Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61855

⸱

3 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Minnesota, 2Center for Genomic Engineering, University of Minnesota, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy szczegółowy, krok po kroku protokół inżynierii genomowej opartej na CRISPR/Cas9 pierwotnych ludzkich limfocytów B do nokautowania genów (KO) i knock-in (KI) w celu zbadania biologicznych funkcji genów w komórkach B i rozwoju terapii komórek B.

Streszczenie

B limfocyty pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych i są kluczowym składnikiem humoralnego ramienia adaptacyjnego układu odpornościowego. Są atrakcyjnymi kandydatami do terapii komórkowych ze względu na łatwość izolacji od krwi obwodowej, zdolność do ekspansji in vitro i długowieczność in vivo. Dodatkowo, ich normalna funkcja biologiczna - wytwarzanie dużych ilości przeciwciał - może być wykorzystana do ekspresji bardzo dużych ilości białka terapeutycznego, takiego jak rekombinowane przeciwciało do zwalczania infekcji lub enzym do leczenia enzymopatii. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody izolowania pierwotnych ludzkich komórek B od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) oraz aktywacji/ekspansji izolowanych komórek B in vitro. Następnie pokazujemy etapy związane z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9 do specyficznego dla miejsca KO endogennych genów w komórkach B. Metoda ta pozwala na efektywne KO różnych genów, które mogą być wykorzystane do badania funkcji biologicznych interesujących genów. Następnie demonstrujemy etapy korzystania z systemu CRISPR/Cas9 wraz z rekombinowanym, związanym z adenowirusem wektorem (rAAV) w celu efektywnej specyficznej dla miejsca integracji kasety ekspresji transgenu w komórkach B. Razem protokół ten zapewnia platformę inżynieryjną krok po kroku, która może być wykorzystana w pierwotnych ludzkich komórkach B do badania biologicznych funkcji genów, a także do opracowywania terapii komórkami B.

Wprowadzenie

Komórki B są podgrupą linii limfocytów wywodzących się z hematopoetycznych komórek macierzystych. Odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnym humoralnym układzie odpornościowym, wytwarzając duże ilości przeciwciał w odpowiedzi na wyzwania immunologiczne1. Limfocyty B są również prekursorami komórek B pamięci i terminalnie zróżnicowanych, długowiecznych komórek plazmatycznych, zapewniając w ten sposób trwałą odporność humoralną2. Komórki plazmatyczne, w szczególności, są unikalne wśród komórek odpornościowych pod względem ich zdolności do wytwarzania dużych ilości określonego przeciwciała podczas przetrwania przez lata lub dekady3. Dodatkowo, łatwość izolacji od krwi obwodowej sprawia, że linia komórek B jest doskonałym kandydatem do nowatorskich terapii komórkowych4.

Poprzednio, losowe metody integracji, takie jak te wykorzystujące wektory lentiwirusowe lub transpozon Śpiącej Królewny, były używane do inżynierii komórek B do dostarczania i ekspresji transgenu5,6,7,8. Jednak niespecyficzny charakter tych podejść utrudnia badanie funkcji biologicznych określonego genu w komórkach B i niesie ze sobą nieodłączne ryzyko mutagenezy insercyjnej i zmiennej ekspresji transgenu i/lub wyciszenia w warunkach terapeutycznych.

System CRISPR/Cas9 to potężne narzędzie inżynierii genomu, które pozwala naukowcom na precyzyjną edycję genomu różnych komórek u wielu gatunków. Ostatnio dwie grupy, w tym nasza, z powodzeniem opracowały metody ekspansji ex vivo i ukierunkowanej inżynierii genomu pierwotnych ludzkich komórek B9,10. Opiszemy proces oczyszczania pierwotnych ludzkich limfocytów B z próbki leukaforezy. Następnie opiszemy nasz zaktualizowany protokół ekspansji komórek B i aktywacji izolowanych komórek B. Następnie opiszemy proces wybijania klastra różnicowania 19 (CD19), specyficznego receptora komórek B i cechy charakterystycznej komórek B, za pomocą elektroporacji w celu wprowadzenia mRNA CRISPR / Cas9 wraz z sgRNA CD19 do aktywowanych komórek B.

Cas9 mRNA ulega translacji i wiąże się z sgRNA CD19, tworząc kompleks rybonukleoproteinowy CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Następnie sgRNA w kompleksie prowadzi Cas9 do wytworzenia pęknięcia dwuniciowego (DSB) w sekwencji docelowej na eksonie 2 genu. Komórki naprawią DSB poprzez "niehomologiczne łączenie końców" poprzez wprowadzanie lub usuwanie nukleotydów, co prowadzi do mutacji przesunięcia ramki i powoduje znokautowanie genu. Następnie zmierzymy utratę CD19 za pomocą cytometrii przepływowej i przeanalizujemy tworzenie indeli poprzez śledzenie indeli za pomocą analizy rozkładu (TIDE).

Następnie opiszemy proces używania CRISPR/Cas9 razem z rekombinowanym wektorem AAV6 (rAAV6, matrycą dawcy do naprawy kierowanej homologią (HDR)) do pośredniczenia w specyficznym dla miejsca insercji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w genie miejsca integracji wirusa związanego z adenowirusem 1 (AAVS1). Gen AAVS1 jest aktywnym locus bez znanych funkcji biologicznych i miejscem integracji wirusa AAV w ludzkim genomie; Dlatego jest uważany za "bezpieczną przystań" dla inżynierii genomu. Tutaj informujemy, że ekspansja i aktywacja limfocytów B pozwoliła na 44-krotną ekspansję w ciągu 7 dni hodowli (Rysunek 1). Elektroporacja komórek B wykazała nieznaczne pogorszenie ogólnego stanu zdrowia komórek (Rysunek 2A) po 24 godzinach od transfekcji. Analiza wykresu punktowego markera CD19 (Rysunek 2B) wykazała do 83% redukcję w edytowanych komórkach (Rysunek 2C).

analiza TIDE chromatografów (Rysunek 3A) wykazała, że % indeli było podobne do % utraty białka przez cytometrię przepływową (Rysunek 3B). Analiza cytometrii przepływowej eksperymentu KI wykazała, że komórki, które otrzymały wektor AAV (Figura 4), wraz z RNP, wyrażały do 64% komórek EGFP-dodatnich (Figura 5A), a następnie wykazywały pomyślną integrację przez reakcję łańcuchową polimerazy złączowej (PCR) (Figura 5B). Zliczanie komórek wykazało, że wszystkie próbki szybko odzyskały się w ciągu 3 dni po inżynierii (Rysunek 5C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki leukaferezy od zdrowych dawców zostały pobrane z lokalnego banku krwi. Wszystkie opisane tutaj eksperymenty zostały uznane za zwolnione z badań przez Institutional Review Board (IRB) i zostały zatwierdzone przez Institutional Biosafety Committee (IBC) na University of Minnesota.

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z uniwersalnymi środkami ostrożności dla patogenów przenoszonych przez krew, przy użyciu sterylnych/aseptycznych technik i odpowiedniego sprzętu do poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.

1. Przygotuj suplementy do pożywki do ekspansji komórek B

  1. Oligonukleotyd CpG należy rozpuścić w stężeniu 1 mg/ml.
  2. Ligand CD40 (CD40L) należy rozpuścić do stężenia 100 μg/ml.
  3. Rozpuścić rekombinowaną ludzką IL-10 (rhIL-10) do stężenia 50 μg/ml.
  4. Rozpuść rekombinowaną ludzką IL-15 (rhIL-15) do stężenia 10 μg/ml.
    UWAGA: Każdy suplement należy przechowywać w małych porcjach w temperaturze od -20 °C do -80 °C przez okres do 6 miesięcy.

2. Przygotuj podłoże podstawowe

  1. Połącz pożywkę bazową komórek B z 5% (v/v) suplementem pożywki do ekspansji komórek odpornościowych in vitro (np. CTS Immune Cell SR) oraz 1% (v/v) penicyliną i streptomycyną.
  2. Przefiltruj i wysterylizuj podłoże podstawowe za pomocą adaptera filtra 0,22 μm do wysterylizowanej butelki.
  3. Podłoże podstawowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

3. Przygotuj podłoże do ekspandowania komórek B

  1. Przenieść wymaganą ilość podłoża podstawowego do sterylnego pojemnika w celu hodowli limfocytów B w stężeniu 5 × 105 komórek/ml.
  2. Uzupełnij podłoże podstawowe o 1 μg/ml CpG, 100 ng/ml CD40L, 50 ng/ml rhIL-10 i 10 ng/ml rhIL-15.
  3. Przefiltruj pożywkę rozszerzającą komórkę B za pomocą filtra 0,22 μm.
  4. Pożywkę do ekspandowania komórek B w inkubatorze do hodowli tkankowych należy równoważyć wilgotnością w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
    UWAGA: Przygotuj świeżą pożywkę do ekspandowania komórek B do użycia przez jeden dzień. Nie należy przygotowywać pożywki ekspansywnej komórek B do użycia przez wiele dni. Ta receptura pożywki zachęca do proliferacji komórek B pamięci i aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek B.

4. Oczyszczanie i ekspansja ludzkich komórek B

UWAGA: Dodaj 99–100% alkoholu izopropylowego do pojemnika do zamrażania o kontrolowanej temperaturze, postępując zgodnie z instrukcją producenta, i schładzaj pojemnik do zamrażania w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem kroku 4.1.

  1. Wyizolować PBMC z próbki leukaforezy
    1. Przenieś próbkę leukaforezy (około 8–10 ml) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Zwiększyć objętość do 35 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym 1x fosforanem (PBS).
    3. Ostrożnie ułóż 35 ml próbki leukaforezy na 15 ml podłoża o gradiencie gęstości.
    4. Wirować przy 500 × g przez 25 minut bez hamowania, usunąć warstwę osocza bez naruszania kożucha (warstwa PBMC), zebrać PBMC z granicy faz i przenieść do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    5. Podnieś PBMC do 50 ml za pomocą 1x PBS.
    6. Wirować przy 500 × g przez 5 minut bez hamulca. Usunąć supernatant bez naruszania osadu PBMC, który może mieć czerwony kolor.
    7. Dodać 7 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu, pipetować 3 razy, aby dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 minuty.
    8. Zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą 1x PBS.
    9. Wirować przy 400 × g przez 5 minut z hamulcem o niskim oporowym. Usunąć supernatant bez naruszania osadu. Granulka powinna wyglądać na różowawą lub białą.
      UWAGA: Aby kontynuować hodowlę świeżo wyizolowanych limfocytów B, przygotuj pożywkę do ekspandowania komórek B przed rozpoczęciem izolacji komórek B (krok 4.2).
  2. Izolacja komórek B z PBMC przy użyciu zestawu do izolacji ludzkich pierwotnych komórek B
    1. Zawiesić PBMC w buforze izolacyjnym do stężenia 5 × 107 komórek/mL.
      UWAGA: Jeśli całkowita liczba PBMC jest mniejsza niż 5 × 107 komórek, zmniejsz objętość bufora izolacyjnego, aby utrzymać 5 × 107 komórek/ml. Minimalne i maksymalne objętości zawiesiny komórek wynoszą odpowiednio 0,25 ml i 8 ml.
    2. Przenieś do 8 ml (5 × 107 komórek/ml) do sterylnej, polipropylenowej probówki z okrągłym dnem z nakrętką.
    3. Dodaj 50 μl/ml Cocktail Enhancer do PBMCs.
    4. Dodaj 50 μl/ml koktajlu izolacyjnego do PBMC, zakryj probówkę i odwróć 2-3 razy, aby wymieszać.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut; w 4 minucie inkubacji wirować mikrokulki magnetyczne przez co najmniej 30 s.
    6. Przenieś 50 μl mikrogranulek magnetycznych na 1 ml PBMC, zakryj probówkę i odwróć 2-3 razy, aby wymieszać.
    7. Uzupełnij do 10 ml buforem izolacyjnym i delikatnie pipetuj w górę i w dół 2–3 razy.
    8. Umieść probówkę w stacji magnetycznej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    9. Przytrzymaj magnes i rurkę razem i jednym ruchem odwróć magnes i rurkę razem, aby wlać zawiesinę ogniw do nowej probówki. Wyrzuć starą rurkę.
    10. Powtórzyć krok 4.2.8 (skrócić czas inkubacji do 2 minut) i wlać zawiesinę komórek B do czystej stożkowej probówki.
    11. Wzbogacone limfocyty B są gotowe do użycia. Jeśli komórki zostaną użyte natychmiast, przejdź do punktu 4.3 (Ekspansja ludzkich komórek B). Sprawdź czystość wyizolowanych limfocytów B za pomocą cytometrii przepływowej (opcjonalnie). Jeśli komórki mają zostać zamrożone przed użyciem, przejdź do kroku 4.2.12.
    12. Aby zamrozić limfocyty B, odwirować przy 400 × g przez 5 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.
    13. Ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej w stężeniu 107 komórek/ml i podwielokrotności 1 ml/kriowial.
    14. Umieścić kriowial w schłodzonym pojemniku do zamrażania i przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc; następnie przenieść zamrożony kriowial do zbiornika z ciekłym azotem; przechowywać zamrożone komórki do 1 roku.
      UWAGA: Oczekiwana wydajność izolowanych komórek B wynosi 2%-8% wszystkich PBMCs, przy żywotności 95%-99%.
  3. Ekspansja ludzkich komórek B
    UWAGA: Jeśli używasz świeżo wyizolowanych komórek B, pomiń kroki 4.3.1–4.3.5. Policz komórki i przenieś wymaganą liczbę komórek do sterylnej stożkowej probówki, a następnie przejdź do kroku 4.3.6.
    1. Wstępnie ogrzej płodową surowicę bydlęcą (FBS) w łaźni wodnej przed rozmrożeniem limfocytów B. Przygotować 20 ml pożywki do ekspandowania komórek B, przenieść do kolby T25 i wstępnie zrównoważyć pożywkę w inkubatorze do hodowli tkankowych (w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności) co najmniej 15 minut przed użyciem.
    2. Rozmrozić komórki B w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Czekając, przenieś 2 ml wstępnie podgrzanego FBS do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Po całkowitym rozmrożeniu limfocytów B natychmiast dodaj do próbki 1 ml wstępnie podgrzanego FBS, kroplami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
    4. Delikatnie odpipetować w celu ponownego zawieszenia próbki i przenieść całą objętość, kroplami, do stożkowej probówki zawierającej 2 ml wstępnie podgrzanego FBS.
    5. Zwiększ objętość do 15 ml za pomocą sterylnego 1x PBS, nakrętki i delikatnie odwróć probówkę 2-3 razy.
    6. Wirować przy 400 × g przez 5 min.
    7. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego, ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml wstępnie zbalansowanego podłoża do ekspandowania komórek B i policzyć komórki. Całkowita liczba komórek powinna wynosić około 107 komórek.
    8. Przenieść komórki do kolby zawierającej 20 ml wstępnie zbalansowanej pożywki do ekspandowania komórek B. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić około 5 x 105 komórek/ml.
    9. Inkubować kolbę pionowo w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    10. Całkowicie odświeżać pożywkę ekspandacyjną co 2 dni, przenosząc całą objętość limfocytów B do sterylnej stożkowej probówki i powtórzyć kroki 4.3.6–4.3.9.
      UWAGA: Kolba T25 może pomieścić 10–20 ml pożywki; Kolba T75 może pomieścić do 20–60 ml podłoża.

5. Pierwotna inżynieria ludzkich komórek B

  1. Inżynieria komórek B po 48 ± 2 godzinach po rozprężeniu/aktywacji w celu uzyskania optymalnych wyników. Przygotować pożywkę do ekspandowania komórek B, podwielokrotność 1 ml pożywki na 48-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i wstępnie zrównoważyć w inkubatorze do hodowli tkankowej co najmniej 15 minut przed użyciem.
    UWAGA: Projektując sgRNA CRISPR/Cas9 dla interesującego genu, postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    - Projektowanie sgRNA za pomocą narzędzia online11.
    - Zaprojektuj sgRNA na eksonie, który jest wspólny dla wszystkich izoform białka.
    - Zamów chemicznie modyfikowane sgRNA w renomowanych firmach.
    - sgRNA zwykle występuje w postaci liofilizowanej; rozpuścić sgRNA w sterylnym buforze Tris-EDTA (TE) wolnym od DNaz/RNaz do stężenia 1 μg/μL.
  2. Przygotować substrat transfekujący CRISPR/Cas9, mieszając 1 μl (1 μg/μL) chemicznie zmodyfikowanego sgRNA z 1,5 μl (1 μg/μL) chemicznie zmodyfikowanego nukleazy Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) na reakcję transfekcji. Do kontroli użyj 1 μl buforu TE zamiast sgRNA.
    UWAGA: Gdy CD19 sgRNA jest używany w eksperymencie genu KO, zobacz wyniki Rysunek 2. Gdy AAVS1 sgRNA jest używany w eksperymencie genu KI, zobacz Rysunek 5, aby uzyskać wyniki.
    • Trzymaj wszystkie elementy na lodzie.
  3. Delikatnie wymieszać i przenieść 2,5 μl substratu transfekującego CRISPR/Cas9 na reakcję do probówki z 8-probówkowym paskiem o pojemności 0,2 ml; odstawić na miejsce w temperaturze pokojowej.
  4. Włączyć nukleofektor (elektroporator) i przygotować odczynniki do transfekcji, jak pokazano w tabeli 1.
    UWAGA: Jest to dobry krok na przerwę, jeśli to konieczne, poprzez umieszczenie wszystkich odczynników na lodzie. Usuń wszystkie odczynniki z lodu, gdy będziesz gotowy do wznowienia eksperymentu. W przypadku stosowania białka S.p. Cas9, badacz MUSI wstępnie skompleksować rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9-sgRNA, mieszając 1 μg sgRNA z 5 μg białka S.p. Cas9, unikając pęcherzyków i inkubując mieszaninę w temperaturze RT przez co najmniej 20 minut przed użyciem w celu uzyskania optymalnych wyników.
  5. Policz i przenieś 106 komórek B na reakcję transfekcji do sterylnej stożkowej probówki.
  6. Zwiększyć objętość do 15 ml za pomocą sterylnego 1x PBS i odwirować przy 400 × g przez 5 minut. W czasie oczekiwania przygotować odczynnik do transfekcji komórek pierwotnych (Tabela 2) i odstawić na miejsce w temperaturze względnej.
  7. Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego.
  8. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml sterylnego 1x PBS i odwirować przy 400 × g przez 5 minut.
  9. Supernatant należy całkowicie wyrzucić, nie naruszając osadu komórkowego.
  10. Przenieś 0,5 μg chemicznie zmodyfikowanego mRNA GFP (jako reporter transfekcji) na 10 6 komórek B do osadu komórkowego (opcjonalnie).
  11. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 20 μl odczynnika do transfekcji komórek pierwotnych na 106 komórek B; delikatnie wymieszać, pipetując 5–6 razy. Przenieść 20,5 μl na reakcję transfekcji do probówki o pojemności 0,2 ml paska z 8 probówkami zawierającego 2,5 μl substratu do transfekcji CRISPR/Cas9.
  12. Pipetować w górę i w dół jeden raz, aby wymieszać i przenieść całą objętość (23 μl) do kuwety transfekcyjnej. Nakręć i delikatnie postukaj kuwetą o ławkę, aby upewnić się, że płyn zakrywa dno kuwety.
  13. Użyj protokołu ludzkiej pierwotnej komórki B na nukleofektorze do transfekcji.
    UWAGA: Nukleofektor (elektroporator) może być umieszczony i używany na zewnątrz kaptura do hodowli tkankowej. Zakręć kuwetę, aby zapewnić sterylność.
  14. Odstaw elektroporowane ogniwa w kuwecie w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  15. Przenieść 80 μl wstępnie zbalansowanej pożywki do ekspandowania limfocytów B z płytki do hodowli tkankowej do reakcji transfekcji w kuwecie. Umieścić kuwetę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 30 minut.
  16. Delikatnie odpipetować kilka razy, aby wymieszać i przenieść całą objętość próbki z kuwety do odpowiedniego dołka na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej zawierającej 1 ml pożywki do ekspandowania limfocytów B. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić 106 komórek/ml.
  17. Jeśli wykonujesz eksperyment z genem KI, przenieś wektor rAAV6 przy 500 000 wielokrotności infekcji do odpowiedniej studzienki zawierającej elektroporowane komórki (około 45 minut po elektroporacji). Zobacz przykładową konstrukcję wektorową rAAV6 w Rysunek 4A.
    UWAGA: Na przykład: Próbka kontrolna zostanie poddana elektroporacji bez CRISPR/Cas9 lub wektora rAAV6. Próbka zawierająca tylko wektor zostanie poddana elektroporacji bez CRISPR/Cas9, a następnie zostanie wydedukowana za pomocą wektora rAAV6. Próbka KI zostanie poddana elektroporacji za pomocą CRISPR/Cas9, a następnie transdukowana za pomocą wektora rAAV6. rAAV6 musi zawierać ramiona homologiczne przed i za docelową witryną DSB dla HDR.
  18. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy wilgotności.
  19. Policz komórki i zapisz żywotność w pierwszym dniu po zakończeniu inżynierii.
  20. Odświeżaj pożywkę do ekspandowania komórek B co 2 dni, licząc komórki, a następnie przenosząc całą objętość komórek do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 400 × g przez 5 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl świeżej pożywki do ekspandowania limfocytów B i przenieść do dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Zwiększyć objętość pożywki, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek na poziomie 5 × 105 komórek/ml.
    UWAGA: Płytka 48-dołkowa może pomieścić do 1 ml pożywki/dołka; płytka 24-dołkowa może pomieścić do 2 ml pożywki/dołka; płytka 12-dołkowa może pomieścić do 4 ml pożywki/dołka, a płytka 6-dołkowa może pomieścić do 8 ml pożywki/dołka.
  21. Pozwól zmodyfikowanym komórkom rozprężyć się przez co najmniej 5 dni przed wykonaniem dalszych analiz, takich jak analiza cytometrii przepływowej, analiza TIDE i PCR złącza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaktualizowany protokół ekspansji i aktywacji umożliwił szybką ekspansję limfocytów B do 44-krotności w ciągu 7 dni (Rysunek 1; n = 3 dawców). W eksperymencie KO liczba limfocytów B określona za pomocą barwienia błękitem Trypanu wykazała ponad 80% żywotnych komórek przy niewielkim spadku odzysku komórek zarówno w próbach kontrolnych, jak i CD19 KO w 24 h po elektroporacji (Rysunek 2A; p ≥ 0,05, n = 3 dawców). Wynik ten wskazuje, że elektroporacja nieznacznie wpł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Precyzyjna inżynieria genomu w pierwotnych ludzkich komórkach B była do niedawna wyzwaniem 9,10. Wcześniej opublikowaliśmy protokoły wykorzystujące CRISPR/Cas9 do inżynierii pierwotnych ludzkich limfocytów B9. W tym miejscu przedstawiamy ulepszone protokoły izolacji, ekspansji i inżynierii komórek B, aby umożliwić skuteczne KO CD19 lub wbijanie EGFP.

Tutaj pokazujemy, że nasz protokół ekspansji pozwala ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Złożono wniosek patentowy na metody wytwarzania i używania komórek B z edytowanym genomem, których wynalazcami są M.J.J., K.L. i B.S.M. B.S.M jest konsultantem i właścicielem akcji Immusoft Inc. Immusoft Inc sponsorował badania w laboratorium B.S.M.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Children's Cancer Research Fund (CCRF) i NIH R01 AI146009 dla B.S.M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Białko nukleazy Cas9 V3 Alt-R, S.P. 500 ugIDT1081059mniejszym rozmiarze jest również dostępne
Komórka pierwotna Amaxa P3 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)LonzaV4XP-3032
Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)Jakość Biologiczna118-156-101
CleanCap chemicznie modyfikowane mRNA Cas9Trilink BiotechnologyL-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mgInvivogenTLRL-2006-5dostępnych różnych rozmiarów
Cryostor CS10, 100 mlSTEMCELL Technology7930
CTS Immune Cell SRThermo Fisher ScientificA2596101
Zestaw do izolacji ludzkich komórek B EasySepTechnologia STEMCELL17954
eBioscience utrwalany barwnik żywotności eFlour 780eBiosciences65-0865-14
Doskonałe podłoża z komórek B, wolne od ksenotypówR& D SystemsCCM031B-komórkowe podłoże
bazowe Falcon 14 ml polipropylenowa probówka okrągłodennaCorning352059
Płodowa surowica bydlęca (FBS)R& D SystemsS11550Tylko do rozmrażania komórek B
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-paskowe probówki PCR 0,2 ml z indywidualnie dołączonymi nasadkami kopułkowymiBioExpressT-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0,0067M PBS (bez Ca, bez Mg) lub 1x PBSGE lifesciencesSH30256.01
Lonza 4D Nucleofector jednostka głównaLonzaAAF-1002B
Jednostka Lonza 4D Nucleofector XLonzaAAF-1002X
Mega CD40 LigandEnzo Life SciencesALX-522-110-C010
Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EADo zamrażania komórek
Pen/Strep 100XSigma-AldrichTMS-AB2-C
PerCP anty-ludzki klon CD19 HIB19biolegend302228mniejszym rozmiarze dostępny jest również
pakiet rAAV6 SA-GFP (z naszą kasetą SA-GFP, patrz rysunek 4).Vigene BiosciencesN/A opakowaniena dużą skalę, 1e13 GC/mL, 500 mL
Rekombinowane ludzkie białko IL-10 250 ugR& D Systems217-IL-250dostępne różne rozmiary
Rekombinowane ludzkie białko IL-15 25 ugR& D Systems247-ILB-025dostępne różne rozmiary
Duży magnes Easy EasySepSTEMCELL Technology18001dostępne różne rozmiary
Bufor Tris-EDTA (TE)Fisher ScientificBP2476100

Bibliografia

  1. LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
  3. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
  4. Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
  5. Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
  6. Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
  7. Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
  8. Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
  9. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144(2018).
  10. Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
  11. Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
  12. Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
  13. Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
  14. Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404(2014).
  15. Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
  16. Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
  17. Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System CRISPR Cas9knockout genuknock in genuizolacja limfocyt w Bekspansja limfocyt w Belektroporacjacytometria przep ywowawektor rAAVsekwencjonowanie genomiczne
Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.