Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena mikroperfuzji rdzenia kręgowego w czasie rzeczywistym w świńskim modelu niedokrwienia/reperfuzji

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62047

⸱

10 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Center of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2University Department for Vascular Surgery and Department of Operative Medicine, Medical University of Innsbruck, 3Department of Medical Biometry and Epidemiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Vascular Medicine, University Heart and Vascular Center Hamburg (UHZ), 5Department of Cardiology, Rostock University Medical Center, 6University Department for Cardiac Surgery, Heart Center Leipzig

W tym artykule

Podsumowanie

Mikrokrążenie rdzenia kręgowego odgrywa kluczową rolę w uszkodzeniu rdzenia kręgowego. Większość metod nie pozwala na ocenę mikrokrążenia rdzenia kręgowego w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do opracowania terapii ukierunkowanych na mikrokrążenie. W tym miejscu proponujemy protokół z użyciem sond Laser-Doppler-Flow Needle w dużym zwierzęcym modelu niedokrwienia/reperfuzji.

Streszczenie

Uraz rdzenia kręgowego jest wyniszczającym powikłaniem naprawy aorty. Pomimo postępów w zakresie zapobiegania i leczenia urazów rdzenia kręgowego, częstość ich występowania jest nadal bardzo wysoka, a tym samym wpływa na wyniki pacjentów. Mikrokrążenie odgrywa kluczową rolę w perfuzji tkanek i zaopatrzeniu w tlen i często jest oddzielone od makrohemodynamiki. W związku z tym bezpośrednia ocena mikrokrążenia rdzenia kręgowego jest niezbędna do opracowania terapii ukierunkowanych na mikrokrążenie i oceny istniejących podejść w odniesieniu do mikrokrążenia rdzenia kręgowego. Jednak większość metod nie zapewnia oceny mikrokrążenia rdzenia kręgowego w czasie rzeczywistym. Celem tego badania jest opisanie ustandaryzowanego protokołu oceny mikrokrążenia rdzenia kręgowego w czasie rzeczywistym przy użyciu laserowo-dopplerowskich sond igłowych wprowadzanych bezpośrednio do rdzenia kręgowego. Użyliśmy świńskiego modelu niedokrwienia/reperfuzji, aby wywołać pogorszenie mikrokrążenia rdzenia kręgowego. Ponadto zastosowano technikę fluorescencyjnego wstrzykiwania mikrosfery. Początkowo zwierzęta były znieczulane i wentylowane mechanicznie. Następnie wykonano wprowadzenie laserowej sondy dopplerowskiej, a następnie założenie drenażu płynu mózgowo-rdzeniowego. Wykonano sternotomię środkową w celu odsłonięcia aorty zstępującej w celu wykonania zacisku krzyżowego aorty. Niedokrwienie/reperfuzję wywołano przez nadceliakijskie zaciskanie krzyżowe aorty przez łącznie 48 minut, a następnie reperfuzję i stabilizację hemodynamiczną. Laser Doppler Flux wykonywano równolegle z oceną makrohemodynamiczną. Ponadto zastosowano zautomatyzowany drenaż płynu mózgowo-rdzeniowego w celu utrzymania stabilnego ciśnienia mózgowo-rdzeniowego. Po wykonaniu protokołu zwierzęta zostały uśmiercone, a rdzeń kręgowy pobrano do analizy histopatologicznej i mikrosferycznej. Protokół ujawnia wykonalność pomiarów mikroperfuzji rdzenia kręgowego za pomocą laserowych sond dopplerowskich i wykazuje wyraźny spadek podczas niedokrwienia, a także powrót do zdrowia po reperfuzji. Wyniki wykazały zachowanie porównywalne do oceny mikrosfery fluorescencyjnej. Podsumowując, ten nowy protokół może zapewnić użyteczny duży model zwierzęcy do przyszłych badań wykorzystujących ocenę mikroperfuzji rdzenia kręgowego w czasie rzeczywistym w warunkach niedokrwienia/reperfuzji.

Wprowadzenie

Uraz rdzenia kręgowego wywołany niedokrwieniem/reperfuzją (SCI) jest jednym z najbardziej niszczycielskich powikłań naprawy aorty związanych z obniżonym wynikiem1,2,3,4. Obecne opcje zapobiegania i leczenia SCI obejmują optymalizację parametrów makrohemodynamicznych, a także normalizację ciśnienia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSP) w celu poprawy ciśnienia perfuzji rdzenia kręgowego2,5,6,7,8,9. Pomimo zastosowania tych manewrów, częstość występowania SCI nadal waha się od 2% do 31% w zależności od złożoności naprawy aorty10,11,12.

Ostatnio mikrokrążenie zyskało coraz większą popularność13,14. Mikrokrążenie to obszar poboru tlenu przez komórki i wymiany metabolicznej, a zatem odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu narządów i integralności komórkowej13. Upośledzony mikrokrążeniowy przepływ krwi jest głównym czynnikiem determinującym niedokrwienie tkanek związane ze zwiększoną śmiertelnością15,16,17,18,19. Upośledzenie mikrokrążenia rdzenia kręgowego wiąże się z obniżeniem funkcji neurologicznych i wyników20,21,22,23. Dlatego optymalizacja mikroperfuzji w leczeniu SCI jest najbardziej obiecującym podejściem. Opisano utrzymywanie się zaburzeń mikrokrążenia, pomimo optymalizacji makrokrążenia26,27,28,29. Ta utrata koherencji hemodynamicznej występuje często w różnych stanach, w tym w niedokrwieniu/reperfuzji, co podkreśla potrzebę bezpośredniej oceny mikrokrążenia i terapii ukierunkowanych na mikrokrążenie26,27,30.

Do tej pory tylko kilka badań wykorzystywało laserowo-dopplerowskie sondy do oceny w czasie rzeczywistym zachowania mikrokrążenia rdzenia kręgowego20,31. W istniejących badaniach często stosowano techniki wstrzykiwania mikrosfery, które są ograniczone przez sporadyczne stosowanie i analizę pośmiertną32,33. Liczba różnych pomiarów z wykorzystaniem techniki iniekcji mikrosfer jest ograniczona dostępnością mikrosfer o różnych długościach fal. Ponadto, w przeciwieństwie do technik laserowo-dopplerowskich, ocena mikroperfuzji w czasie rzeczywistym nie jest możliwa, ponieważ w przypadku tej metody konieczne jest pośmiertne przetwarzanie i analiza tkanek. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalny protokół oceny mikrokrążenia rdzenia kręgowego w czasie rzeczywistym w dużym zwierzęcym modelu niedokrwienia/reperfuzji świni.

To badanie było częścią dużego projektu na zwierzętach, łączącego randomizowane badanie porównujące wpływ krystaloidów i koloidów na mikrokrążenie w niedokrwieniu/reperfuzji, a także eksploracyjne randomizowane badanie wpływu płynów i wazopresorów na mikroperfuzję rdzenia kręgowego. 2-punktowa kalibracja sondy przepływu, a także kalibracja cewnika z końcówką ciśnieniową zostały wcześniej opisane34. Oprócz zgłoszonego protokołu, do pomiaru mikroperfuzji rdzenia kręgowego, jak opisano wcześniej, użyto mikrosfer fluorescencyjnych, używając 12 próbek tkanki rdzenia kręgowego dla każdego zwierzęcia, przy czym próbki 1-6 reprezentują górny rdzeń kręgowy, a 7-12 reprezentują dolny rdzeń kręgowy35,36. Iniekcję mikrosfery wykonywano dla każdego kroku pomiarowego po zakończeniu zapisów laserowo-dopplerowskich i ocenie makrohemodynamicznej. Ocenę histopatologiczną przeprowadzono przy użyciu skali Kleinmana, jak opisano wcześniej37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Rządową Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Miasta Hamburga (nr referencyjny 60/17). Zwierzęta otrzymały opiekę zgodnie z "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" (publikacja NIH nr 86-23, poprawiona w 2011 r.), a także zaleceniami FELASA, a eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE24,25. To badanie było ostrym badaniem, a wszystkie zwierzęta zostały poddane eutanazji pod koniec protokołu.

UWAGA: Badanie przeprowadzono na sześciu trzymiesięcznych świniach płci męskiej i żeńskiej (German Landrace) o wadze około 40 kg. Zwierzęta zostały przywiezione do placówek opieki nad zwierzętami co najmniej 7 dni przed eksperymentami i były trzymane zgodnie z zaleceniami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Zwierzętom dostarczano jedzenie i wodę ad libitum, a ich stan zdrowia był regularnie oceniany przez odpowiedzialnego lekarza weterynarii. Przed eksperymentami utrzymywano czas postu wynoszący 12 godzin. Cała procedura doświadczalna i obchodzenie się ze zwierzętami były nadzorowane przez odpowiedzialnego lekarza weterynarii.

1. Indukcja znieczulenia i utrzymanie znieczulenia

  1. W celu indukcji znieczulenia i utrzymania znieczulenia należy wstępnie medykować zwierzęta i głęboko je uspokajać za pomocą wstrzyknięcia domięśniowego, a następnie wstrzyknięć dożylnych, jeśli to konieczne, w celu wykonania intubacji dotchawiczej. Następnie należy wywołać i utrzymać znieczulenie, stosując kombinację lotnego środka znieczulającego z ciągłym podawaniem opioidów uzupełnionym dodatkowym wstrzyknięciem bolusa opioidowego.
  2. Wykonaj domięśniowe wstrzyknięcia ketaminy 20 mg·kg-1, azaperonu 4 mg·kg-1 i midazolamu 0,1 mg·kg-1 w celu premedykacji i uspokojenia.
  3. Umieść cewnik żylny w żyle usznej, zapewnij prawidłowe mocowanie i oceń funkcjonalność, szybko nakładając 10 ml soli fizjologicznej.
  4. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na kocu rozgrzewającym, aby zapobiec utracie ciepła.
  5. Ustanowienie podstawowego monitorowania za pomocą elektrokardiografii (EKG) i pulsoksymetrii w celu monitorowania stanu krążeniowo-oddechowego zwierząt i podłączenie go do podstawowego sprzętu monitorującego.
  6. Podaj 15 l·min-1 tlenu przez maskę w kształcie świni w celu wstępnego natlenienia.
  7. W razie potrzeby wstrzyknąć dożylnie boli w ilości 0,1 mg·kg-1 1% propofolu i wykonać intubację dotchawiczą.
  8. Zapewnić prawidłowe umieszczenie za pomocą kapnografii oddechowej i osłuchiwania, podać 0,1 mg•kg-1 pankuronium i zapewnić prawidłowe zamocowanie rurki dotchawiczej.
  9. Ustanowić wentylację o kontrolowanej objętości za pomocą objętości oddechowej 10 ml·kg-1 masy ciała-1, dodatniego ciśnienia wydechowego 10 cmH2 O i frakcji wdychanego tlenu (FiO2) 0,3 za pomocą urządzenia do znieczulenia. Dostosuj częstotliwość wentylatora, aby utrzymać końcowe ciśnienie dwutlenku węgla (etCO2) na poziomie 35-45 mmHg.
  10. Wprowadzić sondę żołądkową, odessać płyny żołądkowe, prawidłowo zamocować rurkę i podłączyć ją do worka zbiorczego. Ostrożnie zamknij oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas znieczulenia.
  11. Utrzymuj znieczulenie poprzez ciągły wlew fentanylu (10 μg·kg-1·h-1) i sewofluranu (3,0% stężenie wydychanego, dostarczane przez parę). Należy zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia poprzez uważną obserwację parametrów życiowych i wentylacji oraz brak jakichkolwiek ruchów podczas całego protokołu, zwracając szczególną uwagę na fazy bodźca chirurgicznego. Podać dodatkowe dawki fentanylu (50 μg) w bolusie, jeśli występują jakiekolwiek oznaki bólu lub niepokoju.
    UWAGA: Podczas całego zabiegu należy zapewnić obecność badaczy, którzy mają doświadczenie w znieczulaniu zwierząt, a także korzystać z nadzoru doświadczonego lekarza weterynarii, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie.
  12. Podawać wyjściową szybkość infuzji 10 ml·kg-1·h-1 zrównoważonych krystaloidów, aby skompensować straty płynów podczas znieczulenia, przygotowania chirurgicznego i wykonania protokołu eksperymentalnego. Użyj podgrzewacza do płynów, aby zapobiec utracie ciepła.
  13. Delikatnie oczyść skórę świni wodą z mydłem. Użyj roztworu do dezynfekcji skóry zawierającego powidon-jod, aby zmniejszyć zanieczyszczenie skóry. Do preparatów chirurgicznych należy używać sterylnych rękawiczek. Zastosuj 300 mg klindamycyny w profilaktyce przeciwbakteryjnej i powtórz dawkę po 6 godzinach.

2. Umieszczenie sondy

  1. Umieść zwierzę w odpowiedniej pozycji bocznej i zegnij grzbiet zwierzęcia, aby poszerzyć przestrzeń między kręgami.
  2. Chirurgicznie odsłonić obszar przykręgosłupa w celu przygotowania wyrostków kolczystych i łuków kręgowych (Rysunek 1A).
  3. Umieść naczyniowy cewnik do żył obwodowych 14 G przyśrodkowy do rdzenia kręgowego na poziomie kręgu piersiowego (Th) 13/14 lub kręgu lędźwiowego (L) 1/2 między dwoma łukami kręgowymi (Rysunek 1B).
  4. Wyjmij igłę, włóż sondę laserową/dopplerowską do cewnika dożylnego (Rysunek 1C) i przetestuj jakość sygnału poprzez połączenie z wyznaczonym sprzętem i oprogramowaniem. Upewnij się, że sygnał jest stabilny z umiarkowaną pulsacją.
  5. Ostrożnie przymocuj sondę za pomocą szwów (Rysunek 1D) i użyj wyściółki, aby zapobiec zwichnięciu lub załamaniu sondy.
  6. W celu przezskórnego umieszczenia drenażu płynu mózgowo-rdzeniowego w celu pomiaru i kontroli ciśnienia mózgowo-rdzeniowego, określ poziom L 4/5 lub L 5/6, nakłuj skórę i przestrzeń podskórną igłą wprowadzającą i wyjmij igłę wkładu.
  7. Umieścić strzykawkę wypełnioną solą fizjologiczną na igle i ostrożnie wprowadzić igłę, stale naciskając na strzykawkę wypełnioną płynem.
  8. Gdy utrata oporu zostanie wyczuta jako dowód na ułożenie zewnątrzoponowe, ponownie wprowadź igłę do wkładu i wprowadź igłę 2-3 mm dalej, aby nakłuć oponę twardą i usunąć igłę wkładu.
  9. Sprawdź pozycję dooponową, szybko kapiąc klarownym alkoholem. Wprowadzić drenaż na głębokość do 20 cm, założyć adapter Luer-lock i sprawdzić położenie poprzez staranne zasysanie płynu.
  10. Ostrożnie przymocuj drenaż za pomocą szwów i podłącz go do systemu drenażu płynu mózgowo-rdzeniowego.
  11. Odsłoń czaszkę za lewe ucho i ostrożnie wykonaj trepanację otworu w skórze za pomocą nasadki wiertarskiej 6 mm.
  12. Wprowadzić drugą laserową sondę dopplerowską bezpośrednio do mózgu. Ostrożnie przymocuj sondę za pomocą szwów i przetestuj jakość sygnału, podłączając go do wyznaczonego sprzętu i oprogramowania. Ponownie upewnij się, że istnieje stabilny sygnał o umiarkowanej pulsacyjności.
  13. Odłącz wszystkie sondy, ostrożnie ułóż zwierzę w pozycji leżącej, upewniając się, że pozycja sondy nie uległa zmianie. Upewnij się, że co najmniej 4-5 badaczy wykona ten manewr.
  14. Podłącz ponownie sondy i ponownie sprawdź jakość sygnału.
  15. Podłącz kanały wyjściowe sprzętu laserowo-dopplerowskiego do wzmacniacza oraz sprzętu i oprogramowania do akwizycji synchronicznej, aby dodatkowo rejestrować strumień laserowy/dopplerowski jednocześnie z sygnałami makrohemodynamicznymi.
  16. Kalibruj strumień na jednostkę (PU) za pomocą kalibracji 2-punktowej.
    1. Naciśnij Enter, aby otworzyć menu i wybrać ustawienie wyjścia analogowego.
    2. Użyj wyświetlanego współczynnika konwersji (5.0 V = 1000 PU), aby skalibrować strumień z kalibracją 2-punktową do użytku z oprogramowaniem do akwizycji synchronicznej.
    3. Wybierz Powrót, aby powrócić do poprzedniego menu, a następnie wybierz opcję Pomiar, aby kontynuować pomiar.
    4. Otwórz oprogramowanie do akwizycji synchronicznej. Wybierz opcję wyzeruj wszystkie wejścia z menu Ustawienia. Podłącz wszystkie wejścia do używanych urządzeń i sond.
    5. Wykonaj 2-punktową kalibrację dla Flux, klikając menu rozwijane kanału Flux. Wybierz kalibrację 2-punktową. Ustaw wartość units-conversion na włączoną i wybierz BPU jako jednostki. Dla punktu 1 ustaw 0 V na 0 BPU. Dla punktu 2 ustaw napięcie od 5,0 V do 1000 jednostek BPU. Wybierz zestaw jednostek dla wszystkich i nowych danych. Naciśnij OK, aby zamknąć menu.
  17. Rozpocznij ciągły drenaż płynu mózgowo-rdzeniowego przy docelowym ciśnieniu 10 mmHg i objętości drenażu 20 ml·h-1.

3. Umieszczenie cewnika

  1. Odsłoń obie tętnice udowe.
  2. Podwiązać dystalną część prawej tętnicy udowej, tymczasowo zamknąć bliższe światło tętnicy za pomocą pętli naczynia, wykonać 2 mm nacięcie naczynia za pomocą nożyczek Pottsa i wprowadzić drut prowadnikowy.
  3. Wprowadzić drut doprowadzający dalej, zapewniając wprowadzenie bez oporu i unikając załamania się drutu; wprowadzić cewnik nad drutem.
  4. Zamocuj cewnik za pomocą szwów.
  5. Zapewnić prawidłową pozycję poprzez aspirację krwi tętniczej zweryfikowaną za pomocą gazometrii krwi i pomiaru sygnału tętniczego po prawidłowym połączeniu z ciśnieniem krwi i monitorowaniem transkrążeniowo-oddechowym za pomocą sprzętu i oprogramowania.
  6. Umieść sondę przepływu 5 mm na lewej tętnicy udowej i sprawdź jakość sygnału, podłączając go do przepływomierza.
  7. Zamknij obie pachwiny szwami.
  8. Odsłoń prawą tętnicę szyjną, a także prawą żyłę szyjną wewnętrzną w celu umieszczenia 8 osłonek wprowadzających.
  9. W przypadku założenia cewnika należy postępować w taki sam sposób, jak opisano w ppkt 3.2-3.4.
  10. Podłącz światło boczne osłonki wprowadzającej tętnicę szyjną do podstawowego sprzętu do monitorowania ciśnienia i termorozcieńczania płuc w celu pomiaru ciśnienia tętniczego.
  11. Wprowadź cewnik z końcówką ciśnieniową do aorty wstępującej i sprawdź położenie, podłączając go do wzmacniacza i oprogramowania do synchronicznej akwizycji.
  12. Umieść cewnik do tętnicy płucnej Swana-Ganza przez osłonkę żylną w tętnicy płucnej, napełniając balon powietrzem na głębokości 20 cm i delikatnie wkładając go, aż w krzywej hemodynamicznej pojawi się nacisk klinowy. Opróżnij balon i odciągnij cewnik o 2 cm do tyłu. Zapewnić satysfakcjonującą jakość sygnału ciśnienia w tętnicy płucnej. Podłącz termistory do podstawowego sprzętu do monitorowania ciśnienia i termorozcieńczania płuc.
  13. Skorzystaj ze wskazówek ultrasonograficznych w celu przezskórnego umieszczenia cewnika do żyły centralnej 12 Fr. 5-Lumen do podawania leków i pomiaru ciśnienia w żyle żylnej zewnętrznej prawej do szyjki zewnętrznej. Użyj podejścia 6 kroków do umieszczania ultrasonograficznego38
  14. Podłącz dystalne światło cewnika do twardego i sprzętowego monitorowania ciśnienia krwi i układu przezkrążeniowo-oddechowego. Zamień wszystkie leki i wlewy na centralny cewnik żylny. Używaj różnych świateł dla leków przeciwbólowych, płynów i katecholamin, a duże światło oszczędzaj na podawanie koloidów podczas etapów ładowania objętościowego.

4. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Wykonaj mini-laparotomię, zmobilizuj pęcherz, włóż cewnik Foleya do drenażu moczu, napompuj balon solą fizjologiczną i przymocuj cewnik za pomocą szwów workowych.
  2. Podłącz cewnik do worka do zbierania moczu, w którym wyświetlana jest ilość moczu w ml.
  3. Zwiększyć FiO2 do 1,0 i ponownie podać dożylnie 0,1 mg·kg-1 pankuronium.
  4. Wykonaj sternotomię środkową za pomocą elektrokoagulacji w celu przygotowania do mostka. Delikatnie wypreparuj mostek z otaczającej tkanki. Wykonaj tylne umieszczenie kompresu, aby zapobiec kontuzjom.
  5. Zatrzymaj wentylację i podziel kość piłą oscylacyjną. Kontynuuj wentylację i zmniejsz FiO2 do 0,3. Użyj elektrokoagulacji, aby zmniejszyć krwawienie i uszczelnij mostek woskiem kostnym.
  6. Ostrożnie zmobilizuj wierzchołek lewego płuca i podziel lewą boczną część przepony, aby ułatwić ekspozycję chirurgiczną.
  7. Odsłoń aortę zstępującą proksymalnie do pnia trzewnej poprzez delikatne cofnięcie lewego płuca, zapewniając niezakłóconą wentylację i unikając urazu lewego płuca (Rysunek 2A) i podziel otaczającą tkankę (Rysunek 2B). Podawać 7 ml koloidu hydroksyetyloskwodrobiowego 7 ml · kg-1, jeśli potrzebna jest stabilizacja hemodynamiczna.
  8. Umieść nadstawkę wokół aorty zstępującej, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję (Rysunek 2C).
  9. Przymocuj sondę przepływu wokół zstępującej aorty piersiowej (Rysunek 2D). Zapewnij odpowiednią jakość sygnału poprzez podłączenie do modułu przepływu oraz sprzętu i oprogramowania do synchronicznej akwizycji. W razie potrzeby użyj żelu kontaktowego, aby poprawić jakość sygnału.
  10. Przymocuj pętlę naczynia wokół aorty zstępującej, dystalnie do sondy przepływu, aby zaznaczyć obszar zacisku krzyżowego aorty.

5. Ocena i pozyskiwanie danych

  1. Wyzeruj wszystkie cewniki i wypoziomuj cewniki za pomocą linii wypełnionych płynem umieszczonych na prawym poziomie przedsionków.
  2. Umieść igłowe elektrody EKG i podłącz je do sprzętu i oprogramowania do synchronicznej akwizycji.
  3. Ocena przezkrążeniowo-płucnego termorozcieńczenia oraz pomiary przepływu i ciśnienia w aorcie zostały wcześniej opisane 34.
  4. W celu pomiaru rzutu serca za pomocą termorozcieńczenia tętnicy płucnej należy wykonać 3 wstrzyknięcia 10 ml zimnego soli fizjologicznej i zanotować średnią wartość wyświetlaną przez podstawowy sprzęt monitorujący.
  5. Uruchom oprogramowanie laser-Doppler, po prostu naciskając Start i ustaw znak dla każdego kroku pomiaru, starannie oznaczając kroki jako M0 do M5.

6. Protokół eksperymentalny

  1. Wykonaj pomiary bazowe (M0).
  2. Przeprowadzić optymalizację hemodynamiczną przy użyciu etapów obciążenia objętościowego koloidu hydroksyetyloskwrobi o stężeniu 7 ml·kg-1. Wykonuj każdy etap ładowania objętości przez 5 minut, używając naparów pod ciśnieniem. Po zakończeniu każdego etapu ładowania woluminu odczekaj 5 minut na wyrównanie. Rozpocznij obciążenie objętościowe, aż wzrost pojemności minutowej serca wyniesie <15%.
  3. Powtórz pomiary (M1) po zakończeniu optymalizacji hemodynamicznej.
  4. Wywołaj niedokrwienie/reperfuzję przez łącznie 48 minut zaciskania krzyżowego aorty nadceliakii, umieszczając zacisk aortalny w zaznaczonym obszarze.
  5. Zastosuj zaciskanie aorty w kolejności rosnącej w odstępach 1-, 2-, 5-, 10- i 30-minutowych, aby poprawić przeżywalność zwierząt podczas protokołu badania.
  6. Kontynuuj zaciskanie krzyżowe aorty po każdym interwale po maksymalnie 5 minutach lub po normalizacji przepływu w tętnicy udowej.
  7. Wykonaj ręczną niedrożność dopływu żyły głównej dolnej, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia krwi > 100 mmHg średniego ciśnienia tętniczego.
  8. W razie potrzeby należy podać wstrzyknięcia dożylne noradrenaliny lub epinefryny w fazie zaciskania, aby zapobiec spadkowi średniego ciśnienia tętniczego poniżej 40 mmHg.
  9. Powtórz pomiary pod koniec 30-minutowego okresu zaciskania przed reperfuzją (M2).
  10. Stopniowo otwieraj zacisk, aby zapewnić stabilność hemodynamiczną. Zamknij zacisk, jeśli ciśnienie krwi spadnie zbyt szybko i pozwól na stabilizację.
  11. Podać 7 ml·kg-1 koloidów hydroksyetyloskwrobi, a także dodatkowe wstrzyknięcia bolusa 10-20 μg noradrenaliny i/lub epinefryny w celu stabilizacji. Podawać 2 ml kg-1 8,4% wodorowęglanu sodu, jeśli pH spadnie poniżej 7,1. Zapewnij prawidłowe dostosowanie częstości oddechów, aby zapewnić normokapnię.
  12. Powtórz pomiary 1 godzinę po reperfuzji (M3).
  13. Powtórz optymalizację hemodynamiczną zgodnie z opisem w punkcie 6.2 i powtórz pomiary (M4).
  14. Pomiary końcowe należy wykonać 4,5 godziny po indukcji niedokrwienia/reperfuzji (M5).

7. Eutanazja

  1. Podawać dożylnie 40 mmol chlorku potasu w celu eutanazji w celu wywołania migotania komór i asystolii.
  2. Zakończyć wentylację i usunąć wszystkie cewniki.

8. Grabież organów

  1. Umieść zwierzę w pozycji leżącej i wyjmij sondy igłowe oraz drenaż.
  2. Odsłoń kręgosłup poprzez nacięcie skóry i usunięcie tkanki mięśniowej za pomocą skalpela i kleszczy.
  3. Użyj piły oscylacyjnej, aby podzielić łuk kręgowy przyśrodkowy po obu stronach i usuń grzbietową część kości kręgowej, ostrożnie przesuwając wyrostek kolczysty na boki, aby poluzować pozostałe połączenia.
  4. Użyj kleszczy, aby ostrożnie podnieść rdzeń kręgowy od końca ogona do czaszki i użyj skalpela, aby przeciąć nerwy rdzeniowe, aby usunąć rdzeń kręgowy.
  5. Rdzeń kręgowy należy przechowywać w 4% formalinie do czasu dalszego wykorzystania do oceny histopatologicznej lub kwantyfikacji mikrosfery.

9. Analiza statystyczna

  1. Korzystaj z oprogramowania statystycznego.
  2. W razie potrzeby należy zapewnić rozkład normalny poprzez inspekcję histogramów i zmiennych logarytmiczno-transformacyjnych.
  3. Poddaj zmienne zależne - strumień rdzenia kręgowego, pojemność minutową serca, częstość akcji serca, objętość wyrzutową, skurczowe ciśnienie tętnicze, średnie ciśnienie tętnicze, rozkurczowe ciśnienie tętnicze, centralne ciśnienie żylne, układowy opór naczyniowy - a także mikroperfuzję górnego i dolnego rdzenia kręgowego ocenianą za pomocą mikrosfer fluorescencyjnych, jeśli to pożądane - ogólnym liniowym analizom modeli mieszanych, przy użyciu rutynowego GENLINMIXED dla ciągłych danych z funkcją powiązania tożsamości.
  4. Użyj korekt linii bazowej.
  5. Określ modele ze stałymi efektami dla zmiennej linii bazowej i punktu pomiaru. Rozważ punkt pomiarowy jako powtarzające się pomiary u zwierząt.
  6. Raportuj wartości p stałych efektów dla punktu pomiarowego dla każdego parametru.
  7. Do analizy mikrosfery fluorescencyjnej rdzenia kręgowego należy dodatkowo użyć regionu (dolny rdzeń kręgowy, górny rdzeń kręgowy) jako stałego efektu i interakcji między regionem a punktem pomiarowym do oceny interakcji między regionami a punktem pomiarowym, a także podać wartości p stałych efektów dla interakcji.
  8. Oblicz skorygowane średnie brzeżne z 95% przedziałem ufności (CI) dla wszystkich zmiennych zależnych w punktach pomiarowych M1-M5, a następnie porównaj parami za pomocą testów najmniej istotnych różnic.
  9. Wyrażaj zmienne jako średnią (95% CI). Wyraź masę zwierzęcia jako średnią ± odchylenie standardowe.
  10. Przedstaw nieskorygowane wartości p.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wszystkie sześć zwierząt przeżyło do zakończenia protokołu. Masa ciała zwierząt wynosiła 48,2 ± 2,9 kg; pięć zwierząt było samcami, a jedno zwierzę było samicą. Wprowadzenie igły sondy do rdzenia kręgowego, jak i pomiar strumienia (Flux) w rdzeniu kręgowym, były możliwe do przeprowadzenia u wszystkich zwierząt.

Przykłady rejestracji mikrokrążenia rdzenia kręgowego w czasie rzeczywistym w połączeniu z zapisami mikrokrążenia mózgo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

SCI wywołane niedokrwieniem rdzenia kręgowego jest głównym powikłaniem naprawy aorty, które ma ogromny wpływ na wyniki leczenia 1,2,3,4,10,11,12. Najbardziej obiecujące są terapie ukierunkowane na mikrokrążenie w celu zapobiegania i leczenia SCI. Protokół zapewnia powtarzalną metodę oceny mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Constantin J. C. Trepte otrzymał honorową nagrodę za wykłady Maqueta. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Badanie to było wspierane przez Europejskie Towarzystwo Anestezjologii Young Investigator Start-Up Grant 2018.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Lenie Brix, V.M.D., Institute of Animal Research, Hannover Medical School, a także Pani Jutcie Dammann, Facility of Research Animal Care, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Niemcy, za zapewnienie przed- i okołooperacyjnej opieki nad zwierzętami oraz ich pomoc techniczną w obchodzeniu się ze zwierzętami. Autorzy pragną również podziękować dr Danielowi Manzoni z Oddziału Chirurgii Naczyniowej, Hôpital Kirchberg, Luksemburg, za jego pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przepływomierz CardioMedMedistim AS, Oslo, NorwegiaPrzepływomierz CM4000do sondy przepływu tętnicy udowej
Sonda przepływu CardioMed, 5mmMedistim AS, Oslo, NorwegiaPS100051Sonda przepływu
Sonda COnfidence tętnicy udowej, Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USAMA16PAUSonda przepływu Aorta
16 mm wkładki
DIVA Sevoflurane VaporDrä ger Medical, Lü beck, NiemcyGorąca linia parowa
poziomu 1 podgrzewacz płynówSmiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, NiemcyHL-90-DE-230Podgrzewacz do płynów
Infinity DeltaDrä ger Medical, Lü beck, NiemcyPodstawowy sprzęt do monitorowania
Infinity Hemo Drä ger Medical, Lü beck, NiemcyPodstawowy sprzęt do monitorowania ciśnienia i termorozcieńczania płuc
LabChart ProADInstruments Ltd., Oxford, Wielka Brytaniav8.1.16Synchroniczne oprogramowanie do laserowego dopplera, ciśnienia krwi, EKG i przepływu krwi
LiquoGuard 7Mö ller Medical GmbH, Fulda, NiemcySystem drenażu płynu mózgowo-rdzeniowego
Cewnik ciśnieniowy Millar Micro-Tip (5F, pojedynczy, zakrzywiony, 120 cm, PU/WD)ADInstruments Ltd., Oksford, Wielka BrytaniaCewnik ciśnieniowySPR-350
wrzosowisko VMS LDFmoor Instruments, Devon, Wielka BrytaniaWyznaczony sprzęt do laserowo-dopplerowskiego
wrzosowisko VMS Oprogramowanie badawczemoor Instruments, Devon, Wielka BrytaniaDedykowany laserowo-dopplerowski moduł
przepływu okołonaczyniowegoTransonic Systems Inc., Ithaca, NY, USATS 420do sondy przepływu Aorta
PiCCO 2, wersja naukowaGetinge AB, Gö teborg, Szwecjav. 6.0Monitorowanie ciśnienia krwi i układu przezsercowo-oddechowego Twarde i programowe
PiCCO 5 Fr. 20cmGetinge AB, Gö teborg, SzwecjaLinia tętnicza z końcówką termistora 
PowerLabADInstruments Ltd., Oxford, Wielka BrytaniaPL 3516Synchroniczny laserowy doppler, sprzęt do pomiaru ciśnienia krwi, EKG i przepływu krwi
QuadBridgeAmpADInstruments Ltd., Oxford, Wielka BrytaniaFE 224Czterokanałowy wzmacniacz mostkowy do laserowego dopplera i inwazyjnego pomiaru ciśnienia krwi
SilverlineSpiegelberg, Hamburg, NiemcyELD33.010.02Drenaż
płynu mózgowo-rdzeniowegoPakiet oprogramowania statystycznego SPSS IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, Nowy Jork, USAv. 27Oprogramowanie
Twinwarm Warming SystemMoeck & Moeck GmbH, Hamburg, Niemcy12TW921DESystem ocieplenia
Uniwersalny II Koc ocieplającyMoeck & Moeck GmbH, Hamburg, Niemcy906Koc ocieplający
VP 3 Sonda, długość 8 mm (produkowana indywidualnie)moor Instruments, Devon, Wielka BrytaniaLaserowa sonda dopplerowska
ZeusDrä ger Medical, Lü beck, NiemcyMaszyna anestezjologiczna
Aorta Moduł przepływu statystyczne

Bibliografia

  1. Etz, C. D., et al. Contemporary spinal cord protection during thoracic and thoracoabdominal aortic surgery and endovascular aortic repair: a position paper of the vascular domain of the European Association for Cardio-Thoracic Surgerydagger. The European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 47 (6), 943-957 (2015).
  2. Schraag, S. Postoperative management. Best Practice & Research Clinical Anaesthesiology. 30 (3), 381-393 (2016).
  3. Cambria, R. P., et al. Thoracoabdominal aneurysm repair: results with 337 operations performed over a 15-year interval. Annals of Surgery. 236 (4), 471-479 (2002).
  4. Becker, D. A., McGarvey, M. L., Rojvirat, C., Bavaria, J. E., Messe, S. R. Predictors of outcome in patients with spinal cord ischemia after open aortic repair. Neurocritical Care. 18 (1), 70-74 (2013).
  5. McGarvey, M. L., et al. The treatment of spinal cord ischemia following thoracic endovascular aortic repair. Neurocritical Care. 6 (1), 35-39 (2007).
  6. Fukui, S., et al. Development of collaterals to the spinal cord after endovascular stent graft repair of thoracic aneurysms. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 52 (6), 801-807 (2016).
  7. Augoustides, J. G., Stone, M. E., Drenger, B. Novel approaches to spinal cord protection during thoracoabdominal aortic interventions. Current Opinion in Anesthesiology. 27 (1), 98-105 (2014).
  8. Bicknell, C. D., Riga, C. V., Wolfe, J. H. Prevention of paraplegia during thoracoabdominal aortic aneurysm repair. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 37 (6), 654-660 (2009).
  9. Feezor, R. J., Lee, W. A. Strategies for detection and prevention of spinal cord ischemia during TEVAR. Seminars in Vascular Surgery. 22 (3), 187-192 (2009).
  10. Heidemann, F., et al. Incidence, predictors, and outcomes of spinal cord ischemia in elective complex endovascular aortic repair: An analysis of health insurance claims. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Rizvi, A. Z., Sullivan, T. M. Incidence, prevention, and management in spinal cord protection during TEVAR. Journal of Vascular Surgery. 52 (4), Suppl 86-90 (2010).
  12. Wortmann, M., Bockler, D., Geisbusch, P. Perioperative cerebrospinal fluid drainage for the prevention of spinal ischemia after endovascular aortic repair. Gefasschirurgie. 22, Suppl 2 35-40 (2017).
  13. Saugel, B., Trepte, C. J., Heckel, K., Wagner, J. Y., Reuter, D. A. Hemodynamic management of septic shock: is it time for "individualized goal-directed hemodynamic therapy" and for specifically targeting the microcirculation. Shock. 43 (6), 522-529 (2015).
  14. Moore, J. P., Dyson, A., Singer, M., Fraser, J. Microcirculatory dysfunction and resuscitation: why, when, and how. British Journal of Anaesthesia. 115 (3), 366-375 (2015).
  15. De Backer, D., Creteur, J., Preiser, J. C., Dubois, M. J., Vincent, J. L. Microvascular blood flow is altered in patients with sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (1), 98-104 (2002).
  16. De Backer, D., Creteur, J., Dubois, M. J., Sakr, Y., Vincent, J. L. Microvascular alterations in patients with acute severe heart failure and cardiogenic shock. American Heart Journal. 147 (1), 91-99 (2004).
  17. Sakr, Y., Dubois, M. J., De Backer, D., Creteur, J., Vincent, J. L. Persistent microcirculatory alterations are associated with organ failure and death in patients with septic shock. Critical Care Medicine. 32 (9), 1825-1831 (2004).
  18. Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
  19. Donati, A., et al. From macrohemodynamic to the microcirculation. Critical Care Research and Practice. 2013, 892710(2013).
  20. Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine. 32 (18), Phila Pa 1976 1955-1962 (2007).
  21. Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine. 37 (22), Phila Pa 1976 1376-1382 (2012).
  22. Han, S., et al. Rescuing vasculature with intravenous angiopoietin-1 and alpha v beta 3 integrin peptide is protective after spinal cord injury. Brain. 133, Pt 4 1026-1042 (2010).
  23. Muradov, J. M., Ewan, E. E., Hagg, T. Dorsal column sensory axons degenerate due to impaired microvascular perfusion after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 249, 59-73 (2013).
  24. Guillen, J., , FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51, 311-321 (2012).
  25. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. Osteoarthritis Cartilage. 20, 256-260 (2012).
  26. Ospina-Tascon, G., et al. Effects of fluids on microvascular perfusion in patients with severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36 (6), 949-955 (2010).
  27. Pottecher, J., et al. Both passive leg raising and intravascular volume expansion improve sublingual microcirculatory perfusion in severe sepsis and septic shock patients. Intensive Care Medicine. 36 (11), 1867-1874 (2010).
  28. De Backer, D., Ortiz, J. A., Salgado, D. Coupling microcirculation to systemic hemodynamics. Current Opinion in Critical Care. 16 (3), 250-254 (2010).
  29. van Genderen, M. E., et al. Microvascular perfusion as a target for fluid resuscitation in experimental circulatory shock. Critical care medicine. 42 (2), 96-105 (2014).
  30. Ince, C. Hemodynamic coherence and the rationale for monitoring the microcirculation. Critical care. 19, Suppl 3 8(2015).
  31. Kise, Y., et al. Directly measuring spinal cord blood flow and spinal cord perfusion pressure via the collateral network: correlations with changes in systemic blood pressure. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 149 (1), 360-366 (2015).
  32. Haunschild, J., et al. Detrimental effects of cerebrospinal fluid pressure elevation on spinal cord perfusion: first-time direct detection in a large animal model. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 58 (2), 286-293 (2020).
  33. Wipper, S., et al. Impact of hybrid thoracoabdominal aortic repair on visceral and spinal cord perfusion: The new and improved SPIDER-graft. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 158 (3), 692-701 (2019).
  34. Kluttig, R., et al. Invasive hemodynamic monitoring of aortic and pulmonary artery hemodynamics in a large animal model of ARDS. Journal of Visualized Experiments. (141), e57405(2018).
  35. Detter, C., et al. Fluorescent cardiac imaging: a novel intraoperative method for quantitative assessment of myocardial perfusion during graded coronary artery stenosis. Circulation. 116 (9), 1007-1014 (2007).
  36. Wipper, S., et al. Distinction of non-ischemia inducing versus ischemia inducing coronary stenosis by fluorescent cardiac imaging. International Journal of Cardiovascular Imaging. 32 (2), 363-371 (2016).
  37. Etz, C. D., et al. Spinal cord blood flow and ischemic injury after experimental sacrifice of thoracic and abdominal segmental arteries. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 33 (6), 1030-1038 (2008).
  38. Saugel, B., Scheeren, T. W. L., Teboul, J. L. Ultrasound-guided central venous catheter placement: a structured review and recommendations for clinical practice. Critical care. 21 (1), 225(2017).
  39. Marty, B., et al. Partial inflow occlusion facilitates accurate deployment of thoracic aortic endografts. Journal of Endovascular Therapy. 11 (2), 175-179 (2004).
  40. Matyal, R., et al. Monitoring the variation in myocardial function with the Doppler-derived myocardial performance index during aortic cross-clamping. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 26 (2), 204-208 (2012).
  41. Miller, R. D. Miller'sanesthesia. 8th Edition. , Elsevier. Philadelphia. (2015).
  42. Martikos, G., et al. Remote ischemic preconditioning decreases the magnitude of hepatic ischemia-reperfusion injury on a swine model of supraceliac aortic cross-clamping. Annals of Vascular Surgery. 48, 241-250 (2018).
  43. Lazaris, A. M., et al. Protective effect of remote ischemic preconditioning in renal ischemia/reperfusion injury, in a model of thoracoabdominal aorta approach. Journal of Surgical Research. 154 (2), 267-273 (2009).
  44. Ince, C., et al. Second consensus on the assessment of sublingual microcirculation in critically ill patients: results from a task force of the European Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Medicine. 44 (3), 281-299 (2018).
  45. Edul, V. S., et al. Dissociation between sublingual and gut microcirculation in the response to a fluid challenge in postoperative patients with abdominal sepsis. Annals of intensive care. 4, 39(2014).
  46. Schierling, W., et al. Sonographic real-time imaging of tissue perfusion in a porcine haemorrhagic shock model. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (10), 2797-2804 (2019).
  47. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243(2018).
  48. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Meliorating microcirculatory with melatonin in rat model of spinal cord injury using laser Doppler flowmetry. Neuroreport. 27 (17), 1248-1255 (2016).
  49. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Melatonin prevents blood vessel loss and neurological impairment induced by spinal cord injury in rats. Journal of Spinal Cord Medicine. 40 (2), 222-229 (2017).
  50. Phillips, J. P., Cibert-Goton, V., Langford, R. M., Shortland, P. J. Perfusion assessment in rat spinal cord tissue using photoplethysmography and laser Doppler flux measurements. Journal of Biomedical Optics. 18 (3), 037005(2013).
  51. Glenny, R. W., Bernard, S. L., Lamm, W. J. Hemodynamic effects of 15-microm-diameter microspheres on the rat pulmonary circulation. Journal of Applied Physiology. 89 (1985), 499-504 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sonda dopplerowskaocena mikrokrążeniadrenaż płynu mózgowo-rdzeniowegozaciskiecie aortalnefluorescencyjne mikrosferyocena makrohemodynamicznauraz rdzenia kręgowego
Ocena mikroperfuzji rdzenia kręgowego w czasie rzeczywistym w świńskim modelu niedokrwienia/reperfuzji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.