Artykuł metodologiczny

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

DOI:

10.3791/61843

⸱

29 października 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uchwycenie dynamicznych procesów replikacji i składania wirusów zostało utrudnione przez brak solidnych technologii hybrydyzacji in situ (ISH), które umożliwiają czułe i jednoczesne znakowanie wirusowego kwasu nukleinowego i białka. Konwencjonalne metody hybrydyzacji in situ fluorescencji DNA (FISH) często nie są kompatybilne z barwieniem immunologicznym. W związku z tym opracowaliśmy metodę obrazowania MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and p rotein), która umożliwia jednoczesną wizualizację DNA, RNA i białkaw pojedynczych komórkach. W porównaniu z konwencjonalnym DNA FISH, MICDDRP wykorzystuje technologię ISH rozgałęzionego DNA (bDNA), która znacznie poprawia czułość i wykrywanie sondy oligonukleotydowej. Niewielkie modyfikacje MICDDRP umożliwiają obrazowanie białek wirusowych jednocześnie z kwasami nukleinowymi (RNA lub DNA) o różnej nici. Zastosowaliśmy te protokoły do badania cykli życiowych wielu patogenów wirusowych, w tym ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)-1, ludzkiego wirusa limfotropowego T (HTLV)-1, wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), wirusa Zika (ZKV) i wirusa grypy A (IAV). Wykazaliśmy, że możemy skutecznie znakować wirusowe kwasy nukleinowe i białka w różnych wirusach. Badania te mogą zapewnić nam lepsze zrozumienie mechanistyczne wielu systemów wirusowych, a ponadto służyć jako szablon do zastosowania multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego DNA, RNA i białka w szerokim spektrum systemów komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż dostępne są tysiące komercyjnych przeciwciał do specyficznego znakowania białek za pomocą konwencjonalnych metod barwienia immunologicznego, a białka fuzyjne mogą być modyfikowane za pomocą zoptymalizowanych pod kątem fototerapii znaczników fluorescencyjnych do śledzenia wielu białek w próbce1, mikroskopowa wizualizacja białka często nie jest kompatybilna z konwencjonalną fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ (FISH)2. Ograniczenia techniczne w jednoczesnej wizualizacji DNA, RNA i białka przy użyciu podejść opartych na fluorescencji utrudniły dogłębne zrozumienie replikacji wirusa. Śledzenie zarówno wirusowego kwasu nukleinowego, jak i białka w trakcie infekcji pozwala wirusologom na wizualizację podstawowych procesów, które leżą u podstaw replikacji i montażu wirusa3,4,5,6.

Opracowaliśmy metodę obrazowania, multiplex immunofluorescencyjna detekcjad oparta na DNA, RNA i Proteina (MICDDRP)3, która wykorzystuje technologię rozgałęzionego DNA (bDNA) in situ w celu poprawy czułości wykrywania kwasów nukleinowych7,8,9. Dodatkowo, ta metoda wykorzystuje sparowane sondy dla zwiększenia specyficzności. Sondy specyficzne dla sekwencji bDNA wykorzystują rozgałęzione DNA przedwzmacniacza i wzmacniacza do wytworzenia intensywnego i zlokalizowanego sygnału, ulepszając poprzednie metody hybrydyzacji, które polegały na celowaniu w powtarzające się regiony w klasie DNA9. Zakażone komórki w kontekście klinicznym często nie zawierają obfitego materiału genetycznego wirusa, co stanowi towar dla czułej metody wykrywania fluorescencyjnych kwasów nukleinowych w warunkach diagnostycznych. Komercjalizacja technologii bDNA za pomocą podejść takich jak RNAscope7 i ViewRNA10 wypełniła tę niszę. Czułość obrazowania fluorescencyjnego bDNA ma również ważne zastosowanie w biologii komórki, umożliwiając wykrywanie rzadkich gatunków kwasów nukleinowych w modelach hodowli komórkowych. Ogromna poprawa czułości sprawia, że metody obrazowania oparte na bDNA nadają się do badania wirusów. Potencjalną wadą jest jednak to, że metody te koncentrują się na wizualizacji RNA lub RNA i białka. Wszystkie replikujące się komórki i wiele wirusów ma genomy DNA lub tworzy DNA podczas cyklu replikacji, co sprawia, że metody zdolne do obrazowania zarówno RNA, jak i DNA, a także białka, są bardzo pożądane.

W protokole MICDDRP wykonujemy bDNA FISH do wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego za pomocą metody RNAscope, z modyfikacjami7. Jedną z głównych modyfikacji tego protokołu jest optymalizacja leczenia proteazy po utrwaleniu chemicznym. Leczenie proteazą ułatwia usuwanie białek związanych z kwasem nukleinowym w celu poprawy wydajności hybrydyzacji sondy. Po leczeniu proteazą następuje inkubacja z rozgałęzionymi sondami oligonukleotydowymi. Po zastosowaniu sondy (sond) bDNA, próbki są myte, a następnie inkubowane z prewzmacniaczem sygnału i DNA wzmacniacza. Multipleksowana hybrydyzacja in situ (ISH), znakowanie wielu celów genowych, wymaga sond docelowych z różnymi kanałami kolorów do różnicowania spektralnego7. Po inkubacji ze wzmacniaczami DNA następuje immunofluorescencja (IF).

bDNA ISH poprawia stosunek sygnału do szumu poprzez wzmocnienie sygnałów specyficznych dla celu, z redukcją szumu tła z niespecyficznych zdarzeń hybrydyzacji7,11. Sondy docelowe są projektowane przy użyciu publicznie dostępnych programów, które przewidują prawdopodobieństwo wystąpienia niespecyficznych zdarzeń hybrydyzacji, a także obliczają temperaturę topnienia (Tm) hybrydy sonda-cel7,11. Sondy docelowe zawierają region o strukturze od 18 do 25 zasad komplementarny do docelowej sekwencji DNA/RNA, sekwencję dystansową i 14-zasadową sekwencję ogonową. Para sond docelowych, z których każda ma odrębną sekwencję ogonową, hybrydyzuje się do regionu docelowego (obejmującego ~50 baz). Dwie sekwencje ogonowe tworzą miejsce hybrydyzacji dla sond przedwzmacniacza, które zawierają 20 miejsc wiązania dla sond wzmacniacza, które dodatkowo zawierają 20 miejsc wiązania dla sondy etykietowej. Na przykład region o wartości jednej kilozasady (kb) na cząsteczce kwasu nukleinowego jest celem 20 par sond, tworząc rusztowanie molekularne do sekwencyjnej hybrydyzacji z przedwzmacniaczem, wzmacniaczem i sondą etykietową. Może to zatem prowadzić do teoretycznej wydajności 8000 znaczników fluorescencyjnych na cząsteczkę kwasu nukleinowego, umożliwiając wykrywanie pojedynczych cząsteczek i znaczne ulepszenia w porównaniu z konwencjonalnymi metodami FISH7 (Zobacz Rysunek 1A dla schematu amplifikacji sygnału bDNA). Aby skonfigurować sondy dla multipleksowanego ISH, każda sonda docelowa musi znajdować się w innym kanale kolorów (C1, C2 lub C3). Te sondy docelowe z różnymi kanałami kolorów mają wyraźne 14-podstawowe sekwencje ogonowe. Te sekwencje ogonowe będą wiązać różne wzmacniacze sygnału z różnymi sondami fluorescencyjnymi, umożliwiając w ten sposób łatwe różnicowanie widma w wielu obiektach. W przedstawionym Protokole, Tabela 4 w Kroku 9 zawiera dalsze informacje na temat znakowania fluorescencyjnego sond docelowych. Ponadto Rysunek 2 i Rysunek 3 przedstawia przykłady, w jaki sposób wybraliśmy odpowiedni wzmacniacz 4-FL (A, B lub C) (sonda fluorescencyjna i końcowy etap hybrydyzacji), aby uzyskać specyficzne znakowanie fluorescencyjne wielu celów wirusowych kwasów nukleinowych po zakażeniach HIV-1 i HTLV-1.

Pokazaliśmy kilka zastosowań jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji RNA, DNA i białek, obserwując krytyczne etapy replikacji wirusa z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną3,4,5. Na przykład, jednoczesna wizualizacja RNA wirusa, cytoplazmatycznego i jądrowego DNA oraz białka w pojedynczej komórce pozwoliła nam na wizualizację kluczowych zdarzeń podczas infekcji HIV-1, w tym śledzenia RNA zawierającego rdzenie w cytoplazmie przed wejściem jądra i integracją prowirusowego DNA3. Ponadto zastosowaliśmy MICDDRP do scharakteryzowania wpływu czynników gospodarza i leczenia farmakologicznego na infekcję wirusową i replikację4,5. W Ukah i wsp. śledziliśmy reaktywację transkrypcji HIV-1 w modelach komórek latencji traktowanych różnymi środkami odwracającymi opóźnienie, aby uwidocznić transkrypcję HIV i odwrócenie opóźnienia4. Ponadto MICDDRP może pozwolić nam na wizualizację zmian fenotypowych związanych z hamowaniem przeciwwirusowym przypisywanym leczeniu małymi cząsteczkami lub ograniczeniem czynnika gospodarza. Jako dowód słuszności koncepcji solidności i szerokiego zastosowania naszego podejścia, wykazaliśmy, że możemy wykorzystać modyfikacje naszego protokołu do skutecznego znakowania wirusowego kwasu nukleinowego w celu śledzenia infekcji nie tylko w ludzkim wirusie niedoboru odporności (HIV)-1, ale także w ludzkim wirusie T-limfotropowym (HTLV)-1, wirusie zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusie zapalenia wątroby typu C (HCV), Wirus Zika (ZIKV) i wirus grypy A (IAV). Ponieważ cykl życiowy HIV-1 składa się zarówno z gatunków wirusa DNA, jak i RNA, przeprowadziliśmy większość naszej optymalizacji MICDDRP na podstawie kinetyki replikacji HIV-1. Jednak dodatkowo wykazaliśmy, że możemy śledzić syntezę różnych wirusowych transkryptów RNA o jednej lub obu nici sensowności (+), jak i antysensowności (-) w wirusach takich jak ZIKV, IAV, HBV i HCV, aby monitorować transkrypcję i replikację wirusa3,4,5,6. Badania mają na celu poprawę mechanistycznego zrozumienia kilku procesów wirusowych i służą jako wytyczne do wdrożenia tej technologii obrazowania fluorescencyjnego w szerokim zakresie modeli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Komórki nasienne (Zawiesina vs. Komórki przylegające) na szkiełkach nakrywkowych lub szkiełkach komorowych (przedstawiony protokół używa szkiełek nakrywkowych).

  1. Wysiew komórek zawiesinowych
    1. Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL) (ułatwia przyleganie komórek zawiesiny do szkiełka nakrywkowego) poprzez uprzednią inkubację szkiełek nakrywkowych w etanolu (EtOH) przez 5 minut (sterylizuje szkiełka nakrywkowe i usuwa wszelkie pozostałości). Następnie przemyć 2x w buforze fosforanowym (PBS) przed inkubacją szkiełek nakrywkowych w PDL (20 μg/ml) przez 30 minut (min) w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Usuń PDL i umyj 2x w PBS. Komórki osadkowe (wcześniej zakażone/leczone w oparciu o pożądane warunki obrazowania) i ponownie zawiesić 106komórek w 50 μl PBS. Umieścić 50 μl komórek na szkle (pokrytym PDL) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  2. Wysiew komórek przylegających
    1. Hoduj komórki na sterylnym szkiełku nakrywkowym umieszczonym w 6-dołkowym naczyniu i infekuj komórki cząstkami wirusa lub traktuj interesującym ich związkiem. Pozwól komórkom osiągnąć 50-70% zbieżności przed przygotowaniem próbki do eksperymentów obrazowych.

2. Utrwalenie komórkowe: Aby zachować morfologię komórkową do badań obrazowania fluorescencyjnego

UWAGA: Utrzymuj 4% PFA i PBS w temperaturze RT przez co najmniej 30 minut przed utrwaleniem komórkowym.

  1. Odessać pożywkę komórkową, przemyć komórki na szkiełkach nakrywkowych 3x w PBS i utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 30 min. Odessać PFA i przepłukać komórki w PBS 2x.
    UWAGA: Komórki mogą być teraz odwodnione i przechowywane, jeśli eksperymentator chce wznowić eksperyment w innym terminie. Utrwalone komórki można odwodnić w EtOH przed przechowywaniem.
    1. Usuń PBS po umyciu po utrwaleniu komórkowym i zastąp 500 μl 50% EtOH (v/v w wodzie). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Usuń 50% EtOH i zastąp 500 μl 70% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Usuń 70% EtOH i zastąp 500 μl 100% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Usuń 100% EtOH i zastąp świeżym 100% EtOH.
      UWAGA: Odwodnione komórki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy. Przed przechowywaniem uszczelnij płytki taśmą lub parafilmem, aby zapobiec parowaniu EtOH.
    5. Uwodnić komórki, aby przejść do multipleksowanego znakowania fluorescencyjnego komórek/wirusa.
    6. Usuń 100% EtOH i zastąp 500 μl 70% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min.
      UWAGA: W żadnym momencie nie pozwól, aby komórki wyschły. Zawsze używaj wystarczającej ilości roztworu, aby zanurzyć wszystkie komórki.
    7. Usuń 70% EtOH i zastąp 500 μl 50% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    8. Usuń 50% EtOH i zastąp 1x PBS.
      UWAGA: Przygotuj rozcieńczenie proteazy, sondy hybrydyzacyjne i bufor do płukania przed leczeniem proteazą (Krok 4) i aplikacją sondy docelowej (Krok 5). Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania odczynnika znajdują się na początku każdego odpowiedniego kroku.
OdczynnikiInne notatki
Roztwór proteazyPrzygotuj w 1X PBS
Docelowa sonda(-y) oligonukletodyjna(e)Rozcieńczyć w buforze hybrydyzacyjnym
Bufor do płukaniaMyje się zgodnie z docelowymi etapami hybrydyzacji
Bufor hybrydyzacyjnyReceptura przedstawiona w tabeli 3

Tabela 1: Kluczowe odczynniki w protokole MICDDRP.

3. Przepuszczalność komórek: Zwiększa dostęp do komórki i organelli komórkowych dla wejścia dużych cząsteczek (przeciwciała, sondy hybrydyzacji kwasów nukleinowych)

  1. Usuń 1x PBS po utrwaleniu komórkowym lub ponownym nawodnieniu i zastąp 500 μl 0,1% (v/v) Tween-20 w 1x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wymień jeden po drugim. Umyj raz 500 μl 1x PBS i dodaj świeży 1x PBS.

4. Unieruchomienie szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i leczenie proteazą w celu usunięcia białek wiążących kwasy nukleinowe z utrwalonego wirusowego/komórkowego kwasu nukleinowego w celu poprawy efektywności hybrydyzacji

UWAGA: Przygotuj rozcieńczony roztwór Proteazy III (zobacz szczegóły odczynnika w Tabeli Materiałów) podczas przepuszczalności komórkowej. Pozwól proteazie dotrzeć do RT przez 10 minut przed przepuszczalnością.

  1. Umieść małą kroplę lakieru do paznokci na wysterylizowanym szkiełku podstawowym. Wysusz z powrotem (strona bez warstwy komórek) i umieść krawędź szkiełka nakrywkowego na kropli lakieru do paznokci, stroną z przylegającymi komórkami do góry. Dodaj kilka kropli PBS na unieruchomione szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec wysuszeniu.
    1. Narysuj okrąg (około 3 mm od szkiełka nakrywkowego) wokół obwodu szkiełka nakrywkowego, teraz przyklejonego do szkiełka, za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (wodoodpornego pisaka, który utrzymuje odczynniki zlokalizowane na komórkach).
  2. Rozcieńczyć proteazę III w 1x PBS (100 μl / szkiełko nakrywkowe).
    UWAGA: Stężenie proteazy może wymagać dostosowania w zależności od różnic w typach komórek, sondach lub docelowych kwasach nukleinowych poprzez optymalizację empiryczną (patrz dyskusja). Aby uzyskać najbardziej efektywne znakowanie RNA / DNA w różnych systemach wirusowych, odnieśliśmy sukces z następującymi rozcieńczeniami przedstawionymi w tabeli 2 poniżej z rozcieńczeniami w zakresie od (1 do 2)-(1 do 15) (proteaza do 1x PBS).
Cele sondyRozcieńczenie proteazy w 1X PBS (proteaza III do 1X PBS)
DNA/RNA wirusa HIV-1od 1 do 5
HTLV-1 DNA/RNAod 1 do 5
Wirus HBV pgRNA i całkowity RNA HBVod 1 do 15
Życiodajne RNA (IAV)od 1 do 15
RNA ZIKVOd 1 do 2

Tabela 2: Rozcieńczenia proteazy III w PBS do hybrydyzacji wirusowych kwasów nukleinowych.

  1. Zdekantować 1x PBS na szkiełko nakrywkowe po unieruchomieniu i nałożyć rozcieńczoną Proteazę III.
  2. Inkubować w wilgotnym piecu w temperaturze 40 °C przez 15 minut.
  3. Zdekantuj roztwór proteazy i zanurz szkiełka w 1x PBS. Mieszać naczyniem kołyszącym przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórzyć mycie nowym 1x PBS.
    1. Tylko w przypadku wykrywania DNA należy przemyć próbki trzykrotnie wodą wolną od nukleaz przez 2 minuty każda, a następnie inkubować z 5 mg/ml RNazy A rozcieńczonej w PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Zdekantować roztwór RNazy A i przemyć 3x przez 2 minuty ultraczystą wodą. Kontynuuj z ISH sondy (sond) docelowej.
      UWAGA: Bufor hybrydyzacyjny poprawia wykrywanie vDNA bez wpływu na wydajność barwienia vRNA dla prezentowanych wyników (wyniki reprezentatywne). Rozcieńczone sondy kanału DNA 1 (C1) 1:1 z sondą hybrydyzacyjną. Rozcieńczyć sondy RNA C2 i C3 w buforze hybrydyzacyjnym. Sondy C2 i C3 używane w naszych badaniach obrazowych są w roztworach 50X (1:50; sonda docelowa do bufora hybrydyzacyjnego).
  4. Przygotuj bufor hybrydyzacyjny w wodzie wolnej od nukleaz, postępując zgodnie z poniższą procedurą krok po kroku:
    1. W probówce o pojemności 15 ml dodaj 700 μl wody wolnej od nukleaz, 300 μl 50% (wagowo-objętościowo (w/v)) siarczanu dekstranu, 300 μl 5 M NaCl, 125 μl 200 mM cytrynianu sodu (pH 6,2) i 375 mg (proszek) węglanu etylenu.
    2. Dobrze wymieszaj za pomocą wiru do rozpuszczenia węglanu etylenu (upewnij się, że cały proszek jest rozpuszczony i klarowny roztwór).
    3. Dodaj 25 μl 10% (objętość/objętość (v/v)) Tween-20 i tyle wody wolnej od nukleaz, aby uzupełnić 2,5 ml (2x roztwór).
      UWAGA: Przedstawiona receptura buforu hybrydyzacyjnego znajduje się w tabeli 3 poniżej. Roztwór jest stabilny przez tydzień. Upewnij się, że detergent Tween-20 jest odpowiednio wymieszany, uważając, aby zapobiec bulgotaniu roztworu.
OdczynnikKoncentracja zapasówDodatkowe uwagi
Woda wolna od nukleaznie
Siarczan dekstranu50% (w/v)Bardzo lepki
chlorek sodu5 mln
Cytrynian sodu (pH 6,2)200 mMPrzechowywać w temperaturze 4 °C
Węglan etylenunieproszek
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)10% (v/v)

Tabela 3: Lista odczynników bufora hybrydyzacji.

5. Inkubacja za pomocą sond do hybrydyzacji DNA/RNA: Docelowe sondy oligonukleotydowe wiążą się z regionem (regionami) zainteresowania, tworząc molekularne rusztowanie dla przedwzmacniaczy, wzmacniaczy i sond fluorescencyjnych.

UWAGA: Ogrzewaj sondy DNA/RNA w temperaturze 40 °C przez 10 minut (podczas Permeabilizacji Komórek) i schładzaj do RT przez co najmniej 10 minut, jeśli nie zastosowano leczenia RNazą. Jeśli przed hybrydyzacją sondy docelowej konieczne jest traktowanie RNazą lub dalsza obróbka próbki, należy odpowiednio rozgrzać sondy. Po podgrzaniu odkręcić sondy C2 i C3 i rozcieńczyć w buforze hybrydyzacyjnym. Po rozcieńczeniu sondy C2 i C3 można krótko podgrzać. Ciepły 50x bufor do płukania (więcej szczegółów w Tabeli Materiałów) w temperaturze 40 °C przez 10-20 minut i rozcieńczyć do 1x w wodzie klasy biologii molekularnej.

  1. Inkubować 200 μl buforu do hybrydyzacji w temperaturze 67 °C przez 10 minut przed dodaniem sondy(-ek) hybrydyzacyjnej(-ych). Rozcieńczyć sondę w buforze hybrydyzacyjnym (receptura wymieniona w tabeli 2). Dodać 50 μl/szkiełko nakrywkowe.
  2. Inkubować w nawilżonym piecu w temperaturze 40 °C przez 2 godziny (h). Sondy dekantacyjne i szkiełka zanurzeniowe w 1x buforze myjącym. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz mycie nowym 1x buforem do mycia.

6. Wzmacniacz (Amp) Hybrydyzacja 1-FL: Dodanie przedwzmacniacza, który jest komplementarny do sekwencji ogonowej docelowych sond DNA/RNA (Krok 5)

UWAGA: Wzmacniacze powinny być ustawione na RT przed użyciem. Wyjmij każdy wzmacniacz z lodówki na 30 minut przed użyciem i pozostaw na stole w RT.

  1. Wyjmij szkiełka z 1x bufora do mycia i dotknij/wchłoń, aby usunąć nadmiar płynu.
  2. Dodać 1 kroplę Amp 1-FL na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w wilgotnym piecu w temperaturze 40 °C przez 30 min.
  3. Zdekantuj Amp 1-FL i zanurz w 1x buforze do mycia. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze RT. Powtórz mycie z nowym buforem do mycia 1x.

7. Hybrydyzacja Amp 2-FL: Inkubacja ze wzmacniaczem sygnału z pokrewną sekwencją rozpoznawania do przedwzmacniaczy (Amp 1-FL)

  1. Wyjmij szkiełka z 1x bufora do mycia i dotknij/wchłoń, aby usunąć nadmiar płynu.
  2. Dodaj 1 kroplę Amp 2-FL na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w nawilżonym piecu w temperaturze 40 °C przez 15 minut.
  3. Zdekantuj Amp 2-FL i zanurz w 1x buforze do mycia. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze RT. Powtórz mycie z nowym buforem do mycia 1x.

8. Hybrydyzacja Amp 3-FL: Inkubacja z drugim wzmacniaczem sygnału

  1. Wyjmij szkiełka z 1x bufora do mycia i dotknij/wchłoń, aby usunąć nadmiar płynu.
  2. Dodaj 1 kroplę Amp 3-FL na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w wilgotnym piecu w temperaturze 40 °C przez 30 min.
  3. Zdekantuj Amp 3-FL i zanurz w 1x buforze do mycia. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze RT. Powtórz mycie z nowym buforem do mycia 1x.

9. Hybrydyzacja Amp 4-FL: Etykieta fluorescencyjna i końcowy etap hybrydyzacji

UWAGA: Po pierwsze, zobacz Tabelę 4, aby wybrać odpowiedni Amp 4 (A,B lub C)- FL w oparciu o kanały sondy docelowej. Oceń, jaki Amp 4-FL jest potrzebny do znakowania interesującego DNA/RNA. Przykład znajduje się w poniższej tabeli:

szt. szt. szt. TGLI TGLI TGLI
ZAWZ
Kanał DNA 1 (C1)Z numerem 488550550
Kanał 2 DNA/RNA (C2)550Z numerem 488647
Kanał RNA 3 (C3)647647Z numerem 488

Tabela 4: Wybór sondy fluorescencyjnej Amp 4 (A, B lub C)-FL dla multipleksowanego ISH.

UWAGA: Dla multipleksowanych RYB (wiele celów), wybór właściwego Amp 4 (A, B lub C)- FL jest krytyczny dla prawidłowego oznaczenia celu (celów). Sondy docelowe (krok 5) mają różne kanały kolorów (C1, C2 lub C3), które dyktują odpowiednią etykietę fluorescencyjną (Alexa 488, Atto 550 lub Alexa 647), w oparciu o wybrany Amp 4-FL. Przykłady wyboru kombinacji fluoroforów do obrazowania multipleksowego znajdują się w legendach Rysunek 2 i Rysunek 3. Jako dodatkowy przykład, wybór Amp 4B-FL spowoduje selektywne znakowanie sond DNA C1 za pomocą Atto 550 i sond RNA C3 za pomocą Alexa 647.

  1. Wyjmij szkiełka z 1x bufora do mycia i dotknij/wchłoń, aby usunąć nadmiar płynu.
  2. Dodać 1 kroplę Amp 4-FL na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w wilgotnym piecu w temperaturze 40 °C przez 15 min.
    UWAGA: Postępując zgodnie z krokiem 9.2, trzymaj próbki pod przykryciem, chronione przed światłem.
  3. Zdekantuj Amp 4-FL i zanurz w 1x buforze do mycia. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz mycie nowym 1x buforem do mycia. Umyć 1x PBS (2 min) i przechowywać w PBS.

10. Barwienie immunologiczne białek: Aby oznaczyć interesujące białko (białka)

  1. Zdekantować PBS i dodać 200 μl buforu blokującego (1% w/v BSA, 10% v/v FBS w PBS z 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) do szkiełka nakrywkowego. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Zdekantować bufor blokujący i nałożyć 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBST + 1% w/v BSA. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Umyć szkiełko dwukrotnie PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem.
  4. Stosować wybrane przeciwciało drugorzędowe przez 1 godzinę w RT w PBST + 1% w/v BSA.
  5. Myć szkiełko PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem.

11. Barwienie jądrowe: Przeciw-plamiste jądra po barwieniu immunologicznym

  1. Zdekantować PBST i nałożyć DAPI lub wybraną barwienie jądrową na 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  2. Umyć szkiełko dwukrotnie PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem.

12. Montaż

  1. Umieść 1 kroplę roztworu zapobiegającego blaknięciu (np. Prolong Gold) na nowym sterylnym szkiełku podstawowym (najpierw wyczyść szkiełko EtOH i pozostaw do wyschnięcia, aby upewnić się, że na szkle nie ma żadnych pozostałości). Tą samą końcówką rozprowadź kroplę roztworu zapobiegającego blaknięciu, aby pokryć obszar o rozmiarze zbliżonym do szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Roztwór zapobiegający blaknięciu jest bardzo lepki i może być trudny do pipetowania. Odcięcie końcówki o pojemności 200 μl przed pipetowaniem może złagodzić te problemy.
  2. Usuń szkiełko nakrywkowe z próbką komórek ze szkiełka i zanurz w PBS, aby usunąć resztki lakieru do paznokci z tyłu za pomocą kleszczyków i PBS. Osusz kleszcze i tylną część szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczki Kimwipe.
  3. Delikatnie zanurzyć szkiełko nakrywkowe w kropli roztworu zapobiegającego blaknięciu, umieszczając stronę próbki (strona z warstwą komórek) szkiełka nakrywkowego na kropli).
  4. Pozostaw próbki do wyschnięcia na noc.

13. Obrazowanie

  1. Obraz za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat MICDDRP jest przedstawiony w Rysunek 1. Po znakowaniu DNA i RNA następuje barwienie immunologiczne. Zastosowanie wzmacniaczy rozgałęziających zwiększa sygnał, umożliwiając detekcję pojedynczych cząsteczek kwasu nukleinowego.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat MICDDRP i przepływu pracy krok po kroku. (A) sygnał bDNA jest wzmacn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoczesna wizualizacja RNA, DNA i białka często wymaga rozległej optymalizacji. Dwie powszechnie stosowane metody to znakowanie 5-etynylo-2-deoksyurydyną (EdU) i DNA FISH. Znakowanie EdU zostało zastosowane do jednoczesnej wizualizacji DNA i białka wirusa, ponieważ EdU jest włączane do powstającego DNA, a następnie znakowane barwnikami fluorescencyjnymi zawierającymi azydek za pomocą chemii kliknięć. Znakowanie EdU może być zatem wykorzystywane do monitorowania kinetyki replikacji natywnych wirusów DNA lub wir...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana w całości lub w części przez National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 i U54 AI150472). Dziękujemy dr Raymondowi F. Schinazi i Sadie Amichai za dostarczenie komórek zakażonych wirusem grypy typu A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% PFA
50% siarczan dekstranuAmreso198Do buforu hybrydyzacji DNA
50X bufor do płukaniaACD Bio320058
6-dołkowe
Wzmacniacz 1-FLACD
Bio Wzmacniacz 2-FLACD
Bio Wzmacniacz 3-FLACD
Bio Amplifier 4-FLACD BioConsult Amp-4 tabela w protokole
Przeciwciało anty-HCV NS5aAbcamab13833Mysz monoklonalna; współpracuje z genotypami HCV 1a, 1b, 3 i 4
Przeciwciało monoklonalne anty-HIV-1 p24Program odczynników NIH AIDS3537
Przeciwciało anty-Mov10Abcamab80613Królik poliklonalny
Przeciwciało anty-PB1GeneTexGTX125923Przeciwciało przeciwko białku grypy
AlbuminaOdczynnik blokujący do barwienia immunologicznego
Pożywki komórkowe z suplementami Pożywkaodpowiednia dla modelu komórkowego
Szkiełka
DAPIACD BioBarwnik jądrowy (zestaw RNAscope firmy ACD Bio)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (1X PBS)Gibco14190250Bez wapnia i magnezu
Węglan etylenuSigmaE26258
Surowica bydlęca płodu (FBS)Użyj określonego FBS w zależności od tego, w jakim przeciwciałie wtórnym w surowicy zostało wyhodowane (np. koza FBS)
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand colorfrost plusFisher Scientific12-550-17/18/19Wstępnie oczyszczone
Sonda HCV-GT2a-sense-C2 SondaRNA ACD Bio441371HCV(+) Sonda RNA
HIV-gagpol-C1ACD Bio 317701Sonda cDNA HIV-nongagpol-C3
ACD Bio317711-CSonda RNA HIV-1
Piec do hybrydyzacji HybEZACD Bio321710/321720
Długopis hydrofobowy ImmEdgeVector LaboratoriesH-4000
LakierDo immobolizacji szkiełka nakrywkowego do ślizgania się przed leczeniem proteazy
Woda wolna od nukleazAmbionAM9937
Poli-d-lizyna (PDL)Powłoka szkiełka nakrywkowe w 20 i mikro; g/ml PDL przez 30 minut
Rozcieńczalnik do sondACD Bio 300041Do rozcieńczania RNA Sondy C2 lub C3
Prolong gold antifadeInvitrogenP36930
Proteaza IIIACD Bio322337
RNAscope®   Sonda- V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221
RNaza AQiagen
Przeciwciała
Slajdy Chlorek
soduDo buforu hybrydyzacji DNA
Cytrynian sodu, pH 6,2Do buforu hybrydyzacji DNA
Tween-20Do buforu hybrydyzacji DNA i PBS-T
V-HBV-GTDACD Bio441351Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2ACD Bio465531-C2HBV pgRNA
sonda V-HCV-GT2aACD Bio441361HCV(-) sense RNA sonda
ACD Bio495071-C3HTLV-1 (-) sense sonda RNA celująca HBZ
V-HTLV1-GAG-C2ACD Bio495051-C2HTLV-1 Sonda DNA
V-HTLV1-GAG-POL-senseACD Bio495061HTLV-1 (+) czujnik RNA
V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221Sonda RNA IAV
V-ZIKA-PP-O2ACD Bio 464531Sonda RNA Zika(+)
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2ACD Bio478731-C2Zika(-) czujnik RNA Sondy
płytki surowicy bydlęcej nakrywkowe do paznokci drugorzędoweV-HTLV-HBZ-sense-C3

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
  2. Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882(2017).
  4. Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
  5. Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
  6. Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  8. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721(2019).
  9. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  10. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
  11. Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  12. Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
  13. Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
  14. Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505(2020).
  15. Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multiplex Fluorescence ImagingViral Nucleic Acid DetectionViral Protein VisualizationSingle Cell AnalysisBranched DNA ISH TechnologyImmunofluorescent Cell Based DetectionConfocal MicroscopyHIV 1 Infection StudyHBV RNA QuantificationHCV Infection Imaging

Powiązane artykuły