Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena in vitro ochrony mięśnia sercowego po wstępnym kondycjonowaniu hipotermicznym w modelu ludzkich miocytów serca

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61837

⸱

27 października 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Różne efekty różnych stopni hipotermii na ochronę mięśnia sercowego nie zostały dokładnie ocenione. Celem niniejszego badania było ilościowe określenie poziomów śmierci komórek po różnych metodach leczenia hipotermii w modelu opartym na ludzkich kardiomiocytach, kładąc podwaliny pod przyszłe dogłębne badania molekularne.

Streszczenie

Dysfunkcja mięśnia sercowego spowodowana niedokrwieniem/reperfuzją jest częstym scenariuszem klinicznym u pacjentów po operacji serca. W szczególności wrażliwość kardiomiocytów na uszkodzenie niedokrwienne jest wyższa niż w przypadku innych populacji komórek. Obecnie hipotermia zapewnia znaczną ochronę przed spodziewanym uszkodzeniem niedokrwiennym. Jednak badania nad złożonymi zmianami molekularnymi wywołanymi hipotermią pozostają ograniczone. Dlatego konieczne jest zidentyfikowanie stanu hodowli podobnego do warunków in vivo, który może wywołać uszkodzenia podobne do tych obserwowanych w stanie klinicznym w powtarzalny sposób. Aby naśladować stany podobne do niedokrwienia in vitro, komórki w tych modelach były leczone przez deprywację tlenu/glukozy (OGD). Dodatkowo zastosowaliśmy standardowy protokół czasowo-temperaturowy stosowany podczas operacji kardiochirurgicznych. Ponadto proponujemy podejście polegające na zastosowaniu prostej, ale kompleksowej metody analizy ilościowej uszkodzenia mięśnia sercowego. Apoptozę i poziomy ekspresji białek związanych z apoptozą oceniano za pomocą cytometrii przepływowej i zestawu ELISA. W tym modelu przetestowaliśmy hipotezę dotyczącą wpływu różnych warunków temperaturowych na apoptozę kardiomiocytów in vitro. Niezawodność tego modelu zależy od ścisłej kontroli temperatury, kontrolowanych procedur eksperymentalnych i stabilnych wyników eksperymentalnych. Ponadto model ten może być wykorzystany do badania molekularnego mechanizmu kardioprotekcji hipotermicznej, co może mieć ważne implikacje dla rozwoju terapii uzupełniających do stosowania w hipotermii.

Wprowadzenie

Dysfunkcja mięśnia sercowego spowodowana niedokrwieniem/reperfuzją jest częstym scenariuszem klinicznym u pacjentów po operacji kardiochirurgicznej1,2. Podczas niepulsacyjnej perfuzji o niskim przepływie i okresów całkowitego zatrzymania krążenia nadal dochodzi do uszkodzenia obejmującego wszystkie typy komórek serca. W szczególności wrażliwość kardiomiocytów na uszkodzenie niedokrwienne jest wyższa niż w przypadku innych populacji komórek. Obecnie hipotermia terapeutyczna (TH) zapewnia znaczną ochronę przed spodziewanym uszkodzeniem niedokrwiennym u pacjentów poddawanych zabiegom kardiochirurgicznym3,4. TH definiuje się jako temperaturę wewnętrzną ciała wynoszącą 14-34 °C, chociaż nie ma zgody co do definicji chłodzenia podczas operacji kardiochirurgicznej5,6,7. W 2013 roku międzynarodowy panel ekspertów zaproponował ustandaryzowany system raportowania do klasyfikacji różnych zakresów temperatur ogólnoustrojowego hipotermicznego zatrzymania krążenia8. Opierając się na elektroencefalografii i badaniach metabolizmu mózgu, podzielili hipotermię na cztery poziomy: głęboką hipotermię (≤ 14 °C), głęboką hipotermię (14,1-20 °C), umiarkowaną hipotermię (20,1-28 °C) i łagodną hipotermię (28,1-34 °C). Konsensus ekspertów zapewnił jasną i jednolitą klasyfikację, dzięki czemu badania były bardziej porównywalne i zapewniały bardziej istotne klinicznie wyniki. Ta ochrona zapewniana przez TH opiera się na jego zdolności do zmniejszania aktywności metabolicznej komórek, dodatkowo ograniczając ich tempo zużycia wysokoenergetycznych fosforanów9,10. Jednak rola TH w ochronie mięśnia sercowego jest kontrowersyjna i może mieć wielorakie skutki w zależności od stopnia hipotermii.

I/R mięśnia sercowego jest dobrze znany z tego, że towarzyszy mu zwiększona apoptiza komórek11. Ostatnie doniesienia wykazały, że programowana śmierć kardiomiocytów wzrasta podczas operacji na otwartym sercu i może zbiegać się z martwicą, zwiększając w ten sposób liczbę martwych komórek mięśnia sercowego12. Dlatego zmniejszenie apoptozy kardiomiocytów jest przydatnym podejściem terapeutycznym w praktyce klinicznej. W mysim modelu kardiomiocytów HL-1 wykazano, że hipotermia terapeutyczna zmniejsza mitochondrialne uwalnianie cytochromu c i czynnika indukującego apoptozę (AIF) podczas reperfuzji13. Jednak wpływ temperatury na regulację apoptozy jest kontrowersyjny i wydaje się zależeć od stopnia hipotermii. Cooper i współpracownicy zaobserwowali, że w porównaniu z normotermiczną grupą kontrolną krążeniowo-oddechową, wskaźnik apoptozy tkanki mięśnia sercowego od świń z głębokim hipotermicznym zatrzymaniem krążenia był zwiększony14. Ponadto wyniki niektórych badań sugerują, że głęboka hipotermia może aktywować szlak apoptozy, podczas gdy mniej agresywna hipotermia wydaje się hamować szlak12,15,16. Przyczyną tego wyniku mogą być mylące efekty związane z uszkodzeniem niedokrwiennym i brak zrozumienia mechanizmów, za pomocą których temperatura wpływa na tkankę mięśnia sercowego. W związku z tym należy dokładnie określić granice temperatury, w których apoptoza jest wzmacniana lub tłumiona.

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy związane ze skutecznością hipotermii i dostarczyć racjonalnych podstaw do jej wdrożenia u ludzi, konieczne jest zidentyfikowanie stanu hodowli podobnego do warunków in vivo, który może powodować uszkodzenia podobne do obserwowanych w stanie klinicznym w powtarzalny sposób. Niezbędnym krokiem w kierunku osiągnięcia tego celu jest stworzenie optymalnych warunków do wywołania apoptozy kardiomiocytów. W związku z tym w niniejszym badaniu zbadaliśmy szczegóły metodologiczne dotyczące eksperymentów z deprywacją tlenu i glukozy na hodowanych komórkach, łatwym modelu in vitro niedokrwienia-reperfuzji. Ponadto oceniliśmy wpływ różnych czasów niedotlenienia i niedokrwienia na apoptozę kardiomiocytów i zweryfikowaliśmy naszą hipotezę dotyczącą wpływu różnych warunków temperaturowych na apoptozę komórek in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Informacje dotyczące komercyjnych odczynników i instrumentów są wymienione w Tabeli Materiałów.

Linia komórkowa ludzkich kardiomiocytów AC16 powstała w wyniku fuzji pierwotnych komórek z dorosłej tkanki serca komorowego z ludzkimi fibroblastami przekształconymi przez SV4017, które zostały zakupione od BLUEFBIO (Szanghaj, Chiny). Linia komórkowa rozwija wiele cech biochemicznych i morfologicznych charakterystycznych dla kardiomiocytów. Ponadto linia komórkowa jest szeroko stosowana do oceny uszkodzenia mięśnia sercowego i funkcji mięśnia sercowego in vitro18,19.

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Podstawowa pożywka hodowlana składa się z pozbawionej surowicy modyfikowanej pożywki Eagle's Eagle's (DMEM), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% suplementu wzrostu miocytów serca i 1% roztworu penicyliny/streptomycyny. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i podgrzać do 37 °C przed użyciem.

  1. Usunąć kriokonserwowane ludzkie komórki kardiomiocytów (HCM) z ciekłego azotu i rozmrozić je w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
  2. Delikatnie wstrząsnąć fiolką (<1 minuta) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż w fiolce pozostanie tylko mały kawałek lodu.
  3. Przenieść fiolkę do sterylnego okapu z przepływem laminarnym. Przetrzeć zewnętrzną stronę fiolki wacikiem zamoczonym w 70% alkoholu.
  4. Przenieść 4 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej kroplami do probówki wirówkowej zawierającej rozmrożone komórki.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 200 × g przez 10 minut. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml kompletnego podłoża.
  6. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2,
    UWAGA: Przed pobraniem komórek do eksperymentów, komórki mogą rosnąć aż do osiągnięcia około 60-70% zgrywania.

2. Ustanowienie modelu deprywacji tlenowo-glukozowej (OGD)

UWAGA: Dwie godziny przed okresem badania, zastąp pożywkę wzrostową pożywką bez surowicy, a komórki zostały ponownie inkubowane w nawilżanym inkubatorze przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze z 5% CO2.

  1. Odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej i delikatnie przemyć komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  2. Dodaj 2 ml świeżego bezcukrowego DMEM na dołek.
  3. Hodować komórki w stałej temperaturze w inkubatorze składającym się z trzech gazów, w atmosferze z mieszaniną 95% N2, 5 % CO2 i 0,1 %O2 w temperaturze 37 °C przez 1, 2, 4, 8, 12 lub 16 godzin.
  4. Po zabiegu hipoksji odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej i trzykrotnie przemyć komórki PBS (pH 7,4).
  5. Dodać 2 ml kompletnego DMEM do dołka.
  6. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5%CO2.

3. Protokół czasowo-temperaturowy

UWAGA: Podczas operacji kardiochirurgicznej stosowany jest standardowy protokół czasowo-temperaturowy, jak wcześniej opisali inni20,21. Traktuj HCM zgodnie z następującym protokołem (Rysunek 1): punkt czasowy 1 (T1) oznacza koniec indukcji, punkt czasowy 2 (T2) oznacza koniec konserwacji, a punkt czasowy 3 (T3) oznacza koniec ponownego nagrzewania. Analizować komórki kontrolne utrzymywane w ciągłych warunkach normotermicznych (37 °C). Warunki temperaturowe są tworzone za pomocą inkubatora trójgazowego, który umożliwia precyzyjną regulację temperatury.

  1. Dwie godziny przed eksperymentami odessać pożywkę hodowlaną z płytki 6-dołkowej i dodać 2 ml świeżego DMEM bez surowicy do dołka.
  2. Ponownie inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5%CO2.
  3. Po 2 godzinach odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej i trzykrotnie przemyć komórki PBS (pH 7,4).
  4. Dodaj 2 ml świeżego DMEM bez surowicy na dołek.
  5. Ponownie inkubować komórki w inkubatorze trójgazowym.
    UWAGA: Wymień podłoże, aby usunąć nieprzymocowane komórki i zanieczyszczenia.
  6. Natychmiast zmień temperaturę, umieszczając szalki hodowlane w inkubatorze trójgazowym.
  7. Po 1 godzinie schładzania szybko odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej i dodać 2 ml świeżego bezcukrowego DMEM do dołka.
  8. Hodować komórki w inkubatorze trójgazowym w atmosferze zawierającej 95% N2, 5 % CO2 i 0,1 %O2 w temperaturze 37 °C przez 12 godzin w celu uzyskania hipoksji.
  9. Ustaw temperaturę zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Protokół rozpoczyna się od 10 godzin zabiegu w niskiej temperaturze, po którym następuje faza rozgrzewania przez 2 godziny do 37 °C i 24 godziny normotermii (37 °C). W każdym punkcie czasowym trzy szalki Petriego są usuwane do analizy.
  10. Po obróbce w niskiej temperaturze odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej i trzykrotnie przemyć PBS (pH 7,4).
  11. Dodać 2 ml kompletnego DMEM do dołka.
  12. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5%CO2.

4. Test żywotności CCK-8

  1. Przed użyciem podgrzać 0,25% roztwór kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i PBS do temperatury 37 °C.
  2. Odessać pożywkę, przepłukać komórki 1 ml PBS, a następnie dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny wzdłuż ściany studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do odłączenia prawie wszystkich HCM (około 1 minuty).
  3. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki DMEM do studzienek, aby zneutralizować trypsynę.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i zagnieżdżać HCM przez odwirowanie z stężeniem 500 × g przez 3 minuty. Odessać supernatant bez naruszania osadu.
  5. Dozować 100 μl porcji zawiesiny komórek (5000 komórek/basenik) do płytki 96-dołkowej. Wstępnie inkubować płytkę przez 24 godziny w nawilżanym inkubatorze (w temperaturze 37 °C).
  6. Użyj hodowanych komórek na 96-dołkowych płytkach, aby wygenerować różne grupy traktowane.
  7. Inkubować płytkę przez odpowiedni okres czasu (16 godzin) w inkubatorze.
  8. Dodać 10 μl roztworu CCK-8 do każdego dołka płytki.
  9. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze.
  10. Zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków do studzienek, ponieważ zakłócają one pomiary odczytu OD.

5. Cytometria przepływowa do analizy apoptozy

  1. Wykonaj etapy trypsynizacji i wirowania, wykonując czynności 4.2-4.4.
    UWAGA: Komórki są zbierane za pomocą trypsyny bez EDTA. Aby ocenić apoptozę, pobiera się zarówno komórki pływające, jak i przylegające.
  2. Odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 1000 × g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Za pomocą pipety przenieś 100 μl zawiesiny komórek poddanych działaniu błękitu trypanowego do hemocytometru. Za pomocą ręcznego licznika liczenia policz żywe, niebarwione komórki w jednym zestawie 16 kwadratów, a następnie użyj PBS do wygenerowania zawiesiny komórek o stężeniu 1×107 komórek/ml.
  4. Uzyskać 200 μl zawiesiny komórek (5 × 105 -1 × 106 komórek).
  5. Wirować przez 5 minut przy 1000 × g i ponownie zawiesić osad w roztworze wiążącym Annexin V-FITC.
  6. Dodać 5 μl aneksyny V-FITC, aby zabarwić komórki.
  7. Dodać 10 μl jodku propidyny do zawiesiny komórkowej.
  8. Delikatnie wymieszaj komórki i inkubuj je przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: Komórki są ponownie zawieszane 2-3 razy podczas inkubacji, aby poprawić barwienie.
  9. Uruchom cytometr przepływowy i upewnij się, że oprogramowanie działa prawidłowo.
  10. Otwórz dwa okna wykresu punktowego w oprogramowaniu do cytometrii przepływowej.
  11. Wybierz światło rozproszone do przodu (FSC) na osi X i światło rozproszone bocznie (SSC) na osi Y, aby wykluczyć resztki komórek i/lub grudki odpowiednio pod względem ich wielkości i ziarnistości.
  12. Wybierz kanał detekcji PE (590 mm) i FITC (530 mm), który służy do pomiaru intensywności fluorescencji komórek.
  13. Umieścić ślepą próbkę (HCM, które nie zostały zabarwione) probówkę z próbką na cytometrze przepływowym.
  14. Kliknij przycisk Nagraj, aby zebrać cząstki z zawiesiny w ślepej probówce, a następnie przebramować populację komórek do dalszej analizy na pierwszym wykresie kropkowym.
  15. Umieść pojedynczo barwione próbki na ramieniu podtrzymującym probówkę. Kliknij przycisk Nagraj, aby zebrać cząstki z zawiesiny, a następnie przebramować populację komórek do dalszej analizy na pierwszym wykresie punktowym.
  16. Zbierz HCM w innych probówkach z próbkami i zoptymalizuj pomiar, dostosowując napięcia kanałów fluorescencyjnych.
    UWAGA: Próbki niebarwione i barwione pojedynczo są używane jako kontrole kompensacyjne podczas eksperymentu.
  17. Wyświetl statystyki każdej probówki z próbką i oblicz szybkość apoptozy każdej próbki.

6. Ocena depolaryzacji mitochondriów

  1. Wykonaj trypsynizację i odwirowanie, wykonując kroki 4.2-4.4.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl kompletnego podłoża, a następnie dostosować gęstość komórek dostosowaną do 1 × 105 - 6 × 106 komórek
  3. Dodać 0,5 ml roztworu roboczego JC-1 do każdej probówki.
  4. Inkubować komórki w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    UWAGA: W okresie inkubacji dodać 1 ml 5× buforu barwiącego JC-1 do 4 ml wody destylowanej, aby przygotować bufor barwiący JC-1.
  5. Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 600 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu barwiącego JC-1.
  7. Powtórz kroki od 6.5 do 6.6 trzy razy.
  8. Ponownie zawiesić HCM w 1 ml lodowatego buforu barwiącego w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i użyć komórek do analizy w ciągu 30 minut.
  9. Wybierz kanał detekcji PE (590 nm) i FITC (530 nm), aby zmierzyć intensywność fluorescencji barwnika JC-1 w komórkach.
    UWAGA: Ustaw cytometr przepływowy, wykonując czynności 5.10-5.17.

7. Test reaktywnych form tlenu

  1. Wykonaj trypsynizację i odwirowanie, wykonując kroki 4.2-4.4.
  2. Wybarwić komórki w pożywce hodowlanej za pomocą 10 μM DCFDA i dostosować gęstość komórek do 1 ×10 6 - 1 × 107 komórek
  3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Delikatnie pipetuj komórki w górę/w dół co 3-5 minut.
  5. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie pożywką do hodowli komórkowych bez surowicy.
  6. Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym, wykonując czynności 5.10-5.17.
    UWAGA: DCF jest wzbudzany przy 488 nm, a intensywność emisji mierzona jest przy 530 nm.

8. Pomiar aktywności kaspazy 3/ Kaspazy 8

  1. Wykonaj trypsynizację, wykonując kroki 4.2-4.4.
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 600 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  3. Dodać 100 μl buforu lizatu na 2 × 106 komórek.
  4. Lizuj komórki przez 15 minut na lodzie.
  5. Po inkubacji przez 15 minut w łaźni lodowej, odwirować próbkę w temperaturze 1,6 ×10 4 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  6. Przenieść supernatant do lodowatej probówki wirówkowej w celu użycia.
    UWAGA: Stężenie białka w próbce powinno wynosić co najmniej 1-3 mg/ml.
  7. Usuń Ac-DEVD-pNA (2 mM) i umieść go w łaźni lodowej do użycia.
  8. Dokładnie dodać 40 μl roztworu buforowego do płytki znakowanej enzymatem, dodać 80 μl próbki, a na koniec dodać 10 μl Ac-DEVD-pNA (2 mM).
  9. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 120 minut.
  10. Zmierzono wartość A405 na czytniku mikropłytek zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Absorbancję wytwarzaną przez pNA generowaną przez kaspazę-3/kaspazę-8 oblicza się przez odjęcie wartości A405 ślepej próby kontrolnej od wartości próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wpływ ekspozycji na OGD na żywotność HCM określono za pomocą testu CCK-8. W porównaniu z grupą kontrolną żywotność komórek była znacząco obniżona w sposób zależny od czasu (Rysunek 2A). Wskaźniki apoptozy HCM w różnych odstępach czasu po reperfusji wykazały specyficzny trend, w którym od 0 do 16 h wskaźniki apoptozy stopniowo rosły, osiągając maksymalną wartość w punkcie czasowym 16 h (Rysunek 2B). Ponieważ OGD przez 12 h zredukowało aktywność komórek o ~50%, w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Złożoność nienaruszonych zwierząt, w tym interakcje między różnymi typami komórek, często uniemożliwiają szczegółowe badania konkretnych składników uszkodzeń I/R. Dlatego konieczne jest stworzenie modelu komórkowego in vitro, który może dokładnie odzwierciedlić zmiany molekularne po niedokrwieniu in vivo. Badania nad modelami OGD były już wcześniej opisywane13,22 i opracowano wiele wyrafinowanych metod 23,24

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81970265, 81900281,81700288), Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (2019M651904); oraz Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do wykrywania apoptozy komórek Annexin V-FITCBio-Technology, ChinyC1062M
Suplement wzrostu miocytów sercaSciencell, USA6252
Zestaw do oznaczania aktywności kaspazy 3Bio-technologia, ChinyC1115
Bio-technologia, ChinyC1151
DMEM, bez glukozyGibco, USA
Zmodyfikowane podłoże orła firmy DulbeccoGibco, USA11960044
Płodowa surowica bydlęcaGibco, USA16140071
Cytometria przepływowaCytoFLEX, USAB49007AF
Ludzkie komórki mięśnia sercowegoBLUEFBIO, ChinyBFN60808678
Zestaw do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej z biotechnologią JC-1,ChinyC2006
Roztwór penicyliny/streptomycynyGibco, USA10378016
Zestaw do oznaczania reaktywnych form tlenuBio-technologia, ChinyS0033S
Inkubator trzygazowyMemmert, NiemcyICO50
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco, USA25200056
Zestaw do oznaczania aktywności kaspazy 8 11966025

Bibliografia

  1. Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
  2. Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
  3. Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
  4. Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
  5. Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
  6. Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
  7. Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
  8. Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
  9. Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
  10. Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
  11. Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498(2016).
  12. Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7(2007).
  13. Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
  14. Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
  15. Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
  16. Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216(2019).
  17. Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
  18. Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
  19. Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668(2019).
  20. Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
  21. Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
  22. Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
  23. Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
  24. Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
  25. Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464(2019).
  26. An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
  27. Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
  28. Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
  29. Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
  30. Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035(2020).
  31. Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Glikogenia i deprywacja tlenuanaliza cytometrycznaocena apoptozypotencjał błony mitochondrialnejoznaczenie reaktywnych form tlenutest żywotności CCK-8inkubator trzigazowyaktywacja kaspaz
Ocena in vitro ochrony mięśnia sercowego po wstępnym kondycjonowaniu hipotermicznym w modelu ludzkich miocytów serca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.