specyficzności¹⁰.
         UWAGA: Różnice w obrębie 3 par zasad na końcu 3' każdego startera zwiększają specyficzność lepiej niż różnice na końcu 5' starterów¹⁰.
   7. W projektowaniu testu należy wziąć pod uwagę następujące ważne parametry.
      1. Określ temperatury topnienia i wyżarzania starterów i sondy. Idealnie, temperatura topnienia (Tm) starterów powinna wynosić od 60 do 64 °C i nie przekraczać 2 °C od siebie, a Tm sondy powinna być o 6-8 stopni wyższa niż Tm starterów. Ustaw temperaturę wyżarzania (Ta) reakcji qPCR o 5 °C poniżej temperatury topnienia, około 55-60 °C¹¹.
      2. Sprawdź zawartość GC. Wybierz między 35 a 65% zawartości GC i unikaj regionów z 4 lub więcej kolejnymi Gs. Posiadanie 1 lub 2 Gs lub C w 5 ostatnich zasadach końca 3' startera (zacisk GC) może zwiększyć specyficzność, ponieważ pomogłoby starterowi w tworzeniu silniejszego wiązania¹².
      3. Szukaj struktur spinki do włosów i dimerów. Przetestuj startery i sondę pod kątem przewidywanych struktur spinki do włosów i dimerów za pomocą programu do analizy oligonukleotydów (np. OligoAnalyzer -IDT¹³; OligoCalculator¹⁴). Struktury te mogą powodować wzmocnienie niedocelowe i niższą wydajność. Należy unikać testów, co do których przewiduje się, że utworzą te struktury.
      4. Określ długość podkładu. Celuj w startery o długości od 18 do 25 zasad i długość sondy od 20 do 25 zasad. Dłuższe startery i sondy mogą mieć niższą wydajność wzmocnienia.
      5. Określ długość amplikonu. Powinien wynosić od około 100 do 250 par zasad. Ten zakres jest na ogół wystarczająco krótki, aby zapewnić wysoką skuteczność PCR, ale wystarczająco długi, aby ułatwić weryfikację za pomocą sekwencjonowania Sanger^4,15.
      6. Sondy projektowe. Upewnij się, że sondy nie mają podstawy G na końcu 5', ponieważ może to stłumić sygnał z zielonego i żółtego barwnika¹¹. Zaprojektowaliśmy sondy z podwójnym hartowaniem, z hartownikami IDT 3IABkFQ i ZEN oraz fluoroforami FAM lub HEX.
         UWAGA: Określ sondy MGB: Sondy TaqMan MGB (minor groove binder) są często używane do badań eDNA. Ponieważ jednak sondy te są bardzo krótkie, mogą wiązać się z obiektami niebędącymi obiektami nawet przy niezgodności 2 lub 3 par zasad¹⁰.
      7. Określ sondę Tm. Temperatura topnienia sondy powinna być o 6-8°C wyższa niż starterów. Niższe temperatury zmniejszają skuteczność wiązania sondy.
      8. Określ długość i położenie sondy. Sonda powinna mieć długość od 20 do 25 pz i najlepiej powinna być umieszczona blisko miejsca wiązania podkładu na tym samym pasmie, nie zachodząc na nie.

3. Badania przesiewowe i optymalizacja testów

1. Opracowywanie i testowanie testów in silico. Przed zamówieniem zestawów starter-sonda należy ocenić swoistość (potencjalną amplifikację niedocelową), testując amplifikację startera in silico.
   1. Przetestuj startery za pomocą NCBI's Primer-Blast¹⁶ lub podobnych programów, które mogą zidentyfikować potencjalne nie-cele w bazie danych NCBI nt/nr, które mogą się wzmocnić wraz z testem. W przypadku korzystania z podkładów w paście Primer-Blast w polu Użyj własnego podkładu w parametrach podkładu. W opcjach Parametry sprawdzania specyficzności pary starterów wybierz nr jako bazę danych i wpisz kolejność organizmu będącego przedmiotem zainteresowania (np. "Unionida" lub "Unionoida") w polu Organizm.
   2. Kontynuuj wizualną ocenę zestawów starterów/sond na podstawie wyrównanych danych sekwencji.
      1. Aby ocenić startery i sondy w tym samym czasie in silico, utwórz ciąg tekstowy startera do przodu, 12 N, sondy, 12 N i odwrotnego dopełnienia startera odwrotnego. Jeśli sekwencja sondy znajduje się w obrębie 12 par zasad jednego ze starterów, użyj liczby N odpowiadającej liczbie par zasad między starterem a sondą.
      2. Użyj wyszukiwania NCBI Nucleotide Blast (Blastn), aby przeszukać bazę danych nr ¹⁷. Użyj zakładki Taksonomia, aby wyszukać gatunki niedocelowe z niewielką liczbą niezgodności; Powinny one zostać przetestowane w laboratorium podczas optymalizacji testu.
         UWAGA: Testy in silico pomagają wykluczyć testy niespecyficzne, ale potencjalnie specyficzne testy muszą być testowane empirycznie (in vitro), ponieważ nie wszystkie gatunki mają sekwencje w genetycznych bazach danych, a startery i sondy mogą nadal wiązać się z niedocelowymi, nawet jeśli oprogramowanie uzna je za mało prawdopodobne.
2. Wybierz od trzech do pięciu kombinacji startera/sondy do przetestowania w laboratorium.
3. Zamów startery, sondy i syntetyczny wzorzec DNA, a także dodatkowe startery z ogonem M13 do sekwencjonowania amplikonów.
   1. Zamów syntetyczne startery i sondy oligonukleotydowe w firmie produkującej oligonukleotydy. Sondy są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym i wygaszaczem. Do testów, które muszą być multipleksowane, należy wybrać różne fluorofory. Sprawdź swój instrument qPCR, aby uzyskać listę fluoroforów, które instrument może wykryć.
   2. Zaprojektuj i zamów startery M13-ogonkowe do weryfikacji detekcji qPCR z sekwencjonowaniem Sangera, dodając sekwencję M13 Forward (-20), GTA AAA CGG CCA GT, do końca 5' startera do przodu i sekwencję M13 Reverse (-27), CAG GAA ACA GCT ATG AC, do końca 5' startera odwrotnego.
   3. Wzorzec syntetycznego DNA zawiera sekwencję docelową (w tym regiony startera) o znanym stężeniu w kopiach/μl. Określ ilościowo nieznane próbki na podstawie krzywej utworzonej przez znane stężenia tego wzorca (tj. krzywej wzorcowej). Zdobądź syntetyczny wzorzec od tej samej firmy, która produkuje startery i sondę. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi ponownego zawieszania i przechowywania. Rozcieńczyć roztwory w buforze TE nośnikiem tRNA przy użyciu wyrobów z tworzywa sztucznego o niskiej retencji w celu zmniejszenia hydrolizy i wiązania z powierzchniami.
      UWAGA: Jeśli krzywa wzorcowa nie działa dobrze (słaba wydajność PCR, patrz krok 3.4.2), spróbuj ponownie zawiesić wzorzec w wodzie lub Tris-HCl.
   4. Zawiesić startery i sondy w wodzie wolnej od nukleaz, buforze Tris-HCl lub TE w dogodnych stężeniach do użycia testowego. Ogólnie rzecz biorąc, rozcieńczyć zapasy robocze 20-krotnie w mieszance wzorcowej, aby uzyskać zoptymalizowane stężenie końcowe testu. Zawieszone olikleotydy przechowywać w stałej temperaturze -20 °C, gdy nie są używane.
4. Optymalizacja i testowanie testów in vitro (w laboratorium). Odrzuć testy, które mają niską skuteczność, reagują krzyżowo ze współwystępującymi gatunkami lub mają słabą czułość¹⁸. Uwzględnij stosowanie wewnętrznej kontroli dodatniej (IPC) podczas opracowywania testu, jak również podczas badania rzeczywistych próbek.
   1. Najpierw znajdź optymalne wartości temperatury i stężenia startera/sondy dla testu. Po zoptymalizowaniu tych parametrów pod kątem wydajności PCR (krok 3.4.2), reaktywności krzyżowej (krok 3.4.3) i czułości (krok 3.4.4), przystąp do testowania testu za pomocą multipleksowanego IPC (krok 3.4.5).
      1. Przetestuj optymalną temperaturę wyżarzania (Ta) dla startera i sond przy użyciu gradientu temperatury PCR wyśrodkowanego o 5° C poniżej przewidywanej średniej Tm startera.
      2. Przetestuj optymalne stężenia startera i sondy. Zazwyczaj testuje się stężenia starterów 200 nM, 400 nM i 800 nM oraz stężenia sondy 75 nM, 125 nM i 200 nM.
   2. Utwórz krzywą standardową i określ wydajność oraz zakres liniowy. Przetestuj co najmniej sześć 10-krotnych rozcieńczeń syntetycznego wzorca DNA zawierającego sekwencję docelową, przy około 10⁰ kopiach/reakcję do 10⁵ kopii/reakcję (Rysunek 3A).
      1. Użyj oprogramowania qPCR, aby wykreślić wartość Cq (próg cyklu przy kwantyfikacji) każdego wzorca na osi y i logarytm o podstawie 10 początkowego stężenia wzorca w kopiach/reakcji na osi x. Oprogramowanie qPCR powinno automatycznie uruchomić regresję liniową (Rysunek 3B).
      2. Obliczyć wydajność na podstawie nachylenia regresji, E = -1 + 10^{(-1/nachylenie).} Na przykład, jeśli nachylenie wynosi -3,4, E = -1 + 10^(0,29) = 0,97 lub 97%. Należy również sprawdzić wartości r², które wskazują, jak dobrze wzorce pasują do krzywej. Oprogramowanie qPCR również powinno to automatycznie obliczyć (Rysunek 3B). Dąż do wartości wydajności 100% (±10%) i wartości r² ≥0,98^{9,15,19,20,21,22}.
      3. Sprawdź wzrokowo krzywą standardową pod kątem odchylenia, czyli odchyleń od regresji w stałym kierunku lub słabej wydajności krzywej standardowej, mierzonej wydajnością i wartościami r² (Rysunek 3C i 3D).
   3. Specyficzność: Oceń reaktywność krzyżową z gatunkami niedocelowymi, aby zmniejszyć ryzyko wyników fałszywie dodatnich. W przypadku gdy wykrycie eDNA może skutkować kosztownymi decyzjami dotyczącymi zarządzania, należy zweryfikować pozytywne wykrycia za pomocą sekwencjonowania amplikonów.
      1. Niedocelowe: Przeprowadzenie testu w porównaniu z ekstrakcjami genomowego DNA z taksonomicznie zweryfikowanych okazów gatunków pokrewnych i gatunków współwystępujących geograficznie; przy czym najwyższym priorytetem jest przeprowadzenie testu na blisko spokrewnionych, współwystępujących gatunkach. Podobne całkowite stężenia DNA należy stosować zarówno dla próbek docelowych, jak i niedocelowych. Wybrane stężenie powinno prowadzić do amplifikacji z próbek gatunków docelowych w pobliżu środka zakresu liniowego krzywej wzorcowej. Amplifikację należy obserwować tylko w przypadku gatunków docelowych.
      2. Jeśli zaobserwuje się amplifikację inną niż docelowa, wyczyść i zsekwencjonuj produkt, aby zweryfikować jego tożsamość. Nierzadko obserwuje się zanieczyszczenie gatunkami docelowymi w próbkach tkanek gatunków niebędących gatunkami docelowymi, dlatego wszystkie amplifikacje na tym etapie należy zweryfikować za pomocą sekwencjonowania. Ponownie amplifikuj oczyszczone amplikony z testów specyficzności przy użyciu starterów ogoniastych M13 i sekwencjonuj za pomocą starterów M13.
         1. W laboratorium post-PCR przenieś produkty qPCR, które mają być sekwencjonowane, do świeżych probówek. Usuń resztki starterów i składników reakcji za pomocą zestawu do czyszczenia (np. Zestawu do oczyszczania MinElute PCR).
         2. Wykonać rozcieńczenia elucji w stosunku 1:100 i amplifikować 1 μl każdego z nich przez 30 cykli w reakcji PCR o objętości 50 μl ze starterami ogoniastymi M13 i polimerazą o wysokiej wierności (np. polimerazą DNA Phusion High-Fidelity).
         3. Uruchom 10 μl każdej reakcji na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy nie ma pojedynczego pasma o oczekiwanym rozmiarze. Jeśli nie zaobserwuje się żadnego pasma, zwiększ liczbę cykli lub ilość próbki. Jeśli zaobserwuje się wiele prążków, żel oczyść opaskę o oczekiwanym rozmiarze.
         4. Usuń resztki starterów i składników reakcji za pomocą zestawu do czyszczenia, jak powyżej, i zmierz stężenia DNA w elucjach.
         5. Skonfigurować reakcje sekwencjonowania za pomocą starterów M13 zgodnie z instrukcjami zakładu sekwencjonowania.
            UWAGA: Nigdy nie otwieraj amplifikowanych próbek w laboratorium qPCR. Przygotowanie próbek do sekwencjonowania w laboratorium przeznaczonym do pobierania próbek po PCR.
   4. Wrażliwość: Wrażliwość wpływa na prawdopodobieństwo wyników fałszywie ujemnych lub niewykrycia DNA gatunku docelowego, gdy jest on obecny. Ocenić granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) dla każdego testu. Na koniec należy przeprowadzić wewnętrzną kontrolę dodatnią (IPC) w celu oceny zahamowania PCR w próbkach. Multipleksuj i testuj ten test IPC z zaprojektowanym testem, aby upewnić się, że te dwa testy nie zakłócają się nawzajem.
      1. LOD: Wykonaj sześć 4-krotnych seryjnych rozcieńczeń wzorca syntetycznego DNA, z 8-24 powtórzeniami na standardowe rozcieńczenie (Rysunek 4). Oblicz najniższe stężenie początkowe przy wykrywalności 95%. Wykresy LOD i LOQ można generować za pomocą kalkulatora LOD/LOQ R script⁵.
         UWAGA: Dane poniżej LOD nie powinny być cenzurowane. Ze względu na specyfikę PCR nie ma dolnej granicy dla wyników prawdziwie dodatnich. LOD jest najwyższym stężeniem, poniżej którego można spodziewać się wystąpienia wyników fałszywie ujemnych.
      2. LOQ: Z tej samej serii rozcieńczeń obliczyć najniższe początkowe stężenie wzorca DNA kwantyfikowalne o współczynniku zmienności (CV) poniżej 35%.
         UWAGA: LOD i LOQ powinny być podane w kopiach/reakcji. W przypadku korzystania z zwalidowanego testu, gdy próbki terenowe amplifikują się poniżej LOQ, wyniki powinny być podawane jako % wykryć, a nie stężenia eDNA, ponieważ dokładnego stężenia nie można zmierzyć z pewnością⁵.
   5. Użyj wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) do przeprowadzenia testu na zahamowanie PCR. Hamowanie może prowadzić do zmniejszenia czułości i wyników fałszywie ujemnych. Zbadaj zdolność testu IPC do multipleksowania z testem docelowym.
      1. Test IPC można multipleksować z testem docelowym przy użyciu sondy z innym barwnikiem reporterowym niż test docelowy. Ten test IPC składa się z krótkiej syntetycznej sekwencji DNA z gatunku niespokrewnionego z taksonami docelowymi, włączonej do głównej mieszanki qPCR w niskim stężeniu około 10² kopii / reakcję, wraz ze starterem i sondami, które ją wykrywają. To niższe stężenie jest konieczne, aby uniknąć konkurencji z sekwencją docelową dla polimerazy i nukleotydów²³.
      2. Porównaj wartość Cq szablonu IPC próbki z wartością szablonu IPC w kontrolce braku szablonu. W tej kontroli bez matrycy (NTC) jedynym wejściem DNA jest matryca IPC. Szablon IPC w tej reakcji powinien wzmocnić się zgodnie z oczekiwaniami. Jeśli matryca IPC w próbce amplifikuje się w 2 lub więcej cyklach różniących się od matrycy IPC w NTC, próbka eDNA jest hamowana. Próbki, które wykazują inhibicję, można rozcieńczyć w stosunku 1:10 i ponownie przetestować. Jeżeli próbka pozostaje zahamowana, należy ją usunąć z analizy.
5. Opracowywanie i testowanie testów in situ
   1. W laboratorium: Jeśli możliwy jest dostęp do organizmu w laboratorium, jak również do gatunków sympatrycznych; pobrać próbki wody z pomieszczeń z tymi gatunkami, przetworzyć próbki i przetestować test na tych próbkach eDNA. Sekwencjonuj produkty jak powyżej, aby zweryfikować amplifikację zamierzonego celu przy użyciu spłonek ogoniastych M13.
   2. W terenie:
      1. Zidentyfikować miejsca, w których wiadomo, że organizm zwalczany występuje i o których wiadomo, że nie występują. Zaleca się, aby w każdym miejscu, w którym występuje gatunek docelowy, panowała pewna liczebność.
      2. Należy zdecydować, jakie objętości próbek i metody pobierania próbek (np. filtracja, odwirowanie itp.) zostaną zastosowane.
      3. Dołącz ślepą próbę polową lub kontrolę ujemną w każdym miejscu, jest to czysta woda, która została przyniesiona na miejsce w terenie, a następnie zebrana i przygotowana za pomocą tego samego sprzętu terenowego i protokołów, które są używane do pobierania próbek eDNA²⁴. Celem ślepej próby polowej jest wykrycie zanieczyszczenia sprzętu do pobierania próbek i sprzętu polowego przywiezionego na miejsce. Weź ślepe badanie pola przed przetworzeniem próbek wody polowej.
      4. Weź wiele próbek wody na miejsce, najlepiej 3 próbki na miejsce.
      5. Po powrocie do laboratorium przetworzyć i pobrać próbki.
      6. Uruchom test przy użyciu płytki ustawionej podobnie jak Rysunek 5A, i porównaj stężenie eDNA i częstotliwość wykrywania ze znanymi różnicami w występowaniu i liczebności miejsc. Potwierdź wszystkie wykrycia za pomocą sekwencjonowania^24,25.
         UWAGA: Powyższe zweryfikowałoby test za pomocą poziomu 4 skali Thalingera i in. (2020) scale⁶ (optymalizacja wydajności technicznej testu) i rozpoczęłoby gromadzenie danych wspierających walidację testu na poziomie 5. Poziom 5 obejmuje modelowanie prawdopodobieństwa i wykorzystanie testu do badań ekologii eDNA. Uważamy, że wykracza to poza zakres opracowywania podstawowych testów, ale zachęcamy do stosowania tych testów laboratoryjnych i sprawdzonych w terenie w celu poprawy projektowania testów i interpretacji danych.

Wyniki

Podczas projektowania specyficznego dla gatunku testu qPCR dla mukleta (A. ligamentina), pobrano dostępne sekwencje wszystkich gatunków Unionidae w rzece Clinch. Blisko spokrewnione gatunki, takie jak Lampsilis siliquoidea, również zostały włączone do referencyjnej bazy danych, mimo że nie występują w tej samej rzece. Nie wszystkie gatunki w systemie rzecznym będącym przedmiotem zainteresowania zostały znalezione w GenBank, więc dodatkowe gatunki zostały zsekwencjonowane w domu. Sekwencje dostosowano za pomocą oprogramowania Geneious, a oprogramowanie Primer Quest (IDT) wykorzystano do zaprojektowania wielu testów. Do wyrównania w celu oceny wizualnej dodano pięć zestawów starterów i sondy (Rysunek 2). Następnie zostały one przetestowane in silico przy użyciu Primer-Blast, po czym skierowano je do dalszych badań in vitro. W laboratorium wszystkie testy zostały przetestowane przy użyciu ekstrakcji DNA 27 dostępnych gatunków w celu zweryfikowania swoistości. W jednym teście (A.lig.1) z powodzeniem amplifikowano tylko gatunki docelowe (tabela 1; Tabela 2). Test ten posunął się naprzód w celu dalszego testowania skuteczności testu, LOD i LOQ. Ma długość amplikonu wynoszącą 121 par zasad. Tabela 3 przedstawia sekwencję zastosowaną do wzorca syntetycznego DNA A. ligamentina. Rysunek 3A i Rysunek 3B pokazuje wyniki udanego testu z dobrą wydajnością i wartościami r². Rysunek 3C i Rysunek 3D pokazuje test, którego krzywa standardowa ma niską wydajność; Ten test został odrzucony. Stwierdzono, że LOD i LOQ dla wybranego testu (A.lig.1) wynoszą 5,00 kopii/reakcję przy użyciu metody dyskretnej opisanej w Klymus et al⁵. IPC, który został zmultipleksowany z testem (tabele 3-6), nie wpłynął na standardową krzywą testu A. ligamentina. Używany przez nas IPC jest fragmentem mysiego transkryptu HemT. Ten test został wstępnie zaprojektowany przez IDT do innego zastosowania, ale zmodyfikowaliśmy jego użycie jako IPC dla zastosowań eDNA w naszym laboratorium.

Udany przebieg qPCR powinien spełniać określone kryteria dla każdej miary wydajności (np. standardowa amplifikacja krzywej, kontrola pozytywna genomowego DNA, brak kontroli matrycowej i wewnętrzna kontrola pozytywna). Docelowe wzorce oznaczania powinny mieć wykładnicze krzywe amplifikacji. Krzywe te powinny osiągnąć plateau punktu końcowego, jeśli pozwoli się im uruchomić wystarczającą liczbę cykli. Wskazuje to na to, że sonda fluorescencyjna została całkowicie zużyta podczas reakcji, a poziomy fluorescencji osiągnęły maksymalny limit. Późniejsze standardy wzmacniania mogą nie osiągnąć plateau w ciągu 40 cykli. Kontrole pozytywne (genomowe DNA i IPC) powinny mieć ten sam wzór. Niewiadome mogą, ale nie muszą, amplifikacja w niewiadomych powinna również mieć wzorzec wykładniczy i plateau punktu końcowego (Rysunek 5).

W jakościowym qPCR, standardowe rozcieńczenia są wzmacniane w równomiernie rozłożonych Cq mniej więcej co 3,3 cykli na każdą 10-krotną różnicę w stężeniu. Każda powtórzona roztworu wzorcowego amplifikuje się w ściśle zgrupowany sposób, mając prawie takie samo Cq (reprezentowane przez wartości r²). Wszystkie standardowe rozcieńczenia powinny wykazywać amplifikację (Rysunek 3A). W słabym qPCR wzorce mogą wykazywać niewykładniczy kształt, nierównomierne różnice w wartościach Cq między rozcieńczeniami, nie osiągać plateau końcowego lub niektóre rozcieńczenia mogą w ogóle nie ulegać amplifikacji (Rysunek 3D).

Ważnymi parametrami dla krzywej standardowej są efektywność, r², nachylenie i punkt przecięcia z osią y. Wydajność powinna mieścić się w przedziale 90%-110% przy idealnych wartościach bliskich 100%, a wartości r² powinny być powyżej 0,98 z idealnymi wynikami zbliżającymi się do 1,0^15,22. Wartości nachylenia powinny mieścić się w przedziale od -3,2 do -3,5, a idealne wyniki powinny być bliskie -3,3²². Wartości punktu przecięcia z osią y powinny mieścić się w przedziale Cq 34-41, a idealne wyniki powinny mieć wartość Cq 37,0. Punkt przecięcia z osią y to przewidywane Cq reakcji z 1 kopią sekwencji docelowej, najmniejszą jednostką, którą można zmierzyć w pojedynczym qPCR. Niewiadome z Cq większym niż punkt przecięcia z osią y prawdopodobnie zostaną zahamowane. Przeprowadzenie więcej niż 40 cykli PCR może być konieczne w celu wykrycia celu w przypadku zahamowania lub nieskutecznego zestawu starterów, jednak w tych okolicznościach nie jest możliwa kwantyfikacja i należy przeprowadzić dodatkowe kontrole ujemne bez sekwencji docelowej, ale zawierające całkowite DNA podobne do niewiadomych, aby wykluczyć amplifikację ze źródeł niespecyficznych.

Amplifikacja wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) w nieznanych próbkach powinna być porównana z wynikami IPC kontroli matrycy ujemnej, ponieważ nie ma konkurencji dla odczynników i nie ma inhibitorów. Niewiadome z IPC o Cq wynoszącym 2 cykle lub większym niż średnia wartość Cq NTC lub które nie są amplifikowane, należy uznać za zahamowane. Jeśli w próbkach nie ma żadnych inhibitorów, to wszystkie amplifikacje IPC powinny mieć ścisłe grupowanie na wykresie z wartościami Cq zbliżonymi do NTC (Rysunek 6).

W końcu, testy in situ miały miejsce. Dwadzieścia próbek wody z rzeki Clinch i trzy próbki terenowe zostały przefiltrowane w dniach 25-26 września 2019 r. w odległości 500 metrów od złoża małży, o którym wiadomo, że ma A. ligamentina. Około czterech próbek wody o objętości 1 l przefiltrowano w każdym miejscu pobierania próbek. Lokalizacje obejmują dno dna łoża małży w strumieniu, dno dna łoża małży w pobliżu brzegu, 100 m w dół koryta w strumieniu, 500 m w dół od dna w strumieniu i 500 m w dół dna w pobliżu brzegu (Rysunek 7). Po powrocie do laboratorium każdy filtr został przecięty na pół, a DNA zostało wyekstrahowane tylko z połowy filtra. Pozostałą połowę filtra dla każdej próbki przechowywano w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Próbki zostały następnie przeprowadzone przy użyciu testu A.lig.1 zmultipleksowanego z IPC. Z 23 próbek stwierdzono, że pięć jest zahamowanych. Próbki te rozcieńczono w stosunku 1:10, a rozcieńczenia przeprowadzono ponownie. Dziewiętnaście z 20 próbek terenowych amplifikowano za pomocą zaprojektowanego testu. Spośród tych 19 próbek, pięć było powyżej LOD i LOQ testu wynoszącego 5 kopii/reakcję; co oznacza, że w większości próbek wykryto eDNA, ale na poziomie, na którym prawdopodobne jest wystąpienie wyników fałszywie ujemnych, a test nie mógł z całą pewnością określić liczby kopii dla tych 14 próbek. Niemniej jednak od 75 do 100% z czterech powtórzeń miejsc biologicznych zostało amplifikowanych w każdym miejscu pobierania próbek. Dwa z trzech ślepych strzałów były negatywne, podczas gdy jedna ślepa próba pola wykazała wzmocnienie, podkreślając znaczenie czystej techniki w terenie.

Rysunek 1: Przebieg pracy przy budowie bazy danych sekwencji mitochondrialnego DNA.Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Dopasowanie sekwencji dla gatunków małży rzecznych Clinch z prospektywnymi starterami i sondami do testu Actinonaias ligamentina ND1. Startery do przodu w kolorze ciemnozielonym, sonda w kolorze czerwonym i starter wsteczny w kolorze jasnozielonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykłady krzywej standardowej i regresji liniowej. Przykład dopuszczalnej krzywej wzorcowej otrzymanej ze amplifikacji trzech powtórzeń każdy, z sześciu rozcieńczeń wzorcowych. 10-krotny szereg rozcieńczeń wzorcowych z najwyższym stężeniem wzorca po lewej stronie, ze stężeniami malejącymi przesuwającymi się w prawo. Linia pozioma przecinająca wszystkie ślady jest progiem cyklu przy oznaczaniu ilościowym (Cq). W miejscu, w którym każdy ślad przekracza ten próg, określa się Cq. B. Regresja liniowa wykonana z replik standardowych przedstawionych na rysunku 3A. Powtórzenia rozcieńczeń wzorcowych wykreśla się w okręgach, a niewiadome (próbki) wykreśla się za pomocą x. Sprawność wynosi 98,9%, r² zbliża się do 1,0, a nachylenie -3,349. C. Przykład słabej krzywej wzorcowej otrzymanej ze amplifikacji trzech powtórzeń każdy, z sześciu rozcieńczeń wzorcowych. D. Regresja liniowa tworząca krzywą wzorcową dla powtórzeń wzorcowych wzmocnionych w przykładzie 3C. Zwróć uwagę na słabą wydajność i wartości r². Należy również zauważyć, że tylko 4 z 6 standardów zostały wzmocnione. Jeśli po powtórzeniach krzywa wzorcowa nie ulega poprawie, problem może wynikać ze słabego zestawu starter/sonda, który nie amplifikuje docelowego DNA zgodnie z oczekiwaniami, w takim przypadku test ten nie powinien być brany pod uwagę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykłady konfiguracji płytek dla standardowych serii qPCR LOD i LOQ. Wzorce użyte w krzywej są w kolorze niebieskim, stężenie wzorca zmniejsza się od ciemnego do jasnoniebieskiego. Kontrola pozytywna DNA na zielono i kontrola bez matrycy (NTC) na żółto. Eksperymentalne stężenia wzorcowe w kolorze szarym z 24 kontrpróbami dla każdego rozcieńczenia wzorcowego. Serię rozcieńczeń rozsiano na dwóch płytkach (A, B), z których każda miała krzywą wzorcową, kontrolę dodatnią i NTC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Konfiguracja płytki i ślady amplifikacji z serii qPCR. A. Ustawienie płyty, wzorce pokazane na niebiesko, ciemniejszy kolor wskazujący na najwyższe stężenie wzorca. Kontrola pozytywna DNA w kolorze zielonym, brak kontroli matrycowych w kolorze żółtym (NTC), cele próbek w kolorze szarym. B. Ślady amplifikacji z serii qPCR. Standardy pokazane na niebiesko, kontrola pozytywna DNA na zielono, brak kontroli matrycowych na żółto, a niewiadome na czerwono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Ślady amplifikacji dla wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC). Ślady IPC dla wszystkich nieznanych próbek w kolorze purpurowym i IPC z kontroli bez szablonu (NTC) pokazane na pomarańczowo z trójkątami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 7: Mapa przedstawiająca miejsca pobierania eDNA z łoża małży w rzece Clinch wzdłuż granicy Wirginii i Tennessee. Próbki pobrano w Wallens Bend na dnie złoża, 100 m w dół dna dna dna i 500 m w dół dna. Stanowiska zbierano albo na środku strumienia (w strumieniu), albo w odległości około 1 – 2 metrów od linii brzegowej (brzegu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

składnik	nazwa	Sekwencja 5' – 3'		Etykieta fluorescencyjna
Podkład do przodu	A.lig.1-f	CCCTCATCACGTACCTCTTAATC
Podkład odwrotny	A.lig.1-r	GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA
Sondy	Sonda A.lig.1	TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT		Fam

Tabela 1: Zaprojektowany test qPCR Actinonaias ligamentina (A.lig.1), w tym sekwencje dla starterów do przodu i do tyłu oraz sondy.

gatunek	Wzmacniane	W rzece Clinch
1. Actinonaias ligamentina	tak	tak
2. Actinonaias pectorosa	Nie	tak
3. Amblema plicata	Nie	tak
4. Corbicula spp.	Nie	tak
5. Cumberlandia monodonta	Nie	tak
6. Cyklonaje gruźlice (Cyclonaias tuberculata)	Nie	tak
7. Cyprogenia stegaria	Nie	tak
8. Elliptio dilatata	Nie	tak
9. Epioblasma brevidens	Nie	tak
10. Epioblasma capsaeformis	Nie	tak
11. Epioblasma florentina aureola	Nie	tak
12. Epioblasma triquetra	Nie	tak
13. Fusconaia cor	Nie	tak
14. Fusconaia subrotunda	Nie	tak
15. Lampsilis ovata	Nie	tak
16. Lampsilis siliquoidea	Nie	Nie
17. Lasmigona costata	Nie	tak
18. Lemiox rimosus	Nie	tak
19. Lexingtonia dolabelloides	Nie	tak
20. Medionidus conradicus	Nie	tak
21. Plethobasus cyphyus	Nie	tak
22. Pleurobema plenum	Nie	tak
23. Ptychobranchus fasciolaris	Nie	tak
24. Ptychobranchus subtentus	Nie	tak
25. Quadrula pustulosa	Nie	tak
26. Strophitus undulatus	Nie	tak
27. Irys Villosa	Nie	tak

Tabela 2: Lista gatunków używanych do badania swoistości in vitro testu A.lig.1. Test amplifikował genomowe DNA celu (Actinonaias ligamentina) i nie amplifikował żadnego z gatunków niedocelowych.

składnik	Sekwencja 5'-3'
Actinonaias ligementina standard	CCCTCATCACGTACCTCTTAATCCTATTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA
	AAGCCCTCGGGTACTTTCAAATCCGAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC
	CCCAACCATTAGCAGATGCTCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT
	CAAACTACCTACCCTTCATCTCTTAACCCCAACCACTATGTTAATTTTAGTTAGACTTT
	GACAATTATTTCCATCCTTTATANTATCATCCCAAATTTTTGGTATGCTCCTATTCT
	TGTGTATCTCCCCCCTAGCTGTTTATACAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA
	AATATGCCCTTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCAAACCATTTTATGAGGTTACAA
	TAAC
Szablon IPC (Hem-T)	CTACATAAGTAACACCTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTGTCCCTCGAATCTCAGACGCT
	GTATGACAGTCTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGGCTCTCTCTCTCTCTCAAGGACTGCAC

Tabela 3: Sekwencja (5'-3') wzorca Actinonaias ligamentina i szablonu IPC (Hem-T) użytego do tego testu. Sekwencja starterów do przodu i do tyłu jest pogrubiona i kursywą, a sekwencja sondy jest podkreślona.

powiedział:

składnik	nazwa	Sekwencja 5' – 3'		Etykieta fluorescencyjna
Podkład do przodu	HemT-F	TCTGAGTGTCCCTCGAATCT
Podkład odwrotny	HemT-R	GCAGTCCTTGAGAACATAGAGC
Sondy	HemT-P	TGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCG		Cy5

Tabela 4: Test wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC), w tym sekwencje dla starterów do przodu i do tyłu oraz sondy.

pkt.

Objętość na próbkę (μl)	składnik
10	Mistrz środowiskowy
1	20uM A. lig.1 F/R mix
1	Sonda 2.5uM A. lig.1
1	Mieszanka podkładowa 5uM IPC (HemT-F/ R)
0,75	Sonda IPC 2,5 uM (HemT-P)
1,5	1 X 103 stężenie matrycy IPC
Godzina 2,75	H20
cyfra arabska	próbka
20	Całkowita objętość

Tabela 5: Mieszanka PCR użyta do testu A.lig.1 multipleksowana z testem IPC.

Rozdział

krok		Temperatura (°C )	Godzina
1	Początkowa denaturacja	95 Rozdział 95	Czas trwania: 10 min
cyfra arabska	Deturat	95 Rozdział 95	15 sekund
3	Wyżarzanie	60	1 min
4	Przejdź do kroku 2, powtórz 39X

Tabela 6: Warunki reakcji dla testu A.lig.1.

Dyskusja

Podobnie jak w przypadku każdego badania, zdefiniowanie pytania, na które należy odpowiedzieć, jest pierwszym krokiem, a projekt testu eDNA zależy od zakresu badania²⁶. Na przykład, jeśli celem badań lub ankiety jest wykrycie jednego lub kilku gatunków, najlepszy jest ukierunkowany test oparty na sondzie. Jeśli jednak celem jest ocena większego zestawu lub zbiorowiska gatunków, lepiej nadają się testy metabarcodingu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Po ustaleniu, jakie podejście należy przyjąć, zaleca się przeprowadzenie badania pilotażowego obejmującego zaprojektowanie testu, testowanie i optymalizację²⁴. Projekt testu rozpoczyna się od wykazu gatunków zgodnie z opisem na rysunku 1. Wykaz ten będzie podstawą do zrozumienia, jak dobrze test działa pod względem swoistości i zakresu geograficznego^{, do którego} można go zastosować^. Zachęca się do zaprojektowania testu dla określonego obszaru geograficznego, co umożliwi projektantowi lepsze przetestowanie testu pod kątem reaktywności krzyżowej z innymi gatunkami na tym obszarze oraz uświadomienie sobie ograniczeń, jakie niesie to ze sobą w odniesieniu do rozszerzenia testu na inne obszary, na których może występować gatunek docelowy²⁴. Gdy lista jest kompletna, sekwencje można pobrać z publicznych genetycznych baz danych. Ponieważ te bazy danych są niekompletne²⁷, należy zsekwencjonować jak najwięcej gatunków w wykazie we własnym zakresie, aby uzupełnić lokalną referencyjną bazę danych sekwencji, które zostaną wykorzystane w projekcie testu. Priorytetowo traktuj współwystępujące blisko spokrewnione gatunki, ponieważ są to najbardziej prawdopodobne gatunki niebędące celami, które się wzmocnią. Skupienie się na wszystkich gatunkach należących do tego samego rodzaju lub rodziny co gatunek docelowy jest dobrym punktem wyjścia. Porównania z blisko spokrewnionymi gatunkami pomogą zidentyfikować regiony sekwencji unikalne dla gatunku docelowego. Może to pomóc w ustaleniu, jak test może działać w innych systemach lub lokalizacjach. Regiony mitochondrialne są zwykle wybierane do opracowywania testów, ponieważ więcej informacji o sekwencji z szerszej gamy gatunków jest dostępnych w genach mitochondrialnych, które zostały wykorzystane w projektach kodu kreskowego życia, a także dlatego, że mitochondrialne DNA jest obecne w znacznie większym stężeniu w kopiach / komórkę niż DNA jądrowe 24,28,29. Wiele regionów genów powinno zostać ocenionych w celu dalszego rozwoju testu, ponieważ pokrycie sekwencji różni się w zależności od taksonów w bazach danych repozytorium genetycznego. Po utworzeniu tej lokalnej bazy danych sekwencji referencyjnych, do projektowania testów starter/sonda wykorzystuje się kombinację ręcznej wizualizacji wyrównanych danych sekwencji i programów komputerowych. Nie należy polegać wyłącznie na oprogramowaniu, aby określić, które testy należy przetestować. Ważne jest, aby wizualnie zweryfikować ustawienia, w których startery i sondy znajdują się na celach i poza celami, aby lepiej zrozumieć, jak mogą one działać w PCR. Wreszcie, badania przesiewowe i optymalizacja testów obejmują trzy poziomy (in silico, in vitro i in situ)6,7,24,25. Projektowanie i testowanie in silico jest ważne dla stworzenia krótkiej listy testów z dużą szansą na sukces, ale badania empiryczne (in vitro) mają kluczowe znaczenie dla wyboru testu o najlepszej rzeczywistej wydajności. Optymalizacja i testowanie testów in vitro obejmuje pomiar wydajności reakcji oraz określenie czułości i swoistości testu. Granice wykrywalności i oznaczania ilościowego to dwa parametry często pomijane przy opracowywaniu testów, ale ważne dla interpretacji danych. Przeprowadzając wiele powtórzeń krzywych wzorcowych dla testu, LOD i LOQ można łatwo zmierzyć ^1,5,30. Niewiele badań omawia wyniki w odniesieniu do LOD lub LOQ testu, ale Sengupta i in. (2019) włączają LOD i LOQ swojego testu do interpretacji danych i grafiki, aby lepiej zrozumieć ich wyniki³¹. Wewnętrzne kontrole dodatnie powinny być również multipleksowane do zaprojektowanego testu. Bez przeprowadzenia testów na inhibicję PCR w próbkach mogą wystąpić wyniki fałszywie ujemne^24,32. Proponujemy zastosowanie multipleksowanego testu IPC z testem docelowym jako najprostszą metodą testów hamowania PCR²³. Wreszcie, konieczne jest przeprowadzenie badania in situ testu z próbek pobranych w terenie i pobranych w laboratorium, aby zapewnić amplifikację docelową w próbkach środowiskowych²⁴.

Istnieją ograniczenia w stosowaniu specyficznych dla gatunku, opartych na sondzie testów qPCR z próbkami eDNA. Na przykład projektowanie wielu testów do testowania może być ograniczone dostępnością sekwencji, a kompromis może być konieczny w odniesieniu do aspektów wydajności testu. Wybory te muszą być podyktowane celami badania i muszą być raportowane wraz z wynikami²⁶. Na przykład, jeśli celem jest wykrycie rzadkiego gatunku i spodziewanych jest niewiele wyników pozytywnych, można zastosować test o niedoskonałej swoistości (tj. amplifikacji gatunków niedocelowych), jeśli wszystkie wykrycia zostaną zweryfikowane przez sekwencjonowanie. Jeśli celem jest monitorowanie zasięgu geograficznego gatunku, a dane dotyczące stężenia eDNA nie są potrzebne, można zastosować test o niedoskonałej wydajności, a dane podać tylko jako procent wykrywalności. Ponadto, dopóki wszystkie potencjalne współplemieńce nie zostaną przetestowane w laboratorium, co jest rzadko możliwe, nie można poznać z absolutną pewnością prawdziwej swoistości testu. Na przykład test został zaprojektowany i przetestowany na kilku gatunkach małży słodkowodnych w rzece Clinch. Aby użyć tego testu w innym systemie rzecznym, musielibyśmy przetestować go na zestawie gatunków w nowej lokalizacji. Zmienność genetyczna w obrębie gatunku lub populacji, która nie jest badana podczas opracowywania testu, może również wpływać na swoistość. Wreszcie, nawet jeśli test został zweryfikowany jako posiadający wysoką wydajność techniczną; Warunki zmieniają się podczas pracy w terenie. Warunki niezwiązane z testem, takie jak przepływ wody, pH i zachowanie zwierząt, mogą zmienić wykrywalność eDNA, podobnie jak wykorzystanie różnych protokołów pobierania i ekstrakcji eDNA. Stosowanie testów, które są zoptymalizowane i dobrze opisane, ułatwi zrozumienie wpływu takich parametrów na wykrywanie eDNA.

Dziedzina eDNA dojrzewa poza etap analizy eksploracyjnej do coraz większej standaryzacji metod i technik. Osiągnięcia te poprawią naszą wiedzę na temat technik, możliwości i ograniczeń eDNA. Proces optymalizacji, który opisaliśmy powyżej, poprawia czułość, swoistość i odtwarzalność testu. Ostatecznym celem tego udoskonalenia i standaryzacji metod eDNA jest poprawa zdolności badaczy do wyciągania wniosków na podstawie danych eDNA, a także zwiększenie zaufania użytkowników końcowych i interesariuszy do wyników.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96 Miejsce Regały dwustronne z pokrowcami	Globe Scientific	456355AST
Rękawice do czyszczenia (np. lateks, nitryl itp.)	Kimberly-Clark	43431, 55090
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	1855196
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 ml	Fisher Scientific	5408129
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 2,0 ml	Fisher Scientific	2681332
96-dołkowe płytki do PCR z twardą skorupą, niskoprofilowe, cienkościenne, z listwą przypodłogową, białe/ przezroczyste	startery
IPC	Integrated DNA Technologies, Inc.	brak	produkt niestandardowy
Sondy IPC PrimeTime qPCR	Integrated DNA Technologies, Inc.	brak	produkt niestandardowy
IPC Ultramer DNA Oligo syntetyczny szablon	Integrated DNA Technologies, Inc.	brak	produktu niestandardowego
Labnet MPS 1000 Kompaktowa mini wirówka do płytek PCR	Labnet	C1000
	Różne-Każda		mikrowirówka, która mieści probówki 1,5 ml i 2,0 ml, jest zazwyczaj w porządku.
Folia uszczelniająca Microseal 'B' PCR, klej, optyczna	Bio-Rad	MSB1001
Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)	Invitrogen	AM9932
GP LTS 1000 i mikro; L F 768A/8	Końcówki	30389272
GP LTS 20 µ L F 960A/10	30389274		Rainin
GP LTS 200 µ L F 960A/10	Pipety 30389276
	Rainin Rainin	Różne	W zależności od preferencji laboratoryjnych pipety ręczne lub elektroniczne mogą być używane przy różnych maksymalnych objętościach.
TaqMan Environmental Master Mix 2.0	Thermo Fisher Scientific	4396838
Docelowe startery do przodu i do tyłu	Integrated DNA Technologies, Inc.	brak	produkt niestandardowy
Target PrimeTime qPCR Probes	Integrated DNA Technologies, Inc.	brak	produkt niestandardowy
Docelowy syntetyczny fragment genu gBlock	Integrated DNA Technologies, Inc.	brak	produktu niestandardowego. używany do serii standardowych rozcieńczeń qPCR
Bufor TE	Invitrogen	AM9849
VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER	Fisher Scientific	50728002