Artykuł metodologiczny

Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61825

⸱

5 listopada 2020

 ,  ,  , 
1Columbia Environmental Research Center, U.S. Geological Survey

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Środowiskowe testy DNA wymagają rygorystycznego projektowania, testowania, optymalizacji i walidacji przed rozpoczęciem zbierania danych terenowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który przeprowadza użytkowników przez każdy etap projektowania specyficznego dla gatunku, opartego na sondzie testu qPCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA gatunku docelowego z próbek środowiskowych.

Streszczenie

Opracowywane są nowe, nieinwazyjne metody wykrywania i monitorowania obecności gatunków, które pomagają w zarządzaniu rybołówstwem i ochroną dzikiej przyrody. Wykorzystanie próbek środowiskowego DNA (eDNA) do wykrywania makrobioty jest jedną z takich metod, która szybko staje się popularna i jest wdrażana w krajowych programach zarządzania. W tym miejscu skupiamy się na opracowaniu specyficznych dla gatunku testów celowanych do zastosowań ilościowych PCR (qPCR) opartych na sondzie. Stosowanie qPCR opartego na sondzie zapewnia większą specyficzność niż jest to możliwe w przypadku samych starterów. Co więcej, możliwość ilościowego określenia ilości DNA w próbce może być przydatna w naszym zrozumieniu ekologii eDNA i interpretacji wzorców wykrywania eDNA w terenie. Przy opracowywaniu i testowaniu tych testów należy starannie rozważyć, aby zapewnić czułość i swoistość wykrywania gatunków docelowych w próbce środowiskowej. W tym protokole określimy kroki potrzebne do zaprojektowania i przetestowania testów opartych na sondach w celu wykrycia gatunku docelowego; w tym tworzenie baz danych sekwencji, projektowanie testów, wybór i optymalizacja testów, testowanie wydajności testów i walidacja w terenie. Wykonanie tych kroków pomoże uzyskać wydajny, czuły i specyficzny test, który może być używany z pewnością. Demonstrujemy ten proces za pomocą naszego testu przeznaczonego dla populacji błotnika (Actinonaias ligamentina), gatunku małża słodkowodnego występującego w rzece Clinch w USA.

Wprowadzenie

Badacze i menedżerowie coraz bardziej interesują się wykorzystaniem środowiskowych testów DNA do wykrywania gatunków. Przez trzy dekady ilościowy lub rzeczywisty PCR (qPCR/rtPCR) był stosowany w wielu dziedzinach do specyficznego dla sekwencji wykrywania i kwantyfikacji kwasów nukleinowych1,2. W stosunkowo nowej dziedzinie badań nad eDNA stosowanie tych testów ze standardową krzywą do ilościowego oznaczania kopii docelowego DNA na objętość lub masę próbki eDNA stało się obecnie rutynową praktyką. Sekwencje mitochondrialnego DNA są na ogół ukierunkowane w testach eDNA, ponieważ genom mitochondrialny jest obecny w tysiącach kopii na komórkę, ale możliwe są również testy dla sekwencji jądrowego DNA lub RNA. Ważne jest, aby zrozumieć, że opublikowane testy próbek eDNA nie zawsze są równe pod względem wydajności. Wiarygodność testu w wykrywaniu tylko DNA gatunku docelowego (tj. swoistość) i wykrywaniu małych ilości docelowego DNA (tj. czułość) może się znacznie różnić ze względu na różnice w sposobie zaprojektowania, selekcji, optymalizacji i testowania testu. Raportowanie ilościowych miar wydajności testów było wcześniej w dużej mierze pomijane, ale ostatnio pojawiają się standardy mające na celu poprawę przejrzystości w opracowywaniu testów3,4,5,6,7,8.

Optymalizacja i raportowanie pomocy w testach w projektowaniu badań i interpretacji wyników badań eDNA. Testy, które reagują krzyżowo z DNA gatunków niebędących gatunkami docelowymi, mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wykryć, podczas gdy testy o niskiej czułości mogą nie wykrywać DNA gatunku docelowego, nawet jeśli jest ono obecne w próbce (wyniki fałszywie ujemne). Zrozumienie czułości i selektywności testu pomoże w określeniu nakładu pracy związanego z pobieraniem próbek w celu wykrycia rzadkich gatunków. Ponieważ istnieje wiele naturalnych źródeł zmienności w eDNA, badania muszą w jak największym stopniu ograniczyć kontrolowane źródła zmienności, w tym w pełni zoptymalizować i scharakteryzować test eDNA3.

Warunki, które bezpośrednio wpływają na specyficzność lub czułość testu, zmienią jego działanie. Może się to zdarzyć w różnych warunkach laboratoryjnych (tj. różne odczynniki, użytkownicy, maszyny itp.). W związku z tym protokół ten powinien zostać ponownie przeanalizowany przy stosowaniu testu w nowych warunkach. Nawet testy dobrze scharakteryzowane w literaturze powinny być testowane i optymalizowane, gdy zostaną przyjęte przez nowe laboratorium lub przy użyciu różnych odczynników (np. roztwór master-mix)5,9. Swoistość testu może ulec zmianie w przypadku zastosowania do innego regionu geograficznego, ponieważ test jest stosowany do próbek z nowej społeczności biotycznej, która może obejmować gatunki niebędące przedmiotem zwalczania, na których test nie został przetestowany, i może wystąpić zmienność genetyczna u gatunku docelowego. Ponownie, test powinien zostać ponownie oceniony, gdy jest używany w nowej lokalizacji. Warunki polowe różnią się od warunków laboratoryjnych, ponieważ w terenie istnieje większe prawdopodobieństwo, że inhibitory PCR będą obecne w próbkach. Inhibitory PCR bezpośrednio wpływają na reakcję amplifikacji, a tym samym wpływają na wydajność testu. Z tego powodu podczas opracowywania testu eDNA wymagana jest wewnętrzna kontrola pozytywna.

Na koniec, warunki środowiskowe w terenie mogą wpływać na cząsteczki DNA gatunku docelowego i ich przechwytywanie poprzez degradację, transport i zachowanie DNA. Co więcej, różne protokoły pobierania i ekstrakcji DNA różnią się pod względem skuteczności i zdolności do zatrzymywania DNA. Należy jednak zauważyć, że procesy te wpływają na wykrywalność eDNA, ale nie na wydajność testów molekularnych. W związku z tym wykrywalność DNA od gatunków docelowych w próbkach terenowych jest funkcją zarówno parametrów technicznych testu qPCR, jak i warunków terenowych oraz protokołów pobierania, przechowywania i ekstrakcji. Korzystając z dobrze scharakteryzowanego i wysoce wydajnego testu, użytkownicy mogą czuć się pewni jego możliwości; dzięki czemu naukowcy mogą teraz skupić się na zrozumieniu zewnętrznych czynników testowych (tj. zmiennych środowiskowych, różnic w protokołach wychwytywania lub ekstrakcji) wpływających na wykrywanie eDNA.

Tutaj skupiamy się szczególnie na wydajności technicznej testów poprzez rygorystyczne projektowanie i optymalizację. Demonstrujemy protokół za pomocą testu opartego na sondzie opracowanego do wykrywania małża słodkowodnego, mukleta (Actinonaias ligamentina), z wody pobranej w rzece Clinch w USA. Niedawno Thalinger i in. (2020) przedstawili wytyczne dotyczące walidacji celowanych testów eDNA. Projekt testu zgodny z naszym protokołem przyniesie test na poziomie 4 Thalingera i in. oraz dodatkowy krok w kierunku poziomu 56. W tym momencie wydajność techniczna testu zostanie zoptymalizowana i będzie on gotowy do regularnego stosowania w zastosowaniach laboratoryjnych i terenowych. Dalsze wykorzystanie testu w eksperymentach laboratoryjnych, mezokosmicznych i terenowych może następnie odpowiedzieć na pytania dotyczące wykrywania eDNA i czynników wpływających na wykrywalność, co jest ostatnim krokiem walidacji na poziomie 56.

Protokół

1. Generowanie bazy danych sekwencji mitochondrialnego DNA z docelowych i niedocelowych gatunków będących przedmiotem zainteresowania

  1. Zdefiniuj pytanie, cele i system, do którego się odnosisz. Zidentyfikuj gatunki docelowe do wykrycia eDNA. Należy określić system geograficzny, w którym test będzie stosowany. Sporządź listę interesujących gatunków, w tym gatunków docelowych, gatunków sympatrycznych (współwystępujących) w obrębie tych samych taksonów (zwykle rzędu lub poziomu rodziny) oraz blisko spokrewnionych gatunków allopatrycznych, tych, które mogą nie znajdować się w tym samym położeniu geograficznym co cel (Rysunek 1).
    UWAGA: W tym przypadku celem były populacje gatunku A. ligamentina w rzece Clinch.
  2. Wyszukaj i pobierz sekwencje z wielu regionów genów dla gatunków znajdujących się na liście z kroku 1. Można korzystać z baz danych sekwencji, takich jak NCBI (National Center for Biotechnology Information), BOLD (Barcode of Life Database), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) i DDBJ (DNA Data Bank of Japan). NCBI, EMBL i DDBJ udostępniają informacje o sekwencji.
    1. Korzystając z bazy danych nukleotydów NCBI, wyszukaj organizm docelowy (np. Actinonaias ligamentina) i region genu (np. oksydazę cytochromu c I (COI) lub dehydrogenazę NADH 1 (ND1); Przykładowy ciąg wyszukiwania: Actinonaias ligamentina AND ND1)
    2. Następnie wybierz wszystkie sekwencje, które są zgodne ze specyfikacjami, i wybierz opcję Wyślij do. Wybierz Kompletny rekord, Plik i format pobierania jako GenBank lub FAPSA, a następnie Utwórz plik. Te sekwencje są teraz zapisywane na komputerze.
    3. Powtórz te kroki dla wszystkich gatunków z wykazu zdefiniowanego w kroku 1. Sekwencje dla każdego regionu genu należy przechowywać w osobnym pliku, ponieważ będą one analizowane oddzielnie.
      1. Pobierz wszystkie istotne sekwencje (lub dużą, reprezentatywną część sekwencji) dla gatunków docelowych zidentyfikowanych w kroku 1. Jeśli to możliwe, uwzględnij warianty geograficzne.
      2. Powtórz sekwencje wyszukiwania i pobierania dla pokrewnych i sympatrycznych gatunków niebędących przedmiotem zwalczania z tej samej grupy taksonomicznej, które zostały zidentyfikowane w kroku 1 (np. jeśli gatunkiem docelowym jest muklet (A. ligamentina), sekwencje pobierania dla wszystkich innych gatunków małży słodkowodnych z rodziny Unionidae, które występują w systemie będącym przedmiotem zainteresowania).
      3. Powtórz wyszukiwanie i pobierz dla blisko spokrewnionych, ale allopatrycznych (geograficznie odrębnych) gatunków wymienionych w kroku 1.1.
        UWAGA: Nie wszystkie gatunki (docelowe i niedocelowe) będą dostępne w publicznych bazach danych. Zwiększenie lokalnej referencyjnej bazy danych poprzez amplifikację i sekwencjonowanie zweryfikowanych taksonomicznie okazów gatunków będących przedmiotem zainteresowania we własnym zakresie. Jeśli pracujesz z gatunkiem, który ma dużą różnorodność genetyczną wewnątrz gatunku lub pracujesz na dużym obszarze geograficznym, na którym można spodziewać się wariantów geograficznych, zbierz sekwencje z całego zakresu.

2. Projekt testu

  1. Dopasuj sekwencje z każdego regionu genu osobno za pomocą oprogramowania do dopasowywania, które można znaleźć w różnych programach do edycji sekwencji genetycznych i bioinformatycznych. Wykonaj to wyrównanie dla każdego z różnych regionów genu.
    1. Na przykład za pomocą oprogramowania Geneious Prime (https://www.geneious.com) zaimportuj pobrane pliki sekwencji do programu.
    2. Utwórz osobne foldery dla każdego regionu genu.
    3. W folderze zawierającym sekwencje z jednego regionu genu zaznacz wszystkie sekwencje.
    4. Użyj narzędzia Wielokrotne wyrównanie, aby utworzyć wyrównanie nukleotydowe wybranych sekwencji. Może istnieć kilka opcji dla rodzaju wyrównania, użycie wyrównania Geneious lub MUSCLE i parametrów domyślnych działa dobrze.
  2. Wybierz obiecujące regiony do zaprojektowania testu dzięki wizualizacji wyrównanych danych sekwencji. Region, w którym dostępnych jest wiele danych sekwencyjnych dla gatunków będących przedmiotem zainteresowania, jest wysoce rozbieżny między gatunkami i wykazuje niską zmienność wewnątrzgatunkową, jest dobrym kandydatem. Zwiększy to prawdopodobieństwo, że zaprojektowane startery i sondy będą w stanie odróżnić cel od gatunków niedocelowych, zapewniając jednocześnie wzmocnienie wariantów wewnątrzgatunkowych podczas testu.
  3. Projektowanie starterów testowych i sondy.
    1. Użyj oprogramowania do projektowania testów qPCR i postępuj zgodnie z instrukcjami. Wykorzystano tu narzędzie PrimerQuest Tool (https://www.idtdna.com/) firmy IDT do zaprojektowania 5 zestawów testów qPCR.
    2. Wklej sekwencję zaznaczoną w kroku 2.2 w polu Sekwencja. Jeśli wyrównanie utworzyło odstępy, usuń je z sekwencji.
    3. Wybierz qPCR 2 Startery + sonda w opcji Wybierz swój projekt.
    4. Pobierz zalecane testy.
    5. Skopiuj sekwencje ze startera do przodu pierwszego testu i wyszukaj tę sekwencję startera w dopasowaniu utworzonym w kroku 2.1.4. Jeśli używasz Geneious Prime, użyj narzędzia Annotate and Predict (Adnotacja i przewidywanie), aby dodać region startera do wyrównania. Zrób to dla wszystkich kombinacji startera i sondy (Rysunek 2).
    6. Należy sprawdzić te obszary wyrównania pod kątem zmienności w obrębie gatunków docelowych, jak również w obrębie gatunków współwystępujących.
      1. Jeśli występuje wewnątrzgatunkowa zmienność genetyczna, należy poszukać testów, w których startery i sonda nie mieszczą się w tych regionach.
      2. Aby zapobiec namnażaniu się gatunków niedocelowych, należy szukać niezgodności z gatunkami niedocelowymi. Wybierz testy z największą liczbą niezgodności do dalszej walidacji. Currier i in. (2018) sugerują wybór zestawów z co najmniej dwoma z trzech regionów (dwoma starterami lub starterem i sondą) mających co najmniej dwie niezgodności ze wszystkimi gatunkami niedocelowymi. Należy jednak pamiętać, że niezgodności w sondzie w mniejszym stopniu przyczyniają się do specyficzności10.
        UWAGA: Różnice w obrębie 3 par zasad na końcu 3' każdego startera zwiększają specyficzność lepiej niż różnice na końcu 5' starterów10.
    7. W projektowaniu testu należy wziąć pod uwagę następujące ważne parametry.
      1. Określ temperatury topnienia i wyżarzania starterów i sondy. Idealnie, temperatura topnienia (Tm) starterów powinna wynosić od 60 do 64 °C i nie przekraczać 2 °C od siebie, a Tm sondy powinna być o 6-8 stopni wyższa niż Tm starterów. Ustaw temperaturę wyżarzania (Ta) reakcji qPCR o 5 °C poniżej temperatury topnienia, około 55-60 °C11.
      2. Sprawdź zawartość GC. Wybierz między 35 a 65% zawartości GC i unikaj regionów z 4 lub więcej kolejnymi Gs. Posiadanie 1 lub 2 Gs lub C w 5 ostatnich zasadach końca 3' startera (zacisk GC) może zwiększyć specyficzność, ponieważ pomogłoby starterowi w tworzeniu silniejszego wiązania12.
      3. Szukaj struktur spinki do włosów i dimerów. Przetestuj startery i sondę pod kątem przewidywanych struktur spinki do włosów i dimerów za pomocą programu do analizy oligonukleotydów (np. OligoAnalyzer -IDT13; OligoCalculator14). Struktury te mogą powodować wzmocnienie niedocelowe i niższą wydajność. Należy unikać testów, co do których przewiduje się, że utworzą te struktury.
      4. Określ długość podkładu. Celuj w startery o długości od 18 do 25 zasad i długość sondy od 20 do 25 zasad. Dłuższe startery i sondy mogą mieć niższą wydajność wzmocnienia.
      5. Określ długość amplikonu. Powinien wynosić od około 100 do 250 par zasad. Ten zakres jest na ogół wystarczająco krótki, aby zapewnić wysoką skuteczność PCR, ale wystarczająco długi, aby ułatwić weryfikację za pomocą sekwencjonowania Sanger4,15.
      6. Sondy projektowe. Upewnij się, że sondy nie mają podstawy G na końcu 5', ponieważ może to stłumić sygnał z zielonego i żółtego barwnika11. Zaprojektowaliśmy sondy z podwójnym hartowaniem, z hartownikami IDT 3IABkFQ i ZEN oraz fluoroforami FAM lub HEX.
        UWAGA: Określ sondy MGB: Sondy TaqMan MGB (minor groove binder) są często używane do badań eDNA. Ponieważ jednak sondy te są bardzo krótkie, mogą wiązać się z obiektami niebędącymi obiektami nawet przy niezgodności 2 lub 3 par zasad10.
      7. Określ sondę Tm. Temperatura topnienia sondy powinna być o 6-8°C wyższa niż starterów. Niższe temperatury zmniejszają skuteczność wiązania sondy.
      8. Określ długość i położenie sondy. Sonda powinna mieć długość od 20 do 25 pz i najlepiej powinna być umieszczona blisko miejsca wiązania podkładu na tym samym pasmie, nie zachodząc na nie.

3. Badania przesiewowe i optymalizacja testów

  1. Opracowywanie i testowanie testów in silico. Przed zamówieniem zestawów starter-sonda należy ocenić swoistość (potencjalną amplifikację niedocelową), testując amplifikację startera in silico.
    1. Przetestuj startery za pomocą NCBI's Primer-Blast16 lub podobnych programów, które mogą zidentyfikować potencjalne nie-cele w bazie danych NCBI nt/nr, które mogą się wzmocnić wraz z testem. W przypadku korzystania z podkładów w paście Primer-Blast w polu Użyj własnego podkładu w parametrach podkładu. W opcjach Parametry sprawdzania specyficzności pary starterów wybierz nr jako bazę danych i wpisz kolejność organizmu będącego przedmiotem zainteresowania (np. "Unionida" lub "Unionoida") w polu Organizm.
    2. Kontynuuj wizualną ocenę zestawów starterów/sond na podstawie wyrównanych danych sekwencji.
      1. Aby ocenić startery i sondy w tym samym czasie in silico, utwórz ciąg tekstowy startera do przodu, 12 N, sondy, 12 N i odwrotnego dopełnienia startera odwrotnego. Jeśli sekwencja sondy znajduje się w obrębie 12 par zasad jednego ze starterów, użyj liczby N odpowiadającej liczbie par zasad między starterem a sondą.
      2. Użyj wyszukiwania NCBI Nucleotide Blast (Blastn), aby przeszukać bazę danych nr 17. Użyj zakładki Taksonomia, aby wyszukać gatunki niedocelowe z niewielką liczbą niezgodności; Powinny one zostać przetestowane w laboratorium podczas optymalizacji testu.
        UWAGA: Testy in silico pomagają wykluczyć testy niespecyficzne, ale potencjalnie specyficzne testy muszą być testowane empirycznie (in vitro), ponieważ nie wszystkie gatunki mają sekwencje w genetycznych bazach danych, a startery i sondy mogą nadal wiązać się z niedocelowymi, nawet jeśli oprogramowanie uzna je za mało prawdopodobne.
  2. Wybierz od trzech do pięciu kombinacji startera/sondy do przetestowania w laboratorium.
  3. Zamów startery, sondy i syntetyczny wzorzec DNA, a także dodatkowe startery z ogonem M13 do sekwencjonowania amplikonów.
    1. Zamów syntetyczne startery i sondy oligonukleotydowe w firmie produkującej oligonukleotydy. Sondy są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym i wygaszaczem. Do testów, które muszą być multipleksowane, należy wybrać różne fluorofory. Sprawdź swój instrument qPCR, aby uzyskać listę fluoroforów, które instrument może wykryć.
    2. Zaprojektuj i zamów startery M13-ogonkowe do weryfikacji detekcji qPCR z sekwencjonowaniem Sangera, dodając sekwencję M13 Forward (-20), GTA AAA CGG CCA GT, do końca 5' startera do przodu i sekwencję M13 Reverse (-27), CAG GAA ACA GCT ATG AC, do końca 5' startera odwrotnego.
    3. Wzorzec syntetycznego DNA zawiera sekwencję docelową (w tym regiony startera) o znanym stężeniu w kopiach/μl. Określ ilościowo nieznane próbki na podstawie krzywej utworzonej przez znane stężenia tego wzorca (tj. krzywej wzorcowej). Zdobądź syntetyczny wzorzec od tej samej firmy, która produkuje startery i sondę. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi ponownego zawieszania i przechowywania. Rozcieńczyć roztwory w buforze TE nośnikiem tRNA przy użyciu wyrobów z tworzywa sztucznego o niskiej retencji w celu zmniejszenia hydrolizy i wiązania z powierzchniami.
      UWAGA: Jeśli krzywa wzorcowa nie działa dobrze (słaba wydajność PCR, patrz krok 3.4.2), spróbuj ponownie zawiesić wzorzec w wodzie lub Tris-HCl.
    4. Zawiesić startery i sondy w wodzie wolnej od nukleaz, buforze Tris-HCl lub TE w dogodnych stężeniach do użycia testowego. Ogólnie rzecz biorąc, rozcieńczyć zapasy robocze 20-krotnie w mieszance wzorcowej, aby uzyskać zoptymalizowane stężenie końcowe testu. Zawieszone olikleotydy przechowywać w stałej temperaturze -20 °C, gdy nie są używane.
  4. Optymalizacja i testowanie testów in vitro (w laboratorium). Odrzuć testy, które mają niską skuteczność, reagują krzyżowo ze współwystępującymi gatunkami lub mają słabą czułość18. Uwzględnij stosowanie wewnętrznej kontroli dodatniej (IPC) podczas opracowywania testu, jak również podczas badania rzeczywistych próbek.
    1. Najpierw znajdź optymalne wartości temperatury i stężenia startera/sondy dla testu. Po zoptymalizowaniu tych parametrów pod kątem wydajności PCR (krok 3.4.2), reaktywności krzyżowej (krok 3.4.3) i czułości (krok 3.4.4), przystąp do testowania testu za pomocą multipleksowanego IPC (krok 3.4.5).
      1. Przetestuj optymalną temperaturę wyżarzania (Ta) dla startera i sond przy użyciu gradientu temperatury PCR wyśrodkowanego o 5° C poniżej przewidywanej średniej Tm startera.
      2. Przetestuj optymalne stężenia startera i sondy. Zazwyczaj testuje się stężenia starterów 200 nM, 400 nM i 800 nM oraz stężenia sondy 75 nM, 125 nM i 200 nM.
    2. Utwórz krzywą standardową i określ wydajność oraz zakres liniowy. Przetestuj co najmniej sześć 10-krotnych rozcieńczeń syntetycznego wzorca DNA zawierającego sekwencję docelową, przy około 100 kopiach/reakcję do 105 kopii/reakcję (Rysunek 3A).
      1. Użyj oprogramowania qPCR, aby wykreślić wartość Cq (próg cyklu przy kwantyfikacji) każdego wzorca na osi y i logarytm o podstawie 10 początkowego stężenia wzorca w kopiach/reakcji na osi x. Oprogramowanie qPCR powinno automatycznie uruchomić regresję liniową (Rysunek 3B).
      2. Obliczyć wydajność na podstawie nachylenia regresji, E = -1 + 10(-1/nachylenie). Na przykład, jeśli nachylenie wynosi -3,4, E = -1 + 10(0,29) = 0,97 lub 97%. Należy również sprawdzić wartości r2, które wskazują, jak dobrze wzorce pasują do krzywej. Oprogramowanie qPCR również powinno to automatycznie obliczyć (Rysunek 3B). Dąż do wartości wydajności 100% (±10%) i wartości r2 ≥0,989,15,19,20,21,22.
      3. Sprawdź wzrokowo krzywą standardową pod kątem odchylenia, czyli odchyleń od regresji w stałym kierunku lub słabej wydajności krzywej standardowej, mierzonej wydajnością i wartościami r2 (Rysunek 3C i 3D).
    3. Specyficzność: Oceń reaktywność krzyżową z gatunkami niedocelowymi, aby zmniejszyć ryzyko wyników fałszywie dodatnich. W przypadku gdy wykrycie eDNA może skutkować kosztownymi decyzjami dotyczącymi zarządzania, należy zweryfikować pozytywne wykrycia za pomocą sekwencjonowania amplikonów.
      1. Niedocelowe: Przeprowadzenie testu w porównaniu z ekstrakcjami genomowego DNA z taksonomicznie zweryfikowanych okazów gatunków pokrewnych i gatunków współwystępujących geograficznie; przy czym najwyższym priorytetem jest przeprowadzenie testu na blisko spokrewnionych, współwystępujących gatunkach. Podobne całkowite stężenia DNA należy stosować zarówno dla próbek docelowych, jak i niedocelowych. Wybrane stężenie powinno prowadzić do amplifikacji z próbek gatunków docelowych w pobliżu środka zakresu liniowego krzywej wzorcowej. Amplifikację należy obserwować tylko w przypadku gatunków docelowych.
      2. Jeśli zaobserwuje się amplifikację inną niż docelowa, wyczyść i zsekwencjonuj produkt, aby zweryfikować jego tożsamość. Nierzadko obserwuje się zanieczyszczenie gatunkami docelowymi w próbkach tkanek gatunków niebędących gatunkami docelowymi, dlatego wszystkie amplifikacje na tym etapie należy zweryfikować za pomocą sekwencjonowania. Ponownie amplifikuj oczyszczone amplikony z testów specyficzności przy użyciu starterów ogoniastych M13 i sekwencjonuj za pomocą starterów M13.
        1. W laboratorium post-PCR przenieś produkty qPCR, które mają być sekwencjonowane, do świeżych probówek. Usuń resztki starterów i składników reakcji za pomocą zestawu do czyszczenia (np. Zestawu do oczyszczania MinElute PCR).
        2. Wykonać rozcieńczenia elucji w stosunku 1:100 i amplifikować 1 μl każdego z nich przez 30 cykli w reakcji PCR o objętości 50 μl ze starterami ogoniastymi M13 i polimerazą o wysokiej wierności (np. polimerazą DNA Phusion High-Fidelity).
        3. Uruchom 10 μl każdej reakcji na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy nie ma pojedynczego pasma o oczekiwanym rozmiarze. Jeśli nie zaobserwuje się żadnego pasma, zwiększ liczbę cykli lub ilość próbki. Jeśli zaobserwuje się wiele prążków, żel oczyść opaskę o oczekiwanym rozmiarze.
        4. Usuń resztki starterów i składników reakcji za pomocą zestawu do czyszczenia, jak powyżej, i zmierz stężenia DNA w elucjach.
        5. Skonfigurować reakcje sekwencjonowania za pomocą starterów M13 zgodnie z instrukcjami zakładu sekwencjonowania.
          UWAGA: Nigdy nie otwieraj amplifikowanych próbek w laboratorium qPCR. Przygotowanie próbek do sekwencjonowania w laboratorium przeznaczonym do pobierania próbek po PCR.
    4. Wrażliwość: Wrażliwość wpływa na prawdopodobieństwo wyników fałszywie ujemnych lub niewykrycia DNA gatunku docelowego, gdy jest on obecny. Ocenić granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) dla każdego testu. Na koniec należy przeprowadzić wewnętrzną kontrolę dodatnią (IPC) w celu oceny zahamowania PCR w próbkach. Multipleksuj i testuj ten test IPC z zaprojektowanym testem, aby upewnić się, że te dwa testy nie zakłócają się nawzajem.
      1. LOD: Wykonaj sześć 4-krotnych seryjnych rozcieńczeń wzorca syntetycznego DNA, z 8-24 powtórzeniami na standardowe rozcieńczenie (Rysunek 4). Oblicz najniższe stężenie początkowe przy wykrywalności 95%. Wykresy LOD i LOQ można generować za pomocą kalkulatora LOD/LOQ R script5.
        UWAGA: Dane poniżej LOD nie powinny być cenzurowane. Ze względu na specyfikę PCR nie ma dolnej granicy dla wyników prawdziwie dodatnich. LOD jest najwyższym stężeniem, poniżej którego można spodziewać się wystąpienia wyników fałszywie ujemnych.
      2. LOQ: Z tej samej serii rozcieńczeń obliczyć najniższe początkowe stężenie wzorca DNA kwantyfikowalne o współczynniku zmienności (CV) poniżej 35%.
        UWAGA: LOD i LOQ powinny być podane w kopiach/reakcji. W przypadku korzystania z zwalidowanego testu, gdy próbki terenowe amplifikują się poniżej LOQ, wyniki powinny być podawane jako % wykryć, a nie stężenia eDNA, ponieważ dokładnego stężenia nie można zmierzyć z pewnością5.
    5. Użyj wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) do przeprowadzenia testu na zahamowanie PCR. Hamowanie może prowadzić do zmniejszenia czułości i wyników fałszywie ujemnych. Zbadaj zdolność testu IPC do multipleksowania z testem docelowym.
      1. Test IPC można multipleksować z testem docelowym przy użyciu sondy z innym barwnikiem reporterowym niż test docelowy. Ten test IPC składa się z krótkiej syntetycznej sekwencji DNA z gatunku niespokrewnionego z taksonami docelowymi, włączonej do głównej mieszanki qPCR w niskim stężeniu około 102 kopii / reakcję, wraz ze starterem i sondami, które ją wykrywają. To niższe stężenie jest konieczne, aby uniknąć konkurencji z sekwencją docelową dla polimerazy i nukleotydów23.
      2. Porównaj wartość Cq szablonu IPC próbki z wartością szablonu IPC w kontrolce braku szablonu. W tej kontroli bez matrycy (NTC) jedynym wejściem DNA jest matryca IPC. Szablon IPC w tej reakcji powinien wzmocnić się zgodnie z oczekiwaniami. Jeśli matryca IPC w próbce amplifikuje się w 2 lub więcej cyklach różniących się od matrycy IPC w NTC, próbka eDNA jest hamowana. Próbki, które wykazują inhibicję, można rozcieńczyć w stosunku 1:10 i ponownie przetestować. Jeżeli próbka pozostaje zahamowana, należy ją usunąć z analizy.
  5. Opracowywanie i testowanie testów in situ
    1. W laboratorium: Jeśli możliwy jest dostęp do organizmu w laboratorium, jak również do gatunków sympatrycznych; pobrać próbki wody z pomieszczeń z tymi gatunkami, przetworzyć próbki i przetestować test na tych próbkach eDNA. Sekwencjonuj produkty jak powyżej, aby zweryfikować amplifikację zamierzonego celu przy użyciu spłonek ogoniastych M13.
    2. W terenie:
      1. Zidentyfikować miejsca, w których wiadomo, że organizm zwalczany występuje i o których wiadomo, że nie występują. Zaleca się, aby w każdym miejscu, w którym występuje gatunek docelowy, panowała pewna liczebność.
      2. Należy zdecydować, jakie objętości próbek i metody pobierania próbek (np. filtracja, odwirowanie itp.) zostaną zastosowane.
      3. Dołącz ślepą próbę polową lub kontrolę ujemną w każdym miejscu, jest to czysta woda, która została przyniesiona na miejsce w terenie, a następnie zebrana i przygotowana za pomocą tego samego sprzętu terenowego i protokołów, które są używane do pobierania próbek eDNA24. Celem ślepej próby polowej jest wykrycie zanieczyszczenia sprzętu do pobierania próbek i sprzętu polowego przywiezionego na miejsce. Weź ślepe badanie pola przed przetworzeniem próbek wody polowej.
      4. Weź wiele próbek wody na miejsce, najlepiej 3 próbki na miejsce.
      5. Po powrocie do laboratorium przetworzyć i pobrać próbki.
      6. Uruchom test przy użyciu płytki ustawionej podobnie jak Rysunek 5A, i porównaj stężenie eDNA i częstotliwość wykrywania ze znanymi różnicami w występowaniu i liczebności miejsc. Potwierdź wszystkie wykrycia za pomocą sekwencjonowania24,25.
        UWAGA: Powyższe zweryfikowałoby test za pomocą poziomu 4 skali Thalingera i in. (2020) scale6 (optymalizacja wydajności technicznej testu) i rozpoczęłoby gromadzenie danych wspierających walidację testu na poziomie 5. Poziom 5 obejmuje modelowanie prawdopodobieństwa i wykorzystanie testu do badań ekologii eDNA. Uważamy, że wykracza to poza zakres opracowywania podstawowych testów, ale zachęcamy do stosowania tych testów laboratoryjnych i sprawdzonych w terenie w celu poprawy projektowania testów i interpretacji danych.

Wyniki

Przy projektowaniu gatunkowo specyficznego testu qPCR dla mucket (A. ligamentina) pobrano dostępne sekwencje wszystkich gatunków Unionidae występujących w rzece Clinch. Do bazy referencyjnej włączono również gatunki blisko spokrewnione, takie jak Lampsilis siliquoidea, mimo że nie występują one w tej samej rzece. Nie wszystkie gatunki z interesującego nas systemu rzecznego zostały znalezione w GenBank, dlatego dodatkowe gatunki zsekwencjonowano we własnym zakresie. Sekwencje wyrównano za pomocą oprogramowania Geneious, a do zaprojektowania wielu testów wykorzystano oprogramowanie Primer Quest (IDT). Do wyrównania dodano pięć zestawów starterów i sond w celu oceny wizualnej (Rycina 2). Następnie przetestowano je in silico za pomocą Primer-Blast, po czym zamówiono je do dalszych testów in vitro. W laboratorium wszystkie testy sprawdzono przy użyciu ekstraktów DNA 27 dostępnych gatunków w celu weryfikacji specyficzności. Jeden test (A.lig.1) pomyślnie amplifikował wyłącznie gatunek docelowy (Tabela 1; Tabela 2). Test ten wybrano do dalszych badań wydajności, granicy wykrywalności (LOD) oraz granicy oznaczalności (LOQ). Długość amplikonu wynosi 121 par zasad. Tabela 3 przedstawia sekwencję użytą do syntetycznego standardu DNA dla A. ligamentina. Rycina 3A oraz Rycina 3B pokazują wyniki pomyślnego testu z dobrą wydajnością i wartościami r2. Rycina 3C oraz Rycina 3D przedstawiają test, którego krzywa standardowa wykazuje słabą wydajność; test ten został odrzucony. LOD i LOQ dla wybranego testu (A.lig.1) wyniosły 5.00 kopii/reakcję, co określono metodą dyskretną opisaną przez Klymus et al5. IPC zastosowany w układzie multipleksowym z testem (Tabele 3-6) nie wpłynął na krzywą standardową testu dla A. ligamentina. Stosowany przez nas IPC to fragment transkryptu HemT myszy. Test ten został wstępnie zaprojektowany przez IDT do innego zastosowania, jednak zmodyfikowaliśmy jego użycie jako IPC w aplikacjach eDNA w naszym laboratorium.

Prawidłowy przebieg qPCR powinien spełniać określone kryteria dla każdego miernika wydajności (tj. amplifikacji krzywej wzorcowej, pozytywnej kontroli DNA genomowego, kontroli bez matrycy oraz wewnętrznej kontroli pozytywnej). Standardy testu docelowego powinny wykazywać wykładnicze krzywe amplifikacji. Krzywe te powinny osiągnąć plateau w punkcie końcowym, jeśli zostanie przeprowadzona odpowiednia liczba cykli. Świadczy to o całkowitym zużyciu sondy fluorescencyjnej podczas reakcji i osiągnięciu maksymalnego poziomu fluorescencji. Standardy amplifikujące się później mogą nie osiągnąć plateau w ciągu 40 cykli. Kontrole pozytywne (DNA genomowe i IPC) powinny wykazywać taki sam wzorzec. Próbki nieznane mogą ulegać amplifikacji lub nie, jednak amplifikacja w próbkach nieznanych również powinna mieć charakter wykładniczy i osiągać plateau w punkcie końcowym (Rycina 5).

W wysokiej jakości qPCR rozcieńczenia standardów ulegają amplifikacji przy równomiernie rozmieszczonych wartościach Cq, wynoszących około 3,3 cykla dla każdej 10-krotnej różnicy w stężeniu. Każdy powtórz pomiaru rozcieńczenia standardu amplifikuje się w sposób ściśle zgrupowany, mając niemal taką samą wartość Cq (co reprezentują wartości r2). Wszystkie rozcieńczenia standardów powinny wykazać amplifikację (Rycina 3A). W przypadku qPCR niskiej jakości standardy mogą wykazywać kształt nieeksponencjalny, nierówną zmienność wartości Cq pomiędzy rozcieńczeniami, mogą nie osiągać plateau końcowego lub niektóre rozcieńczenia mogą w ogóle nie ulec amplifikacji (Rycina 3D).

Ważnymi parametrami krzywej wzorcowej są wydajność, r2, nachylenie oraz punkt przecięcia z osią y. Wydajność powinna mieścić się w przedziale 90%-110%, przy czym wartości idealne oscylują wokół 100%, a wartości r2 powinny być wyższe niż 0,98, z wynikami idealnymi zbliżającymi się do 1,015,22. Wartości nachylenia powinny mieścić się w zakresie od -3,2 do -3,5, przy czym wyniki idealne wynoszą około -3,322. Wartości punktu przecięcia z osią y powinny mieścić się w przedziale Cq od 34-41, a wyniki idealne powinny mieć Cq wynoszące 37,0. Punkt przecięcia z osią y to przewidywane Cq reakcji zawierającej 1 kopię sekwencji docelowej, czyli najmniejszą jednostkę, jaką można zmierzyć w pojedynczej reakcji qPCR. Próbki nieznane o wartościach Cq wyższych niż punkt przecięcia z osią y są prawdopodobnie inhibowane. W przypadku inhibicji lub zastosowania niewydajnego zestawu starterów może być konieczne przeprowadzenie więcej niż 40 cykli PCR, jednak w takich okolicznościach kwantyfikacja nie jest możliwa i należy przeprowadzić dodatkowe kontrole negatywne bez sekwencji docelowej, ale zawierające całkowitą ilość DNA podobną do próbek nieznanych, aby wykluczyć amplifikację z nieswoistych źródeł.

Amplifikacja wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) w próbki nieznane należy porównać z wynikami ujemnej kontroli matrycowej (NTC) dla IPC, ponieważ w tym przypadku nie występuje konkurencja o odczynniki ani obecność inhibitorów. Próbki nieznane, w których wartość Cq dla IPC jest o 2 cykle lub więcej wyższa od średniej wartości Cq dla NTC, lub w których nie nastąpiła amplifikacja, należy uznać za zahamowane. W przypadku braku inhibitorów w próbkach, wszystkie amplifikacje IPC powinny tworzyć zwartą grupę na wykresie, z wartościami Cq zbliżonymi do wartości NTC (Rysunek 6).

Na koniec przeprowadzono testy testu in situ. W dniach 25–26 września 2019 roku przefiltrowano dwadzieścia próbek wody z rzeki Clinch oraz trzy próbki ślepe w terenie, w odległości 500 metrów od łóżka małży, w którym stwierdzono występowanie A. ligamentina. W każdym punkcie poboru próbek przefiltrowano około czterech próbek wody o objętości 1 L. Punkty poboru obejmowały: dno łóżka małży na środku nurtu, dno łóżka małży przy brzegu, 100 m poniżej łóżka na środku nurtu, 500 m poniżej łóżka na środku nurtu oraz 500 m poniżej łóżka przy brzegu (Rysunek 7). Po powrocie do laboratorium każdy filtr przecięto na pół, a DNA wyekstrahowano tylko z jednej połowy filtra. Pozostała połowa filtra z każdej próbki została przechowywana w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Następnie próbki poddano analizie z użyciem testu A.lig.1 w wersji multipleksowej z IPC. Z 23 próbek w pięciu stwierdzono inhibicję. Próbki te rozcieńczono w stosunku 1:10 i ponownie poddano analizie. W 19 z 20 próbek terenowych uzyskano amplifikację przy użyciu zaprojektowanego testu. W 5 z tych 19 próbek stężenie przekroczało granice LOD i LOQ testu wynoszące 5 kopii/reakcję; oznacza to, że w większości próbek wykryto eDNA, ale na poziomie, przy którym prawdopodobne są wyniki fałszywie ujemne i w którym test nie mógł wiarygodnie określić liczby kopii dla tych 14 próbek. Niemniej jednak, w każdym punkcie poboru próbek amplifikację uzyskano w 75 do 100% z czterech biologicznych powtórzeń stanowiskowych. Dwie z trzech próbek ślepych terenowych były negatywne, podczas gdy jedna próbka ślepa wykazała amplifikację, co podkreśla znaczenie stosowania technik czystych w terenie.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat tworzenia bazy danych sekwencji mitochondrialnego DNA.Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Dopasowania sekwencji dla gatunków małży z rzeki Clinch z potencjalnymi starterami i sondami do analizy ND1 dla  Actinonaias ligamentina. Startery forward w kolorze ciemnozielonym, sonda w kolorze czerwonym i starter reverse w kolorze jasnozielonym. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-3
Rycina 3: Przykłady krzywej wzorcowej i regresji liniowej. A. Przykład akceptowalnej krzywej wzorcowej uzyskanej z amplifikacji trzech powtórzeń dla każdego z sześciu rozcieńczeń wzorca. 10-krotna seria rozcieńczeń wzorca z najwyższym stężeniem wzorca po lewej stronie i malejącymi stężeniami w prawą stronę. Pozioma linia przecinająca wszystkie krzywe to próg dla cyklu kwantyfikacji (Cq). Miejsce, w którym każda krzywa przecina ten próg, wyznacza wartość Cq. B. Regresja liniowa wykonana na podstawie powtórzeń wzorca z Ryciny 3A. Powtórzenia rozcieńczeń wzorca są zaznaczone okręgami, a próbki nieznane (próbki badawcze) krzyżykami x. Wydajność wynosi 98.9%, r2 zbliża się do 1.0, a nachylenie wynosi -3.349. C. Przykład słabej krzywej wzorcowej uzyskanej z amplifikacji trzech powtórzeń dla każdego z sześciu rozcieńczeń wzorca. D. Regresja liniowa tworząca krzywą wzorcową dla powtórzeń wzorca amplifikowanych w przykładzie 3C. Zwróć uwagę na słabe wartości wydajności i r2. Zauważ również, że zamplifikowano tylko 4 z 6 wzorców. Jeśli po powtórnych analizach krzywa wzorcowa nie ulegnie poprawie, problemem może być niewłaściwy zestaw starterów/sond, który nie amplifikuje docelowego DNA w oczekiwany sposób; w takim przypadku nie należy stosować tego testu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Przykłady układów płytek dla standardowych serii qPCR w celu wyznaczenia LOD i LOQ. Standardy użyte w krzywej zaznaczono kolorem niebieskim, przy czym stężenie standardu maleje od ciemnoniebieskiego do jasnoniebieskiego. Pozytywną kontrolę DNA zaznaczono na zielono, a kontrolę bez matrycy (NTC) na żółto. Eksperymentalne stężenia standardów zaznaczono na szaro, pokazując 24 powtórzenia dla każdego rozcieńczenia standardu. Seria rozcieńczeń została naniesiona na dwie płytki (A, B), z których każda zawierała krzywą standardową, kontrolę pozytywną oraz NTC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Układ płytki i krzywe amplifikacji z przebiegu qPCR. AUkład płytki, standardy zaznaczone na niebiesko, ciemniejszy kolor wskazuje najwyższe stężenie standardu. Pozytywna kontrola DNA na zielono, brak kontrole matrycy zaznaczone na żółto (NTC), cele próbek zaznaczone na szaro. BKrzywe amplifikacji z przebiegu qPCR. Standardy zaznaczone na niebiesko, pozytywna kontrola DNA na zielono, brak kontroli wzorcowych zaznaczono na żółto, a próbki nieznane na czerwono. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rysunek 6: Krzywe amplifikacji dla wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC). Krzywe IPC dla wszystkich nieznanych próbek zaznaczono kolorem purpurowym, a IPC z kontroli bez matrycy (NTC) zaznaczono kolorem pomarańczowym z trójkątami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Mapa przedstawiająca miejsca poboru eDNA z ławicy małży w rzece Clinch wzdłuż granicy Wirginii i Tennessee. Próbki pobrano w Wallens Bend w dolnej części ławicy, 100 m poniżej ławicy oraz 500 m poniżej ławicy. Próbki pobierano albo na środku nurtu (w strumieniu), albo w odległości około 1–2 metrów od brzegu (brzeg). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

KomponentNazwaSekwencja 5’ – 3’Znacznik fluorescencyjny
Starter forwardA.lig.1-fCCCTCATCACGTACCTCTTAATC
Starter odwrotnyA.lig.1-rGGAATGCCCATAATTCCAACTTTA
Sondasonda A.lig.1TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGTFAM

Tabela 1: Zaprojektowany test qPCR dla Actinonaias ligamentina (A.lig.1), zawierający sekwencje starterów bezpośredniego i odwrotnego oraz sondy.

GatunekAmplifikowanoW rzece Clinch
1. Actinonaias ligamentinaTakTak
2. Actinonaias pectorosaNieTak
3. Amblema plicataNieTak
4. Corbicula spp.NieTak
5. Cumberlandia monodontaNieTak
6. Cyclonaias tuberculataNieTak
7. Cyprogenia stegariaNieTak
8. Elliptio dilatataNieTak
9. Epioblasma brevidensNieTak
10. Epioblasma capsaeformisNieTak
11. Epioblasma florentina aureolaNieTak
12. Epioblasma triquetraNieTak
13. Fusconaia corNieTak
14. Fusconaia subrotundaNieTak
15. Lampsilis ovataNieTak
16. Lampsilis siliquoideaNieNie
17. Lasmigona costataNieTak
18. Lemiox rimosusNieTak
19. Lexingtonia dolabelloidesNieTak
20. Medionidus conradicusNieTak
21. Plethobasus cyphyusNieTak
22. Pleurobema plenumNieTak
23. Ptychobranchus fasciolarisNieTak
24. Ptychobranchus subtentusNieTak
25. Quadrula pustulosaNieTak
26. Strophitus undulatusNieTak
27. Villosa irisNieTak

Tabela 2: Lista gatunków użytych do testowania swoistości in vitro testu A.lig.1. Test wykazał amplifikację DNA genomowego gatunku docelowego (Actinonaias ligamentina) i nie wykazał amplifikacji żadnego z gatunków niedocelowych.

SkładnikSekwencja 5’-3’
Actinonaias ligementina standardCCCTCATCACGTACCTCTTAATCCTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA
AAGCCCTCGGGTACTTTCAAATCCGAAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC
CCCAACCATTAGCAGATGCTCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT
CAAACTACCTACCCTTCATCTTAACCCCAACCACTATGTTAATTTTAGCACTTAGACTTT
GACAATTATTTCCATCCTTTATANTATCATCCCAAATANTTTTTGGTATGCTCCTATTCT
TGTGTATCTCCTCCCTAGCTGTTTATACAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA
AATATGCCCTTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA
TAAC
Matryca IPC (Hem-T)CTACATAAGTAACACCTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTGTCCCTCGAATCTCAGACGCT
GTATGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGGCTGCTCTATGTTCTCAAGGACTGCAC

Tabela 3: Sekwencja (5’-3’) wzorca Actinonaias ligamentina oraz matrycy IPC (Hem-T) wykorzystanych w tym badaniu. Sekwencje starterów prawego i lewego zaznaczono pogrubioną kursywą, a sekwencję sondy podkreślono.

KomponentNazwaSekwencja 5’ – 3’Znacznik fluorescencyjny
Starter bezpośredniHemT-FTCTGAGTGTCCCTCGAATCT
Starter odwrotnyHemT-RGCAGTCCTTGAGAACATAGAGC
SondaHemT-PTGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGCy5

Tabela 4: Analiza wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC), zawierająca sekwencje starterów prawego i lewego oraz sondy.

Objętość na próbkę (µL)Komponent
10Mieszanka Master Mix do próbek środowiskowych
1mieszanina starterów F/R A. lig.1 20uM
1Sonda A. lig.1 w stężeniu 2,5 µM
1mieszanina starterów IPC 5 $\mu$M (HemT-F/R)
0.75sonda IPC 2,5uM (HemT-P)
1.51 X 103 stężenie matrycy IPC
2.75H20
2Próbka
20Objętość całkowita

Tabela 5: Mieszanina PCR zastosowana w analizie A.lig.1 w układzie multipleksowym z analizą IPC.

KrokTemperatura (°C )Czas
1Denaturacja wstępna9510 min
2Denaturacja9515 sec
3Przymieścanie (Annealing)601 min
4Powrót do kroku 2, powtórzyć 39X

Tabela 6: Warunki reakcji dla testu A.lig.1.

Dyskusja

Podobnie jak w przypadku każdego badania, zdefiniowanie pytania, na które należy odpowiedzieć, jest pierwszym krokiem, a projekt testu eDNA zależy od zakresu badania26. Na przykład, jeśli celem badań lub ankiety jest wykrycie jednego lub kilku gatunków, najlepszy jest ukierunkowany test oparty na sondzie. Jeśli jednak celem jest ocena większego zestawu lub zbiorowiska gatunków, lepiej nadają się testy metabarcodingu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Po ustaleniu, jakie podejście należy przyjąć, zaleca się przeprowadzenie badania pilotażowego obejmującego zaprojektowanie testu, testowanie i optymalizację24. Projekt testu rozpoczyna się od wykazu gatunków zgodnie z opisem na rysunku 1. Wykaz ten będzie podstawą do zrozumienia, jak dobrze test działa pod względem swoistości i zakresu geograficznego, do którego można go zastosować. Zachęca się do zaprojektowania testu dla określonego obszaru geograficznego, co umożliwi projektantowi lepsze przetestowanie testu pod kątem reaktywności krzyżowej z innymi gatunkami na tym obszarze oraz uświadomienie sobie ograniczeń, jakie niesie to ze sobą w odniesieniu do rozszerzenia testu na inne obszary, na których może występować gatunek docelowy24. Gdy lista jest kompletna, sekwencje można pobrać z publicznych genetycznych baz danych. Ponieważ te bazy danych są niekompletne27, należy zsekwencjonować jak najwięcej gatunków w wykazie we własnym zakresie, aby uzupełnić lokalną referencyjną bazę danych sekwencji, które zostaną wykorzystane w projekcie testu. Priorytetowo traktuj współwystępujące blisko spokrewnione gatunki, ponieważ są to najbardziej prawdopodobne gatunki niebędące celami, które się wzmocnią. Skupienie się na wszystkich gatunkach należących do tego samego rodzaju lub rodziny co gatunek docelowy jest dobrym punktem wyjścia. Porównania z blisko spokrewnionymi gatunkami pomogą zidentyfikować regiony sekwencji unikalne dla gatunku docelowego. Może to pomóc w ustaleniu, jak test może działać w innych systemach lub lokalizacjach. Regiony mitochondrialne są zwykle wybierane do opracowywania testów, ponieważ więcej informacji o sekwencji z szerszej gamy gatunków jest dostępnych w genach mitochondrialnych, które zostały wykorzystane w projektach kodu kreskowego życia, a także dlatego, że mitochondrialne DNA jest obecne w znacznie większym stężeniu w kopiach / komórkę niż DNA jądrowe 24,28,29. Wiele regionów genów powinno zostać ocenionych w celu dalszego rozwoju testu, ponieważ pokrycie sekwencji różni się w zależności od taksonów w bazach danych repozytorium genetycznego. Po utworzeniu tej lokalnej bazy danych sekwencji referencyjnych, do projektowania testów starter/sonda wykorzystuje się kombinację ręcznej wizualizacji wyrównanych danych sekwencji i programów komputerowych. Nie należy polegać wyłącznie na oprogramowaniu, aby określić, które testy należy przetestować. Ważne jest, aby wizualnie zweryfikować ustawienia, w których startery i sondy znajdują się na celach i poza celami, aby lepiej zrozumieć, jak mogą one działać w PCR. Wreszcie, badania przesiewowe i optymalizacja testów obejmują trzy poziomy (in silico, in vitro i in situ)6,7,24,25. Projektowanie i testowanie in silico jest ważne dla stworzenia krótkiej listy testów z dużą szansą na sukces, ale badania empiryczne (in vitro) mają kluczowe znaczenie dla wyboru testu o najlepszej rzeczywistej wydajności. Optymalizacja i testowanie testów in vitro obejmuje pomiar wydajności reakcji oraz określenie czułości i swoistości testu. Granice wykrywalności i oznaczania ilościowego to dwa parametry często pomijane przy opracowywaniu testów, ale ważne dla interpretacji danych. Przeprowadzając wiele powtórzeń krzywych wzorcowych dla testu, LOD i LOQ można łatwo zmierzyć 1,5,30. Niewiele badań omawia wyniki w odniesieniu do LOD lub LOQ testu, ale Sengupta i in. (2019) włączają LOD i LOQ swojego testu do interpretacji danych i grafiki, aby lepiej zrozumieć ich wyniki31. Wewnętrzne kontrole dodatnie powinny być również multipleksowane do zaprojektowanego testu. Bez przeprowadzenia testów na inhibicję PCR w próbkach mogą wystąpić wyniki fałszywie ujemne24,32. Proponujemy zastosowanie multipleksowanego testu IPC z testem docelowym jako najprostszą metodą testów hamowania PCR23. Wreszcie, konieczne jest przeprowadzenie badania in situ testu z próbek pobranych w terenie i pobranych w laboratorium, aby zapewnić amplifikację docelową w próbkach środowiskowych24.

Istnieją ograniczenia w stosowaniu specyficznych dla gatunku, opartych na sondzie testów qPCR z próbkami eDNA. Na przykład projektowanie wielu testów do testowania może być ograniczone dostępnością sekwencji, a kompromis może być konieczny w odniesieniu do aspektów wydajności testu. Wybory te muszą być podyktowane celami badania i muszą być raportowane wraz z wynikami26. Na przykład, jeśli celem jest wykrycie rzadkiego gatunku i spodziewanych jest niewiele wyników pozytywnych, można zastosować test o niedoskonałej swoistości (tj. amplifikacji gatunków niedocelowych), jeśli wszystkie wykrycia zostaną zweryfikowane przez sekwencjonowanie. Jeśli celem jest monitorowanie zasięgu geograficznego gatunku, a dane dotyczące stężenia eDNA nie są potrzebne, można zastosować test o niedoskonałej wydajności, a dane podać tylko jako procent wykrywalności. Ponadto, dopóki wszystkie potencjalne współplemieńce nie zostaną przetestowane w laboratorium, co jest rzadko możliwe, nie można poznać z absolutną pewnością prawdziwej swoistości testu. Na przykład test został zaprojektowany i przetestowany na kilku gatunkach małży słodkowodnych w rzece Clinch. Aby użyć tego testu w innym systemie rzecznym, musielibyśmy przetestować go na zestawie gatunków w nowej lokalizacji. Zmienność genetyczna w obrębie gatunku lub populacji, która nie jest badana podczas opracowywania testu, może również wpływać na swoistość. Wreszcie, nawet jeśli test został zweryfikowany jako posiadający wysoką wydajność techniczną; Warunki zmieniają się podczas pracy w terenie. Warunki niezwiązane z testem, takie jak przepływ wody, pH i zachowanie zwierząt, mogą zmienić wykrywalność eDNA, podobnie jak wykorzystanie różnych protokołów pobierania i ekstrakcji eDNA. Stosowanie testów, które są zoptymalizowane i dobrze opisane, ułatwi zrozumienie wpływu takich parametrów na wykrywanie eDNA.

Dziedzina eDNA dojrzewa poza etap analizy eksploracyjnej do coraz większej standaryzacji metod i technik. Osiągnięcia te poprawią naszą wiedzę na temat technik, możliwości i ograniczeń eDNA. Proces optymalizacji, który opisaliśmy powyżej, poprawia czułość, swoistość i odtwarzalność testu. Ostatecznym celem tego udoskonalenia i standaryzacji metod eDNA jest poprawa zdolności badaczy do wyciągania wniosków na podstawie danych eDNA, a także zwiększenie zaufania użytkowników końcowych i interesariuszy do wyników.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Sponsorzy finansujący nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; lub w decyzji o publikacji wyników.

Podziękowania

Dziękujemy Alvi Wadud i Trudi Frost, którzy pomogli w rozwoju i testowaniu podkładów. Finansowanie projektu testu opisanego w tym badaniu zostało zapewnione przez Program Strategicznych Badań i Rozwoju Środowiskowego Departamentu Obrony (RC19-1156). Jakiekolwiek użycie nazw handlowych, produktów lub firm służy wyłącznie celom opisowym i nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych. Dane wygenerowane podczas tego badania są dostępne jako https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 publikacji danych USGS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 Miejsce Regały dwustronne z pokrowcamiGlobe Scientific456355AST
Rękawice do czyszczenia (np. lateks, nitryl itp.)Kimberly-Clark43431, 55090
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad1855196
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 mlFisher Scientific5408129
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 2,0 mlFisher Scientific2681332
96-dołkowe płytki do PCR z twardą skorupą, niskoprofilowe, cienkościenne, z listwą przypodłogową, białe/ przezroczystestartery
IPCIntegrated DNA Technologies, Inc.brakprodukt niestandardowy
Sondy IPC PrimeTime qPCRIntegrated DNA Technologies, Inc.brakprodukt niestandardowy
IPC Ultramer DNA Oligo syntetyczny szablonIntegrated DNA Technologies, Inc.brakproduktu niestandardowego
Labnet MPS 1000 Kompaktowa mini wirówka do płytek PCRLabnetC1000
Różne-Każdamikrowirówka, która mieści probówki 1,5 ml i 2,0 ml, jest zazwyczaj w porządku.
Folia uszczelniająca Microseal 'B' PCR, klej, optycznaBio-RadMSB1001
Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)InvitrogenAM9932
GP LTS 1000 i mikro; L F 768A/8Końcówki30389272
GP LTS 20 µ L F 960A/1030389274Rainin
GP LTS 200 µ L F 960A/10Pipety 30389276
Rainin RaininRóżneW zależności od preferencji laboratoryjnych pipety ręczne lub elektroniczne mogą być używane przy różnych maksymalnych objętościach.
TaqMan Environmental Master Mix 2.0Thermo Fisher Scientific4396838
Docelowe startery do przodu i do tyłuIntegrated DNA Technologies, Inc.brakprodukt niestandardowy
Target PrimeTime qPCR ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.brakprodukt niestandardowy
Docelowy syntetyczny fragment genu gBlockIntegrated DNA Technologies, Inc.brakproduktu niestandardowego. używany do serii standardowych rozcieńczeń qPCR
Bufor TEInvitrogenAM9849
VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXERFisher Scientific50728002
do przodu i do tyłu Bio-Rad#HSP9601 Maszyna do mikrowirówek Końcówki do pipet do pipet Rainin Końcówki do pipet

Bibliografia

  1. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  2. Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology. 10, 5(1992).
  3. Mauvisseau, Q., et al. Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches. Scientific Reports. 9 (1), 580(2019).
  4. Hernandez, C., et al. 60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada. Environmental DNA. , (2020).
  5. Klymus, K. E., et al. Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays. Environmental DNA. , (2019).
  6. Thalinger, B., et al. A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring. bioRxiv. , (2020).
  7. Helbing, C. C., Hobbs, J. Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring. CSA Group. , (2019).
  8. Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management. Trends in Ecology & Evolution. , (2020).
  9. Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
  10. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS One. 8 (3), 59520(2013).
  11. Prediger, E. How to design primers and probes for PCR and qPCR. IDT. , Available from: http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes (2020).
  12. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).
  13. Owczarzy, R., et al. IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 163-169 (2008).
  14. Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 43-46 (2007).
  15. Taylor, S. C., et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).
  16. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (134), 11(2012).
  17. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  18. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  19. Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 5279. , ed Bio-Rad (2020).
  20. Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 6894. , Bio-Rad (2020).
  21. Eurogentec. Eurogentec. Vol. 0708-V2. , ed Eurogentec (2020).
  22. Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
  23. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  24. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  25. Guan, X., et al. Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America. Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).
  26. Mosher, B. A., et al. Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners. Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).
  27. Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences. Cladistics. 28, 6(2012).
  28. Rees, H. C., et al. REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).
  29. Evans, N. T., Lamberti, G. A. Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool. Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).
  30. Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
  31. Sengupta, M. E., et al. Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).
  32. Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix. Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analizy oparte na sondachdetekcja specyficzna dla gatunk wprojektowanie starter woptymalizacja analizyanaliza krzywej wzorcowejgranica wykrywalno citestowanie organizm w niecelowychwalidacja terenowa
Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.