Artykuł metodologiczny

Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62065

⸱

10 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery, University Medical Center Rostock, University of Rostock, 2Molecular Oncology and Immunotherapy, Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery, University Medical Center Rostock, 3Institute of Pathology, University Medical Center Rostock

W tym artykule

Podsumowanie

W poniższej pracy opisujemy kolejne kroki niezbędne do stworzenia dużego biobanku raka jelita grubego i trzustki.

Streszczenie

W świetle rosnącej wiedzy na temat międzyosobniczych właściwości i heterogeniczności nowotworów, rozwijająca się dziedzina medycyny spersonalizowanej wymaga platformy do badań przedklinicznych. W ostatnich latach stworzyliśmy biobank nowotworów jelita grubego i trzustki, w skład którego wchodzą pierwotna tkanka nowotworowa, tkanka normalna, surowice, izolowane limfocyty krwi obwodowej (PBL), ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX), a także pierwotne i wtórne linie komórkowe raka. Ponieważ pierwotna tkanka nowotworowa jest ograniczona, a tempo tworzenia się pierwotnych linii komórek nowotworowych jest nadal stosunkowo niskie, PDX pozwala nie tylko na zachowanie i rozbudowę biobanku, ale także na generowanie wtórnych linii komórek rakowych. Co więcej, udowodniono, że modele PDX są idealnym modelem in vivo do przedklinicznych testów leków. Biobankowanie wymaga jednak starannego przygotowania, ścisłych wytycznych i dobrze dostosowanej infrastruktury. Próbki kolektomii, duodenopankreatektomii lub wyciętych przerzutów są pobierane natychmiast po resekcji i przekazywane na oddział patologii. Z poszanowaniem pierwszeństwa bezstronnego raportu histopatologicznego, według uznania patologa prowadzącego, który przeprowadza sekcje, pobierane są małe kawałki guza i tkanki nienowotworowe.

Martwicze części są odrzucane, a pozostała tkanka nowotworowa jest cięta na małe, identyczne kostki i kriokonserwowana do późniejszego wykorzystania. Dodatkowo niewielka część guza jest mielona i odcedzona w celu pierwotnej hodowli komórek rakowych. Dodatkowo próbki krwi pobrane od pacjenta przed i po operacji są przetwarzane w celu uzyskania surowicy i PBL. W przypadku wszczepienia PDX kriokonserwowane próbki są rozmrażane i wszczepiane podskórnie w boki myszy z niedoborem odporności. Uzyskany PDX dokładnie podsumowuje histologię guzów "dawcy" i może być wykorzystany do późniejszego ksenoprzeszczepu lub kriokonserwowany do późniejszego wykorzystania. W poniższej pracy opisujemy poszczególne etapy tworzenia, utrzymywania i administrowania dużym biobankiem raka jelita grubego i trzustki. Ponadto zwracamy uwagę na kluczowe szczegóły i zastrzeżenia związane z biobankowaniem.

Wprowadzenie

W ostatnich latach zgromadzona wiedza na temat właściwości morfologicznych, klinicznych i genetycznych nowotworów doprowadziła do postrzegania raka jako choroby heterogenicznej i zindywidualizowanej. W konsekwencji charakterystyka mutacyjna zmian nowotworowych, obok cech klinicznych i patologicznych, zyskała na znaczeniu w procesie podejmowania decyzji klinicznych, a dla wielu alteracji molekularnych opracowano liczne terapie celowane. Na przykład skuteczność cetuksymabu w leczeniu raka jelita grubego można przewidzieć na podstawie analizy statusu mutacyjnego genów KRAS i PIK3CA1. Medycyna precyzyjna dąży do zastosowania indywidualnego podejścia, aby zapewnić najwyższą odpowiedź na leczenie u każdego pacjenta i uniknąć toksyczności nieskutecznych terapii2. Biobanki zawierają tkanki, krew i inne materiały biologiczne pacjentów onkologicznych, które są powiązane z danymi klinicznymi, stanowiąc tym samym doskonałe narzędzie w translacyjnych badaniach nad rakiem. Ze względu na dużą liczbę próbek klinicznych, biobanki umożliwiają wykrycie rzadkich, ale potencjalnie podatnych na działanie leków mutacji, co stwarza nowe możliwości terapeutyczne dla poszczególnych pacjentów3.

Aby objąć jak najszerszy zakres badań onkologicznych, nie ograniczyliśmy naszej działalności jedynie do pobierania próbek, lecz skupiliśmy się na tworzeniu linii komórkowych nowotworowych oraz ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Tradycyjne linie komórkowe 2D pozostają kamieniem węgielnym badań in vitro i są głównym wyborem w przypadku wielkoskalowych badań przesiewowych leków4,5. Ponadto analiza linii komórkowych jest często łatwiejsza, tańsza i bardziej dostępna. Dodatkowo, dzięki dostępności limfocytów krwi obwodowej (PBL) pochodzących od pacjentów, in vitro można badać również immunologię nowotworów6. Jednak większość nowo opracowanych leków o obiecującej skuteczności przedklinicznej w eksperymentach in vitro na komórkach lub in vivo wykazała rozczarowujące wyniki w badaniach klinicznych7. W przeciwieństwie do nich, badania przedkliniczne oparte na modelach PDX in vivo znacznie wierniej odzwierciedlały aktywność kliniczną środków przeciwnowotworowych8. Ponieważ tkanka PDX ściśle odzwierciedla właściwości histologiczne i molekularne guza dawcy, modele PDX są dobrym sposobem na namnażanie często bardzo ograniczonych ilości żywej tkanki nowotworowej w celu zachowania integralności biobanku oraz umożliwienia wymiany próbek między grupami badawczymi i instytucjami. Co więcej, linie komórkowe nowotworowe pochodzące z tkanki PDX można ustanowić znacznie łatwiej niż pierwotne linie komórkowe nowotworów9. W ostatnich latach nasza grupa badawcza stworzyła kompleksowy, zintegrowany biobank raka jelita grubego i trzustki poprzez stopniową standaryzację i optymalizację przepływu pracy dla wszystkich omawianych próbek biologicznych (Ryc. 1).

Schemat przetwarzania próbek tkanek; chirurgia, patologia, wirowanie, hodowla komórkowa, biobank, badanie na zwierzętach.
Rysunek 1: Przepływ pracy i organizacja biobanku Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Następujące badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Rostocku (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 i A 2019-0222). Ponadto wszystkie odpowiednie procedury weterynaryjne zostały zatwierdzone przez Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern pod numerami rejestracyjnymi LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 i 7221.3-1-007/19.

1. Wymagania wstępne dotyczące eksperymentu

  1. Spełnienie kilku ważnych warunków ramowych w celu utworzenia i utrzymania biobanku.
    1. Korzystaj z kliniki z oddziałem chirurgicznym i wystarczającą liczbą resekcji onkologicznych wraz z dobrze wyposażoną pracownią i wystarczającą liczbą kadry akademickiej. Kolejnym warunkiem wstępnym jest dobra infrastruktura i ścisła współpraca ze współpracującym oddziałem patologii.
    2. Do badań in vivo należy wykorzystać obiekt dla zwierząt z warunkami przetrzymywania odpowiednimi dla myszy z niedoborem odporności.
    3. Uzyskaj autoryzację na wszelkie badania nad materiałami pochodzącymi od pacjentów od komisji etycznej ds. opieki zdrowotnej. Uzyskaj zgodę na wszelkie badania in vivo od właściwego organu zgodnie z lokalnymi przepisami ustawowymi.

2. Pobieranie próbek

  1. Dzień przed zabiegiem
    1. Oceń wszystkich pacjentów z operacyjnym rakiem jelita grubego lub trzustki i/lub odpowiadającymi im przerzutami pod kątem kwalifikacji do biobankowania. Należy unikać włączania przypadków z neoadjuwantowym leczeniem wstępnym, bardzo małych guzów, guzów o nieokreślonej godności lub zmian, które zostały wcześniej częściowo wycięte endoskopowo.
    2. Uzyskanie pisemnej zgody pacjenta na udział w rozmowie o świadomej zgodzie na zabieg chirurgiczny. Poinformuj w odpowiednim czasie wszystkich zaangażowanych chirurgów, zespół laboratoryjny, a także patologa.
  2. Pobieranie próbek
    1. Poinformuj wszystkich pracowników na sali operacyjnej (OR) o pobraniu tkanek do biobanku bezpośrednio przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby tkanka nie była utrwalona w formalinie. Jeśli tkanka jest zanurzona w formalinie, staje się nieodpowiednia do zintegrowanego biobankowania.
    2. Pobrać 40 ml heparynizowanej krwi (strzykawka 2 x 20 ml), a także standardową probówkę surowicy o pojemności 7,5 ml natychmiast po indukcji znieczulenia i szybko przenieść do laboratorium w celu izolacji PBL i przetworzenia surowicy (patrz krok 3-4).
    3. Wyciętą próbkę należy pobrać bezpośrednio ze stołu operacyjnego, umieścić w odpowiednim pojemniku i zabrać na oddział patomorfologii. Zapisz punkt czasowy odłączenia od krążenia, resekcji i przybycia do patologii.
      UWAGA: Przydatność próbki do biobankowania powinna być oceniona przez współpracującego patologa, który preparuje wycinek guza i tkanki niezłośliwej. Nie wycinaj samodzielnie żadnych części próbki, które mogą zagrozić późniejszemu raportowi patologicznemu.
    4. Umieść oba kawałki tkanki w osobnej probówce polipropylenowej o pojemności od 15 do 50 ml z 10 do 30 ml roztworu do przechowywania tkanek (lub DPBS) na lodzie. Zapisz czas odbioru i natychmiast przenieś próbki do laboratorium.
      UWAGA: Następujące kroki protokołu 3-6 należy przeprowadzić w komorze z przepływem laminarnym w ściśle sterylnych warunkach. Używaj wszystkich płynów w temperaturze pokojowej.

3. Przetwarzanie surowicy

  1. Odwirować probówkę surowicy o pojemności 7,5 ml o stężeniu 1128 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut we wstępnie schłodzonej wirówce.
  2. Podaniec 1 ml surowicy na probówkę we wstępnie znakowanych krioprobówkach i zamrozić w ciekłym azocie.

4. Izolacja PBL przez wirowanie w gradiacji gęstości

UWAGA: Pracuj równolegle z każdą z dwóch strzykawek o pojemności 20 ml.

  1. Wlej 20 ml krwi poddanej heparyniźnie do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i dodaj 15 ml DPBS.
  2. Pobrać 15 ml Pancoll za pomocą pipety serologicznej, ostrożnie włożyć pipetę do samego dna probówki polipropylenowej i bardzo powoli zwolnić Pancoll, aby utworzyć warstwę pod kolumną krew/DBPS.
  3. Wirować przy 375 x g przez 15 minut bez hamulca.
  4. Odessać i przenieść nieprzezroczystą warstwę interfazową między środkową i górną kolumną obu próbek do świeżej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i napełnić DPBS do 50 ml.
  5. Wirować przy 270 x g przez 15 minut z hamulcem.
  6. Odessać i wyrzucić supernatant, zawiesić osad komórkowy w 4,5 ml pożywki zamrażającej.
  7. Podaniec 1,5 ml zawiesiny na krioprobówkę, szczelnie zamknąć probówki i umieścić je w pojemniku do zamrażania odpowiednim do powolnego zamrażania i przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Przetwarzanie tkanek

UWAGA: Zacznij od generowania zamrożonych próbek guza i zdrowej tkanki, aby zachować integralność kwasów nukleinowych.

  1. Próbka tkanki nowotworowej
    1. Przenieś próbkę guza z kilkoma ml roztworu do przechowywania tkanek z probówki polipropylenowej na szalkę Petriego. W razie potrzeby spłukać DPBS. Unikaj dotykania próbki i używaj dwóch sterylnych skalpeli do obchodzenia się z tkanką. Unikaj wysuszenia w dowolnym momencie.
    2. Zważ próbkę guza na wygodnej wadze w osobnym naczyniu i zanotuj masę tkanki.
    3. Oceń wielkość, kształt i jakość tkanki nowotworowej przed cięciem. Staraj się uzyskać co najmniej jeden kawałek o wielkości główki szpilki do zamrażania zatrzaskowego i cztery kostki o długości ok. 30 mm3 (długość krawędzi 3 x 3 x 3 mm) każda do niezbędnej kriokonserwacji. Wygeneruj jak najwięcej kostek30 mm w czwórkach i wygeneruj jedną sztukę do szybkiego zamrażania na 5 czworokątów. Weź również pod uwagę, że nekrotyczne części muszą zostać odcięte, aby kostki składały się tylko z niezbędnej tkanki.
    4. Generuj plastry o grubości 3 mm. Odetnij nekrotyczne porcje, które można rozróżnić jako żelową lub płynną masę, i pokrój plastry w kostkę o dwóch pożądanych rozmiarach.
      UWAGA: W tym momencie nie wyrzucaj żadnej chusteczki.
    5. Szybkie zamrażanie
      1. Oznacz odpowiednio krioprobówki (patrz krok 7.7).
      2. Umieść jeden mały kawałek tkanki na wstępnie oznakowaną krioprobówkę. Próbki należy natychmiast zanurzyć na kilka minut w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
    6. Kriokonserwacja ważnych tkanek
      1. Oznacz odpowiednio krioprobówki (patrz krok 7.7) i napełnij każdą z nich 1,5 ml pożywki do zamrażania. Umieść pojemnik do zamrażania obok ławki.
        UWAGA: Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami tak szybko, jak to możliwe. Ponieważ DMSO w pożywce zamrażarki ma właściwości cytotoksyczne, czas zanurzenia tkanki w pożywce zamrażarki bez odpowiedniego chłodzenia nie powinien przekraczać 2 minut.
      2. Ułóż3 kostki 30 mm w czwórki. Wepchnij martwiczą tkankę i inne resztki na krawędź naczynia, ale nie wyrzucaj ich.
      3. Zgarnij kostki ostrzem skalpela i przenieś 4 kostki na krioprobówkę. Upewnij się, że kawałki guza są całkowicie zanurzone w pożywce zamrażarki. Zamknij szczelnie probówki i umieść je w pojemniku do zamrażania odpowiednim do powolnego zamrażania i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      4. Przenieś krioprobówki do odpowiedniego systemu przechowywania w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -140 °C lub niższej. Dokumentacja w systemie zarządzania zapasami laboratoryjnymi jest obowiązkowa.
  2. Próbka zdrowej tkanki: Powtórzyć kroki od 5.1.1. do 5.1.6.4 dla próbki zdrowej tkanki.

6. Pierwotna hodowla komórkowa

  1. Rozpadnij resztki tkanki nowotworowej, w tym nekrotyczny złom, na szalce Petriego za pomocą skalpeli na jak najmniejsze kawałki.
  2. Umieść sterylne sitko do komórek (porów o wielkości 100 μm) na probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
  3. Za pomocą pipety serologicznej dodaj 5-10 ml DPBS do szalki Petriego, unieś resztki tkanki i pipetuj w górę iw dół, aby wytworzyć zawiesinę.
  4. Przenieść zawiesinę za pomocą pipety do sitka do komórek.
  5. Powtarzać kroki 6.3-6.4, aż wszystkie resztki tkanek z szalki Petriego zostaną usunięte.
  6. Za pomocą tłoka strzykawki jednokierunkowej o pojemności 20 ml przecisnąć zawiesinę komórek i tkanek przez sitko do komórek.
  7. Spłucz 5-10 ml świeżego DPBS, wyrzuć sitko do komórek i prawidłowo zamknij probówkę.
  8. Odwirować zawiesinę o sile 180 x g przez 5-10 minut.
  9. Przygotuj wstępnie pokrytą 6-dołkową płytkę z kolagenem I z 1,5 ml podłoża na dołek.
  10. Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 3 ml DPBS lub pożywce i dodać 500 μl zawiesiny do każdej studzienki. Umieścić płytkę w inkubatorze (100% wilgotności, 5% CO2, 37 °C)
  11. Codziennie monitoruj płytkę pod kątem wzrostu komórek i zanieczyszczenia.
    UWAGA: Dalsza hodowla komórek aż do momentu ustanowienia stałej linii komórkowej nie jest tutaj opisana.

7. Generacja PDX

  1. Eksperymenty invivo należy przeprowadzać wyłącznie przez odpowiednio wykwalifikowane osoby, spełniające wymagania właściwego organu w jurysdykcji użytkownika.
  2. Trzymanie myszy z niedoborem odporności w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF) spełniających wymagania stosowanego szczepu myszy. Środki higieniczne obejmują indywidualnie wentylowane klatki, autoklawowaną żywność, wodę i materiały do gniazdowania, a także bezpieczną śluzę powietrzną i noszenie osobistego sprzętu ochronnego.
  3. Wcześniej należy sterylizować w autoklawie wszystkie instrumenty i używać tylko jednego zestawu narzędzi dla każdego przypadku nowotworu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Z tkanką nowotworową należy obchodzić się tak aseptycznie, jak to możliwe. Wszystkie wymienione poniżej przedmioty z tworzyw sztucznych powinny być sterylne, jednorazowego użytku i wyrzucane po każdym zabiegu.
    UWAGA: Określona metodą zamrażania czterech fragmentów tkanki nowotworowej na krioprobówkę, generacja PDX wymaga zawsze dwóch myszy na próbkę, co idealnie daje cztery guzy PDX.
  4. Wybierz żądany guz pierwotny do wszczepienia za pomocą systemu zarządzania zapasami laboratoryjnymi i przenieś próbkę (żywotnie zachowaną tkankę nowotworową) z głównego zbiornika magazynowego do przenośnego pojemnika na ciekły azot (wygodne jest również pośrednie przechowywanie w temperaturze -80 °C na suchym lodzie).
  5. Przed wejściem do sekcji SPF należy założyć środki ochrony osobistej (fartuchy, chodaki, fartuch, osłona na włosy, maska chirurgiczna i ochraniacze na buty), zdezynfekować ręce i cały sprzęt.
  6. Moczenie Matrigelu
    1. Wyjmij krioprobówkę z pojemnika na ciekły azot i poczekaj na rozmrożenie próbki.
    2. Oznacz probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml i napełnij ją 35 ml DPBS.
    3. Przechyl krioprobówkę w górę iw dół i natychmiast przenieś zawartość do rurki polipropylenowej, gdy tylko można przesunąć pożywkę w postaci błota pośniegowego. Delikatnie opłucz kawałki tkanki nowotworowej, wyrzuć główną objętość z probówki do osobnego naczynia, zamknij pokrywkę i połóż probówkę do góry nogami, tak aby cztery kawałki tkanki zebrały się w pokrywie.
    4. Umieść szalkę Petriego na akumulatorze chłodzącym i umieść 100 μl Matrigelu w postaci pojedynczej kropli na środku. Użyj kleszczyków anatomicznych, aby przenieść kawałki guza do Matrigel. Upewnij się, że każdy kawałek jest całkowicie pokryty Matrigelem. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Znieczulenie myszy (2 myszy na próbkę, praca równolegle)
    1. Przygotuj zapas 3:1 roztworu znieczulającego ketaminy (100 mg/ml) i ksylazyny (20 mg/ml). Zalecana dawka wynosi 90/6 mg/kg masy ciała.
    2. Zważyć mysz i pobrać niezbędny roztwór znieczulający do jednorazowej strzykawki insulinowej.
    3. Umieść mysz na siatce klatki, delikatnie pociągnij ją jedną ręką za ogon, aby wywołać ruch do przodu i jednocześnie uderz w szyję ściskając drugą ręką. Podnieś mysz z siatki i obróć rękę trzymającą tak, aby plecy zwierzęcia spoczywały na twojej dłoni. Unieruchom jedną z tylnych nóg małym palcem i wstrzyknij narkotyki dootrzewnowo. Umieść mysz z powrotem w klatce i poczekaj na indukcję narkotyku.
    4. Umieść znieczuloną mysz na płycie grzewczej i przykryj oczy maścią, aby uniknąć uszkodzenia rogówki. Ocenia głębokość znieczulenia, delikatnie ściskając tylną stopę myszy kleszczami chirurgicznymi.
      UWAGA: Brak ruchu wskazuje na głęboką narkozę. Każdy rodzaj ruchu wymaga albo więcej czasu na osiągnięcie pożądanej głębokości narkotycznej, albo dodatkowej dawki środków znieczulających.
  8. Zabiegu chirurgicznego
    1. Uformuj fałd skórny, ściskając szyję myszy i wstrzyknij mikroczip podskórnie za pomocą aplikatora (patrz krok 9, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat programowania)
    2. W razie potrzeby ogol boki myszy (myszy NMRInu/nu nie wymagają golenia), nałóż jod powidonu za pomocą bawełnianego wacika i użyj serwety chirurgicznej, aby stworzyć sterylne pole.
    3. Podnieś skórę boku za pomocą kleszczy chirurgicznych, wykonaj małe nacięcie o średnicy około 4 mm i uformuj małą kieszeń podskórną preparatem nożyczkami.
    4. Umieść jeden kawałek guza w każdej kieszeni i umieść go na tylnym końcu.
    5. Przyciąć końcówkę końcówki pipety o pojemności 100 μl, odessać pozostałą ilość Matrigelu z szalki Petriego i równomiernie nałożyć go do każdej kieszonki skórnej.
    6. Zamknij rany prostymi przerwanymi szwami i nałóż opatrunek w sprayu.
  9. Zeskanuj mikroczip i sprawdź ważność identyfikatora myszy i nowotworu.
  10. Przygotuj nową klatkę ze świeżą ściółką i materiałem gniazdowym, a także patykiem do gryzienia. Złóż "poduszkę" z ręczników papierowych i połóż mysz z uniesioną głową pod lampą grzewczą na podczerwień.
  11. Zmieszać 0,25 ml trimetoprimu/sulfametoksazolu (400 mg/80 mg) ze 100 ml wody pitnej i podawać przez butelkę do picia. Weź pod uwagę, że jedna mysz spożywa około 150 ml na kg masy ciała dziennie.
    UWAGA: Ponieważ podskórny model PDX nie jest związany z bólem pooperacyjnym, ani podczas procesu gojenia się rany, ani podczas rozrostu guza, analgezja pooperacyjna nie jest wymagana. Należy pamiętać, że wytyczne dotyczące dobrostanu zwierząt obowiązujące w danej instytucji/urzędzie mogą się różnić.
  12. Monitorowanie zwierząt doświadczalnych
    1. Codziennie monitoruj myszy pod kątem oznak niepokoju. Można to zlecić wykwalifikowanym opiekunom zwierząt.
    2. Antybiotykoterapię pooperacyjną z wyżej wymienioną dawką należy kontynuować przez 4 tygodnie. Mieszankę antybiotyków należy wymieniać dwa razy w tygodniu.
    3. Mierz rozmiar guza co najmniej raz w tygodniu, najlepiej codziennie, za pomocą suwmiarki (objętość guza = 0,52 x długość x szerokość x wysokość [mm3]) i zapisz w bazie danych.

8. Zbieranie i przetwarzanie PDX

  1. Zbierz i przetwórz guz PDX, gdy:
    Wielkość guza osiąga objętość docelową 1.500 mm3.
    Zwierzę z guzem wykazuje oznaki niepokoju i/lub choroby, a leczenie jest daremne.
    Guz staje się owrzodzony lub wnika w skórę myszy.
  2. Odczytaj mikroczip, aby zidentyfikować właściwy PDX.
  3. Poddać mysz eutanazji legalną metodą (w zależności od wytycznych krajowych), taką jak na przykład uduszenieCO2 lub wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  4. Podnieś skórę kleszczami chirurgicznymi po bokach i naciąć nożyczkami Metzenbauma w odległości kilku milimetrów od guza.
  5. Oderwij skórę nad guzem za pomocą przygotowania, a następnie ostrożnie chwyć guz anatomicznymi kleszczami i odłącz guz od powierzchownej powięzi ciała.
  6. Przepłucz guz DPBS, włóż go na szalkę Petriego i usuń sąsiednią tkankę łączną.
  7. W tym momencie wykonaj jedną z następujących czynności:
    1. Wytnij30 mm 3 kostki i utwórz nowy PDX (postępuj zgodnie z protokołem w punkcie 7.7.4).
    2. Pokrój guz na plasterki, które są następnie przenoszone do kaset histologicznych i konserwowane w 4% formaldehydzie do późniejszego zatopienia w parafinie.
    3. Zachowaj guz w probówce z roztworem do przechowywania tkanek, aby dodać go do biobanku (postępuj zgodnie z protokołem w kroku 3.) i/lub utwórz linie komórkowe pochodzące z PDX (postępuj zgodnie z protokołem w kroku 4).

9. Biobank i zarządzanie danymi

  1. Przypisz wewnętrzny identyfikator do każdego przypadku guza zgodnie z tabelą 1.
Lokalizacja/nazwa laboratoriumJednostka nowotworowaKolejny numer sprawyspecyfikacjaliczba ciągła
C = jelito grube_Met=Przerzuty
P = trzustka_Tu=Guz
Przykład: HROC389_Met2 = Rostock, rak jelita grubego, przypadek 389, drugi przerzut

Tabela 1: Definicja identyfikatora próbki.

  1. Przechowuj zgodę pacjenta w formie elektronicznej i papierowej wraz z identyfikatorem guza.
  2. Zbierz jak najwięcej danych klinicznych i przechowuj je anonimowo i oddzielnie.
  3. Użyj oprogramowania do zarządzania danymi (np. Freezerworks) lub innego i utwórz interfejs z oprogramowaniem do drukowania etykiet, aby generować odporne na temperaturę, samoprzylepne etykiety z kodami kreskowymi.
  4. Dodaj nową próbkę, otwierając oprogramowanie do zarządzania danymi, zdefiniuj typ próbki i zapisz następujące informacje: identyfikator guza, typ tkanki, metoda zamrażania, data, odpowiedzialny pracownik, numer przejścia, identyfikator myszy i szczep myszy.
  5. Przypisz próbki do określonych pozycji w zbiorniku magazynowym.
  6. Śledzenie i monitorowanie PDX (dotyczy kroków 7-8)
    1. Użyj bazy danych MS Access (lub podobnego systemu) na przenośnym urządzeniu obsługującym technologię Bluetooth (laptopie lub tablecie), aby zarejestrować identyfikator guza, datę implantacji, datę eutanazji, wiek i szczep myszy, a także wzrost guza w czasie.
    2. Podłącz czytnik mikroczipów do urządzenia i odczytaj mikroczip przed implantacją.
    3. Przypisz konkretny identyfikator do każdej myszy; używamy następującego schematu: (patrz Tabela 2 poniżej)
    4. Po implantacji zapisz identyfikator wraz z charakterystyką myszy w bazie danych.
    5. Ponownie przeczytaj mikroczip i sprawdź, czy specyfikacje mikroczipa, bazy danych i etykiety krioprobówki są zgodne.
    6. Utwórz odpowiednią etykietę dla każdej klatki myszy.
      UWAGA: Aby utworzyć fizyczną kopię zapasową, przyklej etykiety krioprobówek z odpowiednimi etykietami z mikroczipem do książeczki i zanotuj datę i szczep myszy.
    7. Aby monitorować wzrost guza u poszczególnych PDX, zeskanuj mikroczip myszy za pomocą czytnika podłączonego do urządzenia bazy danych w celu identyfikacji i rejestruj rozmiar guza mierzony suwmiarką co tydzień.
    8. Zaplanuj idealny punkt czasowy zbioru PDX, analizując krzywą wzrostu guza.
Identyfikator guzaWcześniejsze składowanie w N2 (=f)Liczba przejścia (=T)kolejna liczba myszy (=M)
Przykład: HROP12 fT0 M1 = Rostock, rak trzustki, przypadek 12, wygenerowany z zamrożonej tkanki pierwotnej, pierwsze przejście, mysz 1.

Tabela 2: Definicja identyfikatora PDX.

Wyniki

W naszych badaniach wskaźnik ustanowienia pierwotnych kultur komórkowych (Rycina 2A & B) wyniósł 12,9% w dużej serii9. Większość prób izolacji ekspandowalnych komórek nowotworowych ze świeżych preparatów resekcyjnych zakończyła się niepowodzeniem z powodu braku przyrostu lub wczesnej kontaminacji. Ustanowienie linii komórkowej uznano za udane po 3 pasażach przy stałym wzroście w standardowych warunkach hodowli (DMEM, 10% FCS, standardowe naczynie hodowlane) i walidacji różnicowania nabłonkowego za pomocą analizy FACS10. Linie komórkowe pochodzące z guzów PDX (Rycina 2C & D) wykazały wyższy wskaźnik ustanowienia wynoszący 23,6%, co wynika również z możliwości podejmowania wielokrotnych prób, w przeciwieństwie do pierwotnych guzów resekcyjnych9. Jednakże niektóre kultury mieszane (Rycina 2E) nie mogą zostać oczyszczone z przyrostu fibroblastycznego lub zostają całkowicie utracone z powodu przerostu fibroblastów (Rycina 2F).

Obrazy mikroskopowe hodowli komórkowych, stadia różnicowania komórek macierzystych, wyniki eksperymentu, skala: 100μm.
Rycina 2: Hodowla komórkowa. Pierwotne linie komórek nowotworowych, pochodzące z przerzutu w przypadku raka jelita grubego HROC313, pasaż 21 (A) oraz raka trzustki HROP88, pasaż 5 (B). Linie komórek nowotworowych pochodzące z modeli PDX raka jelita grubego PDX HROC285 T0 M2 (D) oraz raka trzustki PDX HROP10 T5 M2, pasaż 4 (E). Mieszana hodowla fibroblastów i komórek nowotworowych z raka trzustki HROP75, pasaż 8 (C) oraz przerost fibroblastyczny (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Biorąc pod uwagę zmiany w protokole generowania PDX, wykorzystane szczepy myszy, a także różnych badaczy na przestrzeni kilku lat, jak również znaczne różnice w ilości tkanki nowotworowej dostępnej do przeszczepienia, określenie ogólnego wskaźnika sukcesu generowania PDX nie jest trywialne. W bardzo niedawnej serii eksperymentów z generowania PDX przeprowadzonych przez dwóch badaczy (S.M. i F.B.) zaobserwowano pierwotne wskaźniki wzrostu na poziomie 63% dla PDX jelita grubego (przykładową histologię przedstawiono na Ryc. 3A) i 48% dla PDX trzustki (Ryc. 3B). Wzrost chłoniaków mysich lub ludzkich w miejscu implantacji występuje stosunkowo rzadko, ale może przypominać udany wzrost PDX (Ryc. 3C). Poza badaniem histopatologicznym, zgodność między modelami PDX a pacjentami-dawcami była regularnie potwierdzana za pomocą analizy krótkich powtórzeń tandemowych (STR) (Ryc. 3D). Do chwili obecnej biobank obejmuje >50 pierwotnych i >50 wtórnych linii komórkowych raka jelita grubego, 3 pierwotne i 6 wtórnych linii komórkowych raka trzustki, a także >150 modeli PDX jelita grubego i 19 modeli PDX trzustki.

Obrazy histologiczne A-C próbek tkanek z barwieniem H&E; D przedstawia elektroferogram analizy genetycznej.
Rysunek 3: Reprezentatywne porównanie histologiczne PDX jelita grubego (A) oraz trzustki (B). Chłoniak ludzki w miejscu implantacji naśladujący wzrost PDX (C). Test tożsamości genetycznej modelu PDX (HROC430 T1 M2) w stosunku do oryginalnej tkanki guza pacjenta (HROC430Tu) za pomocą analizy krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Porównanie dziewięciu loci STR: vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (barwnik FAM) oraz D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (barwnik HEX) z wykorzystaniem wielokrotnej PCR z primerami znakowanymi fluorescencyjnie po elektroforezie kapilarnej potwierdziło zgodność genetyczną PDX i guza dawcy (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Stworzenie żywego biobanku zakłada, oprócz przestrzegania przepisów prawnych dotyczących prywatności, prawa medycznego i dobrostanu zwierząt, dobrą infrastrukturę i zgrany zespół. Korzystne okazało się bezpośrednie zaangażowanie części personelu chirurgicznego w procedury badawcze, ponieważ może on bardzo dobrze ocenić przydatność danego pacjenta do przeszczepienia tkanki. Co więcej, pacjenci mają tendencję do częstszego wyrażania zgody na biobankowanie, gdy ich pisemna zgoda zostanie uzyskana w trakcie dyskusji na temat świadomej zgody chirurgicznej. Aby zaoszczędzić czas i zasoby, przypadki, które przypuszczalnie dostarczą niewystarczającej ilości tkanki nowotworowej, nie powinny być wybierane do biobankowania. Jeśli chodzi o pozyskiwanie próbek, maksyma "komunikacja jest kluczowa" jest prostą, ale często pomijaną prawdą. Wystarczy jedna niedoinformowana pielęgniarka lub kolega chirurg, aby zniszczyć próbkę już na samym początku, postępując jak zwykle i dodając formaldehyd do próbki do resekcji. W związku z tym niezwykle ważne jest, aby każdy członek zaangażowanego personelu zapoznał się ze standardowymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi biobankowania. Chirurdzy powinni zostać powiadomieni dzień przed zabiegiem i zaraz po jego rozpoczęciu o planowanym pobraniu tkanek. Ponadto przypadki wybrane do biobankowania powinny być wyróżnione w elektronicznym planie sali operacyjnej. Pobranie tkanki z próbki chirurgicznej powinno być wykonane przez patologa. Po pierwsze, zapewni to, że pobieranie tkanek nie będzie kolidować z końcowym raportem patologicznym. Po drugie, zwiększa to prawdopodobieństwo otrzymania tkanki z odpowiednią ilością żywej tkanki nowotworowej. Szczególnie w rakach trzustki z wyraźną reakcją desmoplastyczną i częstymi obszarami martwiczymi, żywotne części są trudne do zidentyfikowania makroskopowo dla niewprawnego oka. W drodze wyjątku od tej reguły, bloki tkanek z dużych przerzutów do wątroby lub płuc mogą być czasami wycinane przez chirurga "na tylnym stole", jeśli marginesy chirurgiczne można określić makroskopowo. Rak odbytnicy wycięty przez całkowite wycięcie mezorektalne (TME) może nie nadawać się do biobankowania, ponieważ pobranie tkanki z wyciętej próbki przed zatopieniem parafiny może zakłócić ocenę jakości TME. Alternatywnie, tkankę do biobankowania można pozyskać przez przezodbytniczą biopsję raka odbytnicy.

Wskaźniki zakładania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z pierwotnego guza są na ogół niskie. Wtórne hodowle komórkowe pochodzące z PDX mogą być z większym prawdopodobieństwem pomyślnie założone. Zalecamy testowanie różnych pożywek dla każdego przypadku i stosowanie suplementów antybiotykowych przy pierwszych pasażach, aby zmniejszyć zanieczyszczenie do minimum, ponieważ pobrana tkanka rzadko jest sterylna. Po udanej namnażaniu każda pojedyncza linia komórkowa powinna zostać potwierdzona jako linia komórek nowotworowych za pomocą analizy FACS i regularnie badana pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Aby wykluczyć zanieczyszczenie krzyżowe, zaleca się regularną analizę STR. Należy zauważyć, że protokół zakładania dla pierwotnych i drugorzędowych linii komórkowych jest stale poddawany optymalizacji. Szczegółowe informacje na temat składu i wskaźników sukcesu poszczególnych mediów wyraźnie wykraczają poza zakres niniejszej pracy i zostaną opublikowane oddzielnie.

W przypadku wszczepienia PDX tkanka nowotworowa może być wszczepiona bezpośrednio po resekcji lub kriokonserwowana w płodowej surowicy cielęcej z 10% DMSO lub podobnym środkiem do zamrażania w celu opóźnionej implantacji. Implantacja bezpośrednio po pobraniu tkanki nowotworowej stanowi obciążenie dla personelu logistycznego i laboratoryjnego, a wyniki ksenoprzeszczepu po kriokonserwacji wcale nie są gorsze 10. Co więcej, inkubacja tkanki w Matrigel przed implantacją guza znacznie zwiększa wskaźniki wszczepienia12. Zalecamy opóźnione wszczepienie po stwierdzeniu jednoznacznego badania patologicznego i natychmiastowe usunięcie błędnie pobranych próbek tkanek. Ponieważ wskaźnik powodzenia pierwotnego wszczepienia wzrasta wraz z niedoborem odporności myszy biorcy, zwykle używamy myszy NSG do pierwszego przejścia PDX. Po pierwszym udanym wszczepieniu PDX, myszy NMRInu/nu mogą i powinny być wykorzystywane do kolejnych pasaży i ekspansji tkanek. Szczep ten jest bardziej wytrzymały, tańszy i łatwiejszy w hodowli w porównaniu z NSG lub podobnymi szczepami z niedoborem odporności, ale nadal wykazuje rozsądne wskaźniki wszczepienia. Co więcej, jego nagość ułatwia implantację i monitorowanie wzrostu guza. Aby zwiększyć szybkość wszczepiania w kolejnych pasażach, zalecamy bezpośredni transfer świeżo pobranych tkanek PDX do myszy gospodarza, gdy tylko jest to możliwe, szczególnie w przypadku wolno rosnących PDX i przypadków o niskim wskaźniku powodzenia pierwotnego wszczepienia. Collins i Lang niedawno dokonali przeglądu 14 badań dotyczących tworzenia PDX jelita grubego i odnotowali wskaźniki wszczepienia wahające się od 14 do 100%, przy medianie wskaźnika tworzenia PDX wynoszącej 68%, przy czym ta ostatnia jest zgodna z naszymi ustaleniami13. Zgodnie z piśmiennictwem zaobserwowaliśmy niższe wskaźniki rozwoju raka trzustki w porównaniu z rakiem jelita grubego PDX14. Niezależnie od szczepu myszy gospodarza i jednostki nowotworowej, wyrostek ludzkich chłoniaków z komórek B związanych z wirusem Epsteina-Barr (EBV) i chłoniaków mysich po stronie implantacji stanowi ważną pułapkę15,16. Jeśli nie zostaną rozpoznane, takie guzy mogą "zanieczyścić" kolejne pasaże, a tym samym zakłócić kolejne wyniki. Niezwykły szybki wzrost PDX i obrzęk węzłów chłonnych szyjnych, pachowych i pachwinowych są silnymi wskaźnikami wzrostu chłoniaka mysiego, ale mimo to wskazane jest regularne badanie histologiczne PDX. Ponadto zgodność genetyczna między PDX a odpowiadającym mu pacjentem-dawcą powinna być regularnie badana za pomocą analizy STR. Idealnie byłoby, gdyby biobank był połączony z kliniczną bazą danych zawierającą charakterystykę pacjenta (informacje ogólne, przeżycie, przeżycie wolne od nawrotu, terapia, nowotwór wtórny itp.). Ze względu na regulacje prawne dotyczące ochrony prywatności oraz brak takiej anonimowej bazy danych, nasz zbiór danych klinicznych jest regularnie administrowany i aktualizowany ręcznie przez współpracujących lekarzy.

Podczas gdy konwencjonalne biobanki ograniczają się do badań obserwacyjnych, żywy biobank daje możliwość interwencji in vitro i in vivo. Linie komórkowe pochodzące od pacjentów są ważnym narzędziem w badaniach podstawowych, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i ocenie nowych środków farmaceutycznych4. Odpowiednie modele PDX mają jednak coraz większe znaczenie, ponieważ ściśle podsumowują histologię pierwotnego guza 17,18 i wykazują wysoką stabilność genetyczną przez kilka pasaży19,20. Nasz biobank PDX sprawdził się jako doskonała platforma do badań przedklinicznych i podstawowych 6,21. Ponadto, ponieważ duże zbiory PDX odpowiednio odzwierciedlają międzyosobniczą heterogeniczność populacji pacjentów, podejście oparte na badaniu klinicznym PDX (PCT) (jedno zwierzę na model na leczenie) zyskało na znaczeniu dla opracowywania leków, ponieważ umożliwia wierne przewidywanie odpowiedzi klinicznej na nowe leki i schemat skojarzony8. Obecnie oceniamy również nowe eksperymentalne leki w małych badaniach klinicznych PCT.

Pomimo tych obiecujących wyników, mediana czasu trwania leczenia wynosząca 12,2 miesiąca utrudnia kliniczne zastosowanie modeli PDX jako "myszy awatarów" do testowania opcji leczenia przeciwnowotworowego, przynajmniej dla tych pacjentów, którzy wymagają natychmiastowego leczenia uzupełniającego lub nawet neoadjuwantowego22. Dodatkową wadą standardowych modeli PDX jest brak przydatności do testowania immunoterapii ze względu na niedobór odporności u myszy gospodarzy. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano kilka "humanizowanych" szczepów myszy. Myszy te mają silnie obniżoną odporność, ale można je odtworzyć za pomocą różnych typów ludzkich komórek pochodzących ze szpiku kostnego lub hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + po wyrosciu PDX23, co pozwala na ocenę cytotoksyczności za pośrednictwem limfocytów i odpowiedzi na leczenie inhibitorem immunologicznego punktu kontrolnego24,25.

W ostatnich latach organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) stały się ważnymi modelami nowotworów konkurującymi z PDX. Te trójwymiarowe struktury, pochodzące z nienaruszonych fragmentów guza i hodowane w rusztowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej, ściśle odzwierciedlają histologiczne i genetyczne właściwości oryginalnego guza. Możliwość długoterminowej rozbudowy i kriokonserwacji sprawia, że ChNP jest idealnym uzupełnieniem żywego biobanku 26,27. Oprócz stosunkowo wysokiego wskaźnika zakładania, odnotowano wiarygodne przewidywanie odpowiedzi na lek dla PDO kilku jednostek nowotworowych28. Co więcej, PDO zostały nawet wygenerowane z krążących komórek nowotworowych, a także możliwe jest jednoczesne tworzenie organoidów z odpowiednich zdrowych tkanek, co pozwala na ocenę toksyczności związanej z terapią na podstawie indywidualnej oceny pacjenta29,30. Jednak w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami komórkowymi 2D, hodowla organoidów jest czasochłonna i zasobochłonna, a sztuczne związki macierzy zewnątrzkomórkowej mogą zakłócać niektóre procedury analityczne31. Co więcej, organoidy nowotworowe są podatne na przerost przez szybciej rosnące, niezłośliwe organoidy pochodzące ze zdrowego nabłonka30. Ze względu na brak zrębu, naczyń krwionośnych i komórek odpornościowych, PDO są w większości nieprzydatne do testowania antyangiogennych leków immunoterapeutycznych. Jednak nowe metody hodowli pozwalają na modelowanie mikrośrodowiska guza in vitro, co sprawia, że PDO są prawdziwym pretendentem do modeli PDX32. Miejmy nadzieję, że w niedalekiej przyszłości indywidualne modele nowotworów u poszczególnych pacjentów, w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi, takimi jak sekwencjonowanie nowej generacji, utorują drogę do prawdziwej medycyny precyzyjnej i dostosowanych do potrzeb metod leczenia.

Podziękowania

Uprzejmie dziękujemy Jenny Burmeister, naszej asystentce graficznej, za nagranie i montaż filmu. Ponadto dziękujemy naszym kolegom z oddziału chirurgiczno-patomorfologicznego za wieloletnią współpracę. Chcielibyśmy również podziękować Marcusowi Müllerowi, kierownikowi produkcji w Centrum Informatyki i Mediów Uniwersytetu w Rostocku, za dostarczenie sprzętu do nagrywania dźwięku i dopracowanie jakości dźwięku.

FINANSOWANIE: Niemiecka Fundacja Pomocy Rakowi (DKH e.V.), grant numer 108446, oraz grant numer TBI-V-1-241-VBW-084 z kraju związkowego Meklemburgia-Pomorze Przednie częściowo sfinansowały te badania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bacillol® AF; 1LBode, HartmannREF 973380
probówka wirówkowa PP do dezynfekcji, 15ml; sterylnaGreiner Bio OneGBO Cat. Nr:188271probówka wirówkowa
PP, 50 ml, sterylnaSarstedtNumer zamówienia: 62.547.254probówka wirówkowa
BD DiscarditTM II Strzykawka 20mlBDREF 300296pobieranie krwi
Surowica 7,5ml Sarstedt MonovetteSarstedtNumer artykułu: 01.1601Pobieranie krwi
Pipeta serologiczna 10mlSarstedtREF 86.1254.001transfer cieczy
Pipetboy ratiolab® accupettaRatiolabNumer artykułu: RL3200300transfer cieczy
PIPETBOY acu 2Integra BiosciencesVWR Cat.No: 613-4438cieczy
DPBS; bez Ca & MgPan BiotechKot. Nr: P04-36500mycie
Pancoll człowiekPan BiotechCat. Nr art.: P04-60500wirowanie w gradionym gradimencie gęstości
DMEM/F12 (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średni)PAN BiotechKat. Nr kat.: P04-41500hodowla komórek
FBS Good Forte (filtrowane serum bydlęce)PAN BiotechCat. Nr kat.: P40-47500hodowla komórkowa
L-Glutamina 200mMPAN BiotechCat. Nr kat.: P04-80100hodowla komórek
Trypsyna / EDTAPAN BiotechKot. Nr: P10-023100hodowla komórek
DMSO (dimetylosulfotlenek do hodowli komórkowych)PanReac AppliChemVWR Cat.No: A3672.0250do zamrażania komórek
(FCS z 10% DMSO)zamrażaniawłasnej roboty---
CryoPure 2mlSarstedt72380zamrażanie komórek
6-dołkowa płytka do hodowli komórek; sterylna; z pokrywkąGreiner bio-oneNr kat.: 657 160hodowla komórkowa
szalka Petriego 92 x 16 mm, PS, bez krzywekSarstedtKat. Nr: 82.1472.001Przygotowanie tkanek
sterylne ostrza chirurgiczneB.Braun (Aesculap)REF BB510preparatyka tkanek
BD DiscarditTM II Strzykawka 10mlBDREF 309110do przygotowywania tkanek do komórek
; żółty; 100&mikro; mFalconREF 352360preparat tkankowy
CoolCellbiocisionNumer artykułu: 210004pojemnik chłodzący z -1° C/min
Dewar  statek transportowy typ 27 B, 2 l, 138 mmKGWKat. Nr: System transportowy HT39.1
Końcówka do pipet 200µ lSarstedtREF 70.760.002transfer cieczy
Końcówka filtra 1000µ lSarstedtREF 70.762.411do przenoszenia cieczy
200µ l, żółtyEppendorfCat. Nr: 3121 000.082do przenoszenia cieczy
1000µ l, niebieskiEppendorfCat. Nr artykułu: 3121 000.120do przenoszenia cieczy
  BB 6220 CUHeraeusNr kat.: płytahodowli komórkowej
51012839 PRÄ ZITHERMHarry Gestigkeit GmbH---Mikroskop grzewczy
Zeiss Primo VertCarl Zeiss MicroImaging GmbHNumer seryjny. 3842000839obrazowanie kultur komórkowych
Sterylna ławka Bezpieczny przepływ 1.8 nuncnunc GmbH & Co. KGsterylna
zamrażarka stołowa -80° CKryotec-Kryosafe GmbH---przechowywanie próbek
Waga elektroniczna MP-300Chyo---Scale
BD Micro-fine, U100 strzykawka insulinowaBDREF 324826znieczulenie iniekcyjne
Rompun 2%; 25mlBayer: 6293841.00.00znieczulenie
Ketamin 100 mg/ml, 25mlNumer zatwierdzenia CP-Pharma GmbH: 401650.00.00anestezjologia
GES3S CzytnikdanychniedostępnyCzytnik RFID
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)Peddymark---Chip RFID
Cotrim-ratiopharm®   Ampullen SF 480  mg/5  mlRatiopharmPZN-03928197antybiotykowa woda pitna
Płyta grzewcza #FM-20 42x28cmSmok---heating
Lampa grzewczaElektryczna Petra, Burgau---heating
Maść na oczy i nos (5% dekspantenolu) BepanthenBayerPZN-01578675
Pęseta anatomicznaB.Braun AesculapBD21 LUBChirurgicznych
pęseta chirurgicznaB.Braun AesculapBD50 1 Rnarzędzia chirurgiczne
NożyczkiB.Braun AesculapBC05 6Rigła do narzędzi chirurgicznych
  uchwytB.Braun AesculapBH1 1 ORnarzędzia chirurgiczne
Prolene 5-0EthiconXN8870. P32materiał do szwów chirurgicznych
Opsite przepuszczalny dla wilgoci i pary opatrunek w sprayuSmith& SiostrzeniecREF 66004978, PZN- 02063507materiał do szwów chirurgicznych
Zasłona adhezyjnaBarieraREF 904622sterylna siatka tkankowa OP
Gazin®; sterylna; 10x10 cmLohmann& RauscherREF 18506sterylne aplikatory z
bawełnianą końcówką OP RaucotupfLohmann& RauscherREF 11969aplikator
Corning® Matrigel Basement Membrane MatrixCorningNr kat.: 354234Membrana podstawna Matrix
roztwór jodu Braunol (7,5g jodu powidonu)B.Braun Melsungen AGNumer artykułu: 18839dezynfekcja
MACS® Rozwiązanie do przechowywania tkanekMiltenyi Biotec GmbHNr zamówienia: 130-100-008rozwiązanie do przechowywania
Formafix 4%Grimm med. Logistik GmbHNumer artykułu:Rozwiązanie do mocowania
Oprogramowanie FreezerworksBasicDataworks Development, Inc---przykładowa organizacja
Drukarka Zebra TLP 2844Drukarka Zebra---label
transfer zamrażarka kriotuba do komórek - sitko pipeta pipeta inkubator grzewcza do --- Numer zgody do ochrony oczu do narzędzi chirurgicznych F10010G

Bibliografia

  1. Sartore-Bianchi, A., et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).
  2. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  3. Lipson, D., et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).
  4. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  5. Mouradov, D., et al. Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer. Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).
  6. Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept. Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).
  7. DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. Clinical approval success rates for investigational cancer drugs. Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).
  8. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
  9. Mullins, C. S., et al. Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research. Cancers. 11 (10), (2019).
  10. Kuehn, F., et al. Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft. Scientific reports. 6, 24671(2016).
  11. Dangles-Marie, V., et al. Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features. Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).
  12. Gock, M., et al. Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models. BioMed research international. 2016, 11715053(2016).
  13. Collins, A. T., Lang, S. H. A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine. PeerJ. 6, 5981(2018).
  14. Brown, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).
  15. Zhang, L., et al. The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice. Scientific reports. 5, (2015).
  16. Moyer, A. M., et al. Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall. Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).
  17. Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment. PloS one. 12 (10), 0186271(2017).
  18. Guenot, D., et al. Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability. The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).
  19. Mattie, M., et al. Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics. Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).
  20. Cho, Y. B., et al. Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors. The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).
  21. Maletzki, C., et al. Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype. PloS one. 10 (11), 0143194(2015).
  22. Katsiampoura, A., et al. Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer. Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).
  23. Wege, A. K., et al. Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy. International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).
  24. Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).
  25. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37(2019).
  26. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  27. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  28. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  29. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  30. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  31. Abe, Y., et al. Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids. Scientific reports. 8 (1), 11401(2018).
  32. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentarak jelita grubegorak trzustkiprzetwarzanie tkanki nowotworowejlimfocyty krwi obwodowejgenerowanie linii komórkowychkriokonserwacjawirowanie w gradiencie gęstościprzedkliniczne testowanie leków
Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.