Artykuł metodologiczny

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

DOI:

10.3791/62062

⸱

2 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Department of Surgery, Division of Neurosurgery, University of Toronto, 4Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto, 5Department of Medicine, Division of Neurology, Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease and the Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Clinic, Toronto Western Hospital, University Health Network, 6Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej jest kluczową metodą w badaniach przedklinicznych nad chorobą Parkinsona. Obecnie bezstronne zliczanie stereologiczne jest standardem w kwantyfikacji tych komórek, ale pozostaje pracochłonnym i czasochłonnym procesem, który może nie być wykonalny dla wszystkich projektów. W tym miejscu opisujemy zastosowanie platformy do analizy obrazu, która może dokładnie oszacować liczbę oznaczonych komórek we wstępnie zdefiniowanym obszarze zainteresowania. Opisujemy krok po kroku protokół dla tej metody analizy w mózgu szczura i pokazujemy, że może on zidentyfikować znaczne zmniejszenie neuronów dodatnich pod względem hydroksylazy tyrozynowej z powodu ekspresji zmutowanej α-synukleiny w istocie czarnej. Zwalidowaliśmy tę metodologię, porównując ją z wynikami uzyskanymi za pomocą bezstronnej stereologii. Podsumowując, metoda ta zapewnia efektywny czasowo i dokładny proces wykrywania zmian w liczbie neuronów dopaminergicznych, a tym samym nadaje się do skutecznego określania wpływu interwencji na przeżycie komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest powszechnym neurodegeneracyjnym zaburzeniem ruchowym charakteryzującym się obecnością agregatów białkowych zawierających α-synukleinę (α-syn) i preferencyjną utratą neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej pars compacta (SNpc)1. Kwantyfikacja liczby neuronów dopaminergicznych jest istotną częścią badań nad chorobą Parkinsona, ponieważ pozwala na ocenę integralności układu nigrostriatalnego, zapewniając w ten sposób ważny punkt końcowy do oceny skuteczności potencjalnych terapii modyfikujących przebieg choroby. Obecnie standardem ilościowego określania liczby komórek jest bezstronne zliczanie stereologiczne, które wykorzystuje dwuwymiarowe (2D) przekroje tkanek do oszacowania cech wolumetrycznych w strukturach trójwymiarowych (3D)2,3,4. Nowoczesne metody stereologiczne oparte na projektowaniu wykorzystują kompleksowe procedury losowego pobierania próbek i stosują protokoły zliczania (znane jako sondy) w celu uniknięcia potencjalnych artefaktów i błędów systematycznych, co pozwala na niezawodne wykrywanie różnic tylko nieznacznie większych niż zmienność między zwierzętami5. Chociaż stereologia stanowi potężne narzędzie analityczne do badań histologicznych in vivo, jest czasochłonna, zakłada jednolite przygotowanie próbki i wymaga walidacji na kilku etapach, co może mieć wpływ na wydajność coraz bardziej wymaganą w przedklinicznych badaniach translacyjnych.

Najnowsze osiągnięcia technologiczne w nauce cyfrowej umożliwiają przyjęcie nowatorskich aplikacji do bardziej efektywnej oceny patologii bez stereomikroskopu, jednocześnie wypełniając potrzebę jako substytut bezstronnej stereologii. Metody te zwiększają szybkość, redukują błędy ludzkie i poprawiają odtwarzalność technik stereologicznych6,7. HALO jest jedną z takich platform analizy obrazu do ilościowej analizy tkanek w patologii cyfrowej. Składa się z wielu różnych modułów i raportuje morfologiczne i multipleksowane dane dotyczące ekspresji na podstawie komórki po komórce w całych odcinkach tkanek przy użyciu algorytmów rozpoznawania wzorców. Moduł cytonuclear FL mierzy immunofluorescencyjność dodatnich markerów fluorescencyjnych w jądrze lub cytoplazmie. Pozwala to na raportowanie liczby komórek dodatnich dla każdego markera oraz wyniku intensywności dla każdej komórki. Moduł można dostosować do indywidualnych rozmiarów komórek i pomiarów intensywności, chociaż ta funkcja nie jest wymagana do ilościowego oznaczania neuronów dopaminergicznych.

Celem tego badania jest zweryfikowanie tej metody z wcześniej zweryfikowanym modelem neurodegeneracji nigral opartym na wektorze wirusowym opartym na wektorze wirusowym α-syn8,9,10. W tym modelu ludzki zmutowany A53T α-syn ulega ekspresji w SNpc przez stereotaktyczne wstrzyknięcie hybrydowego serotypu 1/2 wirusa związanego z adenowirusem (AAV1/2), co powoduje znaczną neurodegenerację w okresie 6 tygodni. Kontralateralny, niewstrzykiwany SNpc może, w niektórych badaniach, służyć jako wewnętrzna kontrola dla wstrzykniętej strony. Częściej wstrzyknięcie pustego wektora AAV (AAV-EV) w kohorcie kontrolnej zwierząt stosuje się jako kontrolę negatywną. Przedstawiamy przewodnik krok po kroku, jak oszacować gęstość neuronów dopaminergicznych pozostających w wstrzykniętym SNpc po 6 tygodniach przy użyciu oprogramowania do automatycznej analizy obrazu (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Stereotaktyczne wstrzykiwanie

  1. Dorosłe samice szczurów Sprague-Dawley (250-280 g) trzymane w parach w klatkach z drewnianą ściółką i dostępem do pożywienia i wody. Utrzymuj kolonię zwierząt w regularnym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światła włączone o 06:30) ze stałą temperaturą i wilgotnością.
  2. Wykonaj jednostronne stereotaktyczne wstrzyknięcie AAV bezpośrednio do SNpc po prawej stronie mózgu (prawej lub lewej stronie, zgodnie z preferencjami każdego laboratorium), jak opisano wcześniej8,10. Wstrzyknąć 2 μl AAV1/2 przy końcowym mianie 3,4 x 1012 cząstek genomowych/ml.

2. Sekcja mózgu i immunohistochemia (IHC)

  1. Znieczulić szczura 5% izofluranem, umieszczając go w komorze znieczulającej na 3 minuty. Na tym etapie można zastosować inne zatwierdzone metody, po przeprowadzeniu odpowiedniego przeglądu instytucjonalnego.
  2. Gdy szczur osiągnie płaszczyznę chirurgiczną głębokiego znieczulenia, przenieś go na stożek nosowy mocno przymocowany do stołu do sekcji zwłok. Zabezpiecz przednie łapy szczura za pomocą taśmy i użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić głębokość znieczulenia. Zwierzę musi nie reagować przed kontynuacją.
  3. Wykonaj boczne nacięcie poniżej mostka i przetnij przeponę na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową. Podnieś i zaciśnij mostek za pomocą hemostatu i umieść nad głową.
  4. Zacisnąć serce za pomocą kleszczy i wprowadzić igłę motylkową podłączoną do pompy perfuzyjnej do tylnego końca lewej komory. Perfuzję u szczura przezsercowo w 150 ml heparynizowanej soli fizjologicznej lub do momentu, gdy oczy i skóra będą czyste. Perfuzja z 4% paraformaldehydem (PFA) zamiast soli fizjologicznej może być preferowana w celu ułatwienia barwienia immunologicznego niektórymi przeciwciałami lub cieńszego wycinka mózgu.
  5. Po zakończeniu perfuzji odetnij głowę gilotyną i wyciągnij mózg do macierzy mózgowej, powierzchnią brzuszną skierowaną do góry.
  6. Za pomocą świeżej żyletki wykonaj cięcie w płaszczyźnie koronalnej 2 mm rostral do skrzyżowania wzrokowego. Przesuwaj ostrze z boku na bok, aby uniknąć wypaczenia mózgu podczas krojenia.
  7. Zanurz tylną część mózgu we wstępnie oznakowanej fiolce zawierającej około 20 ml 4% PFA na 48 godzin po utrwaleniu w temperaturze pokojowej. Przednia część mózgu może zostać błyskawicznie zamrożona w 2-metylobutanie schłodzona do temperatury -42 °C przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.
  8. Po 48 godzinach przenieść utrwalone mózgi do znakowanej fiolki zawierającej 30% sacharozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu zatonięcia (48-72 godziny).
  9. Przygotuj mikrotom, umieszczając suchy lód w korycie etapu próbki, a następnie 100% etanol. Po ostygnięciu stolika wyciśnij na stolik środek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aż utworzy okrąg o średnicy 2 cm i grubości 0,5 cm. Po częściowym zamrożeniu ostrożnie opuść mózg na kopiec OCT, upewniając się, że powierzchnia cięcia prążkowia pozostaje równoległa do sceny.
  10. Dodaj więcej suchego lodu do sceny, aby pomóc mózgowi zamarznąć. Gdy mózg zmieni kolor na kremowy, oczyść etap z suchego lodu.
  11. Zrób dziurę w prawej stronie mózgu za pomocą igły 25G, aby odróżnić prawą i lewą półkulę. Należy uważać, aby nie przebić igły przez interesujące nas struktury anatomiczne.
  12. Seryjnie wycinane odcinki o grubości 40 μm w płaszczyźnie koronalnej, zaczynając od bregmy -3,8 i kończąc na bregmie -6,8.
  13. Przechowuj sześć serii w oznakowanych tubkach z roztworem niezamarzającym (40% PBS, 30% 2-etoksyetanol, 30% glicerol). Każda seria powinna zawierać 12 sekcji mózgu.
  14. Wybierz jeden zestaw sekcji do barwienia immunohistochemicznego i zmyj roztwór przeciw zamarzaniu 3 x 10 min płukania w 0,2% PBS-T.
  15. Blokuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatną nutacją w roztworze blokującym (10% normalna surowica kozia (NGS), 2% albumina surowicy bydlęcej (BSA) w 0,2% PBS-T). Następnie wykonaj inkubację z króliczym przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH) (1:500) i mysim przeciwciałem anty-α-syn (1:500) w 2% NGS w 0,2% PBS-T przez noc w temperaturze pokojowej.
  16. Zmyj przeciwciało pierwszorzędowe przez 3 x 5 minut przemyć w 0,2% PBS-T, a następnie 1 godzinę inkubacji z kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym Alexa Fluor 488 (1:500) i kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-mysim Alexa Fluor 555 w 2% NGS w 0,2% PBS-T. Upewnij się, że sekcje są chronione przed światłem i delikatnie nutyfikują.
  17. Przeciwciało wtórne zmyć 3 x 5 min płukać w 0,2% PBS-T i zamontować cały zestaw sekcji na szkiełkach zabezpieczonych przed światłem i kurzem za pomocą wąskiego pędzla. Szkiełko nakrywkowe z fluorescencyjnym medium montażowym i uszczelnić bezbarwnym lakierem do paznokci.

3. Mikroskopia konfokalna i akwizycja obrazu

  1. Rejestruj obrazy IHC za pomocą oprogramowania sprzężonego z mikroskopem konfokalnym przy 10-krotnym powiększeniu. Otwórz otwór na 1,5 j.a., aby uchwycić szeroką płaszczyznę o łącznej wartości ~1,5 μm i ustaw ostrość na wstrzykniętą stronę mózgu.
  2. Na karcie Akwizycja zaznacz opcję obrazowania Tile Scan i ustaw wymiary na 10 x 4.
  3. W panelu Tryb pozyskiwania ustaw opcję Zoom na 1,1. Pomaga to uniknąć oczywistych śladów łączących obrazy skanowanych kafelków.
  4. Ustaw rozmiar klatki na 1024 x 1024 pikseli, a uśrednianie na 2, aby zapewnić wysoką jakość pozyskiwania obrazu.
  5. W panelu Kanały ustaw ścieżkę 1 na Alexa488, a ścieżkę 2 na Alexa555.
  6. Załaduj szkiełko na scenę i wybierz sekcję z silnym zabarwieniem TH. Kliknij opcję Live (Na żywo) w panelu Acquisition (Pobieranie).
  7. W panelu Kanały ustaw Siłę i Wzmocnienie lasera na poziomy, które maksymalizują sygnał i ograniczają szumy dobiegające z tła. Użyj wskaźnika zasięgu, aby upewnić się, że sygnały nie są prześwietlone (na co wskazuje ciemnoczerwona nakładka).
  8. Powtórz powyższy krok z wieloma szkiełkami, aby upewnić się, że barwienie jest spójne między szkiełkami, ponieważ nie można regulować siły/wzmocnienia lasera między szkiełkami.
  9. Na karcie Pozyskiwanie zaznacz pole Pozycje.
  10. W tym momencie jesteś gotowy do rozpoczęcia obrazowania. Za pomocą okularu wybierz pierwszą sekcję pokazującą dodatnie barwienie TH, ustaw ostrość w punkcie zainteresowania (tj. SNpc), a następnie przesuń stolik do linii środkowej sekcji. Spowoduje to zapisanie pozycji w osiach x, y i z oraz zobrazowanie skanu kafelka obejmującego cały przekrój.
  11. Powtórz powyższy krok dla wszystkich sekcji w całym SNpc, dając pełny zestaw obrazów SNpc. Jeśli wymagana jest szczegółowa analiza strony niewstrzykniętej, kroki od 3.10 do 3.11 należy powtórzyć, skupiając się na stronie niewstrzykniętej.

4. Analiza obrazu i kwantyfikacja

  1. Oddziel pliki obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania i zaimportuj pliki obrazów do oprogramowania do automatycznej analizy obrazu.
  2. Zdefiniuj obszar zainteresowania, wybierając narzędzie Adnotacja pióra, aby narysować adnotację wokół SNpc.
    UWAGA: W sekcjach, w których występuje duża utrata neuronów dopaminergicznych, tymczasowe zwiększenie emitacji/absorpcji może pomóc w jasnym zdefiniowaniu SNpc (Rysunek 2).
  3. Przejdź do zakładki Analiza i z rozwijanego menu Analizuj wybierz opcję Dostrajanie w czasie rzeczywistym. Spowoduje to otwarcie osobnego okna na obrazie przekroju pozwalającego na modyfikację parametrów analizy w czasie rzeczywistym (Rysunek 3).
  4. W sekcji Powiększenie analizy wybierz odpowiednie powiększenie obrazu.
  5. W sekcji Wykrywanie komórek wybierz barwnik jądrowy jako barwnik używany do barwienia TH (Alexa Fluor 488).
  6. Dostosuj ustawienia Próg kontrastu jądrowego, Minimalna intensywność jądra, Agresywność segmentacji jądrowej i Rozmiar jądra, uważnie obserwując okno dostrajania w czasie rzeczywistym.
    UWAGA: Dokładna reprezentacja każdej pojedynczej komórki jako pojedynczej komórki w oknie dostrajania w czasie rzeczywistym ma kluczowe znaczenie dla dokładności. Ustawienia te są w dowolnej skali w zależności od używanego oprogramowania, ale potrzebna jest odpowiednia regulacja, aby oprogramowanie mogło dokładnie rozróżnić poszczególne komórki oraz komórki i tło (Rysunek 3).
  7. Powtórz ten proces z co najmniej 10 oddzielnymi próbkami, aby zapewnić jednolitą zgodność tego, co stanowi komórkę w różnych sekcjach.
    UWAGA: Dodatkowe markery komórkowe (takie jak α-syn lub NeuN) można zidentyfikować w ramach tej samej platformy analitycznej za pomocą sekcji Znacznik 1 lub Znacznik 2 na karcie analizy.
  8. Po pobraniu odpowiedniej liczby obrazów i odpowiednim dostosowaniu dostrajania w czasie rzeczywistym zapisz ustawienia analizy w menu rozwijanym Akcje ustawień.
  9. Wybierz wszystkie obrazy do analizy i kliknij Analizuj.
  10. Wybierz właśnie zapisane ustawienie analizy i w oknie Region analizy zaznacz pole Warstwa adnotacji. Następnie sprawdź warstwę 1 i kliknij Analyze.
    UWAGA: W przypadku pojedynczego mózgu analiza trwa zwykle około 5 minut. Ukończony wynik wyraźnie pokaże każdy element, który został policzony jako komórka (Rysunek 4).
  11. Po zakończeniu wyeksportuj dane analizy podsumowującej dla wszystkich sekcji. Istnieje opcja eksportu danych analizy obiektowej, która dostarczy szczegółowych danych, w tym rozmiaru każdej wykrytej pojedynczej komórki. Ten zestaw danych może być wykorzystany do zbadania zmian wielkości komórek w odpowiedzi na toksynę/terapię.
  12. Dodaj łączną liczbę komórek z każdej analizowanej sekcji na zwierzę i całkowitą analizowaną powierzchnię (mm2). Podziel całkowitą liczbę komórek przez całkowitą analizowaną powierzchnię, aby obliczyć liczbę komórek/mm2 w SNpc dla każdego szczura

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosując powyższe metody do tkanki mózgowej pobranej 6 tygodni po wstrzyknięciu AAV, wykazaliśmy, że stereotaktyczne wstrzyknięcie zmutowanego A53T α-syn (AAV-A53T) do SNpc mózgu szczura powoduje znaczne zmniejszenie gęstości neuronów dopaminergicznych w porównaniu do wstrzyknięcia pustego wektora AAV (AAV-EV) jako kontroli (Rysunek 5A, Średnia liczba neuronów TH-dodatnich/mm2 w SNpc szczurów, którym wstrzyknięto AAV-EV, wynosiła 276,2 ± 34,7, a w SNpc szczurów, którym wstr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiarygodna ocena integralności układu dopaminergicznego w przedklinicznych modelach choroby Parkinsona ma kluczowe znaczenie dla określenia skuteczności potencjalnych terapii modyfikujących przebieg choroby. Dlatego ważne jest, aby kontrolować i minimalizować potencjalne zakłócenia, które mogą zmniejszyć wiarygodność i odtwarzalność danych histopatologicznych. Staranne wyniki ilościowe mogą dostarczyć więcej informacji niż same opisy jakościowe lub półilościowe. Jednocześnie musimy zdać sobie sprawę, że ograniczenia czas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują braku sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim pracownikom Zaawansowanego Ośrodka Mikroskopii Optycznej (AOMF) w University Health Network za poświęcony czas i pomoc w opracowaniu tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało A-SynThermoFisher Scientific32-8100
ABC EliteVector LabsPK-6102
Alexa Fluor 488 przeciwciało drugorzędoweThermoFisher ScientificA-11008
Alexa Fluor 555 przeciwciało drugorzędoweThermoFisher ScientificA-28180
Przeciwciało przeciw-królicze igG sprzężone z fosfatazą alkalicznąJackson Jackson Immuno111-055-144
Biotynylowane przeciwciało przeciw mysim IgGVector LabsBA-9200
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153
DAKO Fluorescencyjne podłoże montażoweAgilentS3023
HALO™Indica Labs
Histo-Clear IIDiamedHS202
ImmPACT DAB Podłoże peroksydazyVector LabsSK-4105
LSM880 Mikroskop konfokalnyZeiss
NeuN PrzeciwciałoMilliporeMAB377
Normalna surowica koziaVector LabsS-1000-20
OCTTissue-Tek
ParaformaldehydeBioShopPAR070.1
Przesuwny mikrotomLeicaSM2010 R
Stereo InvestigatorMBF Bioscience
SacharozaBioShopSUC700
TH PrzeciwciałoThermoFisher ScientificP21962
VectaMountVector LabsH-5000
Wektor Niebieski Podłoże fosfatazy alkalicznejVector LabsSK-5300
Zen Black OprogramowanieZeiss
Zen BlueOprogramowanie Zeiss

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  2. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
  3. Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  4. Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196(2015).
  5. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  6. Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
  7. Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68(2017).
  8. Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43(2010).
  9. Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698(2011).
  10. McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17(2020).
  11. Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
  12. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11(2017).
  13. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dopaminergic Neuron DensitySubstantia NigraAutomated Image AnalysisParkinson s DiseaseTyrosine Hydroxylase StainingConfocal MicroscopyUnbiased StereologyCell DetectionRodent BrainAlpha Synuclein

Powiązane artykuły