Artykuł metodologiczny

Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61867

⸱

5 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”, 3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 5Reithera Srl, 6IRCCS, Neuromed

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ekspansja klonalna jest kluczową cechą odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu. Jednak cykl komórkowy limfocytów T reagujących na antygen został słabo zbadany, częściowo z powodu ograniczeń technicznych. Opisujemy metodę cytometrii przepływowej do analizy klonalnie rozszerzających się limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w śledzionie i węzłach chłonnych szczepionych myszy.

Streszczenie

Cykl komórkowy limfocytów T specyficznych dla antygenu in vivo został zbadany przy użyciu kilku metod, z których wszystkie mają pewne ograniczenia. Bromodeoksyurydyna (BrdU) oznacza komórki, które są w fazie S lub niedawno zakończonej, a ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE) wykrywa komórki potomne po podziale. Jednak barwniki te nie pozwalają na identyfikację fazy cyklu komórkowego w momencie analizy. Alternatywnym podejściem jest wykorzystanie Ki67, markera, który ulega silnej ekspresji przez komórki we wszystkich fazach cyklu komórkowego z wyjątkiem fazy spoczynku G0. Niestety, Ki67 nie pozwala na dalsze różnicowanie, ponieważ nie oddziela komórek w fazie S, które są zaangażowane w mitozę, od tych w G1, które mogą pozostać w tej fazie, przejść do cyklu lub przejść do G0.

Tutaj opisujemy metodę cytometrii przepływowej do przechwytywania "migawki" limfocytów T w różnych fazach cyklu komórkowego w wtórnych narządach limfoidalnych myszy. Metoda łączy barwienie Ki67 i DNA z barwieniem głównym kompleksem zgodności tkankowej (MHC)-peptyd-multimerem oraz innowacyjną strategią bramkowania, co pozwala nam skutecznie różnicować między specyficznymi dla antygenu limfocytami T CD8 w fazach G0, G1 i S-G2/M cyklu komórkowego w śledzionie i drenujących węzły chłonne myszy po szczepieniu wektorami wirusowymi przenoszącymi modelowy antygen gag ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)-1.

Kluczowymi etapami metody były wybór barwnika DNA i strategii bramkowania, aby zwiększyć czułość testu i włączyć wysoce aktywowane/proliferujące limfocyty T specyficzne dla antygenu, które zostałyby pominięte przez obecne kryteria analizy. Barwnik DNA, Hoechst 33342, umożliwił nam uzyskanie wysokiej jakości dyskryminacji pików DNA G0/G1 i G2/M, przy jednoczesnym zachowaniu barwienia błonowego i wewnątrzkomórkowego. Metoda ta ma ogromny potencjał w zakresie poszerzenia wiedzy na temat odpowiedzi limfocytów T in vivo oraz poprawy analizy monitorowania immunologicznego.

Wprowadzenie

Naiwne limfocyty T ulegają klonalnej ekspansji i różnicowaniu po torowaniu antygenowym. Zróżnicowane limfocyty T wykazują funkcje efektorowe, które są niezbędne do usuwania antygenu i utrzymania pamięci specyficznej dla antygenu, co jest kluczem do długotrwałej ochrony. Podczas pierwszych etapów pierwotnej odpowiedzi, naiwna interakcja limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen (APC) w wyspecjalizowanych niszach w narządach limfoidalnych ma kluczowe znaczenie dla indukcji ogromnej proliferacji limfocytów T, która charakteryzuje fazę ekspansji klonalnej1,2,3. Interakcja limfocytów T z APC jest precyzyjnie regulowana przez stężenie i trwałość antygenu, sygnałów kostymulujących i rozpuszczalnych czynników (cytokin i chemokin), które wpływają na ilość i jakość potomstwa klonów limfocytów T4,5,6,7.

Pomimo intensywnych badań nad ekspansją klonalną limfocytów T, nadal nie wiadomo, czy limfocyty T z antygenem kończą cały cykl komórkowy w miejscu rozpoznania antygenu, czy też migrują do innych organów podczas progresji cyklu komórkowego. Ten brak wiedzy wynika z właściwości dostępnych narzędzi do analizy cyklu komórkowego. Należą do nich przeciwciała monoklonalne (mAb) specyficzne dla markera jądrowego Ki67 oraz barwniki komórkowe, które albo identyfikują komórki, które przeszły fazę S cyklu komórkowego (np. Bromodeoksyurydyna (BrdU)) lub rozróżniają komórki potomne i ich przodków (np. ester sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE)).

Jednak barwniki znakujące komórki, takie jak CFSE i BrdU, nie pozwalają na określenie, czy komórki znalezione w danym narządzie rozmnożyły się lokalnie, czy raczej migrowały do tego miejsca po podziale8,9. Co więcej, białko wewnątrzjądrowe, Ki67, jest w stanie odróżnić komórki tylko w G0 (komórki Ki67-ujemne) od tych w dowolnej innej fazie cyklu komórkowego (komórki Ki67-dodatnie). Tak więc analiza Ki67 nie odróżnia komórek w aktywnej proliferacji (tj. w S, G2 lub M) od tych w G1, które mogą albo szybko przejść do podziału, albo pozostać przez długi czas w G1, albo powrócić do stanu spoczynku10,11.

Tutaj opisujemy nową metodę cytometrii przepływowej do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD812 ze śledziony i węzłów chłonnych (LN) szczepionych myszy (Rysunek 1). Metoda wykorzystuje kombinację barwienia Ki67 i DNA, która była wcześniej używana do analizy cyklu komórkowego komórek krwiotwórczych szpiku kostnego myszy (BM)13,14. W tym przypadku z powodzeniem zastosowaliśmy barwienie Ki67 plus DNA, wraz z niedawno opublikowaną innowacyjną strategią bramkowania12, do analizy ekspansji klonalnej limfocytów T CD8. Byliśmy w stanie wyraźnie rozróżnić limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu w G0, w G1 i w fazach S-G2 / M w śledzionie i drenujących LN szczepionych myszy.

Protokół

Myszy były trzymane w Plaisant Animal Facility, a praca została wykonana na podstawie autoryzacji włoskiego Ministerstwa Zdrowia o numerze 1065/2015-PR. Protokół był zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami zgodnie z krajowymi i międzynarodowymi przepisami i politykami (Dyrektywa UE 2010/63/UE; Włoski dekret ustawodawczy nr 26/2014).

1. Przygotowanie podłoża i roztworu barwiącego

  1. Przygotuj kompletną pożywkę: pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z 2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 50 μM beta-merkaptoetanolu i 10% objętości/objętości (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS)
  2. Przygotować bufor barwiący: sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+/Mg2+ (PBS) z 1% masy/objętości (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)

2. Leczenie myszy

  1. Pierwszorzędne 7-8-tygodniowe samice myszy Balb / c przez domięśniowe (i.m.) wstrzyknięcie w mięsień czworogłowy ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)-1-GAG-ekspresji-szympansa wektora adenowirusowego (ChAd3-gag) w dawce10-7 cząstek wirusa.
  2. Po 1-4 miesiącach od przygotowania należy raz wzmocnić myszy przez wstrzyknięcie domięśniowo zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara z ekspresją HIV-1-gag (MVA-gag) w dawce 106 jednostek tworzących blaszki miażdżycowe.
  3. W 3 dniu po wzmocnieniu poświęć wzmocnione myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i analizuj je równolegle z myszami nieleczonymi.
  4. Zbierz LN drenujące mięsień czworogłowy uda (biodrowy, podkolanowy i pachwinowy) oraz śledziony od wzmocnionych i nieleczonych myszy. Ponadto należy pobrać BM z dwóch tylnych nóg od nieleczonych myszy i użyć tego BM do ustawień cytometru przepływowego oraz jako kontroli pozytywnej do analizy cyklu komórkowego (Rysunek 2).
    UWAGA: Generuj wektory ChAd3-gag i MVA-gag zgodnie z wcześniejszym opisem12,15,16,17.

3. Izolacja drenujących komórek LN, śledziony i BM

  1. Izolacja komórek śledziony i LN
    1. Umieścić 5 ml kompletnej pożywki w każdej z dwóch probówek o pojemności 15 ml i przechowywać je na lodzie, gotowe do pobrania narządów.
    2. Poświęć dorosłą mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Umieść mysz na plecach i wysterylizuj powierzchnię skóry 70% v/v etanolem.
    4. Aby zebrać pachwinowe LN, wykonaj nożyczkami podłużne nacięcie na brzuchu o długości ~1 cm i rozciągnij nacięcie kleszczami.
    5. Wizualizuj pachwinowe LN na wewnętrznej powierzchni skóry i zbierz je kleszczami. Umieścić pachwinowe LN w jednej z dwóch probówek o pojemności 15 ml przygotowanych w kroku 3.1.1.
    6. Aby zebrać śledzionę, wykonaj nacięcie otrzewnej nożyczkami i usuń śledzionę. Po przecięciu otaczającej tkanki łącznej umieścić śledzionę w drugiej probówce o pojemności 15 ml przygotowanej w kroku 3.1.1.
    7. Aby zebrać LN biodrowe, odsuń jelita na bok i uwidocznij LN biodrowe w pobliżu żyły głównej dolnej, a następnie zbierz je za pomocą kleszczy. Umieść LN biodrowe w tej samej probówce, w której znajdują się pachwinowe LNs.
      UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą ilość komórek LN do barwienia (patrz sekcja 4), często konieczne jest zebranie LN podkolanowych, pachwinowych i biodrowych z jednej myszy. Wszystkie te LN drenują mięsień czworogłowy uda (miejsce szczepienia domięśniowego). W tym protokole używana jest tylko jedna probówka o pojemności 15 ml z połączonymi LN.
    8. Aby zebrać LN podkolanowe, chwyć skórę tylnych nóg i delikatnie pociągnij ją w dół, aby odsłonić mięśnie. Następnie włóż kleszcze między mięśnie pod stawem kolanowym i zbierz LN podkolanowe. Umieść LN podkolanowe w tej samej probówce zawierającej LN pachwinowe i biodrowe.
      UWAGA: Patrz uwaga po 3.1.7.
    9. Umieścić śledzionę w sitku o wielkości 70 μm w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm wypełnionym 5 ml kompletnej pożywki. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml delikatnie rozgnieść narząd, aż do jego całkowitego rozdrobnienia.
    10. Usunąć sitko i przenieść zawiesinę komórek do czystej probówki o pojemności 15 ml.
    11. Dodać 5 ml kompletnej pożywki do naczynia hodowlanego i ostrożnie umyć naczynie i sitko, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały odzyskane. Zebrać pozostałą część zawiesiny komórek śledziony w probówce o pojemności 15 ml.
    12. W przypadku połączonych LN pachwinowych, biodrowych i podkolanowych należy przygotować zawiesinę jednokomórkową zgodnie z procedurą podobną do tej zastosowanej w krokach 3.1.9 do 3.1.11 dla śledziony.
    13. Odwirować komórki o masie 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w PBS.
    14. Policz komórki za pomocą komory Neubauera, używając buforu do lizy czerwonych krwinek i 0,04% v/v błękitu trypanowego w PBS.
  2. Izolacja komórek BM
    1. Umieść 5 ml kompletnego podłoża w probówce o pojemności 15 ml i trzymaj je na lodzie, gotowe do pobrania tylnych nóg.
    2. Poświęć dorosłą mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Wysterylizuj powierzchnię skóry za pomocą 70% v/v etanolu.
    4. Wykonaj nożyczkami poprzeczne nacięcie na skórze brzusznej ~1 cm, mocno chwyć skórę po obu stronach nacięcia i delikatnie pociągnij w dół, aby odsłonić mięśnie tylnych nóg.
    5. Aby usunąć skórę z tyłu tylnych nóg, utrzymując mysz w pozycji leżącej, umieść zacisk pod kolanem i pociągnij do góry, aby odsłonić mięśnie.
    6. Przetnij kości na dwóch końcach jednej tylnej nogi: staw miedniczny/biodrowy i kostkę.
    7. Przenieść obie tylne nogi do probówki o pojemności 15 ml przygotowanej w kroku 3.2.1. Trzymaj probówkę na lodzie.
    8. Wyjmij tylne nogi z probówki o pojemności 15 ml i przenieś je na bibułkę. Przetnij tylne nogi tuż poniżej stawu kolanowego, aby usunąć kość piszczelową. Wypreparuj kość udową i piszczelową z otaczających mięśni, usuń nadmiar tkanki za pomocą nożyczek i zwilż bibułę.
    9. Odetnij końce kości nożyczkami, aby odsłonić wewnętrzny trzon szpiku. Włóż kość piszczelową i kość udową do rurki ekstrakcyjnej BM (patrz przygotowanie w 3.2.9.1-3.2.9.218), z najszerszym końcem na dole.
      1. Wytnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl na linii tuż nad końcem końcówki i na linii 100 μl.
      2. Umieść środkową część w górnej, większej części końcówki i umieść ją w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.
    10. Obracać probówkę ekstrakcyjną BM na 800 × g przez 1 minutę.
    11. Wyrzuć kość i energicznie ponownie zawieś osad w 1 ml kompletnego podłoża, aby usunąć wszelkie skupiska. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr 70 μm umieszczony na górze probówki o pojemności 15 ml.
    12. Probówkę ekstrakcyjną BM przemyć dwukrotnie 1 ml kompletnego podłoża za każdym razem. Przefiltrować przez filtr 70 μm i połączyć objętość z resztą zawiesiny komórek otrzymanej w kroku 3.2.11.
      UWAGA: Pojedyncza probówka o pojemności 15 ml będzie zawierała komórki z obu tylnych nóg myszy.
    13. Odwirować komórki o masie 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w PBS.
    14. Policz komórki za pomocą komory Neubauera, używając buforu do lizy czerwonych krwinek i 0,04% v/v błękitu trypanowego w PBS.

4. Barwienie komórek śledziony, LN i BM

  1. Podziel próbki komórek do barwienia na 3 podgrupy: próbki komórek do kompensacji, w tym komórki BM od myszy nieleczonych, które mają być barwione tylko Hoechst 33342 (odtąd określane jako Hoechst) i komórki śledziony od myszy nieleczonych, które mają być użyte do przygotowania mieszanki martwych/żywych komórek do kompensacji barwnika martwych komórek; kontrola pozytywna do analizy cyklu komórkowego, składająca się z próbki BM od myszy niepoddanych działaniu substancji; oraz próbki eksperymentalne zawierające próbki śledziony i LN od myszy nieleczonych i szczepionych.
    UWAGA: Upewnij się, że jest wystarczająca ilość komórek śledziony i LN do analizy wystarczającej liczby komórek T CD8 specyficznych dla gag. Często konieczne jest użycie połączonych komórek śledziony i połączonych komórek LN od 3 zaszczepionych myszy i barwienie dwóch lub więcej identycznych próbek połączonych komórek, z których każda zawiera 3 × 106 komórek. Połączyć identyczne próbki na etapie barwienia Hoechst. Podobnie, wybarwić połączone komórki śledziony i komórki LN od 3 nieleczonych myszy, a na końcu połączyć identyczne próbki. Odłóż na bok niebarwioną próbkę komórek śledziony od nieleczonej myszy do wykorzystania w ustawieniu instrumentu i kompensacji.
  2. Przygotuj mieszaninę martwych/żywych komórek do kompensacji barwnika martwych komórek (ta mieszanina komórek zostanie zabarwiona tylko barwnikiem martwych komórek).
    1. Podgrzać łaźnię wodną w temperaturze 65 °C.
    2. Weź porcję komórek śledziony (~3 × 106).
    3. Zawiesinę komórek przenieść do probówki do mikrofuge, umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 5 minut, a następnie natychmiast umieścić na lodzie na 10 minut.
    4. Wymieszaj komórki zabite termicznie z żywymi komórkami śledziony (~3 × 106) w stosunku 1:1 i przenieś połowę mieszaniny na 96-dołkową okrągłą płytkę dolną (~3 × 106 komórek/studzienkę do kontroli barwienia martwych komórek).
  3. Barwienie martwych komórek w próbkach doświadczalnych, kontrola pozytywna do analizy cyklu komórkowego i mieszanie martwych/żywych komórek
    1. Przenieść śledzionę, LN, komórki BM (3 × 106 komórek/basenik) oraz mieszaninę martwych/żywych komórek (sekcja 4.2) na 96-dołkową płytkę okrągłodenną, zgodnie ze schematem barwienia (etap 4.1) i odwirować przy 400 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    2. Zawiesić każdą komórkę w 50 μl barwnika z martwych komórek rozcieńczonego w PBS i natychmiast ponownie zawiesić, pipetując w górę iw dół 3 razy.
    3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
    4. Przemyć komórki 2 razy buforem barwiącym; pierwszy raz 200 μl, a drugi raz 250 μl. Przy każdym płukaniu odwirować płytkę o masie 400 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 μl PBS.
  4. Barwienie komórek błonowych za pomocą multimerów peptydowych głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) i mAb.
    1. Biorąc pod uwagę niezbędne objętości zgodnie ze schematem barwienia (Ustawienia cytometru przepływowego, tabela 1), przygotuj następujące odczynniki:
      1. Rozcieńczyć mAb 2,4G2 w buforze barwiącym zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem (patrz tabela materiałów); dla każdej próbki przeznaczonej do barwienia użyć 10 μl tego rozcieńczenia.
        UWAGA: 2,4G2 mAb blokuje niespecyficzne dla antygenu wiązanie immunoglobulin z receptorami FcγIII i FcγII.
      2. Rozcieńczyć tetramer allofikocyjaniny (APC) znakowany H-2k(d) AMQMLKETI (APC) w buforze barwiącym w celu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia (patrz tabela materiałów); dla każdej próbki, która ma być barwiona, użyć 20 μl tego rozcieńczenia.
      3. Przygotować mieszaninę przeciwciał przez rozcieńczenie mAb w buforze barwiącym zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem (patrz Tabela Materiałów), które zostało uprzednio określone w doświadczeniach miareczkowania; dla każdej próbki, która ma być barwiona, użyć 20 μl tej mieszaniny przeciwciał.
        UWAGA: Tutaj zastosowano białko chlorofilu anty-CD3e perydyniny (PerCP-Cy5.5) (klon 145-2C11), błyszczący ultrafiolet anty-CD8a (BUV805) (klon 53-6,7) i cyjaninę fikoerytryny anty-CD62L (PECy7) (klon MEL-14).
    2. Dodać 10 μl uprzednio rozcieńczonego 2,4G2 mAb (etap 4.4.1.1) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
    3. Dodać 20 μl uprzednio rozcieńczonego Tetr-gag APC (krok 4.4.1.2) i 10 μl pentameru H-2k(d) AMQMLKETI phycoerytryna (PE) (pent-gag). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
    4. Dodać 20 μl wcześniej przygotowanej mieszanki przeciwciał (etap 4.4.1.3) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: W związku z tym końcowa objętość wynosi 80 μl na studzienkę (krok 4.3.5, kroki 4.4.2 do 4.4.4).
    5. Umyj komórki 200 μl buforu barwiącego. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 250 μl buforu barwiącego i przenieść zawiesinę komórek do probówek o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml buforu barwiącego do probówki i odwirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Pobrać podwielokrotność komórek BM (3 × 106 komórek) (patrz wykaz próbek komórek, sekcja 4.1), która ma być użyta do kompensacji kanału Hoechsta (Hoechst 33342 jest wzbudzany przez laser ultrafioletowy (ustawienia cytometru przepływowego (tabela 2)) i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml buforu barwiącego do probówki i odwirować 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

5. Utrwalenie/przepuszczalność

  1. Przygotować świeży bufor do utrwalania/przepuszczalności, rozcieńczając 1 część koncentratu utrwalającego/przepuszczalnego z 3 częściami rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności, zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Odrzucić supernatant i pulsacyjnie wirować próbki, aby całkowicie zdezagregować osad.
  3. Dodać 1 ml świeżo przygotowanego buforu do utrwalania/przepuszczalności do każdej probówki, w tym probówki z niebarwionymi komórkami śledziony (3 x 106, patrz wykaz próbek komórek, sekcja 4.1) i wirować.
  4. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

6. Barwienie wewnątrzkomórkowe

  1. Barwienie Ki67
    1. Przygotować świeży bufor permeabilacyjny 1x, rozcieńczając 10x bufor permeabilizacyjny wodą destylowaną, zgodnie z instrukcją producenta. Przed użyciem bufor permeabilizacyjny 1x należy przefiltrować przez filtr 0,45 μm w celu wyeliminowania agregatów.
    2. Rozcieńczyć mAb Ki67 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (klon SolA15) w buforze przepuszczalnym 1x (patrz Tabela materiałów), jak oznaczono wcześniej w doświadczeniach miareczkowania (końcowa objętość 100 μl na próbkę).
    3. Dodać 3 ml buforu permeabilacyjnego 1x do każdej probówki i odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Odrzucić supernatant i powtórzyć krok 6.1.3.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl uprzednio rozcieńczonego mAb Ki67 FITC (krok 6.1.2).
    6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
    7. Przemyć komórki 2 razy 4 ml buforu permeabilizacyjnego 1x. Dla każdego płukania odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Zawiesić osad komórkowy w PBS, biorąc pod uwagę następujące objętości: 350 μl PBS dla próbek, które mają być pobrane bezpośrednio na cytometrze przepływowym; 250 μl PBS dla próbek, które mają być inkubowane za pomocą Hoechst na krótko przed cytometrią przepływową (sekcja 6.2).
  2. Barwienie DNA
    1. Do każdej próbki dodać 250 μl 4 μg/ml Hoechst w PBS (końcowe stężenie Hoechst wynosi 2 μg/ml).
      UWAGA: W przypadku, gdy przygotowano dwie lub więcej identycznych próbek o objętości 250 μl w PBS, należy je połączyć na tym etapie i dodać równą objętość 4 μg/ml roztworu Hoechsta do PBS (końcowe stężenie Hoechsta wynosi 2 μg/ml). Liczba komórek ma duży wpływ na etap barwienia DNA. Użyj tego samego numeru komórki w każdej próbce. Należy pamiętać, że nawet nieznacznie zmniejszona liczba komórek (np. z powodu utraty komórek w poprzednich etapach mycia) powoduje większe wiązanie Hoechst z DNA i wyższą intensywność Hoechst.
    2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
    3. Odwirować próbki o masie 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 350 μl PBS.

7. Przygotowanie próbek koralików kompensacyjnych

  1. Przygotować 5 μl przeciwciała, odpowiednio rozcieńczając mAb w buforze barwiącym.
    UWAGA: Dla każdego mAb sprzężonego z fluorochromem użytego w eksperymencie należy przygotować odpowiednią próbkę kulki kompensacyjnej.
  2. Vortex Negative Control i Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp Beads przed użyciem.
  3. Do każdej próbki wprowadź jedną kroplę (~20 μL) Negative Control CompBeads i jedną kroplę Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads.
  4. Dodać 5 μl wstępnie rozcieńczonego przeciwciała (krok 7.1) do probówki i pipetować w górę i w dół.
  5. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
  6. Próbki przemyć 2 ml buforu barwiącego. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 500 μl PBS do każdej probówki i wiru.

8. Konfiguracja przyrządu i kompensacji oraz eksperymentalne pobieranie próbek za pomocą cytometru przepływowego

UWAGA: Zapoznaj się z ustawieniami cytometru przepływowego (Tabela 2) dla konfiguracji cytometru.

  1. Ogólna konfiguracja przyrządów i wynagrodzeń
    1. Otwórz oprogramowanie do pobierania próbek (patrz Spis materiałów) i utwórz nowy eksperyment, klikając pozycję Nowy eksperyment w sekcji wstążki obszaru roboczego i wybierając pozycję Nowy pusty eksperyment.
    2. Kliknij dwukrotnie utworzony eksperyment, aby go otworzyć.
    3. W oknie Ustawienia cytometru kliknij Parametry i wybierz wszystkie kanały (np. PE, APC itp.) używane w panelu barwienia, w tym parametry Forward Scatter (FSC) i Side Scatter (SSC).
    4. Wybierz skalę liniową jako parametr Hoechsta, odznaczając skalę logarytmiczną, i sprawdź szerokość (W) impulsu napięciowego dla FCS, SSC i Hoechst.
      UWAGA: Wszystkie parametry są domyślnie wyświetlane w skali logarytmicznej (logarytmicznej), z wyjątkiem FSC i SSC, które są w skali liniowej. Wszystkie parametry są analizowane przez powierzchnię (A) i wysokość (H) impulsu napięciowego.
    5. W arkuszu globalnym utwórz wykres punktowy z FSC-A na osi x i SSC-A na osi y.
    6. Uruchom niebarwioną próbkę śledziony, klikając przycisk Uzyskaj dane na pulpicie nawigacyjnym pozyskiwania.
    7. Ustaw odpowiednie ustawienia FSC i SSC, aby wizualizować komórki, modyfikując wartości napięcia w sekcji Parametry, a następnie utwórz bramkę, aby zaznaczyć wszystkie komórki wyświetlane na wykresie kropkowym FSC-A/SSC-A, klikając Brama wielokątna na pasku narzędzi obszaru roboczego Arkusza globalnego.
    8. Wyświetlaj bramkowane komórki na histogramach z każdym parametrem fluorescencji na osi x.
    9. Uruchom niebarwione i całkowicie wybarwione próbki śledziony, aby dostosować detektor fluorescencji (PMT), aby uzyskać wyraźną separację między negatywnymi i pozytywnymi sygnałami barwionych komórek dla każdego parametru fluorescencji.
    10. Aby przeprowadzić konfigurację wynagrodzenia, kliknij pozycję Eksperymentuj na wstążce obszaru roboczego i w sekcji Konfiguracja wynagrodzenia wybierz pozycję Utwórz kontrolki wynagrodzenia. Usuń zaznaczenie opcji Dołącz niezabarwioną rurkę kontrolną/studnię i kliknij OK.
      UWAGA: Ta operacja spowoduje utworzenie próbki o nazwie Kontrolki kompensacji oraz Normalnego arkusza roboczego zawierającego kilka arkuszy odpowiadających każdemu wybranemu parametrowi.
    11. Uruchom próbkę kulek kompensacyjnych (patrz sekcja 7); ustaw odpowiednie ustawienia FSC i SSC, aby wizualizować kulki, modyfikując wartości napięcia i próg akwizycji 5,000 na parametrach FSC w oknie Cytometr.
    12. Dostosuj bramkę P1 na populacji ściegu i sprawdź, czy dodatnie i ujemne piki są widoczne na osi x. Powtórz tę operację dla każdej próbki koralików kompensacyjnych, a na koniec zarejestruj każdy plik próbki, klikając przycisk Rejestruj dane na pulpicie nawigacyjnym akwizycji (zarejestruj co najmniej 5 000 zdarzeń dla każdej próbki).
    13. Dla każdej zarejestrowanej próbki kulki ustaw bramki P2 i P3 odpowiednio na pikach dodatnich i ujemnych.
    14. Uruchom próbki komórek w celu kompensacji (patrz kroki 4.2 i 4.4.7 oraz sekcje 5 i 6). Zmodyfikuj napięcia FSC i SSC oraz wartość progową, aby zobrazować komórki, dostosuj bramkę P1 i na koniec nagraj każdy plik próbki (zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń). Ustaw bramki P2 i P3 odpowiednio na dodatnim i ujemnym piku.
      UWAGA: Do kompensacji kanału Hoechsta należy użyć G0/G1 jako piku ujemnego (P3) i G2/M jako piku dodatniego (P2).
    15. Kliknij pozycję Eksperymentuj w sekcji wstążki obszaru roboczego, a następnie w sekcji Ustawienia wynagrodzenia wybierz pozycję Oblicz wynagrodzenie.
    16. Nazwij utworzone ustawienie wynagrodzenia, połącz je i zapisz w bieżącym eksperymencie.
  2. Eksperymentalne pobieranie próbek
    1. Otwórz próbkę, klikając przycisk Nowy wzór na pasku narzędzi przeglądarki, a następnie utwórz strategię bramkowania w arkuszu globalnym.
      UWAGA: Strategia bramkowania polegająca na pozyskiwaniu próbek jest podobna do tej analizy próbki, opisanej w Rysunek 3 i sekcja 9.
    2. Wyświetl całą populację zdarzeń na histogramie z CD3-A na osi x. Utwórz bramkę interwałową, aby zaznaczyć tylko komórki CD3+.
    3. Na pulpicie nawigacyjnym akwizycji wybierz bramę pamięci masowej jako Wszystkie zdarzenia dla próbek LN i opcję Wszystkie zdarzenia lub komórki CD3+ dla próbek śledziony.
    4. Uruchom próbki eksperymentalne z niską prędkością, a na koniec nagraj wszystkie pliki, upewniając się, że zebrałeś co najmniej 100-200 specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 dla każdej próbki od zaszczepionych myszy.
      UWAGA: Rozmiar pliku próbek eksperymentalnych jest zwykle duży (30-120 MB), zwłaszcza gdy częstotliwość limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu jest niska. W związku z tym należy zebrać dużą liczbę zdarzeń (> 1 × 106), aby zarejestrować co najmniej 100-200 limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu. Duże pliki mogą spowolnić późniejszy proces analizy danych. Akwizycja tylko komórek CD3+ w próbkach śledziony (patrz krok 8.2.2 powyżej) jest pomocna w utrzymaniu mniejszego rozmiaru pliku.
    5. Uruchom i zapisz kontrolę pozytywną do analizy cyklu komórkowego, tj. próbkę BM od myszy nieleczonych.

9. Analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie (patrz Spis materiałów) i utwórz różne grupy odpowiadające różnym narządom, które mają być analizowane, klikając Utwórz grupę w sekcji wstążki obszaru roboczego (tj. utwórz grupę "a-LNs"; "b-splenen"; "c-BM").
    UWAGA: Nowo utworzone grupy pojawią się na liście grup, podczas gdy grupa "Kompensacja" jest automatycznie generowana przez oprogramowanie.
  2. Otwórz okno Modyfikuj grupę, klikając dwukrotnie nazwę grupy i sprawdź, czy nowo utworzone grupy są zsynchronizowane. Jeśli nie, wstaw znacznik wyboru przy funkcji Zsynchronizowane.
  3. Przeciągnij każdy plik .fcs do odpowiedniej grupy.
  4. Utwórz strategię bramkowania, zaczynając od grupy "a-LNs".
  5. Kliknij dwukrotnie w pełni wybarwioną próbkę w grupie, aby otworzyć okno wykresu; osie x i y są oznaczone tak, jak w plikach fcs (patrz ustawienia cytometru przepływowego, tabela 2).
  6. Wyświetl łączną liczbę zdarzeń uzyskanych dla tej próbki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i DNA-W na osi y.
  7. Wybierz tylko populację pojedynczej komórki, klikając Prostokąt w sekcji narzędzia do bramkowania w oknie wykresu.
    UWAGA: Pojedyncze komórki mają wartości DNA-A w następujący sposób: 2N (niski): od 2N do 4N (pośredni) lub równy 4N (wysoki), podczas gdy wartości DNA-W są identyczne dla wszystkich z nich (krok 1 z Rysunek 3).
  8. Kliknij dwukrotnie na środku prostokątnej bramki, aby wyświetlić pojedyncze komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i barwnikiem martwych komórek na osi y.
  9. Wybierz tylko populację żywych komórek, klikając Wielokąt w sekcji narzędzia do bramkowania w oknie wykresu. Żywe komórki są ujemne dla barwnika martwej komórki (krok 2 z Rysunek 3).
  10. Kliknij dwukrotnie na środku bramki wielokątnej, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i parametrem SSC-A na osi y.
  11. Kliknij na Prostokąt i utwórz "zrelaksowaną" bramę, aby uwzględnić wszystkie pojedyncze żywe komórki na tym wykresie12 (krok 3 z Rysunek 3).
  12. Kliknij dwukrotnie na środku "zrelaksowanej" bramki, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z CD3 na osi x i CD8 na osi y.
  13. Zaznacz komórki CD3 + CD8 +, klikając Wielokąt (krok 4 z Rysunek 3).
  14. Kliknij dwukrotnie na środku bramki CD3 + CD8 +, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z Tetr-gag na osi x i Pent-gag na osi y.
  15. Wybierz specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8 (dodatnie zarówno dla Tetr-gag, jak i Pent-gag), klikając Polygon (krok 5 z Rysunek 3).
  16. Kliknij dwukrotnie na środku bramki specyficznej dla knebla, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y (Rysunek 4).
  17. Wybierz komórki w różnych fazach cyklu komórkowego, klikając Quad w sekcji narzędzia do bramkowania w oknie wykresu.
    UWAGA: Komórka w fazie G0 to niskie komórki Ki67neg-DNA (lewy dolny ćwiartka); komórki w G1 to Ki67pos-DNA nisko (lewy górny ćwiartka); komórki w S-G2 / M są pośrednie/wysokie Ki67pos-DNA (prawy górny kwadrant) (Rysunek 4).
  18. Skopiuj strategię bramkowania utworzoną w jednej próbce do odpowiedniej grupy, aby zastosować bramki do wszystkich próbek w grupie.
  19. Powtórz kroki od 9.5 do 9.18 dla "grupy a-LN".
  20. Sprawdzić, czy wszystkie bramki są odpowiednie dla każdej próbki z grupy "b-śledziona". Aby przeanalizować cykl komórkowy między komórkami BM (kontrola pozytywna), kliknij na środku "zrelaksowanej" bramki, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y.
  21. Sprawdź, czy wszystkie bramki są odpowiednie dla każdej próbki z 3 grup (tj. dla komórek ze śledziony, LN i BM).
    UWAGA: Bramka populacji pojedynczej komórki (krok 9.7) i bramka poczwórna dla cyklu komórkowego (krok 9.17) mogą mieć różne współrzędne bramki w różnych próbkach, głównie ze względu na możliwe niewielkie różnice w intensywności barwnika Hoechsta między próbkami (sekcja 6.2). Z tego powodu może być konieczna modyfikacja bramki populacji pojedynczej komórki i bramek poczwórnych dla cyklu komórkowego w każdej próbce. Zostanie to zrobione w następujący sposób: kliknij dwukrotnie nazwę grupy i usuń synchronizację z właściwości grupy. Ta operacja umożliwia modyfikację bramek w jednej próbce bez modyfikowania tych samych bramek we wszystkich innych próbkach grupy. Po usunięciu synchronizacji zmodyfikuj bramki w razie potrzeby.
  22. Aby wyświetlić wyniki uzyskane w wyniku tej analizy, kliknij pozycję Edytor układu w sekcji wstążki przestrzeni roboczej, aby ją otworzyć. Przeciągnij każdą bramę strategii bramkowania w okienku próbki do edytora układu i umieść wykresy zgodnie z sekwencją strategii bramkowania. W razie potrzeby zmień typ wykresu, klikając dwukrotnie odpowiedni wykres w układzie i wybierając odpowiedni typ w oknie Definicja wykresu.
  23. Kliknij przycisk Grupuj i iteruj według funkcji na wstążce układu, aby wyświetlić wyniki uzyskane w każdym narządzie i porównać różne próbki.

Wyniki

Fazy cyklu komórkowego komórek śledziony, węzłów chłonnych (LNs) i szpiku kostnego (BM) myszy Balb/c analizowano przy użyciu fluorescencyjnego barwnika DNA, Hoechst, oraz przeciwciała mAb anty-Ki67, zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1. Barwienie to pozwoliło na rozróżnienie komórek w następujących fazach cyklu komórkowego: G0 (Ki67neg, z ilością DNA 2N zdefiniowaną jako DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) oraz S-G2/M (Ki67pos, z zawartością DNA mieszczącą się w przedziale od 2N do 4N lub równą 4N, zdefiniowaną jako DNAintermediate/high).

W pierwszej kolejności przeprowadzono analizę cyklu komórkowego komórek BM, aby powtórzyć wcześniej opublikowane wyniki13,14, a następnie przeanalizowano interesujące nas komórki, tj. limfocyty T CD8. Na Rysunku 2 przedstawiono typowy przykład analizy cyklu komórkowego komórek BM (Rysunek 2A). Protokół pozwolił uzyskać niski współczynnik zmienności (CV) dla pików DNA w fazach G0/G1 oraz G2/M, co wskazuje na doskonałą jakość barwienia DNA (Rysunek 2B, przedstawiający przykład z CV < 2,5; we wszystkich eksperymentach CV wynosiło zawsze < 5).

Następnie zastosowaliśmy ten sam protokół w odniesieniu do antygenowo swoistych limfocytów T CD8 od myszy zaszczepionych. Myszy BALB/c zaszczepiono przeciwko antygenowi gag wirusa HIV-1, stosując Chad3-gag do primingu oraz MVA-gag do dawki przypominającej (boosting), przy czym oba wektory zostały zmodyfikowane tak, aby przenosiły gag HIV-1. W dniu (d) 3 po dawce przypominającej przeanalizowaliśmy częstotliwość występowania limfocytów T CD8 swoistych dla gag w śledzionie oraz drenujących węzłach chłonnych (LNs). Wykorzystaliśmy nowo zdefiniowaną strategię bramkowania dla limfocytów T w wczesnej fazie odpowiedzi immunologicznej, która w przeciwieństwie do strategii konwencjonalnej jest odpowiednia do wykrywania silnie aktywowanych, odpowiadających na antygen limfocytów T CD812. Nową strategię zrealizowaliśmy w pięciu kolejnych krokach. W kroku 1 wykluczyliśmy dublety lub agregaty za pomocą bramki DNA-A/ -W, a w kroku 2 zidentyfikowaliśmy żywe komórki poprzez wykluczenie markerem komórek martwych. W kroku 3 zidentyfikowaliśmy interesującą nas populację, stosując niekonwencjonalną „rozluźnioną” bramkę FSC-A/ SSC-A (Rycina 3A) zamiast kanonicznej wąskiej bramki limfocytów12. Po bramkowaniu komórek CD3+CD8+ (krok 4 na Rycini 3A), zidentyfikowaliśmy limfocyty T CD8 swoiste dla gag, używając dwóch różnych multimerów MHC, tj. Pent-gag i Tetr-gag (krok 5 na Rycini 3A). Użyliśmy dwóch multimerów zamiast jednego, aby zwiększyć czułość wykrywania limfocytów T CD8 swoistych dla gag u myszy zaszczepionych, bez zwiększania tła barwienia u myszy nieleczonych (Rycina 3B i C, krok 5). W ten sposób pomyślnie odróżniliśmy myszy nieleczone (odpowiednio 0,00% i 0,00% antygenowo swoistych limfocytów T CD8 w węzłach chłonnych i śledzionie) od myszy zaszczepionych (odpowiednio 0,46% i 0,29% antygenowo swoistych limfocytów T CD8 w węzłach chłonnych i śledzionie, Rycina 3B i C).

Warto zaznaczyć, że protokół ten pozwolił nam uzyskać niezwykle niskie tło w bramce dla limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w węzłach chłonnych (LNs) i śledzionie myszy nieleczonych (zazwyczaj 0,00% i maksymalnie 0,02%). Porównanie wykresów FSC-A / SSC-A dla komórek specyficznych dla gag i niespecyficznych dla gag wykazało, że komórki specyficzne dla gag charakteryzowały się wysokimi wartościami SSC-A i FSC-A (Rycina 3D), co potwierdziło konieczność zastosowania „rozluźnionej” bramki FSC-A/ SSC-A w celu uchwycenia tych komórek. Następnie oceniliśmy odsetek limfocytów T CD8 specyficznych dla gag w różnych fazach cyklu komórkowego (Rycina 4A). Stwierdzono, że limfocyty T CD8 specyficzne dla gag w śledzionie, a jeszcze bardziej w drenujących LNs, zawierały wysoką proporcję komórek w fazach S-G2/M w 3. dobie po dawce przypominającej (odpowiednio 18,60% i 33,52%).

Ponadto stwierdzono, że swoiste dla białka gag limfocyty T CD8 w fazach S-G2/M charakteryzowały się wysokimi wartościami FSC-A i SSC-A po nałożeniu ich na całkowitą populację limfocytów T CD8 z tego samego narządu (Rysunek 4B). Ekspresja CD62L w swoistych dla gag limfocytach T CD8 była niska, co jest oczekiwane dla aktywowanych limfocytów T, z wyjątkiem kilku komórek w fazie G0 w węzłach chłonnych (Rysunek 4C). Podsumowując, wyniki te potwierdziły, że zastosowanie „rozluźnionego” bramkowania (krok 3 na Rysunkach 3A, B i C) było niezbędne do uwzględnienia wszystkich proliferujących swoistych dla antygenu limfocytów T CD812. Protokół ten okazał się niezwykle wartościowy do oceny „migawkowej” faz cyklu komórkowego swoistych dla antygenu limfocytów T CD8 w momencie analizy oraz ekspresji CD62L w komórkach znajdujących się w różnych fazach cyklu komórkowego.

Schemat procesu cytometrii przepływowej przedstawiający etapy barwienia komórek i analizy danych.
Rysunek 1: Schemat protokołu analizy cyklu komórkowego antygenowo swoistych limfocytów T CD8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat analizy cytometrii przepływowej przedstawiający zawartość DNA i fazy cyklu komórkowego wraz z wykresami danych z bramkowaniem.
Rycina 2: Analiza cyklu komórkowego komórek BM. Komórki BM od nieleczonych myszy Balb/c zostały zabarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Przykład strategii bramkowania. Wykonano bramkowanie pojedynczych komórek na wykresie DNA-A/-W (lewo), a następnie żywych komórek poprzez wykluczenie barwnika do komórek martwych (środek). Następnie dla wszystkich komórek BM zastosowano „rozluźnione” bramkowanie FSC-A/SSC-A (prawo). (B) Przykład analizy cyklu komórkowego komórek BM (lewo). Wykorzystano kombinację barwienia Ki67 i DNA w celu zidentyfikowania komórek w następujących fazach cyklu komórkowego: G0 (lewy dolny kwadrant, komórki Ki67neg-DNAlow), G1 (lewy górny kwadrant, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (prawy górny kwadrant, Ki67pos-DNAintermediate/high). Przedstawiono kontrolę Fluorescence Minus One (FMO) dla przeciwciała mAb przeciwko Ki67 (środek) oraz histogram DNA (prawo). Na wykresie histogramu DNA lewa i prawa bramka odpowiadają odpowiednio piku DNA dla fazy G0/G1 oraz G2/M, a liczby reprezentują współczynniki zmienności (CV) każdego piku. Na wszystkich pozostałych wykresach liczby reprezentują procent komórek w zaznaczonych bramkach. Rycina przedstawia 1 reprezentatywny eksperyment z 5 przeprowadzonych. W każdym eksperymencie analizowano połączone komórki BM od 3 myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Cytometria przepływowa, limfocyty T CD8, limfocyty, szczepienie, komórki specyficzne dla gag, analiza danych, wykresy kropkowe.
Rysunek 3: Analiza antygenowo-specyficznych limfocytów T CD8 z węzłów chłonnych (WN) i śledziony. Myszy Balb/c poddano immunizacji pierwotnej domięśniowo (i.m.) preparatem Chad3-gag, a następnie dawce przypominającej i.m. preparatem MVA-gag. W 3. dobie po dawce przypominającej komórki z drenujących WN i śledziony myszy zaszczepionych oraz myszy kontrolnych nieleczonych zostały znakowane i analizowane metodą cytometrii przepływowej. (A) Schemat strategii bramkowania w pięciu krokach w celu identyfikacji pojedynczych komórek (Krok 1); żywych komórek (Krok 2); limfocytów (Krok 3); limfocytów T CD8 (Krok 4) oraz komórek specyficznych dla gag (Krok 5). (B-C) Przykładowe wykresy: analiza komórek z (B) WN i (C) śledziony myszy nieleczonych (góra) i zaszczepionych (dół). W Kroku 1 zidentyfikowano pojedyncze komórki na wykresie DNA-A/ -W. Następnie, w Kroku 2, wyselekcjonowano żywe komórki poprzez wykluczenie barwnika dla martwych komórek. W Kroku 3 zastosowano niekanoniczną, „rozluźnioną” bramkę dla limfocytów. W Kroku 4 zidentyfikowano limfocyty T CD8 na podstawie podwójnej ekspresji CD3 i CD8. W Kroku 5 zidentyfikowano komórki specyficzne dla gag oraz niespecyficzne dla gag, na podstawie ich zdolności (lub jej braku) do wiązania znakowanego fluorochromem H-2kd-gag-Pentameru (Pent-gag) i H-2kd-gag-Tetrameru (Tetr-gag). (D) Profile FSC-A/SSC-A komórek specyficznych dla gag (niebieskie) i niespecyficznych dla gag (szare) po bramkowaniu opisanym powyżej. Liczby reprezentują procenty komórek w wskazanych bramkach. Rysunek przedstawia 1 reprezentacyjny eksperyment z 5 przeprowadzonych. W każdym eksperymencie analizowano połączone próbki komórek ze śledziony i WN od 3 myszy zaszczepionych i 3 myszy nieleczonych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza cytometrii przepływowej przedstawiająca fazy cyklu komórkowego w węzłach chłonnych i śledzionie; wyniki wykresów Ki67, DNA-A.
Rycina 4: Analiza cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8. Myszy zaszczepiono zgodnie z opisem na Rycina 3, a analizę cyklu komórkowego komórek specyficznych dla białka gag przeprowadzono w 3. dniu po dawce przypominającej, po bramkowaniu w 5 krokach, tak jak na Rycina 3. (A) Przykład analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8 specyficznych dla białka gag z węzłów chłonnych (góra) i śledziony (dół) zaszczepionych myszy. Fazy cyklu komórkowego zidentyfikowano zgodnie z Rycina 2B. Panele przedstawiają komórki w fazie G0, w fazie G1 oraz w fazach S-G2/M (lewo) oraz kontrolę Fluorescence Minus One (FMO) dla przeciwciała mAb przeciwko Ki67 (prawo). Liczby oznaczają procenty komórek w wskazanych bramkach. (B) Wykresy kropkowe FSC-A/SSC-A przedstawiające limfocyty T CD8 specyficzne dla białka gag w fazach S-G2/M (na czerwono) nałożone na całkowitą populację limfocytów T CD3+CD8+ (na szaro) z węzłów chłonnych (góra) i śledziony (dół) zaszczepionych myszy. (C) Przesunięte histogramy przedstawiające ekspresję CD62L przez limfocyty T CD8 specyficzne dla białka gag w fazie G0 (zielony), w fazie G1 (niebieski) oraz w fazach S-G2/M (czerwony) z węzłów chłonnych (góra) i śledziony (dół) zaszczepionych myszy. Osie Y wskazują znormalizowaną liczbę zdarzeń. Rycina przedstawia 1 reprezentatywny przykład z 5 niezależnych eksperymentów z udziałem łącznie 15 myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Materiały uzupełniające: Ustawienia cytometru przepływowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Chociaż ekspansja klonów limfocytów T była intensywnie badana, niektóre aspekty pozostają nieznane, głównie dlatego, że dostępne narzędzia do jej badania są nieliczne i mają swoje wady. Z tej perspektywy opracowaliśmy bardzo czułą metodę cytometrii przepływowej do analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu we wczesnym okresie po szczepieniu w modelu mysim. Protokół opiera się na połączeniu barwienia Ki67 i DNA, które wcześniej było wykorzystywane do analizy cyklu komórkowego komórek krwiotwórczych BM u myszy13,14. Aby dostosować protokół do limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu, musieliśmy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kwestii, w tym wybór barwnika DNA, odpowiednie warunki do uzyskania porównywalnego barwienia DNA w różnych próbkach oraz strategię bramkowania do analizy danych.

Do barwienia DNA dostępnych jest wiele barwników, w tym jodek propidyny i 7-aminoaktynomycyna D; wybraliśmy Hoechst, ponieważ był kompatybilny z barwieniem membranowym i łagodnym protokołem utrwalania / przepuszczalności wymaganym do barwienia Ki67. Jednocześnie barwienie Hoechstem pozwoliło na uzyskanie histogramu DNA doskonałej jakości, tj. piki DNA G0/G1 i G2/M miały znacznie niższy współczynnik zmienności (CV) niż piki DNA zwykle uzyskiwane za pomocą innych barwników DNA, np. DRAQ519. Rzeczywiście, Hoechst może barwić DNA nawet w żywych komórkach20.

Zastosowano pewne strategie, aby uniknąć wahań intensywności Hoechsta w różnych próbkach tego samego eksperymentu. Barwienie metodą Hoechsta przeprowadzono tuż przed pobraniem próbki za pomocą cytometru przepływowego, aby zminimalizować spadek intensywności barwnika w czasie. Dla osób zainteresowanych odtworzeniem protokołu w dużych eksperymentach z wieloma próbkami, zalecamy wykonanie barwienia Hoechst na kilku próbkach jednocześnie. Inną wadą jest to, że intensywność Hoechsta może być silnie uzależniona od liczby komórek podczas inkubacji z barwnikiem. Z tego powodu zdecydowanie zalecamy, aby do barwienia DNA zawsze używać tej samej liczby komórek i tej samej objętości na próbkę. Jeśli do pobrania za pomocą cytometru przepływowego wymagana jest duża liczba komórek, zalecamy przygotowanie dwóch lub więcej identycznych próbek, a następnie połączenie ich tuż przed etapem barwienia Hoechsta.

Kluczowym punktem protokołu jest strategia bramkowania do analizy danych. Niedawno opublikowaliśmy nową strategię analizy limfocytów T we wczesnych okresach odpowiedzi immunologicznej, co pozwoliło nam zwiększyć czułość wykrywania limfocytów T specyficznych dla antygenu12. Zastosowaliśmy tę strategię do danych pokazanych tutaj w następujący sposób. Po pierwsze, wykluczyliśmy agregacje komórkowe na wykresie DNA-A/W. Po drugie, po bramkowaniu martwych komórek, użyliśmy dość dużej bramki limfocytów na wykresie FSC/SSC ("bramka zrelaksowana"). Dzięki tej strategii byliśmy w stanie włączyć wysoce aktywowane limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu w S-G2 / M, które zwykle są pomijane przez obecne strategie bramkowania, ponieważ komórki te mają wysokie FSC-A i SSC-A. Podsumowując, analiza danych stanowi krytyczną część metody, która jest niezbędna do uzyskania czułego wykrywania aktywowanych/proliferujących limfocytów T specyficznych dla antygenu.

Metoda zapobiega możliwości pominięcia krytycznych danych dotyczących limfocytów T we wczesnych fazach odpowiedzi immunologicznej i otwiera nowe perspektywy dla immunologicznego monitorowania limfocytów T. Przyszłym ulepszeniem może być włączenie barwienia fosfohistonem 3, które umożliwiłoby różnicowanie między G2 i M21. Obecnym ograniczeniem jest to, że komórki muszą być utrwalone i przepuszczalne, aby wybarwić marker jądrowy, Ki67. W związku z tym komórki nie mogą być używane do innych rodzajów analiz, takich jak sortowanie i późniejsza analiza funkcjonalna. Co więcej, barwniki DNA, w tym Hoechst, zwykle zakłócają analizę genomowego DNA i nie nadają się do tego typu oceny. Identyfikacja markerów błonowych, które korelują z różnymi fazami cyklu komórkowego i które mogą być barwione na żywych komórkach, może przezwyciężyć to ograniczenie. Podsumowując, metoda ta ma ogromny potencjał w ocenie aktywowanych/proliferujących limfocytów T w kilku kontekstach, takich jak szczepienia, infekcje, choroby o podłożu immunologicznym i immunoterapia.

Oświadczenia

A. Folgori i S. Capone są pracownikami Reithera Srl. A. Nikozja zostaje wymieniony jako wynalazca w zgłoszeniu patentowym WO 2005071093 (A3) "Nosiciele szczepionki adenowirusa szympansów". Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Reithera, przez projekt MIUR 2017K55HLC_006 oraz przez grant 5 × 1000 od Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC). Następujący tetramer został uzyskany przez NIH Tetramer Facility: APC-sprzężony H-2K (d) HIV gag 197-205 AMQMLKETI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-200 μ L uniwersalne końcówki do pipet pakowane luzemCorning CLS4866-1000EA
2.4G2 anty-Fcγ R mAb BD55314110 μ g/ml stężenie końcowe
5 ml tłok strzykawkiBD Szmaragd 
Probówki stożkowe 15 mlMercK Millipore 
60 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TCFalcon353002
70 μ Filtr siatkowy M Falcon352097
96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna, mikropłytka hodowlana z powłoką TCFalcon 
Ig,k/Cząstki kompensacyjne kontroli negatywnej przeciw szczurom/chomikomBD- Bioscience552845
Beta-merkaptoetanol   SigmaM3148
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA07030
BUV805 Szczurzy środek przeciw myszom CD8a BD- Nauki biologiczne5649204 μ g/ml stężenie końcowe
Bufor fosforanowy Dulbecco Sól fizjologiczna bez wapnia bez magnezu EurocloneECB4004L 
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mlEppendorf30120159
EtanolSigma34852-1L-M
Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) Sigma E7889
Surowica bydlęcapłodu Corning35-079-CV
Filcon, sterylna, strzykawka typu 70 μ mSokół 352350
Możliwy do utrwalenia barwnik żywotności eFluor 780eBioscience65-0865-141:1000 końcowe stężenie
Foxp3 / zestaw barwiących czynnik transkrypcyjnyeBioscience00-5523-00Ten zestaw zawiera koncentrat i rozcieńczalnik do utrwalania/przepuszczalności oraz bufor permeabilacyjny 10x
H-2k(d) AMQMLKETI allofikocyjanin (APC)znakowany tetramerem dostarczonym przez NIH Tetramer Core Facility6 μ g/ml stężenie końcowe
H-2k(d) AMQMLKETI fikoerytryna (PE) znakowana pentameremProimmune F176-2A-E - 17610 μ L / próbka 
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg/ml roztwór w wodziePrzeciwciałoH3570
Ki-67 (SolA15), FITCeBioscience11-5698-825 μ g/ml stężenie końcowe
L-Glutamina 100X (200 mM)EurocloneECB3000D 
Filtry Millex-HA 0,45 &mikro; mBD340606
Penicylina/Streptomycyna 100XEuroklonECB3001D 
PE/Cyjanina7 Przeciwciało anty-mysie CD62LBiolegend 1044180,2 & mu; g/ml stężenie końcowe
PerCP-Cy&handel; 5.5 Chomik Anty-Myszy CD3e BD- Nauki biologiczne5511634.4 μ g/ml stężenie końcowe
Bufor do lizy czerwonych krwinekSigmaR7757
Probówki z polistyrenu okrągłodennego, 5 mlFalcon 
RPMI 1640 Medium bez L-Glutaminy z Fenolem CzerwonymEuroklonemECB9006L 
Pakiet oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowejFlowJov.10
Oprogramowanie do pobierania próbek za pomocą cytometru przepływowegoBD FACSDiva v 6.2
Roztwór błękitu trypanowegoEurocloneECM0990D
307733SBHA025SB353077 monoklonalne ThermoFisher 352058

Bibliografia

  1. Castellino, F., et al. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).
  2. Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).
  3. Bajénoff, M., et al. Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).
  4. Bevan, M. J., Fink, P. J. The CD8 response on autopilot. Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).
  5. Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Beverley, P. C. Primer: making sense of T-cell memory. Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).
  8. Parretta, E., et al. CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow. Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).
  9. Di Rosa, F. Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation. Nature Review Immunology. 16 (4), 271(2016).
  10. Di Rosa, F. Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory. Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).
  11. Di Rosa, F. Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription. Frontiers in Immunology. 7, 102(2016).
  12. Simonetti, S., et al. Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination. Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735(2019).
  13. Wilson, A., et al. c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation. Genes & Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).
  14. Hirche, C., et al. Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo. Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).
  15. Colloca, S., et al. Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species. Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).
  16. Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
  17. Di Lullo, G., et al. The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use. Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).
  18. Mouse phenotype. , Available from: https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i (2020).
  19. Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus. PLoS One. 5 (11), 15423(2010).
  20. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  21. Vignon, C., et al. Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot. PLoS One. 8 (7), 68425(2013).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice
Posted by JoVE Editors on 11/03/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice. The Authors section and a figure were updated.

The authors section was updated from:

Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR),
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”,
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia,
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II,
5Reithera Srl
* These authors contributed equally

To:

Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR),
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”,
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia,
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II,
5Reithera Srl
6IRCCS, Neuromed
* These authors contributed equally

Figure 1 was updated from:

Lymph node, spleen, bone marrow flow cytometry workflow; staining, fixation, data analysis diagram.
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. Please click here to view a larger version of this figure.

To:

Flow cytometry process diagram; lymph node and bone marrow cell staining, Ki67, DNA with Hoechst 33342.
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Barwienie DNAoznaczenie Ki67multimer MHC peptydstrategia bramkowaniaHoechst 33342w z y ch onne ledziego
Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.