Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie specyficznych dla miejsca cytotoksycznych koniugatów białkowych za pomocą chemii maleimidowo-tiolowej i ligacji za pośrednictwem sortazy A

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61918

⸱

5 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Protein Engineering, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, 2Department of Protein Biotechnology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły specyficznego dla miejsca znakowania białek za pomocą leków cytotoksycznych za pomocą reakcji maleimid-tiol i ligacji za pośrednictwem sortazy A.

Streszczenie

Rak jest obecnie drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie. Cechą charakterystyczną komórek nowotworowych jest obecność na ich powierzchni specyficznych białek markerowych, takich jak receptory czynnika wzrostu. Ta cecha umożliwia rozwój wysoce selektywnych środków terapeutycznych, biokoniugatów białkowych, składających się z docelowych białek (przeciwciał lub ligandów receptorowych) połączonych z wysoce cytotoksycznymi lekami za pomocą specyficznego łącznika. Ze względu na bardzo wysokie powinowactwo i selektywność białek celujących, biokoniugaty rozpoznają białka markerowe na powierzchni komórek nowotworowych i wykorzystują endocytozę za pośrednictwem receptora, aby dotrzeć do wnętrza komórki. Wewnątrzkomórkowy system transportu pęcherzykowego ostatecznie dostarcza biokoniugaty do lizosomów, gdzie proteoliza oddziela wolne leki cytotoksyczne od białkowego rdzenia biokoniugatów, wywołując lekoniezależną śmierć komórek rakowych. Obecnie istnieje kilka biokoniugatów białkowych zatwierdzonych do leczenia raka, a duża liczba z nich jest w trakcie opracowywania lub badań klinicznych.

Jednym z głównych wyzwań w tworzeniu biokoniugatów jest specyficzne dla miejsca przyłączenie leku cytotoksycznego do białka docelowego. Ostatnie lata przyniosły ogromny postęp w opracowywaniu chemicznych i enzymatycznych strategii modyfikacji białek za pomocą leków cytotoksycznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły specyficznego dla miejsca włączenia głowic cytotoksycznych do białek docelowych przy użyciu metody chemicznej wykorzystującej chemię maleimidowo-tiolową oraz podejście enzymatyczne, które opiera się na ligacji za pośrednictwem sortazy A. Używamy zmodyfikowanego wariantu czynnika wzrostu fibroblastów 2 i fragmentu krystalizującego regionu ludzkiej immunoglobuliny G jako przykładowych białek docelowych oraz monometyloaurystatyny E i metotreksatu jako modelowych leków cytotoksycznych. Wszystkie opisane strategie pozwalają na wysoce efektywne generowanie biologicznie aktywnych koniugatów cytotoksycznych o określonej architekturze molekularnej, z potencjałem do selektywnego leczenia różnych nowotworów.

Wprowadzenie

Dziesięciolecia wysiłków naukowych doprowadziły do ogromnego postępu w naszej wiedzy na temat molekularnych mechanizmów rządzących rozwojem i progresją raka. Jednocześnie możliwości terapeutyczne są nadal w dużej mierze ograniczone ze względu na niekorzystne działanie leków spowodowane ich brakiem selektywności, dużą zmiennością nowotworów oraz lekoopornością rozwijającą się po długotrwałym leczeniu. Celowane terapie przeciwnowotworowe zyskują w ostatnich latach coraz większą uwagę jako nowatorskie i bardzo obiecujące podejścia do leczenia różnych nowotworów. Terapie celowane opierają się na wyrafinowanych systemach dostarczania leków, które precyzyjnie dostarczają ładunek cytotoksyczny do komórek nowotworowych i oszczędzają zdrowe. Należą do nich głównie różnorodne nanocząstki, liposomy i nośniki leków na bazie białek.

Komórki nowotworowe często wykazują podwyższony poziom specyficznych białek markerowych na swojej powierzchni. Przeciwciała konfiugaty leków (ADC) to nowatorskie terapie przeciwnowotworowe oparte na białkach, które łączą w jednej cząsteczce ekstremalną specyficzność przeciwciał monoklonalnych i wysoką siłę cytotoksyczną leków. Po związaniu z powierzchnią komórki rakowej, ADC wykorzystuje endocytozę za pośrednictwem receptora, aby dostać się do komórki. Następnie ADC są transportowane przez przedziały endosomalne do lizosomów, gdzie proteazy rozkładają ADC i uwalniają aktywne leki cytotoksyczne. Obecnie w USA zatwierdzono osiem ADC do leczenia różnych nowotworów, w tym potrójnie ujemnego raka piersi, HER2-dodatniego raka piersi, raka urotelialnego, chłoniaka rozlanego z dużych komórek B, nowotworu hematologicznego, chłoniaka Hodgkina i ostrej białaczki szpikowej. Duża liczba przetworników ADC jest również w fazie rozwoju lub oczekuje na zatwierdzenie1. Warto zauważyć, że podejścia oparte na inżynierii białkowej doprowadziły do opracowania różnorodnych alternatyw dla przeciwciał monoklonalnych: rusztowań białkowych i ich cytotoksycznych koniugatów. Należą do nich różne fragmenty przeciwciał2,3, DARPins4,5, knottins6,7, centyrins8, affibodies9,10, lub inżynierskie ligandy receptorów11,12.

Istnieje kilka krytycznych wymagań, które musi spełnić udany koniugat cytotoksyczny oparty na białku, a mianowicie stabilność koniugatu, niezwykła specyficzność, wysokie powinowactwo koniugatu do markera specyficznego dla raka, szybka internalizacja koniugatu do wnętrza komórki rakowej, jego efektywny transport do lizosomów i skuteczne wewnątrzkomórkowe uwalnianie aktywnego ładunku. Kolejną ważną cechą jest jednorodność koniugatów, która w dużej mierze zależy od zastosowanej strategii przyłączania ładunku do docelowych białek. Dostępnych jest kilka metod koniugacji białek z lekami cytotoksycznymi, takich jak modyfikacja reszt cysteiny lub lizyny w łańcuchu bocznym białka, przyłączenie leku do nienaturalnych aminokwasów włączonych do białek docelowych lub modyfikacje enzymatyczne białek docelowych (np. z transglutaminazą, glikozylotransferazą, enzymem wytwarzającym formyloglicynę, sortazą A). W większości przypadków metody koniugacji specyficznej dla miejsca wymagają modyfikacji cząsteczek docelowych (np. poprzez inżynierię cysteiny lub wprowadzenie krótkich znaczników peptydowych), ale z kolei skutkują wydajną produkcją jednorodnego koniugatu będącego przedmiotem zainteresowania.

Tutaj udostępniamy protokoły wysoce efektywnej koniugacji białek docelowych z lekami cytotoksycznymi. Jako przykładowe białka wykorzystaliśmy dwie różne cząsteczki: fragment krystalizujący (Fc) ludzkiej IgG oraz zmodyfikowany wariant ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2). Fragment Fc stanowi integralną część typowych ADC, ale jest również obecny w innych typach koniugatów, takich jak peptyciała cytotoksyczne lub koniugaty fragmentów przeciwciał. FGF2 to ligand naturalnego receptora czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR), który został z powodzeniem zmodyfikowany w celu uzyskania selektywnego koniugatu cytotoksycznego ukierunkowanego na nadprodukcję komórek rakowych FGFR.

Prezentujemy dwie różne strategie koniugacji, pozwalające na specyficzne dla danego miejsca wprowadzanie leków cytotoksycznych. Po pierwsze, podano protokół koniugacji z łańcuchami bocznymi cysteiny fragmentu Fc za pomocą chemii maleimidowo-tiolowej w oparciu o protokół Hermansona13 (Rysunek 1A,B). W tym protokole dwa wiązania dwusiarczkowe są początkowo redukowane tris(2-karboksyetylo)fosfiną (TCEP), a powstałe wolne grupy tiolowe są poddawane koniugacji z monometyloaurystatyną E (MMAE) za pomocą chemii maleimidowo-tiolowej (Rysunek 1B). Ze względu na oddziaływanie między stałymi domenami łańcuchów ciężkich 2 i 3 (CH2 i CH3) zachowana jest dimeryczna struktura Fc związanego z lekiem. Po drugie, przedstawiono strategię generowania koniugatu FGF2 z podwójną głowicą bojową, która łączy inżynierię cysteinową i ligację za pośrednictwem sortazy A w celu włączenia dwóch różnych leków do FGF2 w sposób specyficzny dla miejsca (Rysunek 1A,C). Używany jest wariant FGF2 wolny od cysteiny z dodatkowym N-końcowym KCKSGG z pojedynczą odsłoniętą resztą cysteiny i C-końcowym krótkim znacznikiem peptydowym LPETGG 12. Reakcja maleimid-tiol pozwala na koniugację MMAE z cysteiną w łączniku KCKSSG zaprojektowanym przez naszą grupę14,15. Krok zależny od sortazy A (na podstawie Chen i wsp.)16 pośredniczy w ligacji peptydu tetraglicyny GGGG-MTX połączonego z metotreksatem (MTX) do C-końcowej sekwencji LPETGG, dając dwa rodzaje koniugatów pojedynczej głowicy (Rysunek 1C). Sortaza A to proteaza cysteinowa, która katalizuje reakcję transpeptydu między motywami LPETGG i GGGG. Enzym wiąże się z motywem LPETGG na C-końcu białka, a następnie wiązanie amidowe między treoniną a glicyną ulega hydrolizie, tworząc kompleks enzymato-substrat. Kolejnym krokiem jest aminoliza wiązania enzym-substrat tioestr, gdzie donorem pierwszorzędowej grupy aminowej jest reszta glicyny motywu tetraglicyny17. Połączenie tych dwóch podejść pozwala na uzyskanie specyficznych dla danego miejsca koniugatów podwójnych głowic bojowych FGF2 (Rysunek 1C). Zasadniczo, pod warunkiem, że protokoły koniugacji mogą być z powodzeniem stosowane do dowolnego zmodyfikowanego białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania w celu wygenerowania selektywnych koniugatów cytotoksycznych. Co więcej, wszechstronność tego podejścia sprawia, że nadaje się ono do wielu innych celów ligacji białko-białko i białko-peptyd, a także do przyłączania lipidów, polimerów, kwasów nukleinowych i fluoroforów do białek z dostępną grupą sulfhydrylową (lub generowanych przez redukcję natywnych wiązań dwusiarczkowych) i/lub z wprowadzonym małym znacznikiem peptydowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Koniugacja domeny FC z MMAE

UWAGA: Przed koniugacjami specyficznymi dla danego miejsca przygotuj kluczowe odczynniki: wysoce czyste białko będące przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku fragment Fc i zmodyfikowany wariant FGF2, jako punkt wyjścia 1-5 mg białka rekombinowanego, przygotowane zgodnie z klasą Sokołowska-Wędzina18), alkohol maleimimidocaproyl-Val-Cit-p-aminobenzyl (PABC)-monometyloaurystatyna E (MMAE) (UWAGA, wysoce cytotoksyczny środek, należy obchodzić się z nim ostrożnie), tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP) i sortaza A16. Metotreksat połączony z peptydem tetraglicyny (GGGG-MTX) (UWAGA, MTX jest środkiem wysoce cytotoksycznym, należy obchodzić się z nim ostrożnie) może być syntetyzowany w stałej fazie nośnej zgodnie z metodą syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS) w strategii Fmoc 19 lub pozyskiwany ze źródeł komercyjnych.

  1. Aby zredukować wiązania dwusiarczkowe we fragmencie Fc (Rysunek 1), dodaj dziesięciokrotny nadmiar molowy TCEP nad białkiem Fc (39 μM) w PBS (100 mM NaCl, 18 mM NaH2PO4, 33 mM Na2HPO4 pH 7,4) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Roztwór podstawowy TCEP powinien mieć pH dostosowane z 0,1 M NaOH do 6,0, w celu zapobieżenia wytrącaniu się białek w wyniku zmian pH.
  2. Po inkubacji przefiltrować zredukowane białko za pomocą filtra 0,2 μm w celu usunięcia osadów białkowych.
  3. Do nowej probówki reakcyjnej dodać najpierw czterokrotny nadmiar molowy MMAE (rozpuścić MMAE w N,N-dimetyloacetamidowym (DMAc), aby przygotować 40 mM roztwór podstawowy) na grupach białkowych -SH. Następnie dodać podwójną objętość buforu PBS w stosunku do objętości białka Fc. Na koniec dodaj zredukowany fragment Fc z kroku 1.2.
    UWAGA: Na tym etapie ważna jest kolejność dodawania odczynników.
  4. Przeprowadzić reakcję koniugacji przez noc w temperaturze 15 °C z delikatnymi obrotami. Te łagodne warunki zapobiegają denaturacji białek.
  5. Przefiltrować roztwór ze sprzężeniem za pomocą filtra 0,2 μm w celu usunięcia potencjalnych osadów.
  6. Wykonaj SDS-PAGE, aby przeanalizować skuteczność reakcji. Użyj 10% żelu separacyjnego, markera białkowego 10 – 250 kDa i przeanalizuj pasma między 35 a 50 kDa (Rysunek 2).
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a mieszaninę reakcyjną przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania. Jednak zamrażanie i rozmrażanie może powodować dodatkowe opady i zmniejszać wydajność oczyszczania sprzężonego.
  7. Załadować mieszaninę reakcyjną do kolumny z kulkami sprzężonymi z białkiem A i zmyć nadmiar MMAE buforem myjącym 1 zawierającym 300 mM NaCl, 18 mM NaH2PO4, 33 mM, Na2HPO4, 0,1% Tween 20, 2 mM EDTA pH 7,4. Następnie przepłukać kolumnę za pomocą buforu płuczącego 2 o stężeniu 650 mM NaCl, 18 mM NaH2PO4, 33 mM Na2HPO4, pH 7,4,
    UWAGA: Poprzez selektywne oddziaływanie regionu Fc koniugatu z białkiem A na kulkach, koniugat jest wychwytywany na kolumnie, podczas gdy nieprzereagowane MMAE jest wypłukiwane. Ten krok jest konieczny do uzyskania wysoce czystego sprzężenia.
  8. Eluować koniugat Fc-MMAE z kolumny za pomocą 0,1 M cytrynianu sodu o pH 3,5 do 1,5 ml probówek zawierających 1 M Tris pH 9,0 (1 ml białka na 200 μl 1 M Tris pH 9,0).
  9. Odsolić Fc-MMAE do PBS pH 7,4 za pomocą kolumny z żywicą Sephadex G-25. Ten etap zapobiega denaturacji koniugatu i pozwala na jego użycie w testach in vitro i in vivo.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  10. Wykonaj SDS-PAGE (10%), aby przeanalizować końcowy koniugat Fc-MMAE. Użyj 10% żelu separacyjnego, markera białkowego 10 – 250 kDa i przeanalizuj pasma między 35 a 50 kDa (Rysunek 2).

2. Koniugacja zaprojektowanego FGF2

  1. Sprzężenie GGGG-MTX z C-końcową sekwencją LPETGG zmodyfikowanego FGF2 poprzez ligację za pośrednictwem sortazy A
    1. Przenieś oczyszczony zmodyfikowany FGF2 zawierający N-końcową sekwencję KCKSGG i C-końcową sekwencję LPETGG (używaną na tym etapie do koniugacji) do buforu reakcyjnego sortazy A (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM CaCl2) za pomocą kolumny z żywicą G-25. Dostosuj stężenie białka do 1 μM za pomocą buforu reakcyjnego sortazy A.
    2. Dodać peptyd GGGG-MTX rozpuszczony w DMAc, bezpośrednio do roztworu białkowego do końcowego stężenia 100 μM.
    3. Dodać sortazę A do końcowego stężenia 0,1 μM i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 15 °C z łagodnymi rotacjami. Stężenia odczynników, które mają być stosowane w etapach 2.1.1-2.1.3, są w dużej mierze determinowane przez wydajność koniugatu, która ma zostać osiągnięta, oraz charakterystykę biochemiczną białka docelowego (skuteczność oczyszczania białka, jego rozpuszczalność i stabilność). Aby uzyskać efektywną reakcję sortazy A, należy użyć punktu początkowego dziesięcio- do stukrotnie niższego stężenia sortazy A niż białka docelowego zawierającego LPETGG i 100 razy wyższego stężenia GGGG-MTX niż białka znakowanego LPETGG.
    4. Załadować mieszaninę reakcyjną na kolumnę Sepharose Heparyny.
    5. Nieprzereagowane cząsteczki zmyć za pomocą 25 mM HEPES pH 7,4.
    6. Eluować produkt reakcji (FGF2. MTX) o pH 25 mM HEPES 7,4 z 2 M NaCl.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    7. Przeanalizuj skuteczność koniugacji za pomocą SDS-PAGE. Użyj 15% żelu separacyjnego, markera białkowego 10 – 250 kDa i przeanalizuj pasma między 15 a 25 kDa (Rysunek 3).
  2. Koniugacja MMAE z N-końcową sekwencją KCKSGG zmodyfikowanego FGF2 poprzez reakcję maleimid-tiol
    1. Odsalono zmodyfikowaną FGF2 zawierającą N-końcową sekwencję KCKSGG i C-końcową sekwencję LPETGG do buforu reakcyjnego (25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM metioniny, 0,1 mM EDTA) przy użyciu kolumny z żywicą Sephadex G-25. Dostosuj stężenie białka do 25 μM za pomocą buforu reakcyjnego.
    2. Rozpuścić MMAE w DMAc, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 40 mM.
    3. Do nowej probówki reakcyjnej dodać najpierw czterokrotny nadmiar molowy MMAE nad grupami białkowymi -SH. Następnie dodać podwójną objętość buforu PBS w stosunku do objętości białka FGF2. Na koniec dodaj białko FGF2.
      UWAGA: W tym kroku ważna jest kolejność dodawania odczynników.
    4. Przeprowadzać reakcję przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C z delikatnymi obrotami.
    5. Mieszaninę reakcyjną załadować na kolumnę karboksymetylo(CM)-sefaroza i zmyć nadmiar niesprzężonego czynnika cytotoksycznego o 25 mM HEPES pH 7,4. Te łagodne warunki zapobiegają denaturacji białek.
    6. Usuń MMAE. FGF2 sprzężony z kolumny o pH 25 mM HEPES pH 7,4 z 0,5 M NaCl.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    7. Przeanalizuj skuteczność koniugacji za pomocą SDS-PAGE. Użyj 15% żelu separacyjnego, markera białkowego 10 – 250 kDa i przeanalizuj pasma między 15 a 25 kDa (Rysunek 3).
  3. Przygotowanie koniugatu z podwójną głowicą bojową anginredowanego FGF2 przy użyciu kombinacji chemii maleimidowo-tiolowej i ligacji za pośrednictwem sortazy A
    UWAGA: W celu wygenerowania koniugatów z podwójnymi głowicami bojowymi zaprojektowanych FGF2 kroki 2.1 i 2.2 są połączone. Pierwsze MMAE. Koniugat FGF2 jest wytwarzany w procesie chemii maleimidowo-tiolowej (krok 2.2) i używany do przyłączania GGGG-MTX z sortazą A do zacisku C znacznika LPETGG MMAE. FGF2 (krok 2.1). Możliwa jest również procedura odwrotna (najpierw koniugacja za pośrednictwem sortazy A, a następnie reakcja maleimid-tiol).
    1. Wykonaj kroki 2.2.1-2.2.7 w celu przygotowania monopodstawionego MMAE. Sprzężenie FGF2.
    2. Wymienić bufor na bufor reakcyjny sortazy A (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM CaCl2) za pomocą kolumny z żywicą Sephadex G-25.
    3. Postępować zgodnie z opisem w pkt 2.1.2-2.1.7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawione protokoły opisują dwie odrębne strategie konjugacji różnych leków cytotoksycznych z interesującymi białkami. Ponadto zaprezentowano kombinację poszczególnych strategii, która umożliwia generowanie cytotoksycznych koniugatów z podwójnym ładunkiem w sposób specyficzny dla konkretnego miejsca.

Jak pokazano na żelach SDS-PAGE na Rysunku 2 (ścieżka 2 vs. 3), reakcja maleimid-tiol pozwala na osiągnięcie niemal 100% wydajności sprzęgania MMAE z fragmentem F...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na duże zainteresowanie projektowaniem selektywnych terapii przeciwko różnym typom nowotworów, istnieje pilna potrzeba opracowania strategii pozwalających na specyficzne dla miejsca przyłączanie różnych ładunków do docelowych białek. Specyficzna dla miejsca modyfikacja białek docelowych ma kluczowe znaczenie, ponieważ zapewnia jednorodność opracowanych bioaktywnych koniugatów, co jest warunkiem wstępnym dla nowoczesnych terapii. Istnieje kilka metod, zarówno chemicznych, jak i enzymatycznych, które pozwalają n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Pierwszy ZESPÓŁ oraz programy reintegracyjne Fundacji na rzecz Nauki Polskiej (POIR.04.04.00-00-43B2/17-00; POIR.04.04.00-00-5E53/18-00) współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego, przyznanego L.O i A.S. M.Z prace były wspierane przez OPUS (2018/31/B/NZ3/01656) i Sonata Bis (2015/18/E/NZ3/00501) z Narodowego Centrum Nauki. Prace A.S.W. były wspierane przez grant Miniatura Narodowego Centrum Nauki (2019/03/X/NZ1/01439).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CM-Sepharose kolumnaSigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USACCF100
Heparyna Kolumna SepharoseGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE17-0407-01
HiTrap Kolumna odsalającaGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE17-1408-01
Kolumna HiTrap MabSelect SuReGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE11-0034-93
maleimidocaproyl-Val-Cit-PABC-monometyloaurystatyna E (MMAE)MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-100374Toksyczny
N,N-dimetyloacetamid (DMAc)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA185884
Tris(2-karboksetylo)fosfina (TCEP)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA646547

Bibliografia

  1. Bethany, H. A new generation of antibody-drug conjugates for cancer patients. Chemical & Engineering News. 98 (14), (2020).
  2. Tu, C., et al. A Combination of structural and empirical analyses delineates the key contacts mediating stability and affinity increases in an optimized biotherapeutic single-chain Fv (scFv). Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1267-1276 (2016).
  3. Sokolowska-Wedzina, A., et al. High-affinity internalizing human scFv-Fc antibody for targeting FGFR1-overexpressing lung cancer. Molecular Cancer Research. 15 (8), 1040-1050 (2017).
  4. Seeger, M. A., et al. construction, and characterization of a second-generation DARPin library with reduced hydrophobicity. Protein Science. 22 (9), 1239-1257 (2013).
  5. Deyev, S., et al. Synthesis, characterization, and selective delivery of DARPin-gold nanoparticle conjugates to cancer cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (10), 2569-2574 (2017).
  6. Currier, N. V., et al. Targeted drug delivery with an integrin-binding Knottin-Fc-MMAF conjugate produced by cell-free protein synthesis. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (6), 1291-1300 (2016).
  7. Cox, N., Kintzing, J. R., Smith, M., Grant, G. A., Cochran, J. R. Integrin-targeting knottin peptide-drug conjugates are potent inhibitors of tumor cell proliferation. Angewandte Chemie International Edition. 55 (34), 9894-9897 (2016).
  8. Goldberg, S. D., et al. Engineering a targeted delivery platform using Centyrins. Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 563-572 (2016).
  9. Altai, M., et al. Affibody-derived drug conjugates: Potent cytotoxic molecules for treatment of HER2 over-expressing tumors. Journal of Controlled Release. 288, 84-95 (2018).
  10. Sochaj-Gregorczyk, A. M., Serwotka-Suszczak, A. M., Otlewski, J. A Novel affibody-Auristatin E conjugate with a potent and selective activity against HER2+ cell lines. Journal of Immunotherapy. 39 (6), 223-232 (2016).
  11. Szlachcic, A., Zakrzewska, M., Lobocki, M., Jakimowicz, P., Otlewski, J. Design and characteristics of cytotoxic fibroblast growth factor 1 conjugate for fibroblast growth factor receptor-targeted cancer therapy. Drug Design, Development and Therapy. 10, 2547-2560 (2016).
  12. Krzyscik, M. A., Opaliński, Ł, Otlewski, J. Novel method for preparation of site-specific, stoichiometric-controlled dual warhead conjugate of FGF2 via dimerization employing sortase A-mediated ligation. Molecular Pharmaceutics. 16 (8), 3588-3599 (2019).
  13. Hermanson, G. T. The Reactions of bioconjugation. Bioconjugate Techniques. , 229-258 (2013).
  14. Lobocki, M., et al. High-yield site-specific conjugation of fibroblast growth factor 1 with monomethylauristatin e via cysteine flanked by basic residues. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 1850-1858 (2017).
  15. Krzyscik, M. A., et al. Cytotoxic conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with monomethyl auristatin e for effective killing of cells expressing FGF receptors. ACS Omega. 2 (7), 3792-3805 (2017).
  16. Chen, I., Dorr, B. M., Liu, D. R. A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11399-11404 (2011).
  17. Weiner, E. M., Robson, S., Marohn, M., Clubb, R. T. The sortase A enzyme that attaches proteins to the cell wall of Bacillus anthracis contains an unusual active site architecture. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 23433-23443 (2010).
  18. Sokolowska-Wedzina, A., et al. Efficient production and purification of extracellular domain of human FGFR-Fc fusion proteins from Chinese hamster ovary cells. Protein Expression and Purification. 99, 50-57 (2014).
  19. Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society. 85 (14), 2149-2154 (1963).
  20. Chen, Y. Drug-to-antibody ratio (DAR) by UV/Vis spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1045, 267-273 (2013).
  21. Falck, G., Müller, K. M. Enzyme-based labeling strategies for antibody-drug conjugates and antibody mimetics. Antibodies. 7 (1), Basel, Switzerland. 4(2018).
  22. Shental-Bechor, D., Arviv, O., Hagai, T., Levy, Y. Folding of conjugated proteins. Annual Reports in Computational Chemistry. , Elseiver. 263-277 (2010).
  23. Bigman, L. S., Levy, Y. Entropy-enthalpy compensation in conjugated proteins. Chemical Physics. 514, 95-105 (2018).
  24. Danielsson, J., et al. Thermodynamics of protein destabilization in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (40), 12402-12407 (2015).
  25. Świderska, K. W., Szlachcic, A., Czyrek, A., Zakrzewska, M., Otlewski, J. Site-specific conjugation of fibroblast growth factor 2 (FGF2) based on incorporation of alkyne-reactive unnatural amino acid. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 25 (14), 3685-3693 (2017).
  26. Krzyscik, M. A., Zakrzewska, M., Otlewski, J. Site-specific, stoichiometric-controlled, PEGylated conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with hydrophilic auristatin Y for highly selective killing of cancer cells overproducing fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1). Molecular Pharmaceutics. 17 (7), 2734-2748 (2020).
  27. Borek, A., Sokolowska-Wedzina, A., Chodaczek, G., Otlewski, J. Generation of high-affinity, internalizing anti-FGFR2 single-chain variable antibody fragment fused with Fc for targeting gastrointestinal cancers. PLOS ONE. 13 (2), 0192194(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biokoniugaty białkowekoniugacja specyficzna względem miejscacytotoksyczne ładunkiczynnik wzrostu fibroblastów 2fragment Fc immunoglobulin Gmonometyloaurystatyna Emetotreksatendocytoza zależna od receptora

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.