Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy

Podsumowanie

Ekspansja klonalna jest kluczową cechą odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu. Jednak cykl komórkowy limfocytów T reagujących na antygen został słabo zbadany, częściowo z powodu ograniczeń technicznych. Opisujemy metodę cytometrii przepływowej do analizy klonalnie rozszerzających się limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w śledzionie i węzłach chłonnych szczepionych myszy.

Streszczenie

Cykl komórkowy limfocytów T specyficznych dla antygenu in vivo został zbadany przy użyciu kilku metod, z których wszystkie mają pewne ograniczenia. Bromodeoksyurydyna (BrdU) oznacza komórki, które są w fazie S lub niedawno zakończonej, a ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE) wykrywa komórki potomne po podziale. Jednak barwniki te nie pozwalają na identyfikację fazy cyklu komórkowego w momencie analizy. Alternatywnym podejściem jest wykorzystanie Ki67, markera, który ulega silnej ekspresji przez komórki we wszystkich fazach cyklu komórkowego z wyjątkiem fazy spoczynku G₀. Niestety, Ki67 nie pozwala na dalsze różnicowanie, ponieważ nie oddziela komórek w fazie S, które są zaangażowane w mitozę, od tych w G₁, które mogą pozostać w tej fazie_, przejść do cyklu lub przejść do G₀.

Tutaj opisujemy metodę cytometrii przepływowej do przechwytywania "migawki" limfocytów T w różnych fazach cyklu komórkowego w wtórnych narządach limfoidalnych myszy. Metoda łączy barwienie Ki67 i DNA z barwieniem głównym kompleksem zgodności tkankowej (MHC)-peptyd-multimerem oraz innowacyjną strategią bramkowania, co pozwala nam skutecznie różnicować między specyficznymi dla antygenu limfocytami T CD8 w fazach G₀, G₁ i S-G₂/M cyklu komórkowego w śledzionie i drenujących węzły chłonne myszy po szczepieniu wektorami wirusowymi przenoszącymi modelowy antygen gag ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)-1.

Kluczowymi etapami metody były wybór barwnika DNA i strategii bramkowania, aby zwiększyć czułość testu i włączyć wysoce aktywowane/proliferujące limfocyty T specyficzne dla antygenu, które zostałyby pominięte przez obecne kryteria analizy. Barwnik DNA, Hoechst 33342, umożliwił nam uzyskanie wysokiej jakości dyskryminacji pików DNA G₀/G₁ i G₂/M, przy jednoczesnym zachowaniu barwienia błonowego i wewnątrzkomórkowego. Metoda ta ma ogromny potencjał w zakresie poszerzenia wiedzy na temat odpowiedzi limfocytów T in vivo oraz poprawy analizy monitorowania immunologicznego.

Wprowadzenie

Naiwne limfocyty T ulegają klonalnej ekspansji i różnicowaniu po torowaniu antygenowym. Zróżnicowane limfocyty T wykazują funkcje efektorowe, które są niezbędne do usuwania antygenu i utrzymania pamięci specyficznej dla antygenu, co jest kluczem do długotrwałej ochrony. Podczas pierwszych etapów pierwotnej odpowiedzi, naiwna interakcja limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen (APC) w wyspecjalizowanych niszach w narządach limfoidalnych ma kluczowe znaczenie dla indukcji ogromnej proliferacji limfocytów T, która charakteryzuje fazę ekspansji klonalnej^1,2,3. Interakcja limfocytów T z APC jest precyzyjnie regulowana przez stężenie i trwałość antygenu, sygnałów kostymulujących i rozpuszczalnych czynników (cytokin i chemokin), które wpływają na ilość i jakość potomstwa klonów limfocytów T^4,5,6,7.

Pomimo intensywnych badań nad ekspansją klonalną limfocytów T, nadal nie wiadomo, czy limfocyty T z antygenem kończą cały cykl komórkowy w miejscu rozpoznania antygenu, czy też migrują do innych organów podczas progresji cyklu komórkowego. Ten brak wiedzy wynika z właściwości dostępnych narzędzi do analizy cyklu komórkowego. Należą do nich przeciwciała monoklonalne (mAb) specyficzne dla markera jądrowego Ki67 oraz barwniki komórkowe, które albo identyfikują komórki, które przeszły fazę S cyklu komórkowego (np. Bromodeoksyurydyna (BrdU)) lub rozróżniają komórki potomne i ich przodków (np. ester sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE)).

Jednak barwniki znakujące komórki, takie jak CFSE i BrdU, nie pozwalają na określenie, czy komórki znalezione w danym narządzie rozmnożyły się lokalnie, czy raczej migrowały do tego miejsca po podziale8^,9. Co więcej, białko wewnątrzjądrowe, Ki67, jest w stanie odróżnić komórki tylko w G₀ (komórki Ki67-ujemne) od tych w dowolnej innej fazie cyklu komórkowego (komórki Ki67-dodatnie). Tak więc analiza Ki67 nie odróżnia komórek w aktywnej proliferacji (tj. w S, G₂ lub M) od tych w G₁, które mogą albo szybko przejść do podziału, albo pozostać przez długi czas w G₁, albo powrócić do stanu spoczynku^10,11.

Tutaj opisujemy nową metodę cytometrii przepływowej do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8¹² ze śledziony i węzłów chłonnych (LN) szczepionych myszy (Rysunek 1). Metoda wykorzystuje kombinację barwienia Ki67 i DNA, która była wcześniej używana do analizy cyklu komórkowego komórek krwiotwórczych szpiku kostnego myszy (BM)^13,14. W tym przypadku z powodzeniem zastosowaliśmy barwienie Ki67 plus DNA, wraz z niedawno opublikowaną innowacyjną strategią bramkowania¹², do analizy ekspansji klonalnej limfocytów T CD8. Byliśmy w stanie wyraźnie rozróżnić limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu w G₀, w G₁ i w fazach S-G₂ / M w śledzionie i drenujących LN szczepionych myszy.

Protokół

Myszy były trzymane w Plaisant Animal Facility, a praca została wykonana na podstawie autoryzacji włoskiego Ministerstwa Zdrowia o numerze 1065/2015-PR. Protokół był zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami zgodnie z krajowymi i międzynarodowymi przepisami i politykami (Dyrektywa UE 2010/63/UE; Włoski dekret ustawodawczy nr 26/2014).

1. Przygotowanie podłoża i roztworu barwiącego

1. Przygotuj kompletną pożywkę: pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z 2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 50 μM beta-merkaptoetanolu i 10% objętości/objętości (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS)
2. Przygotować bufor barwiący: sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca²⁺/Mg²⁺ (PBS) z 1% masy/objętości (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)

2. Leczenie myszy

1. Pierwszorzędne 7-8-tygodniowe samice myszy Balb / c przez domięśniowe (i.m.) wstrzyknięcie w mięsień czworogłowy ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)-1-GAG-ekspresji-szympansa wektora adenowirusowego (ChAd3-gag) w dawce^10-7 cząstek wirusa.
2. Po 1-4 miesiącach od przygotowania należy raz wzmocnić myszy przez wstrzyknięcie domięśniowo zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara z ekspresją HIV-1-gag (MVA-gag) w dawce 10⁶ jednostek tworzących blaszki miażdżycowe.
3. W 3 dniu po wzmocnieniu poświęć wzmocnione myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i analizuj je równolegle z myszami nieleczonymi.
4. Zbierz LN drenujące mięsień czworogłowy uda (biodrowy, podkolanowy i pachwinowy) oraz śledziony od wzmocnionych i nieleczonych myszy. Ponadto należy pobrać BM z dwóch tylnych nóg od nieleczonych myszy i użyć tego BM do ustawień cytometru przepływowego oraz jako kontroli pozytywnej do analizy cyklu komórkowego (Rysunek 2).
   UWAGA: Generuj wektory ChAd3-gag i MVA-gag zgodnie z wcześniejszym opisem^12,15,16,17.

3. Izolacja drenujących komórek LN, śledziony i BM

1. Izolacja komórek śledziony i LN
   1. Umieścić 5 ml kompletnej pożywki w każdej z dwóch probówek o pojemności 15 ml i przechowywać je na lodzie, gotowe do pobrania narządów.
   2. Poświęć dorosłą mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
   3. Umieść mysz na plecach i wysterylizuj powierzchnię skóry 70% v/v etanolem.
   4. Aby zebrać pachwinowe LN, wykonaj nożyczkami podłużne nacięcie na brzuchu o długości ~1 cm i rozciągnij nacięcie kleszczami.
   5. Wizualizuj pachwinowe LN na wewnętrznej powierzchni skóry i zbierz je kleszczami. Umieścić pachwinowe LN w jednej z dwóch probówek o pojemności 15 ml przygotowanych w kroku 3.1.1.
   6. Aby zebrać śledzionę, wykonaj nacięcie otrzewnej nożyczkami i usuń śledzionę. Po przecięciu otaczającej tkanki łącznej umieścić śledzionę w drugiej probówce o pojemności 15 ml przygotowanej w kroku 3.1.1.
   7. Aby zebrać LN biodrowe, odsuń jelita na bok i uwidocznij LN biodrowe w pobliżu żyły głównej dolnej, a następnie zbierz je za pomocą kleszczy. Umieść LN biodrowe w tej samej probówce, w której znajdują się pachwinowe LNs.
      UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą ilość komórek LN do barwienia (patrz sekcja 4), często konieczne jest zebranie LN podkolanowych, pachwinowych i biodrowych z jednej myszy. Wszystkie te LN drenują mięsień czworogłowy uda (miejsce szczepienia domięśniowego). W tym protokole używana jest tylko jedna probówka o pojemności 15 ml z połączonymi LN.
   8. Aby zebrać LN podkolanowe, chwyć skórę tylnych nóg i delikatnie pociągnij ją w dół, aby odsłonić mięśnie. Następnie włóż kleszcze między mięśnie pod stawem kolanowym i zbierz LN podkolanowe. Umieść LN podkolanowe w tej samej probówce zawierającej LN pachwinowe i biodrowe.
      UWAGA: Patrz uwaga po 3.1.7.
   9. Umieścić śledzionę w sitku o wielkości 70 μm w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm wypełnionym 5 ml kompletnej pożywki. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml delikatnie rozgnieść narząd, aż do jego całkowitego rozdrobnienia.
   10. Usunąć sitko i przenieść zawiesinę komórek do czystej probówki o pojemności 15 ml.
   11. Dodać 5 ml kompletnej pożywki do naczynia hodowlanego i ostrożnie umyć naczynie i sitko, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały odzyskane. Zebrać pozostałą część zawiesiny komórek śledziony w probówce o pojemności 15 ml.
   12. W przypadku połączonych LN pachwinowych, biodrowych i podkolanowych należy przygotować zawiesinę jednokomórkową zgodnie z procedurą podobną do tej zastosowanej w krokach 3.1.9 do 3.1.11 dla śledziony.
   13. Odwirować komórki o masie 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w PBS.
   14. Policz komórki za pomocą komory Neubauera, używając buforu do lizy czerwonych krwinek i 0,04% v/v błękitu trypanowego w PBS.
2. Izolacja komórek BM
   1. Umieść 5 ml kompletnego podłoża w probówce o pojemności 15 ml i trzymaj je na lodzie, gotowe do pobrania tylnych nóg.
   2. Poświęć dorosłą mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
   3. Wysterylizuj powierzchnię skóry za pomocą 70% v/v etanolu.
   4. Wykonaj nożyczkami poprzeczne nacięcie na skórze brzusznej ~1 cm, mocno chwyć skórę po obu stronach nacięcia i delikatnie pociągnij w dół, aby odsłonić mięśnie tylnych nóg.
   5. Aby usunąć skórę z tyłu tylnych nóg, utrzymując mysz w pozycji leżącej, umieść zacisk pod kolanem i pociągnij do góry, aby odsłonić mięśnie.
   6. Przetnij kości na dwóch końcach jednej tylnej nogi: staw miedniczny/biodrowy i kostkę.
   7. Przenieść obie tylne nogi do probówki o pojemności 15 ml przygotowanej w kroku 3.2.1. Trzymaj probówkę na lodzie.
   8. Wyjmij tylne nogi z probówki o pojemności 15 ml i przenieś je na bibułkę. Przetnij tylne nogi tuż poniżej stawu kolanowego, aby usunąć kość piszczelową. Wypreparuj kość udową i piszczelową z otaczających mięśni, usuń nadmiar tkanki za pomocą nożyczek i zwilż bibułę.
   9. Odetnij końce kości nożyczkami, aby odsłonić wewnętrzny trzon szpiku. Włóż kość piszczelową i kość udową do rurki ekstrakcyjnej BM (patrz przygotowanie w 3.2.9.1-3.2.9.2¹⁸), z najszerszym końcem na dole.
      1. Wytnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl na linii tuż nad końcem końcówki i na linii 100 μl.
      2. Umieść środkową część w górnej, większej części końcówki i umieść ją w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.
   10. Obracać probówkę ekstrakcyjną BM na 800 × g przez 1 minutę.
   11. Wyrzuć kość i energicznie ponownie zawieś osad w 1 ml kompletnego podłoża, aby usunąć wszelkie skupiska. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr 70 μm umieszczony na górze probówki o pojemności 15 ml.
   12. Probówkę ekstrakcyjną BM przemyć dwukrotnie 1 ml kompletnego podłoża za każdym razem. Przefiltrować przez filtr 70 μm i połączyć objętość z resztą zawiesiny komórek otrzymanej w kroku 3.2.11.
       UWAGA: Pojedyncza probówka o pojemności 15 ml będzie zawierała komórki z obu tylnych nóg myszy.
   13. Odwirować komórki o masie 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w PBS.
   14. Policz komórki za pomocą komory Neubauera, używając buforu do lizy czerwonych krwinek i 0,04% v/v błękitu trypanowego w PBS.

4. Barwienie komórek śledziony, LN i BM

1. Podziel próbki komórek do barwienia na 3 podgrupy: próbki komórek do kompensacji, w tym komórki BM od myszy nieleczonych, które mają być barwione tylko Hoechst 33342 (odtąd określane jako Hoechst) i komórki śledziony od myszy nieleczonych, które mają być użyte do przygotowania mieszanki martwych/żywych komórek do kompensacji barwnika martwych komórek; kontrola pozytywna do analizy cyklu komórkowego, składająca się z próbki BM od myszy niepoddanych działaniu substancji; oraz próbki eksperymentalne zawierające próbki śledziony i LN od myszy nieleczonych i szczepionych.
   UWAGA: Upewnij się, że jest wystarczająca ilość komórek śledziony i LN do analizy wystarczającej liczby komórek T CD8 specyficznych dla gag. Często konieczne jest użycie połączonych komórek śledziony i połączonych komórek LN od 3 zaszczepionych myszy i barwienie dwóch lub więcej identycznych próbek połączonych komórek, z których każda zawiera 3 × 10⁶ komórek. Połączyć identyczne próbki na etapie barwienia Hoechst. Podobnie, wybarwić połączone komórki śledziony i komórki LN od 3 nieleczonych myszy, a na końcu połączyć identyczne próbki. Odłóż na bok niebarwioną próbkę komórek śledziony od nieleczonej myszy do wykorzystania w ustawieniu instrumentu i kompensacji.
2. Przygotuj mieszaninę martwych/żywych komórek do kompensacji barwnika martwych komórek (ta mieszanina komórek zostanie zabarwiona tylko barwnikiem martwych komórek).
   1. Podgrzać łaźnię wodną w temperaturze 65 °C.
   2. Weź porcję komórek śledziony (~3 × 10⁶).
   3. Zawiesinę komórek przenieść do probówki do mikrofuge, umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 5 minut, a następnie natychmiast umieścić na lodzie na 10 minut.
   4. Wymieszaj komórki zabite termicznie z żywymi komórkami śledziony (~3 × 10⁶) w stosunku 1:1 i przenieś połowę mieszaniny na 96-dołkową okrągłą płytkę dolną (~3 × 10⁶ komórek/studzienkę do kontroli barwienia martwych komórek).
3. Barwienie martwych komórek w próbkach doświadczalnych, kontrola pozytywna do analizy cyklu komórkowego i mieszanie martwych/żywych komórek
   1. Przenieść śledzionę, LN, komórki BM (3 × 10⁶ komórek/basenik) oraz mieszaninę martwych/żywych komórek (sekcja 4.2) na 96-dołkową płytkę okrągłodenną, zgodnie ze schematem barwienia (etap 4.1) i odwirować przy 400 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
   2. Zawiesić każdą komórkę w 50 μl barwnika z martwych komórek rozcieńczonego w PBS i natychmiast ponownie zawiesić, pipetując w górę iw dół 3 razy.
   3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
   4. Przemyć komórki 2 razy buforem barwiącym; pierwszy raz 200 μl, a drugi raz 250 μl. Przy każdym płukaniu odwirować płytkę o masie 400 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 μl PBS.
4. Barwienie komórek błonowych za pomocą multimerów peptydowych głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) i mAb.
   1. Biorąc pod uwagę niezbędne objętości zgodnie ze schematem barwienia (Ustawienia cytometru przepływowego, tabela 1), przygotuj następujące odczynniki:
      1. Rozcieńczyć mAb 2,4G2 w buforze barwiącym zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem (patrz tabela materiałów); dla każdej próbki przeznaczonej do barwienia użyć 10 μl tego rozcieńczenia.
         UWAGA: 2,4G2 mAb blokuje niespecyficzne dla antygenu wiązanie immunoglobulin z receptorami FcγIII i FcγII.
      2. Rozcieńczyć tetramer allofikocyjaniny (APC) znakowany H-2k(d) AMQMLKETI (APC) w buforze barwiącym w celu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia (patrz tabela materiałów); dla każdej próbki, która ma być barwiona, użyć 20 μl tego rozcieńczenia.
      3. Przygotować mieszaninę przeciwciał przez rozcieńczenie mAb w buforze barwiącym zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem (patrz Tabela Materiałów), które zostało uprzednio określone w doświadczeniach miareczkowania; dla każdej próbki, która ma być barwiona, użyć 20 μl tej mieszaniny przeciwciał.
         UWAGA: Tutaj zastosowano białko chlorofilu anty-CD3e perydyniny (PerCP-Cy5.5) (klon 145-2C11), błyszczący ultrafiolet anty-CD8a (BUV805) (klon 53-6,7) i cyjaninę fikoerytryny anty-CD62L (PECy7) (klon MEL-14).
   2. Dodać 10 μl uprzednio rozcieńczonego 2,4G2 mAb (etap 4.4.1.1) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
   3. Dodać 20 μl uprzednio rozcieńczonego Tetr-gag APC (krok 4.4.1.2) i 10 μl pentameru H-2k(d) AMQMLKETI phycoerytryna (PE) (pent-gag). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
   4. Dodać 20 μl wcześniej przygotowanej mieszanki przeciwciał (etap 4.4.1.3) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: W związku z tym końcowa objętość wynosi 80 μl na studzienkę (krok 4.3.5, kroki 4.4.2 do 4.4.4).
   5. Umyj komórki 200 μl buforu barwiącego. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Zawiesić osad komórkowy w 250 μl buforu barwiącego i przenieść zawiesinę komórek do probówek o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml buforu barwiącego do probówki i odwirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   7. Pobrać podwielokrotność komórek BM (3 × 10⁶ komórek) (patrz wykaz próbek komórek, sekcja 4.1), która ma być użyta do kompensacji kanału Hoechsta (Hoechst 33342 jest wzbudzany przez laser ultrafioletowy (ustawienia cytometru przepływowego (tabela 2)) i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml buforu barwiącego do probówki i odwirować 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

5. Utrwalenie/przepuszczalność

1. Przygotować świeży bufor do utrwalania/przepuszczalności, rozcieńczając 1 część koncentratu utrwalającego/przepuszczalnego z 3 częściami rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności, zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Odrzucić supernatant i pulsacyjnie wirować próbki, aby całkowicie zdezagregować osad.
3. Dodać 1 ml świeżo przygotowanego buforu do utrwalania/przepuszczalności do każdej probówki, w tym probówki z niebarwionymi komórkami śledziony (3 x 10⁶, patrz wykaz próbek komórek, sekcja 4.1) i wirować.
4. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

6. Barwienie wewnątrzkomórkowe

1. Barwienie Ki67
   1. Przygotować świeży bufor permeabilacyjny 1x, rozcieńczając 10x bufor permeabilizacyjny wodą destylowaną, zgodnie z instrukcją producenta. Przed użyciem bufor permeabilizacyjny 1x należy przefiltrować przez filtr 0,45 μm w celu wyeliminowania agregatów.
   2. Rozcieńczyć mAb Ki67 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (klon SolA15) w buforze przepuszczalnym 1x (patrz Tabela materiałów), jak oznaczono wcześniej w doświadczeniach miareczkowania (końcowa objętość 100 μl na próbkę).
   3. Dodać 3 ml buforu permeabilacyjnego 1x do każdej probówki i odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   4. Odrzucić supernatant i powtórzyć krok 6.1.3.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl uprzednio rozcieńczonego mAb Ki67 FITC (krok 6.1.2).
   6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
   7. Przemyć komórki 2 razy 4 ml buforu permeabilizacyjnego 1x. Dla każdego płukania odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Zawiesić osad komórkowy w PBS, biorąc pod uwagę następujące objętości: 350 μl PBS dla próbek, które mają być pobrane bezpośrednio na cytometrze przepływowym; 250 μl PBS dla próbek, które mają być inkubowane za pomocą Hoechst na krótko przed cytometrią przepływową (sekcja 6.2).
2. Barwienie DNA
   1. Do każdej próbki dodać 250 μl 4 μg/ml Hoechst w PBS (końcowe stężenie Hoechst wynosi 2 μg/ml).
      UWAGA: W przypadku, gdy przygotowano dwie lub więcej identycznych próbek o objętości 250 μl w PBS, należy je połączyć na tym etapie i dodać równą objętość 4 μg/ml roztworu Hoechsta do PBS (końcowe stężenie Hoechsta wynosi 2 μg/ml). Liczba komórek ma duży wpływ na etap barwienia DNA. Użyj tego samego numeru komórki w każdej próbce. Należy pamiętać, że nawet nieznacznie zmniejszona liczba komórek (np. z powodu utraty komórek w poprzednich etapach mycia) powoduje większe wiązanie Hoechst z DNA i wyższą intensywność Hoechst.
   2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
   3. Odwirować próbki o masie 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Zawiesić osad komórkowy w 350 μl PBS.

7. Przygotowanie próbek koralików kompensacyjnych

1. Przygotować 5 μl przeciwciała, odpowiednio rozcieńczając mAb w buforze barwiącym.
   UWAGA: Dla każdego mAb sprzężonego z fluorochromem użytego w eksperymencie należy przygotować odpowiednią próbkę kulki kompensacyjnej.
2. Vortex Negative Control i Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp Beads przed użyciem.
3. Do każdej próbki wprowadź jedną kroplę (~20 μL) Negative Control CompBeads i jedną kroplę Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads.
4. Dodać 5 μl wstępnie rozcieńczonego przeciwciała (krok 7.1) do probówki i pipetować w górę i w dół.
5. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
6. Próbki przemyć 2 ml buforu barwiącego. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 500 μl PBS do każdej probówki i wiru.

8. Konfiguracja przyrządu i kompensacji oraz eksperymentalne pobieranie próbek za pomocą cytometru przepływowego

UWAGA: Zapoznaj się z ustawieniami cytometru przepływowego (Tabela 2) dla konfiguracji cytometru.

1. Ogólna konfiguracja przyrządów i wynagrodzeń
   1. Otwórz oprogramowanie do pobierania próbek (patrz Spis materiałów) i utwórz nowy eksperyment, klikając pozycję Nowy eksperyment w sekcji wstążki obszaru roboczego i wybierając pozycję Nowy pusty eksperyment.
   2. Kliknij dwukrotnie utworzony eksperyment, aby go otworzyć.
   3. W oknie Ustawienia cytometru kliknij Parametry i wybierz wszystkie kanały (np. PE, APC itp.) używane w panelu barwienia, w tym parametry Forward Scatter (FSC) i Side Scatter (SSC).
   4. Wybierz skalę liniową jako parametr Hoechsta, odznaczając skalę logarytmiczną, i sprawdź szerokość (W) impulsu napięciowego dla FCS, SSC i Hoechst.
      UWAGA: Wszystkie parametry są domyślnie wyświetlane w skali logarytmicznej (logarytmicznej), z wyjątkiem FSC i SSC, które są w skali liniowej. Wszystkie parametry są analizowane przez powierzchnię (A) i wysokość (H) impulsu napięciowego.
   5. W arkuszu globalnym utwórz wykres punktowy z FSC-A na osi x i SSC-A na osi y.
   6. Uruchom niebarwioną próbkę śledziony, klikając przycisk Uzyskaj dane na pulpicie nawigacyjnym pozyskiwania.
   7. Ustaw odpowiednie ustawienia FSC i SSC, aby wizualizować komórki, modyfikując wartości napięcia w sekcji Parametry, a następnie utwórz bramkę, aby zaznaczyć wszystkie komórki wyświetlane na wykresie kropkowym FSC-A/SSC-A, klikając Brama wielokątna na pasku narzędzi obszaru roboczego Arkusza globalnego.
   8. Wyświetlaj bramkowane komórki na histogramach z każdym parametrem fluorescencji na osi x.
   9. Uruchom niebarwione i całkowicie wybarwione próbki śledziony, aby dostosować detektor fluorescencji (PMT), aby uzyskać wyraźną separację między negatywnymi i pozytywnymi sygnałami barwionych komórek dla każdego parametru fluorescencji.
   10. Aby przeprowadzić konfigurację wynagrodzenia, kliknij pozycję Eksperymentuj na wstążce obszaru roboczego i w sekcji Konfiguracja wynagrodzenia wybierz pozycję Utwórz kontrolki wynagrodzenia. Usuń zaznaczenie opcji Dołącz niezabarwioną rurkę kontrolną/studnię i kliknij OK.
       UWAGA: Ta operacja spowoduje utworzenie próbki o nazwie Kontrolki kompensacji oraz Normalnego arkusza roboczego zawierającego kilka arkuszy odpowiadających każdemu wybranemu parametrowi.
   11. Uruchom próbkę kulek kompensacyjnych (patrz sekcja 7); ustaw odpowiednie ustawienia FSC i SSC, aby wizualizować kulki, modyfikując wartości napięcia i próg akwizycji 5,000 na parametrach FSC w oknie Cytometr.
   12. Dostosuj bramkę P1 na populacji ściegu i sprawdź, czy dodatnie i ujemne piki są widoczne na osi x. Powtórz tę operację dla każdej próbki koralików kompensacyjnych, a na koniec zarejestruj każdy plik próbki, klikając przycisk Rejestruj dane na pulpicie nawigacyjnym akwizycji (zarejestruj co najmniej 5 000 zdarzeń dla każdej próbki).
   13. Dla każdej zarejestrowanej próbki kulki ustaw bramki P2 i P3 odpowiednio na pikach dodatnich i ujemnych.
   14. Uruchom próbki komórek w celu kompensacji (patrz kroki 4.2 i 4.4.7 oraz sekcje 5 i 6). Zmodyfikuj napięcia FSC i SSC oraz wartość progową, aby zobrazować komórki, dostosuj bramkę P1 i na koniec nagraj każdy plik próbki (zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń). Ustaw bramki P2 i P3 odpowiednio na dodatnim i ujemnym piku.
       UWAGA: Do kompensacji kanału Hoechsta należy użyć G₀/G₁ jako piku ujemnego (P3) i G₂/M jako piku dodatniego (P2).
   15. Kliknij pozycję Eksperymentuj w sekcji wstążki obszaru roboczego, a następnie w sekcji Ustawienia wynagrodzenia wybierz pozycję Oblicz wynagrodzenie.
   16. Nazwij utworzone ustawienie wynagrodzenia, połącz je i zapisz w bieżącym eksperymencie.
2. Eksperymentalne pobieranie próbek
   1. Otwórz próbkę, klikając przycisk Nowy wzór na pasku narzędzi przeglądarki, a następnie utwórz strategię bramkowania w arkuszu globalnym.
      UWAGA: Strategia bramkowania polegająca na pozyskiwaniu próbek jest podobna do tej analizy próbki, opisanej w Rysunek 3 i sekcja 9.
   2. Wyświetl całą populację zdarzeń na histogramie z CD3-A na osi x. Utwórz bramkę interwałową, aby zaznaczyć tylko komórki CD3⁺.
   3. Na pulpicie nawigacyjnym akwizycji wybierz bramę pamięci masowej jako Wszystkie zdarzenia dla próbek LN i opcję Wszystkie zdarzenia lub komórki CD3⁺ dla próbek śledziony.
   4. Uruchom próbki eksperymentalne z niską prędkością, a na koniec nagraj wszystkie pliki, upewniając się, że zebrałeś co najmniej 100-200 specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 dla każdej próbki od zaszczepionych myszy.
      UWAGA: Rozmiar pliku próbek eksperymentalnych jest zwykle duży (30-120 MB), zwłaszcza gdy częstotliwość limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu jest niska. W związku z tym należy zebrać dużą liczbę zdarzeń (> 1 × 10⁶), aby zarejestrować co najmniej 100-200 limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu. Duże pliki mogą spowolnić późniejszy proces analizy danych. Akwizycja tylko komórek CD3⁺ w próbkach śledziony (patrz krok 8.2.2 powyżej) jest pomocna w utrzymaniu mniejszego rozmiaru pliku.
   5. Uruchom i zapisz kontrolę pozytywną do analizy cyklu komórkowego, tj. próbkę BM od myszy nieleczonych.

9. Analiza danych

1. Otwórz oprogramowanie (patrz Spis materiałów) i utwórz różne grupy odpowiadające różnym narządom, które mają być analizowane, klikając Utwórz grupę w sekcji wstążki obszaru roboczego (tj. utwórz grupę "a-LNs"; "b-splenen"; "c-BM").
   UWAGA: Nowo utworzone grupy pojawią się na liście grup, podczas gdy grupa "Kompensacja" jest automatycznie generowana przez oprogramowanie.
2. Otwórz okno Modyfikuj grupę, klikając dwukrotnie nazwę grupy i sprawdź, czy nowo utworzone grupy są zsynchronizowane. Jeśli nie, wstaw znacznik wyboru przy funkcji Zsynchronizowane.
3. Przeciągnij każdy plik .fcs do odpowiedniej grupy.
4. Utwórz strategię bramkowania, zaczynając od grupy "a-LNs".
5. Kliknij dwukrotnie w pełni wybarwioną próbkę w grupie, aby otworzyć okno wykresu; osie x i y są oznaczone tak, jak w plikach fcs (patrz ustawienia cytometru przepływowego, tabela 2).
6. Wyświetl łączną liczbę zdarzeń uzyskanych dla tej próbki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i DNA-W na osi y.
7. Wybierz tylko populację pojedynczej komórki, klikając Prostokąt w sekcji narzędzia do bramkowania w oknie wykresu.
   UWAGA: Pojedyncze komórki mają wartości DNA-A w następujący sposób: 2N (niski): od 2N do 4N (pośredni) lub równy 4N (wysoki), podczas gdy wartości DNA-W są identyczne dla wszystkich z nich (krok 1 z Rysunek 3).
8. Kliknij dwukrotnie na środku prostokątnej bramki, aby wyświetlić pojedyncze komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i barwnikiem martwych komórek na osi y.
9. Wybierz tylko populację żywych komórek, klikając Wielokąt w sekcji narzędzia do bramkowania w oknie wykresu. Żywe komórki są ujemne dla barwnika martwej komórki (krok 2 z Rysunek 3).
10. Kliknij dwukrotnie na środku bramki wielokątnej, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i parametrem SSC-A na osi y.
11. Kliknij na Prostokąt i utwórz "zrelaksowaną" bramę, aby uwzględnić wszystkie pojedyncze żywe komórki na tym wykresie¹² (krok 3 z Rysunek 3).
12. Kliknij dwukrotnie na środku "zrelaksowanej" bramki, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z CD3 na osi x i CD8 na osi y.
13. Zaznacz komórki CD3 ⁺ CD8 ⁺, klikając Wielokąt (krok 4 z Rysunek 3).
14. Kliknij dwukrotnie na środku bramki CD3 ⁺ CD8 ⁺, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z Tetr-gag na osi x i Pent-gag na osi y.
15. Wybierz specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8 (dodatnie zarówno dla Tetr-gag, jak i Pent-gag), klikając Polygon (krok 5 z Rysunek 3).
16. Kliknij dwukrotnie na środku bramki specyficznej dla knebla, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y (Rysunek 4).
17. Wybierz komórki w różnych fazach cyklu komórkowego, klikając Quad w sekcji narzędzia do bramkowania w oknie wykresu.
    UWAGA: Komórka w fazie G₀ to niskie komórki Ki67neg-DNA (lewy dolny ćwiartka); komórki w G₁ to Ki67pos-DNA nisko (lewy górny ćwiartka); komórki w S-G₂ / M są pośrednie/wysokie Ki67pos-DNA (prawy górny kwadrant) (Rysunek 4).
18. Skopiuj strategię bramkowania utworzoną w jednej próbce do odpowiedniej grupy, aby zastosować bramki do wszystkich próbek w grupie.
19. Powtórz kroki od 9.5 do 9.18 dla "grupy a-LN".
20. Sprawdzić, czy wszystkie bramki są odpowiednie dla każdej próbki z grupy "b-śledziona". Aby przeanalizować cykl komórkowy między komórkami BM (kontrola pozytywna), kliknij na środku "zrelaksowanej" bramki, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y.
21. Sprawdź, czy wszystkie bramki są odpowiednie dla każdej próbki z 3 grup (tj. dla komórek ze śledziony, LN i BM).
    UWAGA: Bramka populacji pojedynczej komórki (krok 9.7) i bramka poczwórna dla cyklu komórkowego (krok 9.17) mogą mieć różne współrzędne bramki w różnych próbkach, głównie ze względu na możliwe niewielkie różnice w intensywności barwnika Hoechsta między próbkami (sekcja 6.2). Z tego powodu może być konieczna modyfikacja bramki populacji pojedynczej komórki i bramek poczwórnych dla cyklu komórkowego w każdej próbce. Zostanie to zrobione w następujący sposób: kliknij dwukrotnie nazwę grupy i usuń synchronizację z właściwości grupy. Ta operacja umożliwia modyfikację bramek w jednej próbce bez modyfikowania tych samych bramek we wszystkich innych próbkach grupy. Po usunięciu synchronizacji zmodyfikuj bramki w razie potrzeby.
22. Aby wyświetlić wyniki uzyskane w wyniku tej analizy, kliknij pozycję Edytor układu w sekcji wstążki przestrzeni roboczej, aby ją otworzyć. Przeciągnij każdą bramę strategii bramkowania w okienku próbki do edytora układu i umieść wykresy zgodnie z sekwencją strategii bramkowania. W razie potrzeby zmień typ wykresu, klikając dwukrotnie odpowiedni wykres w układzie i wybierając odpowiedni typ w oknie Definicja wykresu.
23. Kliknij przycisk Grupuj i iteruj według funkcji na wstążce układu, aby wyświetlić wyniki uzyskane w każdym narządzie i porównać różne próbki.

Wyniki

Fazy cyklu komórkowego komórek ze śledziony, LN i BM myszy Balb/c zostały przeanalizowane przy użyciu fluorescencyjnego barwnika DNA, Hoechst, i anty-Ki67 mAb, zgodnie z protokołem podsumowanym w Rysunek 1. Barwienie to umożliwiło różnicowanie komórek w następujących fazach cyklu komórkowego: G₀ (Ki67neg, z 2N DNA zdefiniowanym jako DNAlow), G₁ (Ki67pos, DNAlow) i S-G₂/M (Ki67pos, o zawartości DNA składającej się między 2N a 4N lub równej 4N DNA zdefiniowanej jako DNAintermediate/high).

Najpierw przeprowadziliśmy analizę cyklu komórkowego komórek BM, aby odtworzyć wcześniej opublikowane wyniki^13,14, a następnie przeanalizowaliśmy interesujące nas komórki, tj. limfocyty T CD8. Rysunek 2 przedstawia typowy przykład analizy cyklu komórkowego komórek BM (Rysunek 2A). Protokół wykazał niski współczynnik zmienności (CV) pików DNA G₀/G₁ i G₂/M, co wskazuje na doskonałą jakość barwienia DNA (Rysunek 2B, przedstawiający przykład z CV < 2,5; CV zawsze znajdowało < 5 we wszystkich eksperymentach).

Następnie zastosowaliśmy ten sam protokół do specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 od zaszczepionych myszy. Myszy BALB/c zostały zaszczepione przeciwko antygenowemu kneblowi HIV-1 przy użyciu Chad3-gag do pobudzania i MVA-gag do wzmacniania, oba zaprojektowane do przenoszenia gagu HIV-1. W dniu (d) 3 po wzmocnieniu przeanalizowaliśmy częstotliwość specyficznych dla gagów limfocytów T CD8 ze śledziony i drenujących LN. Skorzystaliśmy z nowo zdefiniowanej strategii bramkowania dla limfocytów T we wczesnej fazie odpowiedzi immunologicznej, która w przeciwieństwie do konwencjonalnej strategii jest odpowiednia do wykrywania wysoce aktywowanych limfocytów T CD8 reagujących na antygen¹². Nowatorską strategię zrealizowaliśmy w pięciu kolejnych krokach. W kroku 1 wykluczyliśmy dublety lub agregacje za pomocą bramki DNA-A / -W, a w kroku 2 zidentyfikowaliśmy żywe komórki przez wykluczenie markera martwej komórki. W kroku 3 zidentyfikowaliśmy badaną populację za pomocą niekonwencjonalnej "zrelaksowanej" bramki FSC-A/SSC-A (Rysunek 3A) zamiast kanonicznej wąskiej bramki limfocytów < klasy sup = "xref">12. Po bramkowaniu na komórkach CD3 ⁺ CD8 ⁺ (krok 4 z Rysunek 3A), zidentyfikowaliśmy specyficzne dla gagu komórki T CD8 przy użyciu dwóch różnych multimerów MHC, tj. Pent-gag i Tetr-gag (krok 5 z Rysunek 3A). Użyliśmy dwóch multimerów zamiast jednego, aby poprawić czułość wykrywania specyficznych dla gagu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy, bez zwiększania tła barwienia u myszy nieleczonych (Figura 3B i C, krok 5). W ten sposób udało nam się odróżnić nieleczone myszy (0,00% i 0,00% specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 odpowiednio w LN i śledzionie) od zaszczepionych myszy (0,46% i 0,29% specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 odpowiednio w LN i śledzionie, Rysunek 3B i C).

Warto zauważyć, że protokół pozwolił nam uzyskać bardzo niskie tło w specyficznej dla antygenu bramie limfocytów T CD8 LN i śledziony u myszy nieleczonych (zwykle 0,00%, a maksymalnie 0,02%). Porównanie wykresów FSC-A / SSC-A specyficznych dla gagu i niespecyficznych dla gagu wykazało, że komórki specyficzne dla gagu miały wysokie SSC-A i FSC-A (Rysunek 3D), potwierdzając potrzebę użycia "zrelaksowanej" bramki FSC-A / SSC-A do wychwycenia tych komórek. Następnie oceniliśmy procentowy odsetek limfocytów T CD8 specyficznych dla gagów w różnych fazach cyklu komórkowego (Rysunek 4A). Odkryliśmy, że specyficzne dla gagów limfocyty T CD8 w śledzionie, a jeszcze bardziej w drenujących LN, zawierały wysoki odsetek komórek w fazach S-G₂ / M w 3 dniu po wzmocnieniu (odpowiednio 18,60% i 33,52%).

Ponadto odkryliśmy, że specyficzne dla gagu limfocyty T CD8 w fazach S-G₂/M miały wysoki poziom FSC-A i SSC-A, gdy nałożono je na całkowitą liczbę limfocytów T CD8 z tego samego narządu (Rysunek 4B). Ekspresja CD62L przez specyficzne dla gagu limfocyty T CD8 była niska, zgodnie z oczekiwaniami dla aktywowanych limfocytów T, z wyjątkiem kilku komórek w G₀ w LN (Figura 4C). Podsumowując, wyniki te potwierdziły, że "zrelaksowana" bramka (krok 3 z Figura 3A, B i C) była wymagana, aby objąć wszystkie proliferujące limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu ¹². Protokół był niezwykle cenny dla "migawkowej" oceny faz cyklu komórkowego komórek T CD8 specyficznych dla antygenu w czasie analizy oraz ekspresji CD62L przez komórki w różnych fazach cyklu komórkowego.

Rysunek 1: Schemat protokołu analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8.Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza cyklu komórkowego komórek BM. Komórki BM od nieleczonych myszy Balb/c wybarwiono i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Przykład strategii bramkowania. Przeprowadziliśmy bramkowanie na pojedynczych komórkach na wykresie DNA-A/-W (po lewej), a następnie na żywych komórkach przez wykluczenie barwnika z martwych komórek (w środku). Następnie zastosowano "zrelaksowaną" bramkę FSC-A/SSC-A dla wszystkich komórek BM (po prawej). (B) Przykład analizy cyklu komórkowego komórek BM (po lewej). Użyliśmy kombinacji barwienia Ki67 i DNA do identyfikacji komórek w następujących fazach cyklu komórkowego: G₀ (lewy dolny kwadrant, niskie komórki Ki67neg-DNA), G₁ (lewy górny ćwiartka, Ki67pos-DNAniski), SG₂ / M (prawy górny kwadrant, Ki67pos-DNApośredni / wysoki). Pokazano kontrolę fluorescencji minus jeden (FMO) mAb Ki67 (w środku) i histogram DNA (po prawej). Na wykresie histogramu DNA lewa i prawa bramka odpowiadają odpowiednio pikowi DNA G₀/G₁ i G₂/M, a liczby reprezentują współczynniki zmienności (CV) każdego piku. Na wszystkich pozostałych wykresach liczby reprezentują procenty komórek we wskazanych bramkach. Rysunek przedstawia 1 reprezentatywny eksperyment z 5. W każdym eksperymencie analizowaliśmy połączone komórki BM od 3 myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 z LN i śledziony. Myszy Balb / c zostały zaszczepione domięśniowo (i.m.) Chad3-gag i wzmocnione i.m. MVA-gag. W 3 dniu po wzmocnieniu, drenujące LN i komórki śledziony od szczepionych i nieleczonych myszy kontrolnych zostały wybarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Schemat strategii bramkowania w pięciu krokach w celu identyfikacji pojedynczych komórek (Krok 1); żywe komórki (krok 2); limfocyty (etap 3); Limfocyty T CD8 (krok 4); i komórki specyficzne dla gagu (krok 5). (B-C) Przykład wykresów: analiza komórek z (B) LN i (C) śledziony myszy nieleczonych (na górze) i szczepionych (na dole). Zidentyfikowaliśmy pojedyncze komórki na wykresie DNA-A/-W w kroku 1. Następnie, w kroku 2, wybraliśmy żywe komórki przez wykluczenie barwnika martwej komórki. W kroku 3 użyliśmy niekanonicznej "zrelaksowanej" bramki dla limfocytów. W kroku 4 zidentyfikowaliśmy limfocyty T CD8 na podstawie podwójnej ekspresji CD3 i CD8. Następnie zidentyfikowaliśmy komórki specyficzne dla gagu i niespecyficzne dla gagu w kroku 5, w oparciu o ich zdolność do wiązania znakowanego fluorochromem H-2kd-gag-Pentamer (Pent-gag) i H-2kd-gag-Tetramer (Tetr-gag) lub nie, odpowiednio. (D) FSC-A/SSC-A profile komórek specyficznych dla gag (niebieskich) i niespecyficznych dla gag (szarych) po bramkowaniu, jak opisano powyżej. Liczby reprezentują procenty komórek we wskazanych bramkach. Rysunek przedstawia 1 reprezentatywny eksperyment z 5. W każdym eksperymencie analizowaliśmy połączone komórki śledziony i LN od 3 zaszczepionych myszy i 3 nieleczonych myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza cyklu komórkowego limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu. Myszy zaszczepiono jak w Rysunek 3, a analizę cyklu komórkowego komórek specyficznych dla gagów przeprowadzono w 3 dniu po wzmocnieniu, po bramkowaniu w 5 krokach, jak w Rysunek 3. (A) Przykład analizy cyklu komórkowego specyficznych dla gagu limfocytów T CD8 z LN (na górze) i śledziony (na dole) szczepionych myszy. Fazy cyklu komórkowego zostały zidentyfikowane jako w Rysunek 2B. Panele reprezentują komórki w G₀, w G₁ i w S-G₂ / M (po lewej) i kontroli fluorescencji minus jeden (FMO) Ki67 mAb (po prawej). Liczby reprezentują procenty komórek we wskazanych bramkach. (B) FSC-A/SSC-A wykresy punktowe przedstawiające specyficzne dla gag limfocyty T CD8 w fazach S-G₂ / M (na czerwono) nałożone na całkowite limfocyty T CD3 ⁺ CD8 ⁺ (na szaro) z LN (na górze) i śledziony (na dole) szczepionych myszy. (C) Przesunięte histogramy pokazujące ekspresję CD62L przez specyficzne dla gagu limfocyty T CD8 w G₀ (zielony), w G₁ (niebieski) i w S-G₂ / M (czerwony) od LN (na górze) i śledzionie (na dole) szczepionych myszy. Osie y wskazują znormalizowaną liczbę zdarzeń. Rysunek przedstawia 1 reprezentatywny przykład z 5 niezależnych eksperymentów z udziałem łącznie 15 myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Materiał dodatkowy: Ustawienia cytometru przepływowego.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Chociaż ekspansja klonów limfocytów T była intensywnie badana, niektóre aspekty pozostają nieznane, głównie dlatego, że dostępne narzędzia do jej badania są nieliczne i mają swoje wady. Z tej perspektywy opracowaliśmy bardzo czułą metodę cytometrii przepływowej do analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu we wczesnym okresie po szczepieniu w modelu mysim. Protokół opiera się na połączeniu barwienia Ki67 i DNA, które wcześniej było wykorzystywane do analizy cyklu komórkowego komórek krwiotwórczych BM u myszy^13,14. Aby dostosować protokół do limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu, musieliśmy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kwestii, w tym wybór barwnika DNA, odpowiednie warunki do uzyskania porównywalnego barwienia DNA w różnych próbkach oraz strategię bramkowania do analizy danych.

Do barwienia DNA dostępnych jest wiele barwników, w tym jodek propidyny i 7-aminoaktynomycyna D; wybraliśmy Hoechst, ponieważ był kompatybilny z barwieniem membranowym i łagodnym protokołem utrwalania / przepuszczalności wymaganym do barwienia Ki67. Jednocześnie barwienie Hoechstem pozwoliło na uzyskanie histogramu DNA doskonałej jakości, tj. piki DNA G₀/G₁ i G₂/M miały znacznie niższy współczynnik zmienności (CV) niż piki DNA zwykle uzyskiwane za pomocą innych barwników DNA, np. DRAQ5¹⁹. Rzeczywiście, Hoechst może barwić DNA nawet w żywych komórkach²⁰.

Zastosowano pewne strategie, aby uniknąć wahań intensywności Hoechsta w różnych próbkach tego samego eksperymentu. Barwienie metodą Hoechsta przeprowadzono tuż przed pobraniem próbki za pomocą cytometru przepływowego, aby zminimalizować spadek intensywności barwnika w czasie. Dla osób zainteresowanych odtworzeniem protokołu w dużych eksperymentach z wieloma próbkami, zalecamy wykonanie barwienia Hoechst na kilku próbkach jednocześnie. Inną wadą jest to, że intensywność Hoechsta może być silnie uzależniona od liczby komórek podczas inkubacji z barwnikiem. Z tego powodu zdecydowanie zalecamy, aby do barwienia DNA zawsze używać tej samej liczby komórek i tej samej objętości na próbkę. Jeśli do pobrania za pomocą cytometru przepływowego wymagana jest duża liczba komórek, zalecamy przygotowanie dwóch lub więcej identycznych próbek, a następnie połączenie ich tuż przed etapem barwienia Hoechsta.

Kluczowym punktem protokołu jest strategia bramkowania do analizy danych. Niedawno opublikowaliśmy nową strategię analizy limfocytów T we wczesnych okresach odpowiedzi immunologicznej, co pozwoliło nam zwiększyć czułość wykrywania limfocytów T specyficznych dla antygenu¹². Zastosowaliśmy tę strategię do danych pokazanych tutaj w następujący sposób. Po pierwsze, wykluczyliśmy agregacje komórkowe na wykresie DNA-A/W. Po drugie, po bramkowaniu martwych komórek, użyliśmy dość dużej bramki limfocytów na wykresie FSC/SSC ("bramka zrelaksowana"). Dzięki tej strategii byliśmy w stanie włączyć wysoce aktywowane limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu w S-G₂ / M, które zwykle są pomijane przez obecne strategie bramkowania, ponieważ komórki te mają wysokie FSC-A i SSC-A. Podsumowując, analiza danych stanowi krytyczną część metody, która jest niezbędna do uzyskania czułego wykrywania aktywowanych/proliferujących limfocytów T specyficznych dla antygenu.

Metoda zapobiega możliwości pominięcia krytycznych danych dotyczących limfocytów T we wczesnych fazach odpowiedzi immunologicznej i otwiera nowe perspektywy dla immunologicznego monitorowania limfocytów T. Przyszłym ulepszeniem może być włączenie barwienia fosfohistonem 3, które umożliwiłoby różnicowanie między G₂ i M²¹. Obecnym ograniczeniem jest to, że komórki muszą być utrwalone i przepuszczalne, aby wybarwić marker jądrowy, Ki67. W związku z tym komórki nie mogą być używane do innych rodzajów analiz, takich jak sortowanie i późniejsza analiza funkcjonalna. Co więcej, barwniki DNA, w tym Hoechst, zwykle zakłócają analizę genomowego DNA i nie nadają się do tego typu oceny. Identyfikacja markerów błonowych, które korelują z różnymi fazami cyklu komórkowego i które mogą być barwione na żywych komórkach, może przezwyciężyć to ograniczenie. Podsumowując, metoda ta ma ogromny potencjał w ocenie aktywowanych/proliferujących limfocytów T w kilku kontekstach, takich jak szczepienia, infekcje, choroby o podłożu immunologicznym i immunoterapia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-200 μ L uniwersalne końcówki do pipet pakowane luzem	Corning	CLS4866-1000EA
2.4G2 anty-Fcγ R mAb	BD	553141	10 μ g/ml stężenie końcowe
5 ml tłok strzykawki	BD Szmaragd
Probówki stożkowe 15 ml	MercK Millipore
60 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC	Falcon	353002
70 μ Filtr siatkowy M	Falcon	352097
96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna, mikropłytka hodowlana z powłoką TC	Falcon
Ig,k/Cząstki kompensacyjne kontroli negatywnej przeciw szczurom/chomikom	BD- Bioscience	552845
Beta-merkaptoetanol	Sigma	M3148
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A07030
BUV805 Szczurzy środek przeciw myszom CD8a	BD- Nauki biologiczne	564920	4 μ g/ml stężenie końcowe
Bufor fosforanowy Dulbecco Sól fizjologiczna bez wapnia bez magnezu	Euroclone	ECB4004L
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 ml	Eppendorf	30120159
Etanol	Sigma	34852-1L-M
Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)	Sigma	E7889
Surowica bydlęca	płodu Corning	35-079-CV
Filcon, sterylna, strzykawka typu 70 μ m	Sokół	352350
Możliwy do utrwalenia barwnik żywotności eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	1:1000 końcowe stężenie
Foxp3 / zestaw barwiących czynnik transkrypcyjny	eBioscience	00-5523-00	Ten zestaw zawiera koncentrat i rozcieńczalnik do utrwalania/przepuszczalności oraz bufor permeabilacyjny 10x
H-2k(d) AMQMLKETI allofikocyjanin (APC)	znakowany tetramerem dostarczonym przez NIH Tetramer Core Facility		6 μ g/ml stężenie końcowe
H-2k(d) AMQMLKETI fikoerytryna (PE) znakowana pentamerem	Proimmune	F176-2A-E - 176	10 μ L / próbka
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg/ml roztwór w wodzie	Przeciwciało	H3570
Ki-67 (SolA15), FITC	eBioscience	11-5698-82	5 μ g/ml stężenie końcowe
L-Glutamina 100X (200 mM)	Euroclone	ECB3000D
Filtry Millex-HA 0,45 &mikro; m	BD	340606
Penicylina/Streptomycyna 100X	Euroklon	ECB3001D
PE/Cyjanina7 Przeciwciało anty-mysie CD62L	Biolegend	104418	0,2 & mu; g/ml stężenie końcowe
PerCP-Cy&handel; 5.5 Chomik Anty-Myszy CD3e	BD- Nauki biologiczne	551163	4.4 μ g/ml stężenie końcowe
Bufor do lizy czerwonych krwinek	Sigma	R7757
Probówki z polistyrenu okrągłodennego, 5 ml	Falcon
RPMI 1640 Medium bez L-Glutaminy z Fenolem Czerwonym	Euroklonem	ECB9006L
Pakiet oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej	FlowJo	v.10
Oprogramowanie do pobierania próbek za pomocą cytometru przepływowego	BD FACSDiva	v 6.2
Roztwór błękitu trypanowego	Euroclone	ECM0990D