Artykuł metodologiczny

Ocena in vivo klirensu śluzowo-rzęskowego u myszy

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61929

⸱

18 grudnia 2020

 , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W tej publikacji opisujemy protokoły oceny klirensu śluzowo-rzęskowego dróg oddechowych (MCC) u myszy in vivo z wykorzystaniem obrazowania radionuklidów o podwójnej modalności. Protokół ten jest przeznaczony do tomografii komputerowej z emisją pojedynczych fotonów (SPECT) i protokołu akwizycji tomografii komputerowej (CT) przy użyciu mysich kolimatorów całego ciała (MWB) w podwójnym systemie SPECT/CT.

Streszczenie

Ruchliwe rzęski oddechowe, wyspecjalizowane organelle komórki, pokrywają wierzchołkową powierzchnię komórek nabłonka wyściełających drogi oddechowe. Uderzając w metachronalny, synchroniczny sposób, te liczne, ruchliwe organelle na bazie aktyny generują przepływ płynu głowowego, oczyszczając drogi oddechowe z wdychanych zanieczyszczeń i patogenów. Wraz z rosnącym zanieczyszczeniem środowiska, nowymi patogenami wirusowymi i pojawiającymi się bakteriami wielolekoopornymi, klirens śluzowo-rzęskowy wytwarzany przez rzęski (MCC) jest niezbędny do utrzymania zdrowia płuc. MCC jest również depresją w wielu wadach wrodzonych, takich jak pierwotna dyskineza rzęsek, mukowiscydoza, a także w zaburzeniach nabytych, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc. Wszystkie te zaburzenia stworzyły, w niektórych przypadkach wiele, modeli mysich. W tej publikacji szczegółowo opisano metodę wykorzystującą niewielką ilość radioaktywności i obrazowanie SPECT/CT w podwójnej modalności w celu dokładnego i powtarzalnego pomiaru MCC u myszy in vivo. Metoda ta pozwala na odzyskanie wartości myszy po obrazowaniu, umożliwiając pomiary seryjne i testowanie potencjalnych terapii w czasie. Dane uzyskane na myszach typu dzikiego wskazują na powtarzalność pomiaru MCC, o ile zwraca się odpowiednią uwagę na szczegóły i ściśle przestrzega się protokołu.

Wprowadzenie

Rzęski to organelle komórkowe oparte na mikrotubulach, zachowane w historii ewolucji, od glonów po ludzi. Emanują one z powierzchni komórek i pełnią szereg funkcji1, począwszy od rozpoznawania lokalnych sygnałów sensorycznych środowiska, a skończywszy na ruchliwości, funkcjach, które można prześledzić wstecz od ludzi do wczesnych jednokomórkowych organizmów eukariotycznych2,3. Rzęski mogą być nieruchome i pojedyncze, służąc jako wyspecjalizowana antena komórki do przetwarzania sygnałów środowiskowych; lub ruchliwe i wielokrotne, bijące w zsynchronizowanych falach metachronalnych w celu wytworzenia przepływu płynu, na przykład w błonie śluzowej jajowodów oraz górnych i dolnych drogach oddechowych, z wyjątkiem końcowych oskrzelików prowadzących do pęcherzyków płucnych1,2.

Rozległa powierzchnia nabłonka dróg oddechowych jest narażona na ciągły zaporę zanieczyszczeń w postaci różnych potencjalnie niebezpiecznych wdychanych zanieczyszczeń i patogenów, co wymaga obrony. Jednym z kluczowych mechanizmów obronnych jest aparat śluzowo-rzęskowy drzewa tchawiczo-oskrzelowego, w którym ciągły przepływ wydzielanego śluzu jest mechanicznie transportowany z dróg oddechowych przez bicie wielu ruchliwych rzęsek wyściełających wierzchołkowe powierzchnie komórek nabłonka tchawicy i oskrzeli. Ich funkcją jest zatrzymywanie wdychanych zanieczyszczeń, a poprzez ich ciągłe, synchroniczne dudnienie, transport ich cephalad4,5.

Wykazano, że rzęski odgrywają kluczową rolę, np. w rozwoju wzorca lewo-prawo w rozwijających się zarodkach, gdzie ruchliwe rzęski w węźle embrionalnym łamią symetrię6. Mutacje w genach związanych z rzęskami zostały powiązane z chorobami, takimi jak wrodzona wada serca (CHD) ze względu na asymetryczną strukturę serca6. Ostatnie badania wykazały wysoką częstość występowania dysfunkcji rzęsek w drogach oddechowych pacjentów z chorobą niedokrwienną serca, a także zwiększoną częstość występowania pooperacyjnych powikłań oddechowych i przewlekłych objawów ze strony dróg oddechowych w górnych i dolnych drogach oddechowych7,8,9,10. Wykazano, że pacjenci z chorobą niedokrwienną serca i dysfunkcją rzęsek, z heterotaksją lub bez, mają zwiększone ryzyko powikłań oddechowych i negatywnych wyników oddechowych po operacji5,8,10. Poza ich rolą w sygnalizacji i rozwoju, znaczenie rzęsek dróg oddechowych zostało wykazane przez ciliopaty, których doskonałym przykładem jest pierwotna dyskineza rzęsek (PCD). PCD jest wrodzoną chorobą wynikającą z szeregu mutacji wpływających na ruchliwe rzęski oddechowe, prowadzących do nawracających infekcji płuc, rozstrzeni oskrzeli i potencjalnie konieczności przeszczepu płuc11. Dodatkowo, mimo że rzęski są normalne w mukowiscydozie (CF), najczęstszym zaburzeniu wrodzonym w populacji kaukaskiej, MCC jest upośledzone z powodu gęstego, lepkiego śluzu wynikającego z mutacji w genie CFTR 12. Istnieje wiele mysich modeli PCD i CF, a także stale rosnąca liczba modeli CHD. Ostatecznie rzęski są wszechstronnymi strukturami pełniącymi wiele kluczowych ról, a metoda oceny funkcji ruchliwych rzęsek oddechowych in vivo może być cenna dla badań przedklinicznych i oceny wpływu mutacji oraz leków na klirens śluzowo-rzęskowy (MCC)13. Metoda ta byłaby również cenna w ocenie wpływu nowych leków, terapii genowej lub interwencji na MCC w tych modelach mysich.

Istnieje wiele różnych modeli, które zostały użyte do oceny MCC. Jedna z godnych uwagi metod polega na użyciu barwnika błękitu metylenowego, który został wkroplony do oskrzeli, z klirensem mierzonym za pomocą światłowodowego pomiaru ruchu barwnika14. Metoda ta jest ograniczona możliwością obserwacji ruchu barwnika, co jest bardziej rutynowe u ludzi niż w przedklinicznych modelach mysich. Inną godną uwagi metodą jest synchrotronowe obrazowanie rentgenowskie z kontrastem fazowym (PCXI), które można wykorzystać do śledzenia pojedynczych cząstek w drogach oddechowych. Ta metoda jest stosunkowo nowa i nie jest powszechnie dostępna15. Istnieje wiele metod oceny ex vivo dróg oddechowych poprzez wycięcie tchawicy do wideomikroskopii, jednak modele te są mało użyteczne u ludzi16. Techniki obrazowania rzęsek o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna tomografia koherentna, są ograniczone w ten sam sposób17.

W tym artykule prezentujemy powtarzalną metodę pomiaru MCC in vivo, która została wykorzystana do pomiaru klirensu płuc w niezliczonych modelach zwierzęcych, a także do badania MCC w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc i oceny efektów leków immunosupresyjnych18,19. Metoda ta śledzi klirens radiofarmaceutyku 99mkoloidu technetowo-siarkowego (99mTc-Sc), nierozpuszczalnego radioznacznika cząstek, po wkropleniu do płuc. Radionuklid może być następnie śledzony za pomocą tomografii komputerowej emisji pojedynczych fotonów (SPECT)18,20. Udoskonaliliśmy tę technikę pomiaru MCC, stosując dwumodalność SPECT i obrazowanie tomografii komputerowej (CT) z kolokalizacją liczby radioizotopów do płuc i mierząc spadek tych liczb w ciągu 6 godzin. Obrazowanie dwumodalne, z jednoczesną rejestracją obrazów CT i SPECT, pozwala na dokładną lokalizację liczby promieniowania w naszym obszarze zainteresowania, czyli płucach. Chociaż szczegółowo opisujemy metodę pomiaru MCC u myszy, protokół można dostosować do badania MCC u szczurów. Kolimatory musiałyby być wyregulowane, podobnie jak dawka promieniowania. Naszym zdaniem, skany MCC u myszy są trudniejsze technicznie ze względu na mały rozmiar zwierzęcia, ale bardziej przydatne niż u szczurów ze względu na dużą liczbę ustalonych mysich modeli wielu zaburzeń u ludzi. Dodatkowo, ze względu na niższy koszt i koszt utrzymania w koloniach zwierzęcych, większy rozmiar próbki jest bardziej wykonalny u myszy.

Protokół

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Pittsburghu zatwierdził wszystkie protokoły na zwierzętach określone w tej publikacji przed podjęciem jakichkolwiek eksperymentów na zwierzętach.

UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje, jak przeprowadzać badania in vivo klirensu śluzowo-rzęskowego z wykorzystaniem obrazowania radionuklidów za pomocą dwumodalnego skanera SPECT/CT. Zademonstrowane techniki obejmują przeprowadzanie kalibracji systemu, znieczulanie myszy, intubację tchawicy myszy, wkraplanie izotopu do płuc, obrazowanie dwumodalne, korejestrację tych obrazów i analizę.

1. Konfiguracja systemu SPECT/CT

  1. Zaprojektuj odpowiedni przepływ pracy i skonfiguruj go przed rozpoczęciem eksperymentów z żywymi zwierzętami.
    1. Należy użyć akwizycji SPECT składającej się z 60 projekcji o wielkości kroku 6o między projekcjami o promieniu obrotu 40 cm. Akwizycja CT składa się z 220 projekcji o kącie 1,6o między projekcjami.
  2. Upewnij się, że system ma odpowiednie kolimatory MWB dla myszy i obrazowania SPECT. Jeśli zainstalowane są nieodpowiednie kolimatory, użyj kreatora kolimatora, aby zainstalować właściwe.
  3. Uruchom niezbędne kalibracje systemu, aby przygotować go do użycia.
    UWAGA: Elementy SPECT i CT skanera wymagają kalibracji. Kalibruj komponenty CT za pomocą kondycjonowania źródła i kalibracji ciemności/światła (D/L) raz dziennie, kalibracji przesunięcia środkowego (COS) co 2 tygodnie i oceniaj sprzęt rentgenowski co miesiąc. Komponenty SPECT muszą być kalibrowane raz w roku.
    1. Aby ocenić sprzęt rentgenowski, zaznacz pole Oceń sprzęt rentgenowski podczas kalibracji tomografii komputerowej (Dodatkowe menu kalibracji tomografii komputerowej).
    2. Aby przeprowadzić kondycjonowanie źródła, zaznacz pole Wykonaj kondycjonowanie źródła podczas kalibracji CT (Dodatkowe menu kalibracji CT).
    3. Aby przeprowadzić kalibrację D/L, zaznacz pole D/L obok protokołu akwizycji CT używanego podczas eksperymentów podczas kalibracji CT. Odznacz wszystkie inne protokoły (Dodatkowe menu kalibracji CT).
    4. Aby przeprowadzić kalibrację COS, zastąp łóżko narzędziem do kalibracji pierścienia, dostosuj ustawienia typu stołu, aby pasowały do ustawień sterowania ruchem, a następnie zaznacz pole COS obok protokołu akwizycji CT używanego podczas eksperymentów podczas kalibracji CT. Odznacz wszystkie inne protokoły (Dodatkowe menu kalibracji CT, Dodatkowy pierścień kalibracyjny).

2. Intubacja i wkraplanie myszy

  1. Zważ myszy, które mają być skanowane. Jeśli skanujesz wiele myszy, pamiętaj, aby oznaczyć myszy w celu identyfikacji za pomocą metod takich jak uderzanie w uszy lub znakowanie ogona.
  2. Znieczulij mysz za pomocą 1,5% izofluranu o przepływie gazu 2 l/min O2 w komorze gazowej przez ~5 minut, aby wytworzyć znieczulenie o wystarczającej głębokości, aż oddech zwolni do ~55-65 oddechów na minutę 16 (Rysunek 1A).
  3. Wyjmij mysz z komory i zawieś za przednie siekacze na stojaku do intubacji pod kątem 45stopni. Wyposaż stanowisko do intubacji w stożek nosowy, aby upewnić się, że mysz jest znieczulona podczas intubacji (Rysunek 1B).
  4. Podłącz jeden koniec przewodu światłowodowego 50 μm do źródła światła i nawlecz na niego kaniulę o średnicy 20 mm, używając drutu jako prowadnicy (Rysunek 1C).
  5. Otwórz usta myszy i pociągnij język do przodu za pomocą kleszczy. Podświetl przewód doprowadzający i użyj go do wizualizacji strun głosowych (Rysunek 1D).
  6. Przeprowadź przewód prowadnikowy przez struny głosowe tak, aby drut znajdował się tuż za strunami głosowymi i spoczywał w górnej tchawicy. Przesuń 1-calową kaniulę do przodu wzdłuż drutu, aby zaintubować mysz, przesuwając kaniulę na tyle głęboko, aby jej piasta przylegała do siekaczy zwierzęcia (Rysunek 1E). Usuń drut, pozostawiając kaniulę na miejscu.
  7. Przetestuj intubację, na krótko zatykając kaniulę palcem i sprawdzając, czy nie ma zmian w oddychaniu. Zatrzymany oddech lub napięty oddech podczas zatykania i przyspieszony oddech po uwolnieniu są oznakami prawidłowej intubacji tchawicy. Jeśli nie ma zmian we wzorcach oddechowych po zatkaniu kaniuli, prawdopodobnie znajduje się ona w przełyku.
  8. Przygotować 0,2 mCi 99mkoloidu technetowo-siarkowego (99mTc-Sc) w objętości 10 μl i pipetować do kaniuli. Pozwól myszy spontanicznie wdychać go do płuc w ciągu 1-2 minut (Rysunek 1F). Wyjmij kaniulę przed przeniesieniem myszy na paletę skanera.
    UWAGA: Radionuklid został przygotowany i przefiltrowany przez Cardinal Health.

3. Obrazowanie SPECT/CT

  1. Przenieś mysz na paletę 25 mm ze stożkiem nosowym i zabezpiecz taśmą, uważając, aby nie zakleić zbyt mocno klatki piersiowej i brzucha, aby uniknąć upośledzenia oddychania. Uważaj, aby usunąć wszelkie metalowe kolczyki przymocowane do myszy.
  2. Przygotować radioaktywny fantom składający się z 0,05 mCi w 200 μl i umieścić tę ilość w probówce do PCR o pojemności 0,2 ml. Umieść rurkę, przyklejając ją taśmą do palety pod dolną częścią brzucha myszy, unikając zachodzenia na płuca.
    UWAGA: Fantom służy do jednoczesnej rejestracji obrazów CT i SPECT, a także kontroli negatywnej w celu uzyskania klirensu.
  3. Włóż mysz do systemu SPECT/CT, wybierz przepływ pracy obrazowania i uruchom instalację.
  4. Skonfiguruj położenie detektorów na myszy i uruchom przepływ pracy z obrazowaniem.
  5. Przygotuj klatkę dla myszy, które otrzymały radioaktywność po zabiegu, z nieograniczonym dostępem do pożywienia i wody oraz wyraźnym oznakowaniem za pomocą naklejki bezpieczeństwa przed promieniowaniem.
  6. Po zakończeniu procesu roboczego wyjmij mysz z palety obrazowania i pozwól jej dojść do siebie w przygotowanej klatce przez okres 6 godzin między skanami (koniec skanowania 1 do początku skanowania 2) z dostępem ad libitum do jedzenia i wody. Wybrano 6 godzin, ponieważ odpowiada to okresowi, w którym klirens liniowy w zależności od funkcji rzęsek zachodzi z bardzo małym klirensem pęcherzyków płucnych.
  7. Po 6 godzinach ponownie znieczulij mysz i zeskanuj ją wraz z fantomem, korzystając z tego samego przepływu pracy, aby zmierzyć ilość izotopu usuniętego z dróg oddechowych.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby umożliwić myszy powrót do zdrowia, ponieważ nieprzerwane znieczulenie izofluranem przez 6 godzin doprowadzi do znaczącego efektu depresyjnego rzęsek, co spowoduje prawie zerowy klirens śluzowo-rzęskowy.

4. Analiza

  1. Po zobrazowaniu wykonaj przetwarzanie końcowe, aby zrekonstruować kompletne obrazy stosu 3D.
    1. Wykonaj histogram obrazów SPECT przy użyciu standardowych ustawień fabrycznych dla 99 mTc, a następnie zrekonstruuj je za pomocą algorytmu MAP3D i rekonstrukcji funkcji rozproszenia punktów (PSF).
      UWAGA: Rekonstrukcję wykonano przy użyciu 8 iteracji i 6 podzbiorów. Skuteczna rekonstrukcja wymaga stosunku podzbiorów do projekcji w stosunku 1:10 lub równomiernego podziału na liczbę rzutów, dlatego ze względu na akwizycję za pomocą 60 projekcji wykorzystano 6 podzbiorów.
    2. Rekonstrukcja obrazów CT za pomocą algorytmu Feldkampa i filtra Sheppa-Logana.
      UWAGA: Rekonstrukcja została wykonana przy użyciu 4 iteracji.
  2. Przetwarzaj obrazy CT i SPECT w FIJI ImageJ21 za pomocą narzędzia do ponownego cięcia, aby wygenerować obrazy widoku koronalnego na podstawie domyślnych obrazów osiowych. Następnie wykonaj projekcję sumy stosu z na obrazie SPECT, aby dodać dane zliczania z każdego wycinka i wygenerować pojedynczy obraz w celu ułatwienia analizy.
  3. Zmień rozmiar i współzarejestruj obrazy CT i SPECT, używając fantomowej rurki Eppendorfa jako odniesienia (Rysunek 2A,B). Śledź i używaj spójnych pomiarów zmiany rozmiaru we wszystkich próbkach.
  4. Binaryzuj obraz CT za pomocą automatycznego progowania, a następnie odwróć stos i wykonaj projekcję sumy stosu z, aby wygenerować zarys płuc do analizy (Rysunek 2C).
  5. Obróć obrazy CT i SPECT i scal obraz za pomocą narzędzi kanału. Oblicz MCC, rysując ROI wokół prawego płuca i mierząc (Rysunek 2D).
    UWAGA: Pomiar ten będzie dotyczył całkowitych zliczeń w prawym płucu dla punktów czasowych 0 i 6 godzin, przy czym obrazy 6-godzinne zostaną skorygowane o rozpad promieniotwórczy przy użyciu wzoru: N(t) = N0e−t. 99 mlnTc-Sc ma stałą rozpadu 3,21e−5 na sekundę z okresem półtrwania ~6 godzin. Wartości te można następnie wykorzystać do obliczenia procentowego luzu.
    UWAGA: Prawe płuco jest wybierane do rysowania ROI i mierzenia liczb, ponieważ klirens śluzowo-rzęskowy przetransportuje radioizotop z płuc do gardła, skąd zostanie połknięty i trafi do żołądka. Dość często można zaobserwować zliczenia w żołądku, który może pokrywać się z lewym płucem, a tym samym powodować błędne liczenia. Tego zamieszania można uniknąć, mierząc liczbę tylko w prawym płucu.

Wyniki

Stosując ten protokół, zanieśćestezjowano myszy w komorze z izofluranem (Rycina 1A). Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia myszy umieszczono na wspornikach pionowych (Rycina 1B), a struny głosowe zwizualizowano za pomocą oświetlonego prowadnika (Rycina 1C-1D). Myszy poddano intubacji i za pomocą kaniuli podano 0,2 mCi 99mTc-Sc w objętości 10 µL, umożliwiając zwierzętom spontaniczne wdechnięcie preparatu do płuc (Rycina 1E-1F). Po akwizycji i przetwarzaniu obrazów, obrazy CT i SPECT skorelowano (Rycina 2A), wykorzystując probówkę fantomową jako punkt orientacyjny (Rycina 2B). Maski płuc wygenerowano z obrazu CT (Rycina 2C) i wykorzystano do wyznaczenia obszarów ROI wokół prawego płuca do analizy w czasie 0 (Rycina 2D) oraz 6 godzin (Rycina 2E-2F). Aby przetestować powtarzalność protokołu, łącznie 8 myszy poddano dwukrotnemu skanowaniu w różne dni w identycznych warunkach doświadczalnych; analiza z użyciem testu t-studenta dla prób zależnych nie wykazała istotnych różnic między powtórzonymi skanami (wartość p=0,9904) (Rycina 3A). Dodatkowe 2 myszy przeskanowano trzykrotnie w różne dni w identycznych warunkach doświadczalnych; analiza z użyciem jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA wykazała istotną zgodność między powtórzonymi skanami (wartość p=0,0041) (Rycina 3B). Przeskanowano łącznie 8 myszy i zaprezentowano dwa reprezentatywne obrazy (Rycina 4).

Proces intubacji gryzonia; sprzęt obejmuje ustnik, rurki, narzędzia chirurgiczne; eksperyment laboratoryjny.
Rycina 1: Intubacja myszy i podanie izotopu. Zdjęcia kroków niezbędnych do intubacji i podania izotopu do dróg oddechowych. A) Mysz zostaje poddana znieczuleniu w komorze. B) Znieczulona mysz zostaje umieszczona na pionowym wsporniku, zawieszona za przednie siekacze. C) Podświetlony światłowód o średnicy 0,5 mm służący jako prowadnica zostaje przygotowany poprzez przełożenie go przez kaniulę 20 G. D) Pyszczek myszy zostaje otwarto pęsetą i oświetlono za pomocą świecącej prowadnicy w celu uwidocznienia strun głosowych. E) Kaniula zostaje przesunięta przez struny głosowe, a prowadnica zostaje usunięta. F) Rozpuszczalny izotop zostaje podany do kaniuli za pomocą pipety, a mysz może spontanicznie wdychać izotop do płuc. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie w medycynie nuklearnej, skan płuc, nałożenie PET-CT, analiza znacznika radioaktywnego, badania onkologiczne.
Rysunek 2: Obrazy SPECT/CT podczas skanu MCC.A) Obraz SPECT, który został współlokalizowany z obrazem CT. B) Obraz CT z widoczną rurką fantomową użytą do współlokalizacji. C) Maska dróg oddechowych uzyskana poprzez binaryzację obrazu CT i wykonanie projekcji sumy stosu z (z-stack sum projection). D) Maska CT współlokalizowana z obrazem SPECT. Dla analizy wyznaczono obszar zainteresowania (ROI) wokół prawego płuca. E) Maska dróg oddechowych po 6 godzinach. F) Współlokalizowany obraz CT i SPECT dróg oddechowych po 6 godzinach z wyznaczonym ROI do analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres prześwitu; wykres liniowy, wykres słupkowy, wartość p; analiza statystyczna, porównywanie danych medycznych.
Rysunek 3: Pomiary klirensu tych samych myszy w obrębie wielu skanów. AZmierzono dwa indywidualne powtórne oczyszczenia dla 8 myszy, nie zmieniając warunków eksperymentalnych. Test t-studenta dla prób zależnych wykazał, że nie było istotnej różnicy między powtórnymi skanami (wartość p = 0,9904). BZmierzono trzy indywidualne powtórne wartości prześwitu dla dwóch myszy, nie wprowadzając żadnych zmian w warunkach eksperymentalnych. Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) wykazała istotną zgodność między powtórnymi skanami przy wartości p równym 0,0041. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Mapa cieplna obrazowania guza, analiza emisji, 0h vs. 6h, opisowe schematy, intensywność fluorescencji.
Rycina 4: Współlokalizowane obrazy SPECT/CT dróg oddechowych w 0. i 6. godzinie u 2 myszy z wyznaczonymi obszarami ROI w 0. i 6. godzinie obrysowującymi prawe płuco. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina dodatkowa 1: Film przedstawiający struny głosowe oświetlone światłowodem z wizualizacją efektu oddychania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurę.

Pliki uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać te pliki.

Dyskusja

Rola ruchliwych rzęsek oddechowych zarówno w chorobie, jak i rozwoju nadal ewoluuje i jest coraz lepiej doceniana. Synchroniczne, metachronalne bicie wielu ruchliwych rzęsek na wierzchołkowej powierzchni komórek wyściełających drzewo tchawiczo-oskrzelowe generuje przepływ głowowy, wytwarzając klirens śluzowo-rzęskowy lub MCC. MCC jest upośledzone w ciliopatiach, takich jak PCD22, chorobach nabytych, takich jak POChP18, a jego znaczenie jest uznawane w chorobach niedokrwiennych serca, które nie są tradycyjnie uważane za ciliopaty. Ostatnie dane wykazały dysfunkcję układu oddechowego rzęsek zarówno w chorobie niedokrwiennej serca z heterotaksją23 , jak i bez heterotaksji7. Wykazano, że taka dysfunkcja ruchliwych rzęsek przekłada się na nasilenie objawów ze strony układu oddechowego9 oraz większą zachorowalność pooperacyjną8. Większość, jeśli nie wszystkie, z tych chorób mają dostępne modele mysie, a nasz protokół pomiaru MCC u myszy jest cennym narzędziem, które można wykorzystać do testowania potencjalnych środków terapeutycznych.

Modele zwierzęce są użyteczne w zrozumieniu chorób i opracowywaniu terapii. Obrazowanie zwierząt in vivo zapewnia dodatkową użyteczność dzięki możliwości pozyskiwania wielu punktów danych od tych samych zwierząt, bez konieczności poświęcania zwierząt, co pozwala badaczom śledzić podłużny przebieg choroby, a także badać czas trwania efektów leczenia. Mysi model MCC był rozwijany przez dziesięciolecia przez wielu badaczy, początkowo wykonywany na psach rasy beagle przy użyciu scyntygrafii planarnej, dwuwymiarowej techniki obrazowania jądrowego24. Technika ta została zaadaptowana do użytku u myszy dziesięć lat później, a następnie została przystosowana do obrazowania SPECT dekadępóźniej25,26. Rozwój tej techniki w modelach mysich był dużym postępem w zakresie znaczenia tej techniki, ze względu na dostępność wielu mysich modeli chorób ludzkich, takich jak PCD, w których funkcja rzęsek jest znacznie zmieniona. MCC oceniano w mysich modelach odnerwienia płuc i immunosupresji i ma potencjał do stosowania w połączeniu z innymi modelami19,26. Przeprowadzono badania pomiarowe MCC u ludzi z chorobami dróg oddechowych, takimi jak mukowiscydoza, astma, PCD i ciliopatie związane z chorobą niedokrwienną serca, które przyniosły wyniki, że technika ta może pomóc zarówno w badaniach nad fizjologią płuc, jak i skutecznością terapeutyczną13.

Ważną częścią tego protokołu jest ustawienie akwizycji z odpowiednimi parametrami obrazowania w celu uzyskania dokładnych obrazów do kwantyfikacji. Podczas projektowania ustawień akwizycji SPECT kluczowych jest wiele czynników, w tym to, które kolimatory są używane, liczba projekcji do uzyskania na obrót i rozmiar kroku obrotu. Wybór kolimatora jest głównym czynnikiem wpływającym na czułość i rozdzielczość akwizycji, a ustawienia akwizycji mogą wymagać dostosowania do używanego kolimatora27. Alternatywnie, w przypadku używania większych zwierząt, takich jak szczury, kolimatory musiałyby zostać dostosowane. Na przykład kolimatory z wieloma otworkami są bardziej czułe, ale należy zachować ostrożność przy wyborze rozmiaru kroku, aby uniknąć nakładania się projekcji i powodowania niepożądanego multipleksowania, co może jeszcze bardziej zwiększyć czułość akwizycji kosztem pewnej niejednoznaczności obrazu, która może powodować artefakty rekonstrukcyjne25. Konfiguracja rekonstrukcji jest również kluczem do generowania wymiernych obrazów. MAP3D jest powszechnie używanym algorytmem rekonstrukcji iteracyjnej, a PSF jest powszechnym modelem rekonstrukcji. Oba są niezawodne do rekonstrukcji obrazów, ale należy zachować ostrożność podczas ustawiania liczby iteracji i podzbiorów. Większa liczba iteracji wydłuży czas obliczeniowy wymagany do rekonstrukcji i poprawi jakość rekonstrukcji przy malejących zyskach przy dalszym wzroście.

Aby określić ilościowo obrazy w ImageJ, idealnym narzędziem pomiarowym jest RawIntDen, który wyprowadza sumę pikseli w zaznaczeniu. Podczas ilościowego określania danych SPECT dla różnych rozmiarów ROI płuc, zastosowanie RawIntDen zapewnia bezwzględną miarę zliczeń i pozwala uniknąć dostosowywania pomiaru do obszaru ROI, tak jak miałoby to miejsce w przypadku średniego pomiaru21.

Technika ta ma wiele powiązanych źródeł błędów, których badacz powinien być świadomy podczas stosowania tej techniki. Godnym uwagi czynnikiem zakłócającym jest stosowanie środków znieczulających. Izofluran jest szybko działającym, wziewnym środkiem znieczulającym, z którego myszy szybko wracają do zdrowia po zakończeniu akwizycji. Należy jednak zadbać o to, aby zapewnić myszom wystarczająco dużo czasu na powrót do zdrowia w klatkach i nie przechowywać ich w znieczuleniu dłużej niż to konieczne. Z naszego osobistego doświadczenia (dane niepublikowane) wynika, że myszy, które były znieczulone w sposób ciągły przy użyciu wziewnego izofluranu między punktem czasowym 0 a 6 godzin, wykazywały znikomy klirens. Podobnie, kontrolowana dawka środka znieczulającego jest również konieczna, aby zapewnić szybki powrót do zdrowia. Podczas przytwierdzania zwierzęcia do palety w celu obrazowania, rurka fantomowa używana do wspólnej rejestracji powinna być trzymana nisko na żołądku, aby uniknąć nakładania się artefaktów na płuca. Podobnie, aby zapewnić wysokiej jakości obraz CT, należy usunąć wszelkie metalowe znaczniki z myszy, aby uniknąć artefaktów spowodowanych rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego.

Obecny protokół MCC można zastosować do niezliczonych modeli zwierzęcych. Technika ta ma znikomy wpływ na zdrowie skanowanego zwierzęcia, jest dobrze tolerowana przez myszy, dzięki czemu może być stosowana z modelami chorób bez narażania zdrowia i tak już delikatnych myszy. Siła tej metodologii wynika z tego, że jest to technika in vivo, która pozwala na uzyskanie spójnych i powtarzalnych pomiarów funkcji dróg oddechowych bez poświęcania zwierząt w celu wycięcia tchawicy do wideomikroskopii, czego wymagają modele ex vivo26. Konsekwencja tej techniki w tworzeniu powtarzalnych pomiarów na wielu skanach tych samych zwierząt pozwala na leczenie tego samego zwierzęcia różnymi środkami lub potencjalnymi terapiami oraz na porównania statystyczne dokonywane między tym samym zwierzęciem w celu zmniejszenia zmienności biologicznej nieodłącznie związanej z każdym modelem zwierzęcym, zmniejszając w ten sposób wielkość próby potrzebną do wykazania statystycznie istotnych różnic.

Ocena funkcji dróg oddechowych za pomocą techniki MCC może być dostosowana do różnych modeli zwierzęcych i zastosowana do wielu różnych modeli zdrowia dróg oddechowych, a także do testowania nowych terapii. Za pomocą tej techniki można ocenić drogi oddechowe mysich modeli PCD, a także modele POChP. Nasza metoda może być również wykorzystana do badania zróżnicowanego wpływu różnych środków znieczulających na MCC, które są powszechnie stosowane klinicznie. Wreszcie, za pomocą tego modelu można również ocenić wpływ środków terapeutycznych na drogi oddechowe. Jak wspomniano wcześniej, ale wymaga powtórzenia, ponieważ jest to pomiar in vivo, pozwala na powtarzanie ocen MCC w trakcie choroby, a także na testowanie korzyści z interwencji terapeutycznych w czasie. Ponadto myszy są najczęstszymi zwierzętami laboratoryjnymi wykorzystywanymi do naśladowania/badania chorób ludzkich, a w niektórych przypadkach dostępnych jest wiele transgenicznych mysich modeli chorób ludzkich.

Oświadczenia

Żaden z nich nie ma związku z tą pracą.

Podziękowania

M.Z. i K.S.F. i ta praca została wsparta grantem przyznanym w ramach Pitt Innovation Challenge (PInCh), przez Instytut Nauk Klinicznych i Translacyjnych na Uniwersytecie w Pittsburghu, oraz grantem NHLBI R01 HL153407, przyznanym M.Z.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
500 i mikro; m Drut światłowodowy bez osłonyEdmund Optics02-532
99mKoloid technowo-siarkowyCardinal Health
Anesthesia VaporizerVetland MedicalA13480
Durmont #5 KleszczeFine Science Tools99150-20
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Oprogramowanie
Bezpieczne cewniki Introcan 20G 1inchFisher ScientificNC1534477
IsofluraneHenry Schein118-2097
Stanowisko do intubacji myszyKent ScientificETI-MSE-01
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CTSiemens Jednokanałowe
Summit Anesthesia Solutions22860
stanowisko anestezjologiczne Siemens

Bibliografia

  1. Afzelius, B. A. Cilia-related diseases. Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).
  2. Mitchell, D. R. The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles. Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).
  3. Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella. Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).
  4. Randell, S. H., Boucher, R. C. University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).
  5. Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, Pt 1 1868-1902 (1996).
  6. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).
  7. Zahid, M., et al. Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries. PLoS One. 13 (2), 0191605(2018).
  8. Stewart, E., et al. Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).
  9. Garrod, A. S., et al. Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease. Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).
  10. Harden, B., et al. Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome. Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).
  12. Donaldson, S. H., et al. Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR. JCI Insight. 3 (24), (2018).
  13. Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research. Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).
  14. Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil. Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).
  15. Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour. Journal of Synchrotron Radiation. 19, Pt 4 551-558 (2012).
  16. Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Frontiers in Pediatrics. 2, 111(2014).
  17. Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473(2013).
  18. Lam, H. C., et al. Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).
  19. Bhashyam, A. R., et al. A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model. PLoS One. 7 (9), 45312(2012).
  20. Ortiz, J. L., et al. Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists. PLoS One. 11 (10), 0164399(2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Solomon, G. M., et al. Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography. JCI Insight. 2 (5), 91702(2017).
  23. Nakhleh, N., et al. High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy. Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).
  24. Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs. Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).
  25. Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).
  26. Bhashyam, A. R., et al. Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation. Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).
  27. Van Audenhaege, K., et al. Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging. Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie SPECT CTśledzenie radionuklidówmodel mysifantom promieniotwórczyanaliza płucrekonstrukcja obrazuobszar zainteresowaniabadanie powtarzalnościopracowywanie terapii lekowej
Ocena in vivo klirensu śluzowo-rzęskowego u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.