Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Katelyn  A. Cabral; David  M. Patterson; Olivia  J. Scheideler; Russell Cole; Adam  R. Abate; David  V. Schaffer; Lydia  L. Sohn; Zev J. Gartner

doi:10.3791/61937

Artykuł metodologiczny

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61937

⸱

24 lutego 2021

Katelyn A. Cabral¹ , David M. Patterson² , Olivia J. Scheideler¹ , Russell Cole³ , Adam R. Abate⁴^,⁵^,⁶ , David V. Schaffer⁷^,⁸ , Lydia L. Sohn⁹ , Zev J. Gartner²^,⁶^,¹⁰

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek_.

Streszczenie

Względne rozmieszczenie komórek jest kluczową cechą mikrośrodowiska, które organizuje interakcje komórka-komórka. Do badania interakcji między komórkami tego samego lub innego typu przydatne okazały się techniki mikrowzorcowania. Programowane składanie komórek DNA (DPAC) to technika mikrowzorcowania, która ma na celu przyleganie komórek do substratu lub innych komórek za pomocą hybrydyzacji DNA. Najbardziej podstawowe operacje w DPAC rozpoczynają się od dekoracji błon komórkowych oligonukleotydami modyfikowanymi lipidami, a następnie przelania ich przez podłoże, które zostało uformowane za pomocą komplementarnych sekwencji DNA. Komórki przylegają selektywnie do substratu tylko tam, gdzie znajdą komplementarną sekwencję DNA. Nieprzylegające komórki są wypłukiwane, odsłaniając wzór przylegających komórek. Dodatkowe operacje obejmują kolejne rundy adhezji substratu komórkowego lub komórka-komórka, a także przeniesienie wzorów utworzonych przez DPAC do hydrożelu do zatapiania w celu długotrwałej hodowli. Wcześniej metody modelowania oligonukleotydów na powierzchniach i ozdabiania komórek sekwencjami DNA wymagały odpowiednio specjalistycznego sprzętu i niestandardowej syntezy DNA. Przedstawiamy zaktualizowaną wersję protokołu, wykorzystującą niedrogą konfigurację fotolitograficzną na stole laboratoryjnym i dostępne na rynku oligonukleotydy modyfikowane cholesterolem (CMO) wdrożone przy użyciu formatu modułowego. Komórki znakowane CMO przylegają z wysoką wydajnością do substratów o wzorze DNA. Podejście to można wykorzystać do modelowania wielu typów komórek jednocześnie z dużą precyzją oraz do tworzenia układów mikrotkanek osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej. Do zalet tej metody należy wysoka rozdzielczość, możliwość osadzania komórek w trójwymiarowym mikrośrodowisku bez naruszania mikrowzorca oraz elastyczność w modelowaniu dowolnego typu komórek.

Wprowadzenie

Umiejscowienie komórek względem siebie w tkance jest ważną cechą mikrośrodowiska¹^,²^,³^,⁴. Techniki stosowane do tworzenia modeli żywych komórek w przestrzennie kontrolowane układy są cennymi narzędziami eksperymentalnymi do badania różnicowania⁴^,⁵^,⁶^,7^,⁸, ruchliwość komórek⁹, morphogenesis¹⁰^,¹¹^,¹², metabolism¹³, oraz interakcje komórka-komórka⁷^,¹⁴. Istnieje wiele metod tworzenia wzorców komórek, z których każda ma swoje zalety i wady³^,⁴. Metody tworzenia wysp adhezyjnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takie jak druk mikrokontaktowy i szablony wycinane laserowo, są proste i skalowalne. Trudno jest jednak utworzyć wzór więcej niż jednego lub dwóch typów komórek jednocześnie, ponieważ właściwości adhezyjne różnych typów komórek do różnych cząsteczek ECM są często podobne¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. Bardziej złożone mikrowzory można tworzyć za pomocą adsorpcji molekularnej indukowanej światłem (LIMAP), techniki, która wykorzystuje światło UV do ablacji obszarów pokrytych PEG i umożliwia późniejszą adsorpcję białek¹⁸^,¹⁹. Proces ten można powtórzyć, aby stworzyć mikrowzorce o wysokiej rozdzielczości z wieloma typami komórek. Może jednak dojść do wiązania krzyżowego komórek z różnymi łatami białkowymi, co skutkuje słabą specyficznością wzorca¹⁹. Metody fizyczne, takie jak wysiewanie komórek na mikromechanicznych rekonfigurowalnych urządzeniach do hodowli, mogą tworzyć ustrukturyzowane współkultury z dynamiczną kontrolą, ale bez elastyczności w projektowaniu wzorów druku mikrokontaktowego lub LIMAP¹⁴^,⁸. W przeciwieństwie do innych technik, bioprinting może tworzyć trójwymiarowe układy komórek w hydrożelach²⁰^,²¹. Jednak konstrukty drukowane biologicznie mają znacznie niższą rozdzielczość niż inne techniki mikrowzorów, ze średnim rozmiarem cechy rzędu setek mikronów²². Idealna metoda modelowania komórek miałaby wysoką rozdzielczość, modelowanie wielu typów komórek, używanie sprzętu i odczynników, które są łatwo dostępne, oraz możliwość osadzania udanych wzorów w hydrożelu w celu trójwymiarowej (3D) hodowli komórek. W tym artykule przedstawiamy CMO-DPAC, technikę mikrowzorcowania komórek, która wykorzystuje elastyczność i szybkość hybrydyzacji DNA do celowania w adhezję komórek do substratu. Ta metoda została zaadaptowana z naszych poprzednich protokołów²³^, ²⁴, aby uczynić ją bardziej przystępną cenowo, modułową i dostępną. Korzystając z obecnego protokołu, każde laboratorium powinno być w stanie skonfigurować w pełni funkcjonalny system bez specjalistycznego sprzętu lub wiedzy specjalistycznej.

Programowane Składanie Komórek DNA (DPAC) to potężna technika inżynierii tkankowej, która modeluje komórki w rozdzielczości pojedynczej komórki z precyzyjną kontrolą odstępów między komórkami i geometrii tkanki. W DPAC błony komórkowe są ozdobione oligonukleotydami DNA (oligonukleotydami) za pomocą dwóch zmodyfikowanych lipidami oligonukleotydów zaprojektowanych do hybrydyzacji na błonie komórkowej. Ponieważ oligonukleotydy są sprzężone z hydrofobowymi lipidami, szybko dzielą się na błonę komórkową²⁵, gdzie hybrydyzują, zwiększając hydrofobowość netto niekowalencyjnie związanych cząsteczek, a tym samym wydłużając ich żywotność na powierzchni komórki²⁶. Oligonukleotydy są prezentowane na powierzchni komórki w taki sposób, że mogą hybrydyzować z komplementarnymi oligonukleukleotydami na innych komórkach lub na szkiełkach funkcjonalizowanych DNA, tworząc zdefiniowane wzory komórek 2D lub 3D o określonym składzie, odstępach między komórkami i geometrii²³^, ²⁴. Wzorzyste mikrotkanki można enzymatycznie odłupać od powierzchni i zatopić w hydrożelu w celu przedłużonej hodowli 3D. W połączeniu z komórkami pierwotnymi lub komórkami macierzystymi, powstałe zbiory komórek mogą ulegać morfogenezie i formować się w organoidy²³^,²⁷^,²⁸. DPAC został zastosowany do zbadania dynamiki losu dorosłych nerwowych komórek macierzystych w odpowiedzi na konkurencyjne sygnały⁶^,²⁹, do badania samoorganizacji komórek nabłonka sutka ²³^,²⁸, oraz do generowania "tissue origami" poprzez kondensację mezenchymalną²⁷.

DPAC pozwala na precyzyjne rozmieszczenie wielu populacji komórek i ma znacznie lepszą rozdzielczość niż biodrukarki oparte na ekstruzji (rzędu mikronów)²²^,²³. Ponadto, w przeciwieństwie do metod tworzenia wzorów opartych na ECM, takich jak druk mikrokontaktowy, DPAC nie wymaga zróżnicowanej adhezji różnych typów komórek do powierzchni pokrytej ECM¹⁵^,²³. Idealnie nadaje się do udzielania odpowiedzi na pytania o to, jak skład tkanki wpływa na jej zachowanie, jak komórki integrują wiele sygnałów komórkowych i mikrośrodowiskowych podczas podejmowania decyzji⁶^,²⁹ oraz jak pary komórek oddziałują ze sobą. Przewagą tej metody nad innymi metodami mikrotworzenia mikrowzorów jest to, że można ją wykorzystać do hodowli komórek 3D w jednej płaszczyźnie obrazowania, ułatwiając badania poklatkowe samoorganizacji tkanek i morfogenezy organoidów²³^, ²⁷^,³⁰.

Pomimo tych zalet, pomyślne wdrożenie DPAC wymagało syntezy niestandardowych odczynników oligonukleotydowych i dostępu do specjalistycznego sprzętu do modelowania DNA²³^,²⁴, ograniczając powszechne zastosowanie. Na przykład optymalne oligonukleotydy modyfikowane lipidami (LMO) użyte w oryginalnym protokole muszą być zsyntetyzowane na zamówienie, zmodyfikowane kwasem lignocerynowym lub kwasem palmitynowym i oczyszczone²⁶. Proces ten wymaga użycia syntezatora DNA i wysokowydajnego przyrządu do chromatografii cieczowej, a także zakupu powiązanych odczynników, takich jak metyloamina, substancja kontrolowana, która podlega zarówno przepisom instytucjonalnym, jak i federalnym. Alternatywnie, LMO można kupić hurtowo na zamówienie, ale wymaga to znacznych inwestycji z góry w technologię.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy poprawioną wersję DPAC, która wykorzystuje dostępne na rynku oligonukleotydy modyfikowane cholesterolem (CMO) zamiast specjalnie syntetyzowanych LMO. Aby jeszcze bardziej obniżyć koszty i zwiększyć elastyczność platformy, przeszliśmy na modułowy, trójoligoaktywny system. Zamiast zamawiać nowy oligonukleotyda modyfikowany cholesterolem dla każdej unikalnej populacji komórek, użytkownik tego protokołu może zamiast tego użyć tych samych zmodyfikowanych cholesterolem oligonukleotydów ("Uniwersalna kotwica" i "uniwersalna współkotwica") dla każdej populacji komórek, a następnie zastosować niedrogi, niezmodyfikowany oligo ("Adapter Strand"), który hybrydyzuje zarówno z uniwersalną kotwicą, jak i albo funkcjonalizowanym aminami DNA na powierzchni, albo z nicią adaptera innego typu komórki.

Innym ograniczeniem oryginalnego protokołu DPAC było to, że tworzył on slajdy z wzorem DNA za pomocą drukarki płynnej o wysokiej rozdzielczości (np. Nano eNabler, BioForce Nanosciences)²³^,²⁴. Chociaż ten instrument może pochwalić się niezwykłą rozdzielczością i niskim zapotrzebowaniem na odczynniki, nie jest dostępny dla większości instytucji i ma stosunkowo niską szybkość drukowania (około 1 cecha wzorzysta na sekundę). Ostatnio opracowano dwie metody fotolitograficzne do modelowania cech DNA na powierzchniach. Viola i współpracownicy użyli powłoki z poliakrylamidu i benzofenonu, która kowalencyjnie wiązała jednoniciowe oligonukleotydy DNA po wystawieniu na działanie światła UV ³⁰. Korzystając z tej metody, byli w stanie stworzyć rusztowania tkankowe, które uległy wielkoskalowym, zaprogramowanym zmianom kształtu w wyniku kurczliwości komórek i samoorganizacji. Scheideler i in. opracowali metodę, która wykorzystuje ekspozycję na promieniowanie UV dodatniego fotorezystu do selektywnego wystawiania modyfikowanych aminami oligonukleotydów DNA na funkcjonalizowany aldehydem szkiełko²⁹. Po wypaleniu i redukcyjnej aminacji zmodyfikowany aminami DNA jest kowalencyjnie związany z powierzchnią. Metodę tę wykorzystano do zbadania odpowiedzi dorosłych nerwowych komórek macierzystych na przestrzennie prezentowane sygnały samoodnawiania i różnicowania. W tym artykule dostosowano protokół Scheidelera i in. w celu stworzenia wzorców DNA, które będą przechwytywać komórki znakowane CMO. Ten protokół fotowzorcowania można wykonać bez korzystania z czystego pomieszczenia. Wykorzystuje niedrogi i dostępny na rynku sprzęt, który można łatwo rozłożyć na blacie stołowym lub dygestorium. Użycie niedrogiego sprzętu do fotolitografii typu "zrób to sam" zwiększa dostępność dla badaczy bez dostępu do pomieszczeń czystych i pozwala badaczom wypróbować tę technikę bez dużych inwestycji czasu lub zasobów³¹^,³². Jednak lepszą rozdzielczość i wyrównanie wielu cech DNA można osiągnąć przy użyciu komercyjnego powlekarki wirowej i wyrównywacza masek, powszechnie stosowanych w pomieszczeniach czystych.

Tutaj opisujemy metodę modelowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji opartej na DNA. Po pierwsze, fotowzorcowanie z dodatnim fotorezystem służy do tworzenia wzorów o wysokiej rozdzielczości DNA modyfikowanego aminami na szklanym podłożu modyfikowanym aldehydem. Następnie szkiełko jest poddawane obróbce w celu zmniejszenia niespecyficznego przyczepiania komórek, a komórki przepływowe PDMS są tworzone w celu ograniczenia komórek w regionach wzorzystych. Komórki są następnie znakowane krótkimi oligonukleotydami DNA, które są funkcjonalizowane cholesterolem i w rezultacie wprowadzane do błony komórkowej. Komórki są następnie przepływane przez mikrowzorce DNA. Hybrydyzacja między DNA na powierzchni komórki a DNA na powierzchni szkła powoduje specyficzne przyleganie komórek do wzorca DNA. Nieprzylegające komórki są zmywane, odsłaniając przylegający wzór komórek. Proces ten można powtarzać w celu ukształtowania wielu typów komórek lub stworzenia wielowarstwowych struktur. W razie potrzeby komórki można w pełni osadzić w ECM w celu hodowli komórek 3D.

Protokół

1. Eksperyment projektowy

Zaplanuj żądany eksperyment, biorąc pod uwagę rozmiar funkcji, odstępy między cechami, liczbę zaangażowanych typów komórek i rozmieszczenie komórek względem siebie. Zapoznaj się z Plikiem Uzupełniającym 1, przewodnikiem dotyczącym projektowania eksperymentów, oraz Plikiem Uzupełniającym 2, który zawiera przykładowe sekwencje oligo.
Zaprojektuj fotomaskę za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo. Przykładowa fotomaska znajduje się w pliku uzupełniającym 3.
1. Narysuj prostokąt o wymiarach standardowego szkiełka mikroskopowego (25 mm x 75 mm).
2. Narysuj cztery prostokątne obszary o szerokości 10 mm i długości 10 mm, równomiernie rozmieszczone na szkiełku.
3. W każdym regionie narysuj obiekty o pożądanym rozmiarze, kształcie i odstępach dla eksperymentu. Komórki będą przylegać tylko do tych cech w eksperymencie.
4. Aby utworzyć wyrównane maski fotograficzne dla wielu typów komórek, utwórz rysunek główny ze wszystkimi zestawami obiektów, a następnie zapisz wersje odpowiadające każdemu typowi komórki.
5. Zamów fotomaskę przezroczystości o wysokiej rozdzielczości (co najmniej 20 000 punktów na cal) z tego rysunku CAD z cechami narysowanymi w wersji 1.2.3 przezroczystej i większymi obszarami czarnymi.

2. Fotowzór DNA na szkiełkach funkcjonalizowanych aldehydem (protokół zaadaptowany z Scheideler et al.²⁹ )

W przypadku modelowania wielu typów komórek, przed jakimkolwiek wzorcem DNA należy wytworzyć markery odniesienia na szkiełku funkcjonalizowanym aldehydem, aby ułatwić wyrównanie cech. Alternatywne metody tworzenia znaczników odniesienia są sugerowane w pliku uzupełniającym 1.
1. Aby utworzyć metalowe znaczniki referencyjne, zastosuj dodatni fotorezystor S1813 zgodnie z opisem w krokach 2.3 - 2.11. Użyj maski fotograficznej, która zawiera duże obiekty, które będzie można później łatwo wyrównać. Uwzględnij te cechy w projekcie fotomasek, które będą używane do modelowania DNA.
2. Umieść cienką warstwę (100 angstremów) tytanu na szkiełku za pomocą odparowywania z pistoletu elektronowego²⁹. Usuń nadmiar metalu i fotorezystu za pomocą acetonu, a następnie przystąp do fotowzorcowania DNA.
Przygotować 20 μM roztwór oligo modyfikowanego 5'-aminą w buforze DNA (50 mM fosforanu sodu w wodzie, pH = 8,5). Zobacz Plik uzupełniający 2, aby zapoznać się z sugerowanymi sekwencjami oligo.
UWAGA: Możliwe jest użycie zaledwie 5 μM oligo modyfikowanego aminami dla niektórych wzorów i zastosowań, więc może być konieczna optymalizacja stężenia powierzchniowego DNA.
Rozgrzej płytę grzejną do 100 °C.
Użyj taśmy dwustronnej lub odkurzacza, aby przymocować szkiełko szklane z aldehydem do wirnika powlekarki wirowej.
UWAGA: Odklejenie suwaka podczas wirowania stanowi zagrożenie dla bezpieczeństwa. Zawsze używaj powlekarki wirowej w zamkniętym pojemniku z pokrywką, takim jak akrylowe pudełko.
UWAGA: Oznacz róg szkiełka za pomocą rysika diamentowego lub podobnego narzędzia, aby zarysować szkło. Pomaga to w identyfikacji i orientacji szkiełka po zmyciu fotorezystu.
Użyj jednorazowej pipety, aby upuścić dodatni fotorezystor na szkiełko aldehydowe. Aby uzyskać równomierne powłoki, dodaj małe krople fotorezystu w poprzek szkiełka, zamiast jednej dużej kropli w środku (rysunek uzupełniający 1A).
Za pomocą powlekarki wirowej obracaj szkiełko z prędkością 3000 obr./min przez 30 s.
Umieść szkiełko na płycie grzejnej o temperaturze 100 °C na 1.5 minuty (miękkie pieczenie), aby usieciować fotorezyst
Zdejmij szkiełko z płyty grzejnej. Umieść fotomaskę z cechami pożądanymi w tym eksperymencie na wierzchu szkiełka i obciąż fotomaskę kawałkiem szkła (rysunek uzupełniający 1B, C). Przykryj cały zestaw w nieprzezroczystym pudełku (rysunek uzupełniający 1D). Naświetlić lampą UV (długość fali 365 nm, 360 mW, 5 cali od szkiełka, całkowita gęstość energii promieniowania 100 mJ/cm²) przez 2 min.
UWAGA: Światło UV zerwie wiązania polimerowe w fotorezyście pod przezroczystymi obszarami fotomaski, tworząc obszary, w których DNA będzie mogło później przylegać.
Rozwiń slajd, zanurzając go w roztworze wywoływacza na 3-5 minut (rysunek uzupełniający 1E).
Spłucz nadmiar roztworu wywoływacza wodą. Suszyć pod strumieniem powietrza lub azotu. (Rysunek uzupełniający 1F).
Upewnij się, że fotolitografia się powiodła, patrząc na szkiełko pod mikroskopem. Ponieważ fotorezystor jest wrażliwy na promieniowanie UV, wykonaj ten krok szybko, a następnie przechowuj szkiełko w ciemności, przygotowując inne szkiełka (jeśli dotyczy).
UWAGA: Slajd z pomyślnym wzorem powinien mieć ostro zdefiniowane krawędzie dla każdej cechy, bez pęknięć i zniekształceń funkcji na krawędziach. Przykłady poprawnej i nieprawidłowej fotolitografii przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2A. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sugestiami dotyczącymi rozwiązywania problemów, jeśli fotolitografia nie zapewnia pożądanej jakości funkcji.
Dodać kroplę roztworu oligonugokrzewu modyfikowanego aminami o stężeniu 20 μM (krok 2.1) na każdy obszar szkiełka z fotowzorem. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie rozprowadzić kroplę na całym obszarze, uważając, aby nie zarysować szkiełka. (Rysunek uzupełniający 1G).
Piecz szkiełko w piekarniku o temperaturze 65-70 °C, aż roztwór DNA całkowicie wyschnie na powierzchni szkiełka (około 1 godziny).
Przeprowadzić aminację redukcyjną, umieszczając wzorzyste, upieczone szkiełka w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm i umieścić w dygestoriach na wytrząsarce. Odważyć 100 mg borowodorku sodu. W dygestorium dodaj 40 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), delikatnie wymieszaj i dodaj do naczynia zawierającego wzorzyste szkiełka. Pozwól reakcji postępować przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
UWAGA: Amina na oligo najpierw tworzy zasadę Schiffa z aldehydami na powierzchni szkiełka. Jest to odwracalne wiązanie kowalencyjne, które przed użyciem w DPAC musi zostać przekształcone w wiązanie nieodwracalne. Dodanie środka redukującego (borowodorku sodu) przekształca zasadę Schiffa w aminę drugorzędową w procesie aminacji redukcyjnej.
UWAGA: Reakcja borowodorku sodu z wodą wytwarza gazowy wodór i będzie to trwało przez wiele godzin lub dni po rozpoczęciu reakcji. Wykonać etap aminacji redukcyjnej w dygestoriach i przechowywać wszystkie odpady roztworu borowodorku sodu w otwartym lub luźno zamkniętym pojemniku w dygestoriach przez co najmniej 24 godziny.
Usuń nieprzereagowane DNA, przemywając dwukrotnie 0,1% dodecylosiarczanem sodu (SDS) w wodzie, a następnie trzykrotnie wodą destylowaną. Wysuszyć szkiełko pod strumieniem azotu lub powietrza.
Przepłucz szkiełko acetonem, aby usunąć pozostały fotorezystor.
UWAGA: W tym momencie DNA zostało nieodwracalnie i kowalencyjnie przyłączone do szkiełka, a wszystkie nieprzereagowane grupy funkcyjne aldehydu zostały przekształcone w alkohole. Fotorezystor nie jest już potrzebny.
Jeśli wzorzystych będzie kilka oligonukleotydów, wróć do kroku 2.4, wyrównaj fotomaskę ze znakami odniesienia i powtórz.
UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Szkiełka należy przechowywać w eksykatorze próżniowym. W suchych warunkach szkiełka można przechowywać do 3 miesięcy bez utraty jakości.

3. Make slide hydrofobowy (opcjonalnie) (protokół zaadaptowany z Todhunter et al.²⁴ )

UWAGA: Jest korzystne, ale nie wymagane, aby zmodyfikować skład chemiczny powierzchni szkiełka, aby uczynić go bardziej obojętnym i hydrofobowym. Niespecyficzne przyleganie komórek jest zmniejszone na tych powierzchniach³³, łagodząc w ten sposób niespecyficzne wiązanie komórek z niewzorzonymi obszarami szkiełka. Dodatkowo, jeśli wzorzyste komórki zostaną ostatecznie osadzone w hydrożelu i przeniesione ze szkiełka, obróbka powierzchni jest niezbędna do niezawodnego ruchu hydrożelu wypełnionego komórkami po szkiełku bez zniekształceń lub rozdarć. Silanizowanie (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)dimetylochlorosilanem powoduje obecność hydrofobowych grup fluoroalkilowych na powierzchni szkiełka.

UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności od 3.1 wzwyż w dygestoriach chemicznych, aby zapobiec narażeniu na opary kwasu octowego i chlorku metylenu.

Spłucz szkiełko 10% kwasem octowym, a następnie wysusz pod strumieniem powietrza.
W szklanym słoiku Coplin przygotuj roztwór 60 ml chlorku metylenu (dichlorometanu), 0,6 ml trietyloaminy i 0,6 ml (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)dimetylochlorosilanu. Wymieszaj metalową szpatułką do wymieszania.
UWAGA: Te odczynniki są wrażliwe na wodę. Powinny być przechowywane w suchych warunkach i używane tak świeże, jak to możliwe.
Dodaj szkiełko do słoika Coplin zawierającego roztwór silanu. Umieść słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej (ustawionej na 60-80 obr./min) i pozwól, aby reakcja silanu i szkiełka postępowała przez 15 minut.
Użyj metalowych kleszczy, aby usunąć szkiełko z roztworu silanu. Zanurz szkiełko w słoiku Coplin zawierającym chlorek metylenu na 1 minutę, aby usunąć nadmiar silanu ze szkiełka.
Zanurz szkiełko w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej etanol. Poruszać. Zanurz szkiełko w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej wodę destylowaną. Agitate.
UWAGA: Chlorek metylenu i woda nie mieszają się, dlatego konieczne jest płukanie etanolem, aby usunąć nadmiar chlorku metylenu przed ostatnim płukaniem wodą.
Wyjmij szkiełko z wody i sprawdź je. Zjeżdżalnia powinna być dość sucha, a wszelkie kropelki wody powinny mieć kąt zwilżania większy niż 90°. Pozostawić szkiełka do całkowitego wyschnięcia i przechowywać w eksykatorze próżniowym do czasu użycia.
UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Przechowuj szkiełko w suchych warunkach.

4. Przygotuj komórki przepływowe PDMS i slajd do eksperymentu

UWAGA: Prostokątne komórki przepływu PDMS są używane do koncentracji komórek nad wzorzystymi obszarami slajdu. W przypadku eksperymentów hodowanych w 3D komórki przepływowe tworzą formę dla hydrożelu.

Spraw, aby SU-8 master był używany jako forma do komórek przepływowych PDMS.
1. Rozgrzej płytę grzejną do 95 °C.
2. Dodaj 5 ml SU-8 2075 do płytki krzemowej.
3. Obracaj SU-8 na płytce z prędkością 500 obr./min przez 10 s, a następnie 1,000 obr./min przez 30 s. Powinno to spowodować utworzenie obiektów o wysokości do 240 μm³⁴.
4. Piecz wafelek na miękko na płycie grzejnej przez co najmniej 45 minut.
5. Wyjmij wafel z płyty grzejnej. Umieść fotomaskę (patrz plik uzupełniający 4) (emulsją skierowaną w dół) na wierzchu płytki i obciążyć ją szklanym krążkiem, aby zapewnić kontakt między fotomaską a szkiełkiem.
6. Naświetlić światłem UV (365 nm) w celu uzyskania gęstości energii promieniowania 350 mJ/cm².
7. Piecz wafelek na płycie grzejnej przez 12-15 minut.
8. Umieść wafel w szerokim szklanym pojemniku. Przykryj wafel roztworem wywoływacza SU-8. Umieścić na shakerze i rozwijać, mieszając przez co najmniej 15 minut.
9. Użyj kleszczyków, aby usunąć wafel z rozwiązania deweloperskiego. Płucz przez 5 sekund, rozpylając więcej roztworu wywoływacza z butelki ze spryskiwaczem. Spryskaj alkoholem izopropylowym do spłukania. Jeśli pojawi się biały osad, włóż płytkę z powrotem do roztworu wywoływacza i rozwijaj się dłużej.
10. Suchy wafel pod strumieniem powietrza lub azotu.
11. Piecz zjeżdżalnię przez 5 min.
  UWAGA: Po utworzeniu płytki wzorcowej można jej używać ponownie w nieskończoność, o ile funkcje pozostają nienaruszone.
Przygotuj PDMS.
1. W łodzi wagowej dodać elastomer polidimetylosiloksan i środek sieciujący w stosunku 10:1 (masowo). Mieszaj energicznie, aby zapewnić równomierne wymieszanie.
2. Odgazuj PDMS w eksykatorze próżniowym przez 15-30 minut, aż nie będzie widać już pęcherzyków.
3. Umieść wafel wzorcowy w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 15 cm. Wlej PDMS na wafel. Jeśli pojawią się pęcherzyki, odgazuj w eksykatorze próżniowym przez kilka minut.
4. Piec w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 3 godz
  UWAGA: Po upieczeniu komórki przepływowe PDMS można przechowywać na blacie przez czas nieokreślony.
Przygotuj komórki przepływowe PDMS do eksperymentu.
1. Na krótko przed rozpoczęciem eksperymentu CMO-DPAC należy wyciąć wymaganą liczbę komórek przepływowych PDMS z płytki głównej. Utlenianie plazmowe powietrzem w pomieszczeniu o wydajności 10 cm³/min przez 90 sekund, aby powierzchnia stała się hydrofilowa.
2. Wytnij każdą pojedynczą komórkę przepływową tak, aby z każdej strony pozostało 1-2 mm PDMS, a następnie rozetnij górną i dolną część komory przepływowej, aby utworzyć wlot i wylot.
3. Pobieranie slajdu ze wzorem utworzonego w krokach 2 i 3. Wyrównaj do wierzchu maski fotograficznej.
4. Używając fotomaski jako odniesienia, umieść komórki przepływu PDMS na szkiełku w lokalizacji każdego obszaru z wzorem.
5. Dodać 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do wlotu każdej komory przepływowej, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1H. Upewnij się, że komora przepływowa jest całkowicie wypełniona przez PBS + 1% BSA i że nie ma dużych pęcherzyków. Przejdź natychmiast do kroków 5 i 6.
  UWAGA: Blokowanie za pomocą BSA minimalizuje niespecyficzne przyleganie komórek do powierzchni szkiełka.

5. Podnieś i oznacz komórki DNA modyfikowanym cholesterolem

Przygotuj roztwory DNA modyfikowane cholesterolem.
1. Dla każdego zestawu komórek w eksperymencie wymieszaj ze sobą 3 μl 100 μM roztworu podstawowego uniwersalnej nici kotwiczącej modyfikowanej cholesterolem z 3 μl 100 μM roztworu podstawowego nici adaptera. Inkubować przez 1 minutę. Spowoduje to wstępną hybrydyzację oligonukleotydów. Dodać 69 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby uzyskać roztwór 4 μM Kotwa uniwersalna + adapter.
2. Dla każdego zestawu komórek w eksperymencie dodaj 3 μl 100 μM uniwersalnego roztworu podstawowego Co-Anchor Nici modyfikowanego cholesterolem do 12 μl PBS, tworząc roztwór 20 μM.
Przygotować zawiesinę(-y) jednokomórkową(-e).
1. W przypadku komórek przylegających należy użyć trypsyny lub innego środka dysocjacyjnego w celu usunięcia komórek z kolby hodowlanej. Dodaj pożywkę hodowlaną, aby zneutralizować trypsynę i odwirować, aby osadzać komórki. W przypadku komórek nieprzylegających należy zebrać zawiesinę komórek i odwirować w celu osadzenia komórek.
2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatego PBS lub pożywki bez surowicy. Przenieś 1-3 miliony komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 160 x g przez 4 min.
  UWAGA: Jeśli używany typ ogniwa jest podatny na zbrylanie/agregację, należy używać PBS bez jonów wapnia i magnezu na wszystkich etapach mycia, aby zmniejszyć niepożądaną agregację komórek. Jeśli żywotność jest szczególnym problemem dla używanego typu komórek, należy użyć pożywki bez surowicy zamiast PBS. Pożywki zawierające płodową surowicę bydlęcą nie są zalecane do znakowania komórek, ponieważ mogą utrudniać wprowadzanie oligonukleotydów modyfikowanych lipidami. ³⁵
Oznacz komórki oligonukleukleotydami modyfikowanymi cholesterolem.
1. Zawiesić osad komórkowy w 75 μl lodowatego PBS lub pożywki bez surowicy. Przechowuj komórki w pojemniku na lód przez cały proces etykietowania i mycia, aby zmaksymalizować żywotność komórek i zminimalizować utratę modyfikowanych cholesterolem oligonukleotydów z powierzchni komórki.
  UWAGA: Ponowne zawieszenie komórek przed dodaniem DNA zapewnia, że dystrybucja DNA jest jednolita w całej populacji komórek.
2. Dodać 75 μl roztworu 4 μM Uniwersalna kotwica + adapter utworzonego w kroku 5.1.1 do probówki mikrowirówki zawierającej zawiesinę komórek. Dokładnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
3. Dodać 15 μl uniwersalnego roztworu Co-Anchor do probówki mikrowirówkowej. Dokładnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
4. Usunąć nadmiar oligonukleotydów z zawiesiny komórkowej. Dodaj 1 ml lodowatego PBS lub pożywki bez surowicy do probówki mikrowirówkowej. Wymieszać pipetą P1000. Wirować przy 160 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Powtórz jeszcze dwa razy.
  UWAGA: Jeśli komórki są podatne na zbrylanie, przepuść zawiesinę komórek przez filtr 40 μm przed ostatecznym płukaniem. Jeśli komórki są podatne na adsorpcję z boku probówki mikrowirówki, rozważ wstępne zablokowanie probówki kazeiną.

6. Wzór komórek znakowanych DNA

Ponownie zawiesić komórki w lodowatym PBS lub pożywce bez surowicy, aby uzyskać gęsty roztwór komórek o gęstości co najmniej 25 milionów komórek/ml.
UWAGA: Na jedno szkiełko z użyciem czterech komórek przepływowych PDMS o wymiarach 10 mm x 15 mm x 200 μm opisanych w kroku 4 wymagane jest około 100 μl tej gęstej zawiesiny komórek. Chociaż większość z tych komórek nie będzie przylegać do wzorca i ostatecznie zostanie odrzucona, posiadanie niezwykle skoncentrowanego roztworu komórek nad wzorem radykalnie poprawia wydajność tworzenia wzorców komórkowych.
Podnieś slajd i lekko go przechyl. Dodać 25 μl zawiesiny komórek do wlotu każdej komory przepływowej na szkiełku wzorzystym. Usuń roztwór PBS + 1% BSA z wylotu, pozwalając zawiesinie ogniw wypełnić komórkę przepływową PDMS. Inkubować na lodzie lub w temperaturze pokojowej przez 30 s.
UWAGA: W tym momencie patrzenie na komórkę przepływową pod mikroskopem powinno pokazać gęsto upakowane komórki z niewielkimi lub żadnymi przerwami widocznymi między komórkami. Patrz rysunek uzupełniający 2B.
Odessać 5 μl zawiesiny komórek z wylotu szkiełka i dodać ją z powrotem do wlotu. Powtórz 10 razy na komórkę przepływową.
UWAGA: Przyleganie komórek znakowanych CMO do szkiełka z wzorem DNA jest prawie natychmiastowe. Wielokrotne przepuszczanie komórek przez wzór zwiększa prawdopodobieństwo, że komórka przepłynie przez dany punkt DNA i zostanie przechwycona.
Delikatnie odpipetuj PBS lub pożywkę bez surowicy do wlotu każdej komory przepływowej, aby wypłukać nadmiar komórek. Zebrać zawiesinę ogniw z wylotu. Powtórz 2-4 razy lub do momentu, gdy oględziny szkiełka pod mikroskopem potwierdzą, że nie pozostały żadne nadmiarowe komórki.
UWAGA: Korzystne może być zaoszczędzenie nadmiaru komórek z pierwszego prania. Jeśli wydajność modelowania jest niezadowalająca, nadmiar komórek można odwirować i ponownie zawiesić w mniejszej objętości PBS, aby uzyskać roztwór o większej gęstości komórek, a następnie proces można powtórzyć od kroku 6.2.
Powtórz kroki 6.1-6.4 dla każdego zestawu komórek we wzorcu. W przypadku wzorków, w których wiele typów komórek jest bezpośrednio utworzonych przez szablon powierzchni, należy rozpocząć od najmniej obfitego typu komórki wzoru, a zakończyć na najliczniejszym typie komórki.
UWAGA: Zaleca się wykonywanie każdej rundy składania komórek sekwencyjnie, zamiast łączenia komórek, nawet w warunkach, w których wszystkie komórki są znakowane ortogonalnymi sekwencjami DNA. Łączenie komórek skutecznie rozcieńcza każdą populację komórek i zmniejsza wydajność modelowania.
Po zakończeniu ostatniej rundy montażu ogniw kolejne kroki będą się różnić w zależności od konkretnego eksperymentu. Jeśli komórki mają pozostać na szkle, dodaj pożywkę do szalki Petriego zawierającej szkiełko, a następnie delikatnie użyj kleszczyków, aby odepchnąć komórki przepływowe PDMS od szkiełka. Jeśli komórki zostaną osadzone w hydrożelu i hodowane w 3D, przejdź do kroku 7.

7. Przenieś do hydrożelu w celu hodowli 3D (opcjonalnie)

Przygotować roztwór prekursora hydrożelu zawierający 2% DNazy.
UWAGA: Skład roztworu będzie się różnić w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. W tym protokole dobrze sprawdzają się Matrigel i mieszanki Matrigel i kolagenu I, ale możliwe są również inne hydrożele.
Dodać 50 μl roztworu hydrożelu zawierającego 2% DNazę do wlotu każdej komory przepływowej. Zassać nadmiar płynu z wylotu, wprowadzając roztwór hydrożelu do komory przepływowej. W przypadku lepkich prekursorów hydrożelu może być konieczne lekkie przechylenie suwaka, aby pomóc hydrożelowi przepływać do komory przepływowej.
Inkubować szkiełko w temperaturze 37 °C przez 30-45 minut (w zależności od kinetyki żelowania hydrożelowego), aby umożliwić hydrożelowi związanie i rozszczepienie adhezji opartej na DNA między komórkami a powierzchnią.
Wyjmij każdą komórkę przepływową ze szkiełka i umieść na roztworze prekursora hydrożelu.
1. Dodać 50 μl prekursora hydrożelu do dołka 2-dołkowego szkiełka lub płytki 6-dołkowej.
2. Odpipetować 10 μl PBS po obu stronach każdej celi przepływowej.
3. Użyj żyletki lub pęsety z drobnym czubkiem, aby rozprowadzić PBS na całej długości komory przepływowej, a następnie delikatnie podnieś boki komory przepływowej, tak aby PBS wpadł pod hydrożel.
  UWAGA: Spowoduje to "unoszenie się" hydrożelu po szkiełku, umożliwiając przenoszenie bez zniekształceń i rozdarć.
4. Użyj żyletki, aby delikatnie przesunąć kuwetę przepływową do krawędzi szkiełka podstawowego.
5. Odwróć slajd. Za pomocą żyletki popchnij komórkę przepływową ze szkiełka, tak aby wylądowała na ostrzu żyletki.
6. Podnieś komórkę przepływową z żyletki za pomocą zakrzywionych kleszczy. Odwróć komórkę przepływową tak, aby komórki znajdowały się na dnie, a następnie umieść ją na kropelce roztworu prekursora hydrożelu.
7. Powtórz kroki 7.4.1 - 7.4.6 dla każdej komory przepływowej.
Inkubować przez co najmniej 30 minut, aby hydrożel zawierający wzorzyste komórki mógł związać się z podkładem hydrożelowym, powodując pełne zatopienie wzorzystych komórek.
Usuń komórkę przepływową PDMS.
1. Dodaj wystarczającą ilość nośnika, aby zanurzyć komórkę przepływową PDMS.
  UWAGA: Napływ mediów poluzuje przyczepność między hydrożelem a komorą przepływową PDMS.
2. Użyj zakrzywionych kleszczy, zorientowanych wzdłuż długiej osi komory przepływowej, aby delikatnie popchnąć komórkę przepływową, aż wyskoczy i uniesie się w mediach. Zebrać komórkę przepływową za pomocą kleszczy i wyrzucić.
  UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, rozłóż zakrzywione kleszcze i delikatnie dociśnij ścianki komory przepływowej PDMS. Przyłóż siłę w kierunku długiej osi komory przepływowej.

8. Potwierdź pomyślne etykietowanie komórek za pomocą CMO (opcjonalnie, do rozwiązywania problemów)

Zamów oligonukleotyd modyfikowany fluorescencyjnie (FAM lub AF647), który jest komplementarny do sekwencji adhezji powierzchniowej nici adaptera używanej w eksperymencie.
Oznacz komórki CMO DNA i wypłucz nadmiar DNA zgodnie z opisem w kroku 5. Zawiesić w 200 μl lodowatego PBS.
Uzupełnić 4 μM roztwór znakowanego fluorescencyjnie komplementarnego oligonukleotydu w PBS. Dodać 200 μl tego roztworu do zawiesiny komórek. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
Dodaj 1 ml lodowatego PBS. Wymieszać. Odwirować komórki, aby je ogranulować. Usunąć supernatant. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, aby wypłukać DNA, które nie uległo hybrydyzacji.
Wykonaj analityczną cytometrię przepływową, aby określić ilościowo obecność DNA na powierzchni komórki.
1. Na cytometrze przepływowym przeanalizuj komórki kontrolne, które nie zostały oznaczone DNA. Skonfiguruj bramy na podstawie tej populacji.
2. Przeanalizuj komórki znakowane CMO, które zostały potraktowane fluorescencyjnie znakowanym komplementarnym oligonukleotydem.
3. Obliczyć średnią intensywność fluorescencji.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia precyzyjne rozmieszczenie komórek w układach 2D i 3D bez konieczności stosowania specjalistycznych odczynników lub kosztownego sprzętu z pomieszczeń typu cleanroom. Rysunek 1 przedstawia schemat protokołu. W pierwszej kolejności, za pomocą fotolitografii, przygotowuje się szkiełka funkcjonalizowane DNA. Następnie komórki znakuje się za pomocą CMO. Komórki są następnie przepływane nad szkiełkiem, gdzie przywierają wyłącznie do obszarów funkcjonalizowanych DNA. Po wypłukaniu nadmiaru komórek ukazuje się pożądany wzór rozmieszczenia komórek. Komórki te mogą być hodowane bezpośrednio na szkiełku lub osadzone w hydrożelu zawierającym DNazę i przeniesione poza szkiełko w celu prowadzenia hodowli komórkowej 3D.

Znakowanie komórek za pomocą CMO umożliwia ich przytwierdzenie do slajdu z wzorem DNA (Rysunek 2). Najpierw zmodyfikowana cholesterolem uniwersalna nić kotwicząca (Universal Anchor Strand) jest prehybrydyzowana z nicią adapterową (Adapter Strand). Następnie roztwór uniwersalnej nici kotwiczącej i adaptera miesza się w stosunku 1:1 z zawiesiną komórkową. Cholesterol w kompleksie uniwersalnej nici kotwiczącej i adaptera wbudowuje się w błonę komórkową. Dodanie zmodyfikowanej cholesterolem uniwersalnej nici współkotwiczącej (Universal Co-Anchor Strand), która hybrydyzuje z uniwersalną nicią kotwiczącą, zwiększa stabilność kompleksu CMO w błonie komórkowej poprzez zwiększenie całkowitej hydrofobowości kompleksu²⁶. Po wypłukaniu nadmiaru DNA z zawiesiny komórkowej komórki są przepływane nad slajdem. Hybrydyzacja między nicią adapterową a nicią DNA powierzchniową (Surface DNA Strand) prowadzi do przytwierdzenia komórek do obszarów slajdu z wzorem DNA.

Wzór komórkowy tworzy się za pomocą fotolitografii w celu ograniczenia przyłączenia oligonukleotydów DNA modyfikowanych aminami do określonych obszarów szkiełka przedmiotowego modyfikowanego aldehydem.²⁹ (Rycina 3A). Pozytywny fotorezyst nakłada się metodą spin-coatingu na szkiełko funkcjonalizowane aldehydem. Następnie na wierzch szkiełka nakłada się przezroczystą maskę fotolitograficzną i poddaje szkiełko naświetlaniu promieniami UV. Po wywołaniu obszary szkiełka, które zostały naświetlone promieniami UV, nie są już pokryte fotorezystem, a tym samym mają odsłonięte grupy aldehydowe. A 20 µM roztwór oligonukleotydów DNA zmodyfikowanych aminą nanosi się następnie na szkiełko, rozprowadzając go tak, aby pokrył obszary wzorowane. Wygrzewanie, a następnie aminowanie redukcyjne prowadzi do powstania wiązania kowalencyjnego między zmodyfikowanym aminą DNA a szkiełkiem. Co istotne, proces ten można powtarzać w celu wzorowania wielu oligonukleotydów bez utraty funkcjonalności wcześniej naniesionych oligonukleotydów (Rycina 3B). Należy jednak zachować ostrożność, aby uniknąć nakładania się wzorów, co skutkuje obecnością obu oligosów w obniżonym stężeniu (Rycina dodatkowa 3). Wiele populacji komórek można wzorować sekwencyjnie, wykorzystując nici adapterowe różniące się domeną modułową (20 zasadami znajdującymi się najbliżej końca 3').

Chociaż ten protokół fotowzorowania został opracowany przez Scheidela i współpracowników w warunkach pomieszczenia czystego, wykazaliśmy, że możliwe jest osiągnięcie podobnych wyników przy użyciu niedrogiego, własnoręcznie wykonanego zestawu do fotolitografii, który łatwo mieści się w dygestorium chemicznym. Zestaw obejmuje spin coater za 400 USD, zbudowany z silnika prądu stałego, kontrolera cyfrowego i pudełka na płyty CD, a także lampę UV, która została zmontowana z pojedynczych komponentów i umieszczona w zaadaptowanym pojemniku na odpady ostre (Rycina uzupełniająca 1). Główną zaletą własnoręcznie wykonanego układu do fotolitografii jest jego bardzo niska cena (<(całkowity koszt sprzętu wynosi 1000 USD), przy jednoczesnej możliwości tworzenia struktur o rozmiarach pojedynczych komórek. Jednak stosowanie niedrogiego sprzętu wiąże się z pewnymi ograniczeniami – na przykład trudniej jest precyzyjnie dopasować markery referencyjne w celu wzorowania wielu oligonukleotydów DNA bez użycia wyrównywacza masek. Zalecamy ten tani zestaw do fotolitografii laboratoriom, które nie mają łatwego dostępu do czystego pomieszczenia lub chcą wypróbować tę metodę bez ponoszenia dużych nakładów finansowych.

Aby zidentyfikować optymalne warunki dla programowanej przez DNA adhezji komórkowej, systematycznie zmieniano stężenia nici DNA na powierzchniach komórek i mierzono wydajność adhezji komórek do modyfikowanych DNA powierzchni szklanych. Stężenie Universal Anchor + Adapter Strand oraz Universal Co-Anchor w roztworach znakujących zmieniano w zakresie kilku rzędów wielkości (Rycina 4A,B), co skutkowało obecnością od 10⁴ do 10⁶ kompleksów DNA na komórkę (Rycina dodatkowa 4). Adhezja komórek była zależna od dawki; odnotowano minimalną adhezję komórek do wzoru DNA, gdy komórki były znakowane CMOs w stężeniu 0,05 µM lub niższym, oraz wysokie stopnie zajętości przy stężeniu 2,5 µM i wyższym. W związku z tym w większości eksperymentów stosowano roztwór 2 µM Universal Anchor + Adapter Strand oraz roztwór 2 µM Universal Co-Anchor. Oczekiwano również, że adhezja komórek spadnie w przypadku zmniejszenia ilości DNA użytego na powierzchni szklanej²⁹ lub w przypadku zwiększenia liczby niedopasowań między Adapter Strand a nicią powierzchniową. Więcej informacji na temat projektu sekwencji Adapter Strand znajduje się w Pliku dodatkowym 2. Znakowanie CMO z użyciem Adapter Strands bez powtórzeń CpG nie stymulowało TLR9 w komórkach HEK wykazujących ekspresję mysiego TLR9 (Rycina dodatkowa 5).

Przedstawiamy kilka dowodów na to, że zrewidowany protokół zapewnia powtarzalną i wydajną adhezję komórek programowaną przez DNA. Na przykład ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs) znakowane CMO przylegały do wzorów DNA z wysoką wydajnością. Komórki HUVECs znakowane CMO przylegały równie dobrze jak komórki HUVECs znakowane LMO (Rysunek 5A). Komórki rozmieszczone wzorowo przy użyciu CMO-DPAC zachowały żywotność i funkcjonalność. Komórki znakowane CMO barwiono kalceiną AM oraz etydinium homodimerem w celu oceny żywotności (Rysunek dodatkowy 6). Różnice w żywotności w porównaniu z nieznakowanymi komórkami kontrolnymi były niewielkie (94% vs 97%). Pojedyncze komórki MDCK rozmieszczone wzorowo za pomocą CMO-DPAC i przeniesione do Matrigelu były w stanie prawidłowo proliferować i polaryzować po 5 dniach hodowli (Rysunek 5B). DPAC umożliwia również rozwijanie wzorów komórkowych w trzecim wymiarze (Rysunek 5C). Na przykład wielowarstwowe agregaty wielokomórkowe można tworzyć poprzez naprzemienne układanie warstw komórek znakowanych komplementarnymi CMO (Rysunek 5C). Eksperymenty te dowodzą, że protokół jest powtarzalny, nie wpływa negatywnie na żywotność ani funkcjonalność komórek oraz pozwala na uzyskanie wzorów komórkowych, które mogą być z powodzeniem hodowane w jednej płaszczyźnie obrazowania w 3D ECM.

Dzięki zastosowaniu ortogonalnych sekwencji DNA do kierowania adhezją komórek, technika DPAC umożliwia tworzenie wzorów z wielu typów komórek na jednej powierzchni. Aby zrealizować tę funkcję DPAC, wzory DNA generowane metodą fotolitografii muszą być względem siebie wyrównane. Metalowe markery fiducyjne naniesione na szkiełko pozwoliły na wyrównanie wielu fotomasek, a w konsekwencji na jednoczesne tworzenie wzorów z wielu typów komórek. Komórki MCF10A barwione różnymi, unikalnymi barwnikami zostały oznakowane ortogonalnymi CMO i rozmieszczone w taki sposób, aby stworzyć wizualizację logo UC Berkeley oraz UCSF (Rysunek 6). Eksperyment ten pokazuje, że wiele unikalnych populacji komórek może być wzorowanych wspólnie z wysoką precyzją i bez kontaminacji krzyżowej.

Skuteczne wzorowanie komórek przy użyciu CMO-DPAC wymaga wysokiej jakości fotolitografii, odpowiedniego stężenia oligonukleotydów na powierzchni komórek, wysokiej gęstości komórek w obszarze wzoru oraz dokładnego przemywania. Błąd na którymkolwiek z tych etapów wpływa na wynik końcowy. Rycina dodatkowa 2 zawiera przykładowe obrazy poprawnej i niepoprawnej fotolitografii (Rycina dodatkowa 2A), pożądaną gęstość komórek nad wzorem w celu uzyskania w pełni wypełnionych wzorów (Rycina dodatkowa 2B), utratę wzorowanych komórek w wyniku zbyt intensywnego pipetowania podczas kolejnych kroków DPAC (Rycina dodatkowa 2C) oraz niepożądane skupianie się komórek (Rycina dodatkowa 2D). Tabela 1 zawiera listę najczęstszych przyczyn niepowodzeń oraz sugerowane sposoby rozwiązywania problemów. Jako narzędzie diagnostyczne zaleca się stosowanie fluorescencyjnych oligonukleotydów komplementarnych, aby potwierdzić obecność wzorowanego DNA na szkiełku oraz obecność CMO na powierzchni komórek za pomocą cytometrii przepływowej (patrz Krok 8 protokołu).

Schemat procesu mikromacierzy DNA, obejmujący naświetlanie UV, wiązanie aminy-DNA i hybrydyzację komórek.
Rycina 1: Przegląd protokołu CMO-DPAC. Najpierw tworzony jest preparat z wzorem DNA poprzez pokrycie szklanego slajdu z funkcjonalizacją aldehydową pozytywnym fotorezystem, zasłonięcie go maską z folii w pożądanym wzorze i naświetlenie światłem UV. Naświetlony fotorezyst jest wypłukiwany wywoływaczem, co odsłania regiony slajdu aldehydowego i umożliwia wiązanie funkcjonalizowanego aminą DNA z powierzchnią. Następnie komórki są znakowane CMO i przepływane nad powierzchnią. DNA na błonie komórkowej hybrydyzuje z DNA na powierzchni, co prowadzi do adhezji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wprowadzanie DNA do błony komórkowej za pomocą nici kotwiczących, proces stabilizacji, schemat z komorą przepływową PDMS.
Rysunek 2: Komórki są znakowane za pomocą CMO w procesie etapowym. Najpierw uniwersalna nić kotwicząca (Universal Anchor Strand) zmodyfikowana cholesterolem jest prehybridyzowana z nicią adapterową (Adapter Strand). Następnie roztwór uniwersalnej nici kotwiczącej i adaptera jest mieszany z zawiesiną komórek. Cholesterol w kompleksie uniwersalnej nici kotwiczącej i adaptera wbudowuje się w błonę komórkową. Po inkubacji do zawiesiny komórek dodaje się uniwersalną nić współkotwiczącą (Universal Co-Anchor Strand) zmodyfikowaną cholesterolem, która hybridyzuje z uniwersalną nicią kotwiczącą i wbudowuje się w błonę komórkową. Dodanie drugiej cząsteczki cholesterolu zwiększa wypadkową hydrofobowość kompleksu DNA i stabilizuje go w obrębie błony²⁶. Po wypłukaniu nadmiaru DNA komórki są zagęszczane i przenoszone do komory przepływowej PDMS na powierzchni z naniesionym wzorem. Koniec 3' nici adapterowej hybridyzuje z nicią DNA powierzchniową (Surface DNA Strand) na szkiełku przedmiotowym, co prowadzi do adhezji do szkiełka specyficznie w obszarach funkcjonalizowanych komplementarnym DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces fotowzorowania DNA i tworzenie wzorów komórkowych z użyciem fotorezystu; schemat.
Rysunek 3: Fotolitografia jest wykorzystywana do tworzenia szkiełek z wzorem DNA, które ostatecznie wyznaczają rozmieszczenie komórek. (A) Przegląd procesu fotolitografii. Szkiełko z grupami aldehydowymi poddawane jest powłoce z pozytywnego fotorezystu metodą spin-coatingu. Światło UV naświetla szkiełko przez przezroczystą fotomaskę, która jest przepuszczalna w miejscach, w których pożądana jest adhezja komórek. Po wywołaniu szkiełka obszary, które były wcześniej wystawione na działanie UV, mają teraz odsłonięte grupy aldehydowe. Następnie na szkiełko nanosi się kroplowo roztwór oligonukleotydu DNA z funkcjonalną grupą aminową o stężeniu 20 µM i rozprowadza go po wzorowanych obszarach. Szkiełko jest następnie wygrzewane, aby doprowadzić do powstania wiązań Schiffa (C=N) pomiędzy grupami aminowymi a aldehydowymi, co stanowi odwracalne wiązanie kowalencyjne²⁹. Następująca aminacja redukcyjna za pomocą 0,25% borowodorku sodu w PBS przekształca zasadę Schiffa w aminę wtórną, co skutkuje nieodwracalnym wiązaniem pomiędzy DNA a szkiełkiem. Pozostały fotorezyst można następnie usunąć, płucząc acetonem. (B) Proces ten można powtarzać, aby tworzyć wieloskładnikowe wzory DNA, a tym samym przeprowadzać eksperymenty z wieloma populacjami komórek. (i) Po utworzeniu wzoru z pierwszego oligonukleotydu, szkiełko jest ponownie pokrywane fotorezystem, a procedura przebiega tak jak wcześniej. Aby stworzyć wzory z wielu nici DNA, konieczne jest wyrównanie fotomasek za pomocą markerów referencyjnych. (ii) Każdy typ komórek poddawanych wzorowaniu różni się 20-bazową domeną modularną nici adapterowej (Adapter Strand). Dzięki zastosowaniu ortogonalnych zestawów komplementarnych oligonukleotydów, można tworzyć wzory dla wielu typów komórek bez ryzyka krzyżowej adhezji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Zajęcie DNA przez komórki; wykres stężenia względem procentu oraz analiza mikroarray fluorescencyjnego.
Rycina 4: Adhezja komórek znakowanych CMO do wzorów DNA wzrasta w funkcji stężenia CMO podczas znakowania. W tym eksperymencie Uniwersalna Kotwica + Nić Adapterowa (prehybrydyzowane) oraz Uniwersalna Współkotwica były stosowane w równych stężeniach. Stężenie odnosi się do stężenia CMO w zawiesinie komórkowej podczas znakowania komórek CMO. (A) Ilościowe określenie procentu plamek DNA o średnicy 15 µm, które zostały zajęte przez znakowane CMO komórki MCF10A, w funkcji stężenia CMO podczas znakowania komórek. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe z trzech eksperymentów. (B) Reprezentatywne obrazy wzorów DNA (magenta) i przylegających komórek MCF10A (cyjan) przy różnych stężeniach CMO. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia oligo modyfikowanych cholesterolem/lipidami, schemat organizacji komórek, warstwy hybrydyzacji.
Rysunek 5: CMO-DPAC może być wykorzystywany do tworzenia dwuwymiarowych wzorów komórkowych, które następnie mogą zostać osadzone w trójwymiarowym hydrożelu do hodowli i/lub układane warstwowo w celu stworzenia struktur wielowarstwowych.(A) Bezpośrednie porównanie ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVECs) znakowanych CMO oraz HUVECs znakowanych LMO, przytwierdzonych do liniowego wzoru DNA. Obie metody znakowania komórek skutkują niemal 100% obsadzeniem wzoru DNA. (B) Pojedyncze komórki Madin-Darby Canine Kidney (MDCKs) wykazujące ekspresję H2B-RFP zostały rozmieszczone we wzorze w formie punktów o średnicy 15 µm w odstępach 200 µm, a następnie osadzone w Matrigel. Po 120 h hodowli powstałe cysty nabłonkowe zostały utrwalone i zabarwione na obecność E-kadheryny, aktyny i kolagenu IV. Sferoid w białej ramce przedstawiono w powiększeniu. Pasek skali = 50 µm. (C) Wielowarstwowe struktury komórkowe mogą być tworzone poprzez znakowanie oddzielnych populacji komórek komplementarnymi nićmi adapterowymi (Adapter Strands) i sekwencyjne tworzenie wzorów tak, aby każda nowo dodana warstwa komórek przylegała do poprzedniej warstwy komórkowej. (i) Schemat sekwencyjnego tworzenia wzorów populacji komórek w celu uzyskania struktur wielowarstwowych. (ii) Przy użyciu tego procesu stworzono trójwarstwowe agregaty komórkowe MCF10As (wizualizowane za pomocą barwników). Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wizualna reprezentacja DNA, logo Berkeley i UCSF, symboliczny schemat współpracy w badaniach genetycznych.
Rysunek 6: Możliwość wzorowania wielu typów komórek bez kontaminacji krzyżowej lub utraty adhezji. Wiele zmodyfikowanych aminą oligosów DNA zostało sekwencyjnie naniesionych w formie wzorów na szkiełko aldehydowe i wyrównanych przy użyciu metalowych markerów fiducyjnych. Trzy populacje MCF10As (cyjan, magenta, żółty) zostały zabarwione unikalnymi barwnikami znakowanymi komplementarnymi CMO, a następnie naniesione na szkiełko, co zaowocowało obrazem logo UC Berkeley i UCSF. Pasek skali 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina dodatkowa 1: Przykładowe zdjęcia zestawu do fotolitografii blatu laboratoryjnego. (A) Przedmiotowy szkiełko na powlekaczu wirówkowym, pokryte pozytywnym fotorezystem, przed wirowaniem. (B) Zdjęcie przezroczystej fotomaski. (C) Podczas naświetlania fotomaska jest umieszczona pomiędzy szkiełkiem pokrytym fotorezystem a szklanym krążkiem. (D) Obudowa lampy UV została wykonana z zaadaptowanego pojemnika na odpady ostre. (E) Szkiełko zanurzone w roztworze wywoływacza. (F) Wywołane szkiełko. (G) Roztwór DNA modyfikowanego aminą rozprowadzony na wzorowanych obszarach szkiełka. (H) Komory przepływowe PDMS umieszczone na wzorowanych obszarach szkiełka. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 2: Przykłady typowych błędów w tym protokole. (A) (i) Niedostateczne wypalanie przed ekspozycją na UV lub zbyt długie wywoływanie elementów po ekspozycji może prowadzić do powstania elementów o poszarpanych krawędziach i nieregularnych rozmiarach. (ii) Przykład prawidłowo ufotopatternowanego slajdu z czystymi krawędziami wokół elementów, jednolitym rozmiarem elementów i brakiem widocznych pęknięć w wzorze. Pasek skali = 50 µm. (B) Gęstość komórek ma krytyczne znaczenie dla wydajności patternowania. Podczas obserwacji komórek na wzorze pod mikroskopem pomiędzy komórkami powinno występować niewiele przerw, co obrazuje przykład na zdjęciu po lewej. Pasek skali = 50 µm. (C) Patternowane komórki mogą być wrażliwe na siły hydrodynamiczne wynikające ze zbyt intensywnego pipetowania, co może doprowadzić do uszkodzenia i odrywania się patternowanych komórek. Wielowarstwowe agregaty komórkowe są szczególnie podatne na takie uszkodzenia, ponieważ jedna komórka u podstawy podtrzymuje strukturę złożoną z wielu komórek. (i) Tablica agregatów komórkowych pomyślnie zatopionych w Matrigelu. (ii) Siatka agregatów komórkowych, które oderwały się w wyniku zbyt intensywnego pipetowania lepkiego Matrigelu. (D) Może dochodzić do grudkowania komórek, szczególnie w przypadku komórek nabłonkowych. Grudki te są zazwyczaj homotypowe, ale mogą być heterotypowe (komórki przylegające do już patternowanych komórek innego typu), jeśli komórki są szczególnie lepkie. Zdjęcie przedstawia trzy różne populacje MCF10As patternowane na tablicy składającej się z trzech różnych plamek DNA o rozmiarze pojedynczej komórki (15 µm). Większość plamek DNA ma przytwierdzone 2-4 komórki. Grudkowanie można wyeliminować poprzez traktowanie EDTA lub odfiltrowanie grudek przed patternowaniem. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 3: Nakładające się fotowzory skutkują obecnością obu oligonukleotydów w zmniejszonym stężeniu. Dwa ortogonalne, modyfikowane aminą oligonukleotydy zostały poddane sekwencyjnemu fotowzorcowaniu: najpierw powstała linia pionowa (Strand 1), a następnie linia pozioma, która na nią nachodziła (Strand 2). Oligonukleotydy zwizualizowano następnie poprzez hybrydyzację z fluorescencyjnymi oligonukleotydami komplementarnymi. (A) Obraz fluorescencyjny Strand 1. (B) Ilościowe oznaczenie profilu fluorescencji Strand 1 wzdłuż pionowej linii o długości 100 µm obejmującej obszar nakładania. (C) Obraz fluorescencyjny Strand 2. (D) Ilościowe oznaczenie profilu fluorescencji Strand 2 wzdłuż poziomej linii o długości 100 µm obejmującej obszar nakładania. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Ilościowe oznaczenie kompleksów DNA na powierzchni komórek w zależności od stężenia użytego do znakowania CMO. Komórki HUVEC znakowano roztworami CMO o różnych stężeniach, przemyto, a następnie inkubowano z fluorescencyjną nicią komplementarną. W celu przeprowadzenia ilościowej cytometrii przepływowej i oszacowania liczby kompleksów DNA na powierzchni komórek w zależności od stężenia CMO podczas znakowania zastosowano zestaw mikrosfer MESF (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 5: Znakowanie CMO nie stymuluje odpowiedzi TLR9. Przeprowadzono eksperyment, aby sprawdzić, czy znakowanie CMO wywoła mechanizm wykrywania DNA przez TLR9 oraz czy będzie to zależne od obecności motywów CpG w sekwencji nici adapterowej (Adapter Strand). Komórki HEK wykazujące ekspresję mysiego TLR9 inkubowano przez noc z 0,2 µM ODN 1826 (agonisty TLR9 zawierającego CpG), CMO Universal Anchor + Universal Co-Anchor + Adapter Strand zawierającego tę samą sekwencję co ODN 1826 (CMO-CpG) lub CMO Universal Anchor + Universal Co-Anchor + Adapter Strand zawierającego podobną sekwencję, ale z zastąpieniem motywów CpG przez GpC (CMO-GpC). Stymulacja TLR9 skutkowałaby produkcją SEAP (sekrecyjnej embrionalnej fosfatazy zasadowej). Sekrecję SEAP oznaczono za pomocą testu kolorymetrycznego (absorbancja). Warunki traktowania porównano z komórkami spoczynkowymi, które traktowano wyłącznie PBS. Inkubacja z CMO-GPC nie stymulowała ekspresji TLR9. Inkubacja z CMO-CpG dała wynik nieco wyższy niż w przypadku komórek spoczynkowych, lecz znacznie niższy niż w przypadku ODN-1826. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 6: Żywotność komórek po procesie znakowania CMO.Aby ocenić wpływ protokołu na żywotność, komórki HUVEC podzielono na cztery populacje: jedna pozostawała w lodzie przez 1 h, jedna została poddana pozornemu znakowaniu za pomocą PBS, ale w pozostałym zakresie przeszła przez wszystkie etapy wirowania i przemywania, jedna została znakowana za pomocą CMO, a jedna została znakowana CMO i przefiltrowana przez filtr 40 µm w celu usunięcia skupisk. Następnie komórki barwiono kalceiną AM oraz homodimerem etydyny, aby ocenić liczbę komórek żywych i martwych. Wszystkie zabiegi doprowadziły do znaczącego spadku żywotności w porównaniu z kontrolą w lodzie (jednoczynnikowa ANOVA z analizą post-hoc Tukeya), jednak mediana żywotności dla znakowania CMO (z filtrowaniem lub bez) wynosiła około 94%. Dane zebrane z trzech niezależnych eksperymentów. * = p < 0.05. **** = p < 0.0001 Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wynik	Możliwa(-e) przyczyna(-y)	Sugerowane poprawki
Fotolitografia – pęknięcia struktur	Niejednorodne lub niewystarczające wygrzewanie wstępne (soft-bake)	Wydłużyć czas wstępnego wypalania (soft-bake) do 3 minut; zweryfikować rzeczywistą temperaturę płyty grzejnej i w razie potrzeby zwiększyć temperaturę
Fotolitografia – krawędzie struktur nie są ostre lub w ich wnętrzu pozostał fotorezyst	Niedorozwój	Wydłużyć czas przebywania preparatu w roztworze wywoływującym; zastosować delikatne mieszanie
Fotolitografia – cechy niespójne w obrębie płytki	Światło UV może nie być wycentrowane lub nie być odpowiednio skupione	Dostosować ustawienie światła UV, aby zapewnić kolimację wiązki o jednorodnej intensywności
Komórki nie przylegają do wzorowanych punktów z wysoką wydajnością	Niewystarczająca ilość DNA na powierzchni	Potwierdzenie obecności DNA na powierzchni poprzez hybrydyzację preparatu z fluorescencyjnymi komplementarnymi oligonukleotydami, a następnie obrazowanie pod mikroskopem
	Komórki są niewłaściwie znakowane CMO	Dodaj fluorescencyjne oligosy komplementarne do zawiesiny komórek i potwierdź fluorescencję za pomocą cytometrii przepływowej
	Zbyt mała liczba komórek nad wzorem	Zebrać komórki poprzez wypłukanie z komory przepływowej PDMS, odwirować i ponownie zawiesić w mniejszej objętości w celu skoncentrowania komórek
	Zbyt duża ilość pozostałego CMO w zawiesinie komórkowej, hybrydyzująca z DNA na preparacie	Dodaj kolejny etap płukania. Upewnij się, że podczas każdego płukania usuwasz jak największą ilość supernatantu.
	Zbyt silna internalizacja CMO w wyniku czasu i temperatury	Należy pracować szybko po znakowaniu komórek CMO; komórki i slajd należy przechowywać w lodzie oraz stosować odczynniki schłodzone do temperatury 0°C.
Agregacja komórek	Komórki nie zostały w dostateczny sposób rozdzielone podczas trypsynizacji	Do przemywania komórek należy używać PBS + 0,04% EDTA; zawiesinę komórkową należy przepuścić przez 35 µm filtrowanie przed końcowym płukaniem
Komórki przylegają niespecyficznie	Jeśli występuje to w jednym konkretnym obszarze – może to być spowodowane zarysowaniami na szkiełku, niewłaściwym dopasowaniem przepływowych komórek PDMS lub wyciekiem DNA poza obszar wzoru	Należy unikać zarysowań i dbać o to, aby komory przepływowe z PDMS były wyrównane względem obszaru wzoru
Komórki przylegają niespecyficznie	Jeśli komórki przylegają w każdym miejscu – niewystarczające blokowanie lub płukanie	Należy zastosować więcej etapów płukania po wzorcowaniu komórek; podczas płukania należy pipetować próbki z większą intensywnością; przed rozpoczęciem wzorcowania komórek należy zastosować dłuższą blokadę z użyciem 1% BSA; należy przeprowadzić silanizację preparatu (opcjonalny krok 3) lub potwierdzić powodzenie silanizacji poprzez pomiar kąta zwilżania kropli wody
Powstawanie pęcherzyków powietrza wewnątrz komory przepływowej	Błędy pipetowania, nierównomierna powierzchnia hydrofilowa powstała podczas utleniania plazmowego	Jeśli pęcherzyki są małe, należy dodać bufor PBS do wlotu komory przepływowej, aby je wypłukać. W przypadku większych pęcherzyków należy delikatnie nacisnąć komorę przepływową z PDMS, przesuwając pęcherzyki w stronę wlotu lub wylotu.
Komórki początkowo przylegają do wzoru, lecz zostają usunięte podczas etapów płukania, tworzenia wzorów z innymi typami komórek lub dodawania prekursora hydrożelu	Siły ścinające powstałe w wyniku zbyt intensywnego pipetowania mogą spowodować odklejenie się komórek od powierzchni.	Podczas kolejnych etapów przemywania, rund formowania wzorów komórkowych lub dodawania prekursorów hydrożelu należy pipetować delikatniej. Ze względu na lepkość prekursorów hydrożelu istnieje większe ryzyko odklejenia się wzoru, dlatego należy zachować szczególną ostrożność. Struktury wielowarstwowe mają tendencję do bycia ciężkimi w górnej części i są bardziej podatne na przesunięcie lub odklejenie.
Tkanka odkształca się podczas transferu 3D	Hydrożel przylega do szkiełka	Potwierdzenie hydrofobowości szkiełka za pomocą pomiarów kąta zwilżania
		Użyć żyletki, aby całkowicie podnieść PDMS z obu krawędzi, umożliwiając dopływ PBS pod tkankę.
		Może to wystąpić w przypadku czystych hydrożeli kolagenowych – należy rozważyć dostosowanie stężenia białka lub składu hydrożelu
	Komórki nie przenoszą się wraz z hydrożelem i pozostają na szkiełku	Zwiększyć stężenie Turbo DNAse lub wydłużyć czas inkubacji
	Hydrożel nie jest wystarczająco stały	Zwiększyć czas inkubacji i/lub zmodyfikować mechanizm żelowania w przypadku rozważanego hydrożelu (np. w przypadku kolagenu upewnić się, że pH jest prawidłowe)
	Rozdzieranie hydrożelu podczas usuwania PDMS	Przed rozpoczęciem eksperymentu należy uczynić komory przepływowe z PDMS hydrofilowymi za pomocą utleniania plazmowego, aby łatwiej odczepiły się one po dodaniu pożywki. Do odczepiania PDMS należy bardzo ostrożnie używać pincety.

Tabela 1: Przewodnik rozwiązywania problemów w celu identyfikacji i wyeliminowania potencjalnych błędów, które mogą wystąpić podczas realizacji tego protokołu. W szczególności słaba adhezja komórek do wzoru może mieć wiele przyczyn, a niniejszy przewodnik powinien pomóc w identyfikacji i rozwiązaniu tych problemów.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół modelowania komórek w wysokiej rozdzielczości w 2D i 3D do eksperymentów z hodowlami komórkowymi in vitro. W przeciwieństwie do wcześniej opublikowanych wersji tej metody, prezentowany tutaj protokół skupia się na użyteczności: nie wymaga wysoce specjalistycznego sprzętu, a wszystkie odczynniki można kupić od dostawców, zamiast wymagać niestandardowej syntezy. W przeciwieństwie do innych metod mikromodelowania komórek, ta metoda jest szybka i niezależna od typu komórki: nie wymaga specyficznej adhezji do białek macierzy zewnątrzkomórkowej¹⁵. Komórki wymodelowane za pomocą CMO-DPAC mogą być osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej, takiej jak Matrigel lub kolagen, co skutkuje hodowlami 3D o znacznie wyższej rozdzielczości przestrzennej niż jest to obecnie możliwe przy użyciu metod opartych na druku ekstruzyjnym²². CMO-DPAC może być używany do tworzenia setek lub tysięcy mikroskopijnych cech na jednym szkiełku, co pozwala na wykonanie wielu powtórzeń w tym samym czasie.

Jednym z najważniejszych parametrów decydujących o powodzeniu tego protokołu jest gęstość komórek dodanych do komórek przepływowych na szczycie wzorzystego szkiełka. Idealnie gęstość powinna wynosić co najmniej 25 milionów komórek/ml. Po załadowaniu do komórek przepływowych, ta gęstość komórek powoduje prawie ciasno upakowaną monowarstwę komórek powyżej wzoru (rysunek uzupełniający 2B). Te wysokie zagęszczenie komórek maksymalizuje prawdopodobieństwo, że komórka osiądzie bezpośrednio na plamce DNA i przylega. Zmniejszenie gęstości komórek zmniejszy ogólną wydajność tworzenia wzorów. Kolejnym krytycznym krokiem w tym protokole jest dokładne ponowne zawieszenie komórek w PBS lub pożywce bez surowicy przed dodaniem roztworu CMO. CMO bardzo szybko dzielą się na błony komórkowe, a dodanie roztworu CMO bezpośrednio do osadu komórkowego spowoduje niejednorodne znakowanie komórek. Po dodaniu roztworu CMO do zawiesiny komórek ważne jest, aby dokładnie wymieszać przez pipetowanie, tak aby komórki były jednolicie oznakowane CMO. Po inkubacji konieczne jest dokładne wypłukanie nadmiaru CMO poprzez wielokrotne etapy wirowania i mycia. Nadmiar wolnego CMO obecnego w zawiesinie komórki zwiąże się z wzorcowym DNA zmodyfikowanym aminami na szkiełku szkiełkowym, blokując hybrydyzację i adhezję komórek zmodyfikowanych przez CMO w zawiesinie. Czas jest również kluczowym czynnikiem w tym protokole. Ważne jest, aby pracować tak szybko, jak to możliwe podczas korzystania z CMO i utrzymywać komórki na lodzie, aby zminimalizować internalizację CMO i zmaksymalizować żywotność komórek. Eksperymenty z cytometrią przepływową wykazały, że CMO nie utrzymują się na powierzchni komórki tak długo jak LMO, z 25% utratą kompleksów CMO w ciągu dwóch godzin inkubacji na lodzie³⁶. Co więcej, żywotność komórek będzie się zmniejszać wraz ze wzrostem czasu obsługi komórek. Żywotność można zmaksymalizować, pracując szybko, utrzymując komórki na lodzie, używając lodowatych odczynników i używając pożywek bez surowicy w celu dostarczenia niektórych składników odżywczych.

Chociaż CMO-DPAC może być potężnym sposobem badania biologii komórki poprzez modelowanie komórek z dużą precyzją, ma swoje ograniczenia. Eksperymenty CMO-DPAC mogą być trudne, zwłaszcza że złożoność eksperymentu jest dodawana do wielu typów komórek, warstw lub hodowli komórek 3D (plik uzupełniający 1). Niepowodzenia eksperymentalne mogą być częste podczas uruchamiania tego protokołu, jak opisano w tabeli 1. Dlatego zalecamy, aby użytkownicy przeprowadzili kontrole jakości (potwierdzenie, że DNA jest obecne na szkiełku, potwierdzenie, że komórki są wystarczająco oznakowane DNA (Krok 8), potwierdzenie, że nadmiar komórek został dokładnie wypłukany itp.), aby upewnić się, że eksperyment się powiedzie i zidentyfikować kroki, które mogą wymagać dalszej optymalizacji. Mamy nadzieję, że informacje zawarte w tym manuskrypcie i jego plikach uzupełniających ułatwią rozwiązywanie wszelkich wymaganych problemów.

Cholesterol jest bioaktywną cząsteczką, której internalizacja może wpływać na metabolizm komórkowy, ekspresję genów i płynność błony^37,38. W poprzednim badaniu porównano wpływ na ekspresję genów komórek znakowanych CMO i LMO przy użyciu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Komórki HEK znakowane CMO miały zmienioną ekspresję genów w porównaniu z komórkami nieznakowanymi i znakowanymi LMO³⁶. Znakowanie komórek za pomocą CMO spowodowało zróżnicowaną ekspresję (> 1,5-krotnie) ośmiu genów w stosunku do nieznakowanych kontroli, w tym AP2B1, który został powiązany z transportem cholesterolu i sfingolipidów (GeneCards) oraz MALAT1, długiego, niekodującego RNA, który reguluje akumulację cholesterolu³⁹. Chociaż niewielkie, te odpowiedzi transkrypcyjne mogą jednak stanowić problem, jeśli dany eksperyment bada metabolizm, dynamikę błon lub inne szlaki związane z cholesterolem w komórkach.

Protokół ten jest elastyczny i można go dostosować do potrzeb każdego eksperymentu. Ponieważ CMO wstawia się do błony lipidowej zamiast używać żadnego specyficznego receptora, metoda jest niezależna od typu komórki (wykazano tutaj, że HUVEC, MCF10As, HEK i MDCK). Chociaż cholesterol jest inną hydrofobową kotwicą niż nasze wcześniej opublikowane LMO, do tej pory odkryliśmy, że zachowują się one podobnie. W związku z tym oczekiwalibyśmy, że CMO będą pracować z każdą z szerokiej gamy typów komórek, które wcześniej opublikowaliśmy za pomocą LMO, w tym między innymi z nerwowymi komórkami macierzystymi, fibroblastami, komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej, komórkami nowotworowymi i pierwotnymi komórkami nabłonka sutka 6,23,27,29,36 . Znakowanie CMO nie stymuluje TLR9, co sugeruje, że protokół jest kompatybilny z komórkami odpornościowymi. Włączenie CMO do błony jest funkcją całkowitej wielkości komórki i stopnia ujemnego ładunku w glikokaliksie komórkowym³⁵. W związku z tym dołączyliśmy protokół (Krok 8) do testowania zakresu włączenia membrany, który można szybko optymalizować. Specyficzne cechy każdego wzorca komórki będą się nieuchronnie różnić w zależności od projektu eksperymentalnego (więcej wskazówek można znaleźć w pliku uzupełniającym 1). Chociaż opisany powyżej protokół fotowzorcowania do modelowania DNA jest zalecany, każda metoda przestrzennego ograniczania kropelek roztworu aminowo-DNA powinna działać, taka jak użycie drukarek kropelkowych o wysokiej rozdzielczości. Rozdzielczość wzoru i minimalne odstępy między elementami będą się różnić w zależności od zastosowanej metody. Teoretycznie możliwe jest również połączenie sekcji fotowzorców DNA tego protokołu z innymi metodami, które zostały użyte do znakowania komórek DNA, takich jak DNA zhybrydyzowane z palcami cynkowymi wyrażonymi przez błonę⁴⁰, przy użyciu DNA sprzężonego z NHS⁴¹ i reagujące reszty kwasu azydosjalowego na powierzchni komórki z DNA sprzężonym z fosfiną⁴². CMO-DPAC może być stosowany w różnych eksperymentach, które wymagają ścisłej kontroli nad odstępami między komórkami, w tym w badaniach interakcji między parami komórek, eksperymentach z kokulturą dotyczących transferu sygnałów z komórek "nadawczych" do komórek "odbiorczych" oraz badaniach wpływu pobliskich sygnałów zewnątrzkomórkowych na różnicowanie komórek macierzystych⁶^.^{Lokal mieszkalny 29}. Metoda może być również wykorzystana do tworzenia mikrotkanek, które można wykorzystać do badania migracji komórek w trzech wymiarach, samoorganizacji komórek w tkanki^23,27 oraz dynamicznej interakcji między komórkami a ECM²⁷. Mamy nadzieję, że ten protokół zapewni naukowcom dostępną platformę do odkrywania nowych zastosowań wzorców komórkowych opartych na DNA w wysokiej rozdzielczości w ich własnych laboratoriach.

Oświadczenia

Z.J.G. jest doradcą i udziałowcem w Provenance Biosciences.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Jeremy'emu Garcii za przetestowanie tego protokołu oraz Bhushanowi Kharbikarowi za przeprowadzenie szkolenia na temat sprzętu w UCSF Biomedical Micro and Nanotechnology Core. Badania te były częściowo wspierane przez granty z Programu Badań nad Rakiem Piersi Departamentu Obrony (W81XWH-10-1-1023 i W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315, DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A i 1R21CA182375-01A1), NSF (MCB1330864) oraz UCSF Center for Cellular Construction (DBI-1548297), Centrum Nauki i Technologii NSF. O.J.S został ufundowany przez stypendium NSF Graduate Research Fellowship, stypendium Siebel i stypendium P.E.O. Scholarship. Z.J.G i A.R.A. są badaczami Chan-Zuckerberg BioHub.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-dołkowa komorowa szklana pokrywowa z nieusuwalnymi studzienkami	Thermo Fisher Scientific	155379
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	A6283
Adapter z zewnętrznym gwintem SM1 i wewnętrznym gwintem SM3	ThorLabs	SM3A1
Dysfabrykowane aldehydem Schott		Nexterion Slide AL	otwarciu przechowywać w suchych warunkach.
Wszystkie plastikowe strzykawki, 1 ml	Fisher Scientific	14-817-25
Amino-Modified DNA Oligo	IDT	n/a	Zobacz plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z sugerowanymi sekwencjami.
Asferyczna soczewka kondensatorowa	ThorLabs	ACL7560
Tarcza borokrzemianowa o średnicy 6 cali x grubości 1/2 cala	Chemglass	CG-1906-23
Naczynia do hodowli komórkowych w stylu 60x15 mm	Corning	353002
Oligo modyfikowany cholesterolem	IDT	nie dotyczy	Patrz plik uzupełniający 1, aby uzyskać sugerowane sekwencje.
Diamond Scribe	Excelta	475B
Oligonukleotyd DNA	IDT	n/a	Sugerowane sekwencje znajdują się w pliku uzupełniającym 1.
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Thermo Fisher Scientific	14190250
Alkohol izopropylowy	Sigma-Aldrich	278475
Matrigel Matrix, Obniżony czynnik wzrostu	Corning	354230
Chlorek metylenu (stabilizowany/certyfikowany ACS)	Fisher Scientific	D37-4
MF-321 Developer	Kayaku Advanced Materials	n/a
Microposit S1813 Dodatni fotorezystor	Kayaku Zaawansowane materiały	n/a
Ø Regulowany tubus obiektywu 3", skok 0,81"	ThorLabs	SM3V10
Piekarnik	Thermo Scientific	51-028-112H
PE-50 Kompaktowy stołowy system czyszczenia plazmowego	Wytrawianie plazmowe	PE-50
Maska fotograficzna (niestandardowa)	Usługi CAD/Art	nie dotyczy	Minimalny rozmiar funkcji gwarantowany przez CAD/Art Services to 10 mikronów.
Żyletki	Fisher Scientific	12-640
RCT Podstawowa płyta grzejna	IKA	3810001
Wafel krzemowy (100 mm)	University Wafer	590
Borowodorek sodu, 98%, granulat	Acros Organics	419471000
Zestaw do powlekania wirowego	Instras	SCK-200	Jest to tania opcja, ale wystarczy każda powlekarka, która może utrzymać prędkość 3000 obr./min.
SU-8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU-8 Developer	Microchem	Y020100 4000L1PE
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych		Igły strzykawkowe Dow
	Sigma-Aldrich	Z192341
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Prąd	ThorLabs	LEDD1B
Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylodimetylochlorosilan	Gelest	SIT8170.0
Trietyloamina	Sigma-Aldrich	90335
Pęseta Turbo DNase	Thermo Fisher Scientific	AM2238
Styl N7	VWR	100488-324	Zakrzywiony kształt tej pęsety jest niezbędny do delikatnego zbierania komórek przepływowych PDMS zawierających wzorzyste tkanki.
UV LED (365 nm, 190 mW (min) zamontowana dioda LED, 700 mA)	Pęseta waflowa ThorLabs	M365L2
	Agar Scientific	T5063
WHEATON Suszy-uszczelniony eksykator próżniowy	Millipore Sigma	W365885

Po 2646340

Bibliografia

Kreeger, P. K., Strong, L. E., Masters, K. S. Engineering approaches to study cellular decision-making. Annual Review of Biomedical Engineering. , 49-72 (2018).
Goubko, C. a, Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering C. 29 (6), 1855(2009).
Sun, W., et al. The bioprinting roadmap. Biofabrication. 12 (2), 022002(2020).
Liu, W. F., Chen, C. S. Cellular and multicellular form and function. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (13), 1319-1328 (2007).
Duffy, R. M., Sun, Y., Feinberg, A. W. Understanding the role of ECM protein composition and geometric micropatterning for engineering human skeletal muscle. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2076-2089 (2016).
Chen, S., et al. Interrogating cellular fate decisions with high-throughput arrays of multiplexed cellular communities. Nature Communications. 7, 10309(2016).
Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
Rao, N., et al. A co-culture device with a tunable stiffness to understand combinatorial cell-cell and cell-matrix interactions. Integrative Biology. 5 (11), 1344(2013).
Sriraghavan, V., Desai, R. A., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. S. Micropatterned dynamically adhesive substrates for cell migration. Langmuir. 26 (22), 17733-17738 (2010).
Wong, L., Pegan, J. D., Gabela-Zuniga, B., Khine, M., McCloskey, K. E. Leaf-inspired microcontact printing vascular patterns. Biofabrication. 9 (2), 021001(2017).
Chen, T. H., et al. Directing tissue morphogenesis via self-assembly of vascular mesenchymal cells. Biomaterials. 33 (35), 9019-9026 (2012).
Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939-956 (2017).
Lin, C., Khetani, S. R. Micropatterned co-cultures of human hepatocytes and stromal cells for the assessment of drug clearance and drug-drug interactions. Current Protocols in Toxicology. 2017, 1-23 (2017).
Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5722-5726 (2007).
D'Arcangelo, E., McGuigan, A. P. Micropatterning strategies to engineer controlled cell and tissue architecture in vitro. BioTechniques. 58 (1), 13-23 (2015).
Martinez-Rivas, A., González-Quijano, G. K., Proa-Coronado, S., Séverac, C., Dague, E. Methods of micropatterning and manipulation of cells for biomedical applications. Micromachines. 8 (12), (2017).
Lee, S., et al. Simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils. Journal of Visualized Experiments. (158), e60888(2020).
Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).
Reid, J. A., Mollica, P. M., Bruno, R. D., Sachs, P. C. Consistent and reproducible cultures of large-scale 3D mammary epithelial structures using an accessible bioprinting platform. Breast Cancer Research. , 1-13 (2018).
Wang, Z., Lee, S. J., Cheng, H. -J., Yoo, J. J., Atala, A. 3D bioprinted functional and contractile cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 70, 48-56 (2018).
Miri, A. K., et al. Effective bioprinting resolution in tissue model fabrication. Lab on a Chip. 19 (11), 2019-2037 (2019).
Todhunter, M. E., et al. Programmed synthesis of three-dimensional tissues. Nature Methods. 12 (10), 975-981 (2015).
Todhunter, M. E., Weber, R. J., Farlow, J., Jee, N. Y., Gartner, Z. J. Fabrication of 3D microtissue arrays by DNA programmed assembly of cells. Current Protocols in Chemical Biology. 8 (3), 147-178 (2016).
Csizmar, C. M., Petersburg, J. R., Wagner, C. R. Programming cell-cell interactions through non-genetic membrane engineering. Cell Chemical Biology. 25 (8), 931-940 (2018).
Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
Hughes, A. J., et al. Engineered tissue folding by mechanical compaction of the mesenchyme. Developmental Cell. 44 (2), 165-178 (2018).
Weber, R. J., et al. Rapid organoid reconstitution by chemical micromolding. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 1851-1855 (2016).
Scheideler, O. J., et al. Recapitulating complex biological signaling environments using a multiplexed, DNA-patterning approach. Science Advances. 6 (12), (2020).
Viola, J. M., et al. Guiding cell network assembly using shape-morphing hydrogels. Advanced materials (Deerfield Beach, Fla.). , 2002195(2020).
Mohammad, A., Davis, M., Aprelev, A., Ferrone, F. A. Note: Professional grade microfluidics fabricated simply. Review of Scientific Instruments. 87 (10), 1-4 (2016).
Lee, O. J., Chuah, H. S., Umar, R., Chen, S. K., Yusra, A. F. I. Construction of cost effective homebuilt spin coater for coating amylose-amylopectin thin films. Journal of Fundamental and Applied Sciences. 9 (2), 279(2018).
Webb, K., Hlady, V., Tresco, P. A. Relative importance of surface wettability and charged functional groups on NIH 3T3 fibroblast attachment, spreading, and cytoskeletal organization. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (3), 422-430 (1998).
Processing Guidelines for: SU-8 2025, SU-8 2035, SU-8 2050, SU-8 2075. Microchem SU-8 2000 Permanent Expoxy Negative Photoresist. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4.pdf 1-5 (2019).
Palte, M. J., Raines, R. T. Interaction of nucleic acids with the glycocalyx. Journal of the American Chemical Society. 134 (14), 6218-6223 (2012).
McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16 (7), 619-626 (2019).
Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 422-429 (2010).
Luo, J., Yang, H., Song, B. L. Mechanisms and regulation of cholesterol homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (4), 225-245 (2020).
Liu, L., Tan, L., Yao, J., Yang, L. Long non-coding RNA MALAT1 regulates cholesterol accumulation in ox-LDL-induced macrophages via the microRNA-17-5p/ABCA1 axis. Molecular Medicine Reports. 21 (4), 1761-1770 (2020).
Mali, P., Aach, J., Lee, J. H., Levner, D., Nip, L., Church, G. M. Barcoding cells using cell-surface programmable DNA-binding domains. Nature Methods. 10 (5), 403-406 (2013).
Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25 (12), 6985-6991 (2009).
Gartner, Z. J., Bertozzi, C. R. Programmed assembly of 3-dimensional microtissues with defined cellular conductivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. (17), 1-5 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Programowane sk adanie kom rek za pomoc DNA wzorce kom rkowe zestaw do fotolitografii oligonukleotydy modyfikowane cholesterolem adhezja kom rek zatapianie w hydro elu macierze mikrotkanek technika komory przep ywowej przygotowanie zawiesiny kom rkowej ekspozycja na lamp UV

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA