Udostępniamy szczegółowy protokół interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji u owadów z rzędu Odonata (ważki i ważki) przy użyciu ważki niebieskoogoniastej (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) i ważki srokatej (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Artykuł metodologiczny
Metoda interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji w Odonata
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ważki i ważki (rząd Odonata) reprezentują jedne z najbardziej przodków owadów z metamorfozą, w której drastycznie zmieniają swoje siedlisko, morfologię i zachowanie z larw wodnych na lądowe/powietrzne dorosłe osobniki bez stadium poczwarki. Dorosłe osobniki Odonata mają dobrze rozwinięte widzenie kolorów i wykazują niezwykłą różnorodność kolorów i wzorów ciała u różnych płci, etapów i gatunków. Podczas gdy przeprowadzono wiele badań ekologicznych i behawioralnych nad Odonatą, badania genetyki molekularnej były rzadkie, głównie ze względu na trudności w zastosowaniu analizy funkcjonalnej genów do Odonata. Na przykład interferencja RNA (RNAi) jest mniej skuteczna u Odonata, jak opisano u Lepidoptera. Aby przezwyciężyć ten problem, udało nam się opracować metodę RNAi połączoną z elektroporacją in vivo. Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół, w tym film przedstawiający metodę RNAi za pośrednictwem elektroporacji, w następujący sposób: przygotowanie larw, identyfikacja gatunków, przygotowanie roztworu dsRNA/siRNA i igieł iniekcyjnych, lodowate znieczulenie larw, wstrzyknięcie dsRNA/siRNA, elektroporacja in vivo i indywidualny odchów do momentu pojawienia się dorosłego osobnika. Metoda RNAi za pośrednictwem elektroporacji ma zastosowanie zarówno do ważek (podrząd Zygoptera), jak i ważek (podrząd Anisoptera). W niniejszym protokole przedstawiamy metody dla ważki niebieskoogonowej Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) jako przykładu gatunku ważki oraz ważki srokatej Pseudothemis zonata (Libellulidae) jako kolejnego przykładu gatunku ważek. Jako reprezentatywne przykłady przedstawiamy wyniki RNAi ukierunkowanego na gen syntezy melaniny oksydaza wielomiedziowa 2. Ta metoda RNAi ułatwi zrozumienie różnych funkcji genów zaangażowanych w metamorfozę, morfogenezę, tworzenie wzorów kolorów i inne cechy biologiczne Odonata. Co więcej, protokół ten może być ogólnie stosowany do organizmów niemodelowych, w których RNAi jest mniej skuteczny w supresji genów ze względu na nieskuteczność i niską penetrację.
Wprowadzenie
Ważki i ważki (rząd Odonata) należą do najbardziej pradawnych grup owadów, które wykazują "metamorfozę"1,2. Poprzez metamorfozę drastycznie zmieniają swoje siedlisko, morfologię i zachowanie z larw wodnych na dorosłe osobniki lądowe/powietrzne3. Dorosłe osobniki Odonata mają dobrze rozwinięte widzenie kolorów i reprezentują niezwykłą różnorodność kolorów i wzorów ciała u różnych płci, etapów i gatunków3,4,5. Podczas gdy przeprowadzono wiele badań ekologicznych i behawioralnych nad Odonatą6,7, molekularne badania genetyczne były utrudnione głównie przez trudności w zastosowaniu analizy funkcjonalnej genów do Odonata.
Konwencjonalna metoda interferencji RNA (RNAi), w której wstrzykuje się dwuniciowe RNA (dsRNA) w celu stłumienia funkcji interesującego genu8, okazała się nieskuteczna u owadów Odonata9, jak opisano w Lepidopteran insects10. Z drugiej strony, wcześniejsze doniesienia sugerowały, że RNAi za pośrednictwem elektroporacji jest skuteczne u gatunków Lepidoptera, zwłaszcza w tkankach naskórka11,12,13. Niedawno odkryliśmy, że RNAi, w którym pośredniczy elektroporancja, działa skutecznie u maleńkiej ważki Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, ale N. pygmaea jest stosunkowo rzadkim gatunkiem i dlatego nie nadaje się do molekularnych badań genetycznych.
Większość gatunków Odonata jest klasyfikowana do jednego z dwóch podrzędów, Zygoptera (ważki) lub Anisoptera (prawdziwe ważki)3. Tutaj skupiliśmy się na ważce niebieskoogoniastej Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Rysunek 1A) jako przedstawiciel gatunku Zygopteran i ważki srokatej Pseudothemis zonata (Libellulidae; Rysunek 1B) jako reprezentatywny gatunek Anisotter. Te dwa gatunki należą do najczęstszych gatunków Odonata w naturalnych i miejskich stawach w Japonii, w tym w mieście Tsukuba, a na polu możemy zebrać wiele larw tych dwóch gatunków. Niedawno stworzyliśmy laboratoryjny system hodowli pojedynczych larw I. senegalensis, który umożliwił ciągłe monitorowanie rozwoju i morfogenezy larw Odonata w szczegółach14.
W tym raporcie przedstawiamy udoskonaloną metodę i protokół wideo dla RNAi za pośrednictwem elektroporacji u I. senegalensis i P. zonata. W Japonii I. senegalensis i Ischnura asiatica, które są genetycznie zbliżone, są często spotykane sympatycznie15 i są trudne do odróżnienia u larvae16. Opisujemy również, w jaki sposób można odróżnić dwa gatunki Ischnura na podstawie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).
Do oceny skuteczności RNAi za pośrednictwem elektroporacji, wybieramy gen 2 oksydazy wielomiedziowej (MCO2; znany również jako lakkaza2) jako reprezentatywny gen docelowy, ze względu na widoczny fenotyp jaśniejszego koloru naskórka po wyłączeniu ekspresji genu9. Wiadomo, że MCO2 jest niezbędny do ciemnienia naskórka u różnych gatunków owadów17,18.
Protokół
UWAGA: Ogólny schemat protokołów jest pokazany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie larw ważek lub ważek.
- Zbieraj larwy na polu za pomocą ręcznej siatki.
UWAGA: Larwy I. senegalensis często przylegają do roślin wodnych unoszących się na powierzchni wody, podczas gdy larwy P. zonata często pozostają wśród ściółki liściowej na dnie. W mieście Tsukuba ostatnie larwy I. senegalensis znajdują się głównie od marca do czerwca, a larwy P. zonata od maja do czerwca. Larwy I. senegalensis mogą być hodowane z jaj w laboratory14, ale larwy zebrane w terenie mają wyraźnie wyższy wskaźnik powodzenia w przypadku pojawienia się dorosłych osobników. - Identyfikacja gatunku na podstawie polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) produktów amplifikowanych PCR.
UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy gatunek jest trudny do zidentyfikowania na podstawie wyglądu larw, jak u I. senegalensis.- Przytrzymaj jedną ze skrzeli ogonowych larwy za pomocą kleszczy. Następnie larwa sama odpada od skrzeli ogonowych (powodując autotomię).
UWAGA: Larwy ważek Zygopteran mają zwykle trzy skrzela ogonowe (ryc. 1A). Kiedy zostaną zaatakowane przez drapieżnika, mogą oderwać własne skrzela ogonowe, aby uciec. Jeśli skrzela ogonowe nie są dostępne, część nogi jest wycinana. - Umieścić jedną skrzelę ogonową w 100 μl roztworu PBS [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na2HPO4 i 0,02% KH2PO4 (w/v)] i homogenizować mikserem ręcznym za pomocą tłuczka do osadów.
- Odwiruj mieszaninę przy 5,000 x g przez 10 sekund i poddaj 0,5 μl supernatantu amplifikacji PCR przy użyciu polimerazy DNA i starterów w celu amplifikacji regionu wewnętrznej transkrybowanej przekładki 1 (ITS1) jądrowego DNA.
UWAGA: Wykonaj PCR zgodnie z protokołem producenta. Kombinacja starterów ITS-F0 (5'- GGA, AAG, ATG, GCC, AAA, CTT, GA -3') i 5.8S-AS1 (5'- GCC, GGC, CCT, CAG, CCA, G, -3') może wzmocnić region ITS1 u prawie wszystkich gatunków Odonata19. - Inkubować mieszaninę 1 μl produktu amplifikowanego PCR, 0,3 μl 10x M buforu, 0,1 μl enzymu restrykcyjnego DraI i 1,6 μl wody w temperaturze 37 °C przez 1 h.
UWAGA: Wybierz najlepsze enzymy restrykcyjne, w zależności od kombinacji gatunków. Jeśli nie ma enzymów restrykcyjnych odpowiednich do identyfikacji gatunku, potwierdź to za pomocą sekwencjonowania DNA. - Załaduj 2 μl produktów z barwnikiem ładującym na 2% żel agarozowy i uruchom elektroforezę.
UWAGA: Trudno jest zidentyfikować gatunki przy stosowaniu 1% lub 1,5% żelu agarozowego. - Sprawdź wzorzec elektroforezy, aby zidentyfikować gatunek (Rysunek 2).
UWAGA: Wzorce RFLP są zależne od gatunku i populacji. W populacji Tsukuba I. asiatica ma główne pasmo 400-500 pz, podczas gdy I. senegalensis ma główne pasmo około 200 pz i dodatkowe pasmo mniejsze niż 100 pz (grot strzałki w Ryc. 2). Region ITS1 występuje w wielu kopiach w genomie, a u gatunków Ischnura polimorfizm mikrosatelitarny w regionie ITS1 jest często obecny u tego samego osobnika, wpływając na wzór RFLP.
- Przytrzymaj jedną ze skrzeli ogonowych larwy za pomocą kleszczy. Następnie larwa sama odpada od skrzeli ogonowych (powodując autotomię).
- Zebrane larwy należy wyhodować w laboratorium do momentu użycia do RNAi.
- Umieść każdą larwę osobno w każdym dołku 12-dołkowej płytki z około 3 ml wody.
UWAGA: Larwy I. senegalensis muszą być trzymane pojedynczo, ponieważ często kanibalizują się nawzajem, podczas gdy larwy P. zonata mogą być trzymane w grupie, ponieważ rzadko kanibalizują. - Larwy I. senegalensis należy codziennie karmić krewetkami solankowymi Artemia, a larwy P. zonata dżdżownicami i/lub robakami Tubifex co najmniej dwa razy w tygodniu, aż osiągną odpowiedni etap rozwojowy dla RNAi.
UWAGA: Częste karmienie ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia wskaźnika powodzenia pojawienia się dorosłych osobników. - Zmień wodę, gdy tylko zabrudzi się kałem lub resztkami.
UWAGA: Częsta podmiana wody jest również ważna dla zwiększenia wskaźnika powodzenia wschodu dorosłych osobników. - Oceń odpowiedni etap rozwoju RNAi.
UWAGA: Końcowe larwy I. senegalensis można podzielić na pięć etapów rozwojowych14,20. Pierwszy etap (etap A, zanim skrzydła zaczną się rozszerzać) lub drugi etap (etap B) końcowych larw w stadium rozwojowym jest odpowiedni do eksperymentów z RNAi, biorąc pod uwagę wyraźny fenotyp RNAi po pojawieniu się dorosłego osobnika (patrz Dyskusja). U P. zonata w tym badaniu wykorzystano ostatnie larwy stadium rozwojowego przed rozszerzeniem skrzydeł (odpowiadające stadium A I. senegalensis).
- Umieść każdą larwę osobno w każdym dołku 12-dołkowej płytki z około 3 ml wody.
2. Przygotowanie roztworu dsRNA/siRNA i igieł iniekcyjnych dla RNAi.
UWAGA: Wybierz małe interferujące RNA (siRNA) (krok 2.1) lub dwuniciowe RNA (dsRNA) (krok 2.2) jako rozwiązanie dla RNAi.
- Przygotowanie roztworu siRNA
- Zaprojektuj siRNA za pomocą programu siDirect w wersji 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21, zgodnie z wytycznymi opisanymi wcześniej w Lepidopteran insects22.
- Otrzymaj komercyjnie zsyntetyzowane siRNA.
UWAGA: Sekwencje siRNA ukierunkowane na gen MCO2 I. senegalensis użyte w tym badaniu były następujące: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA AUA -3' dla nici sensownej i 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3' dla nici antysensownej. Jako kontrola negatywna, sekwencje siRNA ukierunkowane na gen wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) były następujące: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' dla nici sensownej i 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' dla nici antysensownej11. - Rozcieńczyć siRNA do 100 μM buforem do wstrzykiwań [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7,4]22.
- Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
- Przygotowanie roztworu dsRNA.
- Wybierz region 300-400 pz dla dsRNA za pomocą programu primer3 w wersji 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 i zaprojektuj zestawy starterów.
- Zaopatrz się w komercyjnie zsyntetyzowane zestawy starterów.
UWAGA: Aby wytworzyć matryce do syntezy dsRNA, zestawy starterów użyte w tym badaniu były następujące: (5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3' dla startera do przodu i 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' dla startera odwrotnego) dla genów MCO2 I. senegalensis (IsMCO2, nr dostępu. LC589180) i (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' dla startera do przodu i 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' dla startera odwrotnego) dla genów MCO2 P. zonata (PzMCO2, nr dostępu LC589179). Jako kontrola ujemna, zestaw starterów dla genu dsRNA ukierunkowanego na gen β-laktamazy (bla) na wektorze klonowania wynosił (5'- CTA, TGT, GGC, GCG, GTA, TTA, T, T, T-3' dla startera do przodu i 5'- CAG AAG TGG TCC TGC AAC T -3' dla startera odwrotnego). - Wyodrębnij RNA z larw Odonata za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji RNA i przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy zgodnie z protokołem producenta.
UWAGA: można również wykorzystać bibliotekę cDNA przygotowaną do analizy sekwencjonowania RNA. - Amplifikuj sekwencje docelowe za pomocą zsyntetyzowanego cDNA i zaprojektowanego zestawu starterów i sklonuj je do wektora klonującego przy użyciu komercyjnej ligazy zgodnie z protokołem producenta.
- Przekształć plazmid w kompetentne komórki E. coli i podnieś pojedynczą kolonię po całonocnej inkubacji.
- PCR-amplifikuj obszar wstawiania za pomocą starterów na wektorze.
- Potwierdź sklonowaną sekwencję za pomocą sekwencjonowania Sangera.
- PCR-amplifikuj wstawkę za pomocą starterów wektorowych zawierających sekwencję promotora polimerazy T724, 25.
UWAGA: W tym badaniu zastosowano następujące startery: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') i T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') 25. - Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta, wymyć DNA za pomocą 50 μl wody destylowanej i zagęścić eluowany roztwór DNA do około 10 μl za pomocą parownika odśrodkowego.
- Syntetyzuj dsRNA przez transkrypcję in vitro zgodnie z protokołem producenta. Użyj łącznie 1000 ng matrycowego DNA i wymyj zsyntetyzowane dsRNA ze 100 μl buforu elucyjnego.
- Zmierzyć stężenie dsRNA za pomocą spektrofotometru i potwierdzić jakość dsRNA za pomocą elektroforezy na 1,5% żelu agarozowym.
UWAGA: Pojedyncze pasmo można zobaczyć, gdy synteza dsRNA zakończy się sukcesem. - Rozcieńczyć dsRNA do 1000 ng/μl buforem elucyjnym i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
- Przygotowanie igieł iniekcyjnych
- Pociągnij szklaną kapilę za pomocą ściągacza do szklanych igieł.
- Umieść końcówkę naciągniętej kapilary na dwustronnej taśmie klejącej i przełam końcówkę kapilary kleszczami.
- Ustawić kapilar na wtryskiwacz.
UWAGA: Łatwiej jest obchodzić się z kapilarą, jeśli nosisz rękawice nitrylowe. - Załaduj roztwór siRNA/dsRNA do przygotowanej kapilary.
UWAGA: Nie używaj kapilary wielokrotnie, ponieważ końcówka wstrzykniętej kapilary może zostać zatkana brudem, ponieważ larwy zebrane na polu żyły w błocie.
3. iniekcja siRNA/dsRNA
UWAGA: Procedura jest nieco inna dla ważek (krok 3.1) i ważek (krok 3.2).
- Iniekcja do larwy Zygopteran (ważki) (np. I. senegalensis).
- Znieczulenie larwy pokrytej mokrym papierem na kruszonym lodzie przez 50-70 sekund (Rysunek 3A-C).
UWAGA: Czas trwania lodowatego znieczulenia zależy od stanu larwy; Jeśli larwa zacznie się poruszać po 70 sekundach znieczulenia lodowatym, stosuje się dodatkowe 70 sekund znieczulenia lodowatego. W przypadku larw, które rzadko się poruszają (np. P. zonata), procedura ta nie jest konieczna. - Przymocuj dwa kołki po obu stronach przedtułowia i przymocuj larwę do stałego stojaka (np. kawałka styropianu) (Rysunek 3D).
UWAGA: Dostosuj położenie i liczbę pinów, w zależności od miejsca wstrzyknięcia. - Rozciągnij błonę międzysegmentową między 7. a 8. segmentem brzusznym w poszukiwaniu RNAi w jamie brzusznej lub między przedpiersiem a synthorax (zrośnięty mezotorax i śródtulat) w poszukiwaniu RNAi w klatce piersiowej za pomocą rąk i kleszczy.
- Utrzymuj membranę międzysegmentową rozciągniętą ręcznie.
- Włóż końcówkę przygotowanej kapilary do rozciągniętej membrany międzysegmentowej (Rysunek 3D, 3F).
- Wstrzyknąć 1 μl roztworu siRNA/dsRNA.
- Znieczulenie larwy pokrytej mokrym papierem na kruszonym lodzie przez 50-70 sekund (Rysunek 3A-C).
- Wstrzyknięcie do larwy Anisopteran (ważki) (np. P. zonata).
- Wytrzyj wodę z powierzchni larw ręcznikiem papierowym.
- W razie potrzeby przymocuj dwie szpilki po obu stronach przedtułowia i przymocuj larwę do stałego stojaka (np. kawałka styropianu) (Rysunek 3H).
UWAGA: Dostosuj położenie i liczbę pinów, w zależności od miejsca wstrzyknięcia. W przypadku P. zonata na tym etapie nie jest konieczne mocowanie larw za pomocą szpilek. - Ręcznie rozciągnij błonę międzysegmentową między 4. a 5. segmentem brzusznym.
- Wykonaj mały otwór cienką igłą w błonie międzysegmentowej między 4. a 5. segmentem brzusznym.
UWAGA: Ta procedura jest konieczna w przypadku wielu gatunków Anisopteran (ważki), ponieważ błona międzysegmentowa jest zbyt twarda, aby bezpośrednio wprowadzić szklaną kapilarę. - Włóż końcówkę przygotowanej kapilary do przygotowanego otworu (Rysunek 3I).
UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 3H, część grzbietowej strony larw odpowiada brzusznej stronie dorosłego osobnika, więc fenotyp pojawia się brzusznie, gdy jest traktowany tak, jak pokazano w Rysunek 3H-J. - Wstrzyknąć 1 μl roztworu siRNA/dsRNA.
4. Elektroporacja in vivo
- W razie potrzeby dodaj więcej szpilek, aby przymocować larwę do stałego stojaka (np. kawałka styropianu).
- Po wstrzyknięciu roztworu siRNA/dsRNA nanieść dwie krople żelu ultradźwiękowego na powierzchnię larwy za pomocą kleszczy.
- Umieść elektrody na żelu ultradźwiękowym, z elektrodą dodatnią po stronie, do której wstrzyknięto roztwór siRNA/dsRNA, a elektrodą ujemną po przeciwnej stronie (Rysunek 3E, 3G, 3J).
UWAGA: Nie dotykaj bezpośrednio naskórka larwy, aby uniknąć palącego efektu elektroporacji. - Generuj 10-krotne impulsy elektroporacyjne (280 ms/s każdy) za pomocą elektroporatora.
UWAGA: Dostosuj napięcie elektroporacji, w zależności od gatunku, etapów i tkanek. W tym badaniu 25 V zastosowano do I. senegalensis i 45 V do P. zonata. - Zetrzyj pozostały żel z powierzchni ręcznikiem papierowym.
- Trzymaj leczone larwy w spoczynku na mokrym ręczniku papierowym przez około jeden dzień w celu wyzdrowienia, a następnego dnia przenieś je do pojemnika hodowlanego.
5. Analiza fenotypowa specyficzna dla danego miejsca
- Trzymaj I. senegalensis pojedynczo na szalce Petriego (5 cm średnicy) zawierającej około 10 ml wody i kawałku ręcznika papierowego, a P. zonata trzymaj w plastikowej klatce z jednorazową siatką z włókniny (eclosion cage14).
- W przypadku I. senegalensis, po zaprzestaniu jedzenia larwy, przenieś je pojedynczo do plastikowej klatki z jednorazową siatką z włókniny.
UWAGA: Nie umieszczaj dwóch lub więcej larw w tej samej klatce. W przeciwnym razie będą się nawzajem kanibalizować natychmiast po osiągnięciu dorosłości. - Po pojawieniu się dorosłego osobnika obserwuj i fotografuj fenotyp wokół obszaru, w którym umieszczono elektrodę dodatnią do elektroporacji.
UWAGA: Fenotyp pojawia się tylko w łaciach. Fenotypy są często trudne do rozpoznania natychmiast po pojawieniu się z powodu niepełnej pigmentacji. - W celu zbadania skuteczności RNAi (np. ilościowego RT-PCR), jeśli fenotyp jest widoczny, należy przeanalizować region i porównać go z regionem bez fenotypu.
UWAGA: Poziomy fenotypu RNAi, a mianowicie wielkość i lokalizacja odbarwienia naskórka, często wykazują znaczne różnice między osobnikami (patrz Ryc. 4). - Utrzymuj wyłonione dorosłe osobniki w 100% EtOH do przyszłych analiz.
UWAGA: Kolor ciała gatunków Odonata szybko blaknie po śmierci, dlatego ważne jest, aby przechowywać je w etanolu przed śmiercią. Etanol czasami odbarwia owady, w takich przypadkach, że owady są zamrażane przed śmiercią.
Wyniki
Zastosowaliśmy powyższy protokół do elektroporacyjnie indukowanego RNAi nakierowanego na gen MCO2 oraz geny kontrolne ujemne (EGFP dla siRNA i bla dla dsRNA) (i) w odwłoku I. senegalensis (Rysunek 4), (ii) w tułowiu I. senegalensis (Rysunek 5) oraz (iii) w odwłoku P. zonata (Rysunek 6). Wyniki eksperymentów RNAi podsumowano w Tabeli 1. Ponieważ ujemnie naładowane siRNA/dsRNA są wbudowywane wyłącznie do dodatnio naładowanych komórek, fenotypy RNAi obserwowano w obrębie regionu, w którym podczas elektroporacji umieszczono elektrodę dodatnią.
Zarówno u I. senegalensis, jak i u P. zonata, zahamowanie pigmentacji melaniną (tj. czarnej, brązowej i czerwonobrązowej) wystąpiło w plamach wokół obszaru, w którym umieszczono elektrodę dodatnią (białe groty strzałek i linie przerywane na Rysunku 4, Rysunku 5 oraz Rysunku 6), gdy RNAi MCO2 przeprowadzono w połączeniu z elektroporacją (Tabela 1), co zgadza się z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi N. pygmaea9. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano żadnych efektów fenotypowych wokół miejsca elektroporacji po wstrzyknięciu genu kontrolnego (siRNA EGFP lub dsRNA bla) (Rysunek 4, Rysunek 5 oraz Rysunek 6, Tabela 1). Ponadto wstrzyknięcie genu MCO2 bez elektroporacji nie wpłynęło na pigmentację osobników dorosłych (Rysunek 4, Tabela 1), co wskazuje, że elektroporacja jest niezbędna dla RNAi u Odonata. Należy zauważyć, że barwy niebieska, zielona i żółta nie są podatne na RNAi genu MCO2 uczestniczącego w syntezie melaniny w kutykuli, co prawdopodobnie odzwierciedla fakt, że kolory te wynikają z obecności granulek pigmentu w komórkach epidermy widocznych przez przezroczystą kutykulę26. Jak pokazano na Rysunku 4, nie stwierdzono istotnych różnic fenotypowych między osobnikami poddanymi traktowaniu siRNA a tymi traktowanymi dsRNA, podczas gdy zaobserwowano znaczną zmienność wielkości i lokalizacji fenotypu RNAi pomiędzy różnymi osobnikami poddanymi tej samej procedurze RNAi (np. porównując dwa przykłady dsRNA IsMCO2 na Rysunku 4).
Aby określić etap rozwojowy najodpowiedniejszy do zastosowania RNAi, porównano skutki fenotypowe zabiegu RNAi na pięciu etapach morfologicznych (etapy A-E) w ostatnim stadium larwalnym I. senegalensis (Rycina 7A). Hamowanie pigmentacji melaniną wywołane RNAi MCO2 zaobserwowano u wszystkich wyklutych osobników dorosłych po wstrzyknięciu na etapach A i B (Rycina 7C). Po wstrzyknięciu na etapach C i D u niektórych osobników dorosłych wyraźnie zaobserwowano supresję pigmentacji melaniną, jednak inne osobniki wykazywały nieprawidłowe zabarwienie spowodowane ranami (Rycina 7B).
Rycina 1: Metody RNAi z wykorzystaniem elektroporacji u Odonata. A. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) jako reprezentatywny gatunek rzęsówki. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) jako reprezentatywny gatunek ważki. C. Ogólny schemat protokołów. Pola niebieskie i pomarańczowe wskazują odpowiednio protokoły dla I. senegalensis oraz P. zonata. Pola fioletowe wskazują wspólne protokoły stosowane dla obu gatunków. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 2: Reprezentatywny wynik identyfikacji gatunków z rodzaju Ischnura w oparciu o polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Grot strzałki wskazuje prążek specyficzny dla I. senegalensis. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: marker drabinkowy 100-bp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Metoda RNAi z wykorzystaniem elektroporacji u Odonata. A-C. Anestezja I. senegalensis w lodowej kąpieli. Groty strzałek wskazują larwę. A. Umieszczenie larwy na kruszonym lodzie z mokrym papierem. B. Powiększony widok larwy na lodzie. C. Larwa przykryta mokrym papierem na lodzie. D-G. Metoda RNAi dla I. senegalensis. D. Iniekcja do klatki piersiowej. E. Elektroporacja klatki piersiowej. F. Iniekcja do odwłoka. G. Elektroporacja odwłoka. H-J. Metoda RNAi dla P. zonata. H. Wykonanie niewielkiego otworu w odwłoku. I. Iniekcja do odwłoka. J. Elektroporacja odwłoka. Strzałki wskazują miejsce wykonania otworu lub iniekcji. +, -: Elektrody dodatnia/ujemna. Liczby wskazują segment odwłoka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Widok grzbietowy fenotypów RNAi na odwłoku I. senegalensis. Białe groty strzałek wskazują obszary zahamowanej melanizacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Widoki boczne i grzbietowe fenotypów RNAi na klatce piersiowej I. senegalensis. Białe groty strzałek i linie przerywane wskazują obszary stłumionej pigmentacji. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Widoki brzuszne fenotypów RNAi w odwłoku P. zonata. Białe groty strzałek i linie przerywane wskazują obszary stłumionej melanizacji. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 7zależny od etapu IsMCO2 skutki RNAi podczas ostatniego stadium larwalnego I. senegalensis. A. Zmiany morfologiczne w złożonych oczach na pięciu etapach morfologicznych (etapy A–E) oraz liczba dni do pojawienia się osobników dorosłych w niniejszym badaniu. Liczby w nawiasach pochodzą z poprzedniego raportu.14. B. Nieprawidłowa pigmentacja spowodowana ranami. Grot strzałki wskazuje miejsce elektroporacji. C. Wpływ RNAi w pięciu stadiach morfologicznych na pigmentację osobników dorosłych u *I. senegalensis*Liczba nad słupkiem określa liczbę osobników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Gatunek | I.senegalensis | P.zonata | |||||||||
| Miejsce wstrzyknięcia | Odwłok | Klatka piersiowa | Odwłok | ||||||||
| siRNA/dsRNA | siRNA | dsRNA | dsRNA | dsRNA | |||||||
| Gen docelowy | IsMCO2 | EGFP | IsMCO2 | IsMCO2 | bla | IsMCO2 | bla | PzMCO2 | PzMCO2 | bla | |
| Elektroporacja | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| Wstrzyknięte larwy | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| Wykluły się osobniki dorosłe | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| Osobniki dorosłe z obszarami o mniejszej pigmentacji (stosunek) | 7 (100%) | 0 (0%) | 13 (100%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 10 (91%) | 0 (0%) | 11 (100%) | 0 (0%) | 0 (0%) | |
Tabela 1. Wpływ RNAi na pigmentację osobników dorosłych u I. senegalensis i P. zonata. Wyniki dla stadium A przedstawiono dla I. senegalensis. IsMCO2: gen oksydazy wielomiedziowej 2 u I. senegalensis, EGFP: gen ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego, bla: gen beta-laktamazy z wektora pGEM-T Easy, PzMCO2: gen oksydazy wielomiedziowej 2 u P. zonata. Wyniki dla genów kontrolnych reprezentują całkowitą liczbę eksperymentów przeprowadzonych przez autorów do chwili obecnej.
Dyskusja
Śmiertelność leczenia RNAi
Stwierdziliśmy, że śmiertelność leczenia RNAi zależy w dużym stopniu od historii hodowli i kondycji larw Odonata. Larwy wkrótce po zebraniu w terenie są na ogół zdrowe i wykazują niską śmiertelność po leczeniu RNAi za pośrednictwem elektroporacji. W przeciwieństwie do tego, larwy hodowane w laboratorium przez długi okres czasu (np. jeden miesiąc) mają tendencję do niskiego wskaźnika powodzenia pojawienia się dorosłych osobników. U I. senegalensis zamiast larw zebranych w terenie można użyć larw wyhodowanych w laboratorium z jaj14, ale wskaźniki sukcesu RNAi przy użyciu larw hodowanych w laboratorium są zwykle znacznie niższe (wiele osobników zmarło podczas metamorfozy) niż w przypadku larw zebranych w terenie. Ponadto częste żerowanie larw i hodowla w czystej wodzie są ważne dla zwiększenia wskaźników powodzenia pojawienia się dorosłych osobników i zmniejszenia śmiertelności leczenia RNAi.
Skuteczność leczenia RNAi
Jak opisano powyżej, poziomy fenotypu RNAi, a mianowicie wielkość i lokalizacja odbarwienia naskórka, często wykazywały znaczne różnice między osobami poddanymi tej samej obróbce RNAi (np. Ryc. 4), ale poziomy penetracji fenotypowej wydają się być niezwykle różne między gatunkami Odonata. Obserwowane regiony fenotypowe były większe i bardziej widoczne u I. senegalensis (ryc. 4-5) niż u P. zonata (ryc. 6) i N. pygmaea9. Różnica ta może wynikać z grubości naskórka na powierzchni larwy, biorąc pod uwagę, że naskórek I. senegalensis jest cieńszy niż naskórek P. zonata i N. pygmaea). Na tyle, na ile to zbadaliśmy, nie stwierdzono wyraźnej różnicy między efektami siRNA i dsRNA (Figura 4, Tabela 1).
Odpowiedni etap rozwoju RNAi
Należy zauważyć, że prawidłowa ocena stopnia zaawansowania larw jest ważna dla efektywnego wykonywania RNAi. Zahamowanie pigmentacji dorosłych było spowodowane przez MCO2 RNAi przed stadium D (około 3 dni przed pojawieniem się osobnika dorosłego), co jest zgodne z poprzednim raportem dotyczącym N. pygmaea9. Fenotypy RNAi obserwowane po wstrzyknięciu w stadiach C i D były mniej widoczne niż te leczone w stadiach A i B, co wskazuje, że stadia C i D mogą być zbyt późne, aby wystarczająco stłumić ekspresję genu. Odpowiedni czas na leczenie RNAi zależy od czasu ekspresji genu, a gen MCO2 wykazuje przejściowo wysoką ekspresję podczas pojawienia się dorosłych9, podobnie jak u innych owadów17,18. U pluskwiaka cuchnącego Plautia stali zaobserwowano knockdown RNAi genu MCO2 od 4 dnia po wstrzyknięciu27, co jest zgodne z obecnymi wynikami.
Nasze poprzednie badanie nad I. senegalensis wykazało, że po stadium B dni do pojawienia się dorosłego osobnika wykazują stosunkowo niewielką zmienność wśród większości larw w końcowym stadium rozwojowym, co sugeruje, że stadium B może odpowiadać początkowi procesu w kierunku pojawienia się dorosłego osobnika, po którym procesy rozwojowe metamorfozy przebiegają w sposób z góry i skoordynowany14. Nieprawidłowości morfologiczne spowodowane ranami często obserwowano, gdy larwy były leczone RNAi w stadiach C i D (ryc. 7B, 7C). Prawdopodobnie wiąże się to z dramatycznym postępem metamorfozy na tych etapach, co sugeruje, że należy unikać leczenia RNAi od etapu C i dalej. Podsumowując, zalecamy, aby do eksperymentów RNAi wykorzystać końcowe larwy w stadium A lub B (lub na etapie przed znacznym rozszerzeniem się skrzydeł larwy).
Przydatność i wyższość metody RNAi za pośrednictwem elektroporacji
Konwencjonalne RNAi jest prostą i potężną metodą eksperymentalną, ale niektóre linie owadów, takie jak motyle10, mszyce28 i ważki9 , wykazują niską wydajność RNAi, dla których ustalenie analizy funkcji genów jest głównym wyzwaniem. W tym badaniu stwierdziliśmy, że RNAi za pośrednictwem elektroporacji może indukować lokalną supresję genów u ważek z prawie 100% skutecznością, przynajmniej w naskórku, jeśli jest leczone na odpowiednich etapach rozwoju (Tabela 1). Ostatnio nokauty genów oparte na CRISPR/Cas9 zostały z powodzeniem zastosowane do różnych owadów, zapewniając potężne narzędzie genetyki molekularnej dla organizmów niemodelowych29. W tym miejscu jednak zwracamy uwagę, że CRISPR/Cas9 jest z pewnością świetny, ale metoda RNAi za pośrednictwem elektroporacji może być pod pewnymi względami lepsza od CRISPR/Cas9.
Po pierwsze, w metodzie RNAi za pośrednictwem elektroporacji, obszar ciała, w którym pojawiają się fenotypy RNAi, może być łatwo kontrolowany eksperymentalnie przez położenie elektrody dodatniej podczas elektroporacji. Ponadto, ponieważ region, w którym ekspresja genu jest tłumiona, jest ograniczony wokół regionu, w którym umieszczono elektrodę dodatnią, fenotypy RNAi można łatwo porównać z fenotypami kontrolnymi obok siebie u tej samej osoby. Po drugie, w porównaniu z metodą CRISPR/Cas9, w której wstrzyknięte jaja muszą być hodowane do dorosłości, aby obserwować fenotypy nokautu, RNAi za pośrednictwem elektroporacji jest lepszy, ponieważ fenotypy knockdown genu można zwykle zaobserwować w znacznie krótszym czasie. Na przykład w przypadku I. senegalensis potrzeba trzech do czterech miesięcy, a w przypadku P. zonata od jednego do dwóch lat od jaj do osobników dorosłych14,30. Jednak, aby zaobserwować fenotypy RNAi w dorosłym naskórku, potrzeba mniej niż jednego miesiąca od wstrzyknięcia dsRNA do końcowych larw w stadium B do pojawienia się dorosłego osobnika zarówno dla I. senegalensis, jak i P. zonata (ryc. 7). Po trzecie, metoda RNAi za pośrednictwem elektroporacji polega na wstrzyknięciu dsRNA do dużych larw, co jest łatwiejsze niż mikroiniekcja do maleńkich jaj wymagana w metodzie CRISPR/Cas9. Ponadto RNAi, w którym pośredniczy elektroporacja, ma zastosowanie do gatunków owadów, których nowo złożone jaja są trudne do zebrania. Na przykład samice P. zonata podczas lotu składają jaja na roślinach pływających na powierzchni wody, a co za tym idzie, trudno jest zebrać ich jaja zarówno w terenie, jak i w laboratorium. W związku z tym spodziewamy się, że protokół ten może mieć ogólne zastosowanie do organizmów niemodelowych, w których konwencjonalna metoda RNAi nie działa skutecznie.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Minoru Moriyama za porady techniczne i wsparcie, Bin Hirota i Ryutaro Suzuki za zebranie larw Odonata oraz Misa Shinya za pomocne komentarze na temat manuskryptu. Prace te były wspierane przez JSPS KAKENHI Granty o numerach JP18J21561 do GO oraz JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 i JP20H04936 do RF.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytka 12-dołkowa | Violamo | VTC-P12 | Do hodowli larw przed wstrzyknięciem Jaja |
| krewetek solankowych | JAPAN PET DESIGN | ||
| Kalibrowana mikropipeta (1-5 i mikro; L) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Tłuczek depozytowy 1,5 ml | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Cyfrowa kamera mikroskopowa o wysokiej defenicji | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Jednorazowa siatka włókninowa | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| Zestaw do ligacji DNA Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Elektroda Takara Bio | 1037A | |
| (1mm) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Kleszcze | KOWA Kleszcze Przemysł | K-10 No1 | |
| Ściągacz igieł do szkła | NARISHIGE | PN-3 | |
| Mikser ręczny | AS ONE | 1-229-02 | |
| Siatka ręczna | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | Do buforu iniekcyjnego |
| Główka do owadów nr 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | Do mocowania larw |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Dla PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | Dla PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | Do buforu iniekcyjnego |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | Do buforu iniekcyjnego |
| Podnośnik laboratoryjny (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | Do regulacji położenia manipulatora |
| LOGIQLEAN Żel do ultradźwięków Twardy typ | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | Do regulacji położenia wtryskiwacza i kapilary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | Do buforu iniekcyjnego |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | Dla PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | Do |
| szalki Petriego PBS (średnica 5 cm) | Iwaki | 1010-060 | Do hodowli larw z wtryskiwanymi wstrzykiwanymi |
| wtryskiwaczami | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Szpilka na owady Shiga Micro ze stali nierdzewnej | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | Do wykonania małego otworu |
| Mikroskop stereoskopowy | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Odwrotna transkryptaza | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | Do amplifikacji PCR z plazmidu |
| Tks Gflex DNA Polimeraza | Takara Bio | R060B | Do amplifikacji PCR ze skrzeli ogonowych |
Bibliografia
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
- Corbet, P. S. Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (1999).
- Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
- Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
- Córdoba-Aguilar, A. Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , Oxford University Press. Oxford. (2008).
- Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059(2014).
- Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
- Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
- Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
- Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
- Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. Dragonflies of Japan (3rd edition). , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2019).
- Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , Springer. 165-220 (2016).
- Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
- Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S. Interspecific hybrids in Japanese Odonata. Tombo. 60, 1-49 (2018).
- Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
- Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392(2009).
- Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469(2011).
- Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).
- Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
- Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
- Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785(2019).
- Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464(2020).
- Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608(2017).
- Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).
Przedruki i uprawnienia
