Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62129

⸱

3 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda może być użyta do zbadania skrócenia sarkomeru za pomocą kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami sarkomerowymi.

Streszczenie

Kardiomiocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC-CMs) mogą być wytwarzane zarówno z embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ES/iPS). Komórki te stanowią obiecujące źródła do modelowania chorób serca. W przypadku kardiomiopatii skrócenie sarkomeru jest jedną ze standardowych ocen fizjologicznych, które stosuje się w przypadku dorosłych kardiomiocytów w celu zbadania ich fenotypów chorobowych. Dostępne metody nie są jednak odpowiednie do oceny kurczliwości PSC-CM, ponieważ komórki te mają słabo rozwinięte sarkomery, które są niewidoczne w mikroskopii z kontrastem fazowym. Aby rozwiązać ten problem i przeprowadzić skracanie sarkomeru za pomocą PSC-CM, zastosowano znakowane fluorescencyjnie białka sarkomerowe i fluorescencyjne obrazowanie na żywo. Cienkie linie Z i linia M znajdują się odpowiednio na obu końcach i w środku sarkomeru. Białka linii Z — α-aktynina (ACTN2), teletonina (TCAP) i białko LIM związane z aktyną (PDLIM3) — i jedno białko M-line — Myomesin-2 (Myom2) — zostały oznaczone białkami fluorescencyjnymi. Te znakowane białka mogą ulegać ekspresji z endogennych alleli jako knock-iny lub z wirusów związanych z adenowirusami (AAV). W tym miejscu przedstawiamy metody różnicowania mysich i ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów, wytwarzania AAV oraz wykonywania i analizowania obrazowania na żywo. Opisano również metody wytwarzania stempli polidimetylosiloksanu (PDMS) do wzorzystej kultury PSC-CM, co ułatwia analizę skracania sarkomeru za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie. Aby ocenić skrócenie sarkomeru, zarejestrowano poklatkowe obrazy bijących komórek z dużą liczbą klatek na sekundę (50-100 klatek na sekundę) pod wpływem stymulacji elektrycznej (0,5-1 Hz). Aby przeanalizować długość sarkomeru w trakcie kurczenia się komórek, zarejestrowane obrazy poklatkowe poddano działaniu SarcOptiM, wtyczki do ImageJ/Fiji. Nasza strategia zapewnia prostą platformę do badania fenotypów chorób serca w PSC-CM.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie1, a kardiomiopatia stanowi trzecią przyczynę zgonów związanych z sercem2. Kardiomiopatia to zbiorowa grupa chorób, które wpływają na mięsień sercowy. Ostatnie odkrycia w zakresie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) i ukierunkowanego różnicowania komórek iPS w kierunku kardiomiocytów (PSC-CM) otworzyły drzwi do badania kardiomiocytów z genomem pacjenta jako modelu kardiomiopatii in vitro. Komórki te mogą być wykorzystane do zrozumienia patofizjologii chorób serca, wyjaśnienia ich mechanizmów molekularnych oraz do testowania różnych kandydatów terapeutycznych3. Zainteresowanie jest ogromne, dlatego wygenerowano komórki iPS pochodzące od pacjentów (np. kardiomiopatia przerostowa [HCM]4,5, arytmogenna kardiomiopatia prawej komory [ARVC]6, kardiomiopatia rozstrzeniowa [DCM]7, oraz kardiomiopatie związane z mitochondriami8,9). Ponieważ jedną z cech kardiomiopatii jest dysfunkcja i zaburzenie sarkomerów, potrzebne jest ważne narzędzie, które jednolicie mierzy funkcję sarkomerów.

Skracanie sarkomeru jest najczęściej używaną techniką do oceny funkcji sarkomeru i kurczliwości dorosłych kardiomiocytów pochodzących z modeli zwierzęcych i ludzkich. Do wykonania skrócenia sarkomerów potrzebne są dobrze rozwinięte sarkomery, które są widoczne w kontraście fazowym. Jednak PSC-CM hodowane in vitro wykazują słabo rozwinięte i zdezorganizowane sarkomery, a zatem nie mogą być używane do prawidłowego pomiaru skracania sarkomerów10. Ta trudność w prawidłowej ocenie kurczliwości PSC-CM utrudnia ich wykorzystanie jako platformy do oceny funkcji serca in vitro. Aby pośrednio ocenić kurczliwość PSC-CMs, wykorzystano mikroskopię sił atomowych, matryce mikrosłupków, mikroskopię sił trakcyjnych i pomiary impedancji w celu zmierzenia wpływu ruchu wywieranego przez te komórki na ich otoczenie11,12,13. Bardziej wyrafinowane i mniej inwazyjne zapisy z wideomikroskopii rzeczywistego ruchu komórkowego (np. SI8000 firmy SONY) mogą być alternatywnie wykorzystane do oceny ich kurczliwości, jednak ta metoda nie mierzy bezpośrednio ruchu sarkomeru ani kinetyki generowania siły14.

Aby bezpośrednio mierzyć ruch sarkomeru w PSC-CMs, pojawiają się nowe podejścia, takie jak fluorescencyjne znakowanie białka sarkomerowego. Na przykład Lifeact jest używany do oznaczania aktyny nitkowatej (F-aktyny) do pomiaru ruchu sarkomeru15,16. Genetycznie zmodyfikowane komórki iPS są inną opcją znakowania białek sarkomerowych (np. α-aktyniny [ACTN2] i miomezyny-2 [MYOM2]) za pomocą białka fluorescencyjnego17,18,19.

W tym artykule opisujemy, jak wykonać obrazowanie poklatkowe do pomiaru skrócenia sarkomeru za pomocą Myom2-TagRFP (mysie embrionalne komórki macierzyste [ES]) i ACTN2-mCherry (ludzkie komórki iPS). Pokazujemy również, że wzorzysta kultura ułatwia wyrównanie sarkomerów. Ponadto opisujemy alternatywną metodę znakowania sarkomerem, przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami (AAV), które mogą być szeroko stosowane do komórek iPS pochodzących od pacjenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy

  1. Utrzymanie mysich komórek ES
    1. Pożywka konserwacyjna: Wymieszaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml L-alaniny-L-glutaminy, 5 ml aminokwasów endogennych (NEAA), 5 ml 100 mM pirogronianu sodu i 909 μl 55 mM 2-merkaptoetanolu z 450 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Uzupełnij czynnik hamujący białaczkę (LIF), CHIR-99021 i PD0325901 w końcowym stężeniu odpowiednio 1000 U/mL, 1 μM i 3 μM. Wysterylizuj pożywkę przez filtr 0,22 μm.
    2. Pożywka FBS: Wymieszaj 55 ml FBS, 5,5 ml L-alaniny-L-glutaminy, 5,5 ml pirogronianu sodu i 5,5 ml NEAA z 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy. Przefiltruj pożywkę przez filtr 0,22 μm w celu sterylizacji.
    3. Hodowla mysich komórek ES SMM18, w których TagRFP został wbity do locus Myom2 na żelatynizowanej 6 cm szalce w pożywce konserwacyjnej, jak wcześniej opisano18. Przejazd co 2-3 dni.
  2. Przygotowanie pożywki do różnicowania bez surowicy (SFD)
    1. Podstawowy SFD: Wymieszaj 250 ml Ham's F-12, 750 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 ml suplementu B27 bez witaminy A, 5 ml suplementu N2, 10 ml L-alaniny-L-glutaminy, 5 ml 10% albuminy surowicy bydlęcej w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) oraz 10 ml penicyliny i streptomycyny (10 000 U/ml). Przefiltruj przez sitko 0,22 μm w celu sterylizacji.
    2. Rozpuść kwas askorbinowy w stężeniu 5 mg/ml w wodzie destylowanej i przefiltruj przez sitko 0,22 μm w celu sterylizacji.
    3. Rozcieńczyć 13 μl 1-tioglicerolu do 1 ml IMDM. W tym miejscu należy odnieść się do tego rozcieńczonego 1-tioglicerolu jako MTG.
    4. Dodać 10 μl kwasu askorbinowego (5 mg/ml) i 3 μl MTG do 1 ml podstawowego SFD w dniu stosowania. W tym miejscu należy odnieść się do tej mieszaniny jako kompletnego SFD.
  3. Dzień 0, tworzenie ciała zarodka (EB) w celu różnicowania
    1. Zbierz mysie komórki ES SMM18 za pomocą rekombinowanej proteazy podobnej do trypsyny (rTrypsyna) i policz komórki.
    2. Odwirować 5 x 105 komórek przy 300 x g przez 3 minuty w 4 °C, ponownie zawiesić w 10 ml kompletnego SFD i wysiewać nasiona na 10-centymetrowej szalce Petriego. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 50 godzin.
  4. Zróżnicowanie dzień 2
    1. Dodaj aktywinę A, ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (hVEGF) i białko morfogenetyczne kości 4 (BMP4), aby uzupełnić SFD w końcowym stężeniu odpowiednio 5 ng / ml, 5 ng / ml i 1,9 ng / ml.
      UWAGA: Stężenia BMP4 mogą się różnić w zależności od partii BMP4. Przetestuj kilka stężeń w badaniu na małą skalę przed użyciem nowej partii i określ najlepsze stężenie dla różnicowania serca.
    2. Przenieść EB z szalki Petriego do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 50-100 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    3. W międzyczasie dodać pożywkę przygotowaną w kroku 1.4.1 do płytki Petriego, aby zabezpieczyć pozostałe EB przed wyschnięciem.
    4. Odessać supernatant z probówki o pojemności 15 ml, ponownie zawiesić EB z pożywką na szalce Petriego i przenieść roztwór EB z powrotem do szalki. Następnie uprawiaj EB w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 46 godzin.
  5. Zróżnicowanie dzień 4
    1. Żelatynizować 10-centymetrowe naczynie poddane kulturze tkankowej z 5 do 10 ml 0,1% żelatyny przez co najmniej 5 minut. Odessać żelatynę tuż przed wysiewem komórek.
    2. Przygotuj pożywkę: Wymieszaj podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), FGF10 i hVEGF, aby ukończyć SFD przy stężeniach końcowych odpowiednio 5 ng / ml, 25 ng / ml i 5 ng / ml. Na naczynie o średnicy 10 cm przygotuj 10 ml.
    3. Przenieś komórki z szalki Petriego do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml PBS do szalki Petriego, umyj kilka razy i przenieś do probówki o pojemności 15 ml, aby zebrać pozostałe komórki. Odwirować przy 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
    4. Odessać supernatant, dodać 1 ml rTrypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    5. Krótko odwiruj, aby oddzielić EB, dodaj 9 ml 10% pożywki FBS, ponownie wiruj i policz komórki.
    6. Odwirować 1,5 x 107 komórek w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 3 minuty, ponownie zawiesić z pożywką przygotowaną w kroku 1.4.2 i umieścić nasiona w żelowatym naczyniu. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 dni.
      UWAGA: W 7 lub 8 dniu można zaobserwować silne bicie PSC-CM.
  6. Wybór leku w 7. i 9. dniu różnicowania: Ponownie wprowadzić do pożywki puromycynę (2 μg/ml w końcowym stężeniu) w celu wyeliminowania niekardiomiocytów w 7. i 9. dniu różnicowania.
    UWAGA: Linia rodzicielska SMM18 to mysie komórki ES syNP4, zawierające gen oporny na puromycynę NCX1 napędzany promotorem NCX1 20.
  7. Dzień 10, przeplatanie do przyszłych eksperymentów
    1. Pokryć płytkę hodowlaną ze szklanym dnem lub naczynie obrazowe o średnicy 35 mm zawierające polimerowe szkiełko nakrywkowe 0,1% żelatyny. Aby przyspieszyć dojrzewanie, pokryj naczynia fragmentem lamininy-511 E8 (LN511-E8) w ilości 1 μg/cm2 przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej18. Aby przeprowadzić hodowlę PSC-CM w określonych wzorcach, należy zapoznać się z krokami 4 i 5 dotyczącymi przygotowania znaczków z polidimetylosiloksanu (PDMS).
    2. Aby zebrać SMM18 PSC-CMs, umyj naczynie dwukrotnie PBS, nałóż 1 ml rTrypsyny i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
    3. Zbierz komórki w 9 ml 10% pożywki FBS, zawieś i policz komórki. Umieść komórki w 50 000-100 000 komórek w jednym dołku 24-dołkowej płytki lub 250 000-500 000 komórek w naczyniu do obrazowania 35 mm.
    4. Odwirować odpowiednią liczbę komórek (300 x g, 3 min) i ponownie zawiesić komórki z kompletnym SFD uzupełnionym FBS (stężenie końcowe 10%).
    5. Inkubuj przez noc i zmień pożywkę hodowlaną, aby uzupełnić SFD z puromycyną.
    6. Od 14 dnia zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa do trzech razy w tygodniu z pełnym SFD do dnia 21-28, kiedy Myom2-RFP staje się widoczny. W przypadku transdukcji białek sarkomerowych znakowanych fluorescencyjnie na podstawie AAV, patrz Krok 3.

2. Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Przygotowanie pożywek różnicujących
    1. RPMI+B27-Ins: wymieszaj 500 ml pożywki RPMI 1640, 10 ml witaminy B27 minus insuliny i 5,25 ml L-alaniny-L-glutaminy.
    2. RPMI+B27+Ins: wymieszaj 500 ml RPMI, 10 ml suplementu B27 i 5,25 ml L-alaniny-L-glutaminy.
  2. Utrzymanie ludzkich komórek iPS
    1. Pasaż ludzkich komórek iPS dwa razy w tygodniu z AK02N na LN511-E8 zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą z pewnymi modyfikacjami21.
    2. Zbierz komórki za pomocą 3-minutowej obróbki rTrypsyną i zbierz do 10% pożywki FBS. Policz komórki i odwiruj przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Zasiej 75 000-125 000 komórek w jednym dołku na 6-dołkowej płytce z 2 ml AK02N uzupełnionymi LN511-E8 i Y27632 w końcowym stężeniu odpowiednio 0,5 μg/ml (0,1 μg/cm2) i 10 μM.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i zastąpić pożywkę następnego dnia 2 ml AK02N bez żadnego dodatku. Zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni i przechodź co trzy do czterech dni.
  3. Dzień -4: ponowne platerowanie przed różnicowaniem
    1. Pokryj 6-dołkową płytkę 0,5 μg/cm2 LN511-E8 rozcieńczonym w PBS. Następnie inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór powlekający tuż przed wysiewem komórek.
    2. Zbierz ludzkie komórki iPS za pomocą rTrypsyny i policz komórki, jak w kroku 2.2.2.
    3. Odwirować 1,25 x 105 komórek do dołka na płytce 6-dołkowej o 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 2 ml AK02N uzupełnionym LN511-E8 (stężenie końcowe 0,5 μg/ml lub 0,1 μg/cm2) i Y27632 (stężenie końcowe 10 μM) na studzienkę.
    4. Odessać roztwór powlekający, wysiać ponownie zawieszone komórki na powlekanej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Dni -3 i -1: zastąp pożywkę 2 ml AK02N.
  5. Dzień 0: Zastąp pożywkę 2 ml RPMI+B27-Ins uzupełnionych CHIR99021 (końcowe stężenie 6 μM) na studzienkę, aby rozpocząć różnicowanie.
  6. Dzień 2: Zastąp pożywkę 2 ml RPMI+B27-Ins z WntC59 (stężenie końcowe 2 μM) na studzienkę.
  7. Dzień 4: Zastąp pożywkę 2 ml RPMI+B27-Ins na studzienkę.
  8. Dzień 7 i dzień 9: zastąp pożywkę 2 ml RPMI+B27+Ins z puromycyną (końcowe stężenie 10 μg/ml) na basenik, aby selektywnie wyhodować PSC-CMs.
    UWAGA: Linia ACTN2-mCherry, użyta w tym badaniu, ma kasetę wewnętrznego miejsca wejścia rybosomalnego (IRES), gen oporny na puromycynę wstawiony do regionu 3′-nieuleganego translacji (UTR) locus TNNT2 oraz mCherry zastępujący kodon stop ACTN2. Aby oczyścić kardiomiocyty bez knock-in, zapoznaj się z krokami 3 i 4.
  9. Dzień 10: ponowne przygotowanie do przyszłych eksperymentów
    1. Pokryć naczynie obrazowe o średnicy 35 mm polimerowym szkiełkiem nakrywkowym 0,5-1 μg/cm2 LN511-E8 rozcieńczonego w 0,1% żelatynie. Inkubować 2-4 godziny w temperaturze pokojowej, aby uzyskać długotrwałą żywotność. Aby wyhodować PSC-CM w żądanych wzorach, należy zapoznać się z krokami 4 i 5 dotyczącymi przygotowania znaczków PDMS.
    2. Aby zebrać ludzkie PSC-CM, umyj naczynie dwukrotnie PBS, nałóż 1 ml rTrypsyny na studzienkę i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
    3. Zbierz komórki w 4 ml 10% pożywki FBS, zawieś i policz komórki. Płytka 250 000-500 000 komórek na czaszę obrazowania 35 mm.
    4. Odwirować wystarczającą liczbę komórek przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić za pomocą RPMI+B27+Ins z puromycyną (10 μg/ml) i umieścić płytkę na powlekanej czaszy do obrazowania o średnicy 35 mm.
    5. Inkubować przez noc. Następnego ranka zastąp pożywkę hodowlaną RPMI+B27+Ins puromycyną (10 μg/ml).
    6. Od 14 dnia zmieniaj pożywkę hodowlaną 2-3 razy w tygodniu za pomocą RPMI+B27+Ins do dnia 21-28 w celu obrazowania. W przypadku transdukcji białek sarkomerowych znakowanych fluorescencyjnie na podstawie AAV, patrz Krok 3.

3. Fluorescencyjne znakowanie sarkomerów za pomocą wirusów związanych z adenowirusami

  1. Przygotowanie przed produkcją AAV
    1. Utrzymuj HEK293T komórki w DMEM uzupełnione FBS (stężenie końcowe 10%) na 10 cm płytce do hodowli tkankowej. Komórki pasażowe trzy razy w tygodniu.
    2. Przygotować polietyleniminę (PEI) w stężeniu 1 mg/ml. Wymieszaj 50 mg polietylenininy MAX 40000 i 40 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą 1 N NaOH. Następnie uzupełnij końcową objętość do 50 ml ultraczystą wodą i przefiltruj przez sitko o wielkości 0,22 μm.
    3. Przygotuj wektor wahadłowy z genem znakowania sarkomerem (np. TCAP lub PDLIM3 połączony z białkiem zielonej fluorescencji [GFP]), napędzany przez promotor specyficzny dla kardiomiocytów, taki jak troponina sercowa T (cTNT)22.
      UWAGA: W tym przypadku użyliśmy monomerycznego wzmocnionego GFP z mutacjami V163A, S202T, L221V23.
  2. Dzień 0, pasaż komórek HEK
    1. Gdy komórki osiągną zbieg, przejdź 2,0 x 107 HEK293T komórek do 15 cm płytki do hodowli tkankowej z 20 ml DMEM z 10% FBS.
  3. Dzień 1, transfekcja
    1. Wymieszaj 13,5 μg wektora wahadłowego, 26 μg pHelper (wektor kodujący E2A, E4 i VA adenowirusa), 16,5 μg pRC6 (wektor kodujący geny AAV2 Rep i AAV6 Cap) i 1 ml DMEM bez pirogronianu sodu (DMEM-Pyr).
    2. Wymieszać 224 μl PEI (1 mg/ml, przygotowany w kroku 3.1.2) i 776 μl DMEM-Pyr.
    3. Wymieszać i inkubować roztwór plazmidu i roztwór PEI w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    4. Dodać roztwór plazmidu/PEI do HEK293T komórek przygotowanych w kroku 3.2.
  4. Dzień 2, średnia zmiana
    1. Po 24 godzinach od transfekcji zmienić podłoże na DMEM-Pyr. Hodowla komórek do momentu zbioru AAV w 7 dniu. AAV zostanie uwolniony do pożywek hodowlanych.
  5. Dzień 7, zbieranie, zatężanie i podstawianie buforu AAV przy użyciu metody minimalnego oczyszczania24
    1. Inkubować odśrodkową jednostkę ultrafiltracji (odcięcie masy cząsteczkowej 100 tys. [MWCO]) z 5 ml 1% BSA w PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie odwirować jednostkę ultrafiltracyjną przy 500 x g przez 2 minuty i odessać zarówno przefiltrowane, jak i pozostałe roztwory.
    2. Przenieś pożywkę z 15 cm naczynia, z którego wyprodukowano AAV, do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj (500 x g, 5 min). Przefiltrować supernatant przez sitko strzykawkowe o średnicy 0,45 μm, aby usunąć resztki komórek i nałożyć zawiesinę na jednostkę ultrafiltracji.
    3. Wirować przy 2000 x g przez 90 minut lub do momentu zagęszczenia supernatantu kultury w ilości 0,5 do 1 ml.
    4. Odessać filtrat i nanieść 15 ml PBS na jednostkę ultrafiltracji.
    5. Powtarzaj wirowanie, aż koncentrat osiągnie 0,5-1 ml.
    6. Powtórzyć czynności 3.5.4 i 3.5.5.
    7. Przenieść skoncentrowany AAV do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C.
      UWAGA: AAV może być używany w obiektach P1, ale należy przestrzegać lokalnych zasad i przepisów. AAV może być również wytwarzany konwencjonalnymi metodami.
  6. Obliczanie miana AAV
    1. Zmieszać 5 μl AAV, 195 μl DMEM-Pyr i 10 j. benzonazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Dodać 200 μl buforu proteinazy K (0,02 M Tris HCl i 1% SDS) oraz 5 μl proteinazy K (20 mg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Ostrożnie przygotować 400 μl roztworu fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego w stosunku 25:24:1, wirować przez 1 minutę i odwirowywać przy 20 000 x g przez 1 minutę.
    4. Przenieś 200 μl fazy wodnej do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, która da około połowy oryginalnych genomów AAV.
    5. Dodać 1 μl glikogenu (20 mg/ml) do 20 μl 3 MCH 3COONa (pH 5,2) i odwirować. Dodaj 250 μl 2-propanolu do 100 μl 100% etanolu i ponownie odwiruj.
    6. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 15 minut. Następnie odwirować przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Odessać supernatant i dodać 70% etanolu do probówki. Następnie odwirować w temperaturze 20 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    8. Zassać supernatant i wysuszyć na powietrzu, aż osad stanie się klarowny.
    9. Dodać 200 μl kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (TE; pH 8,0) w celu rozdzielenia genomów AAV. Następnie rozcieńczyć próbkę 100-krotnie za pomocą TE.
    10. Przygotuj wzorzec z wektorem pAAV-CMV w stężeniu 6,5 ng / μL z TE, aby uzyskać 109 genomów wektorowych (vg) / μL. Następnie wykonaj serię 10-krotnego rozcieńczenia od 104 do 108 z TE.
    11. Zmieszać 1 μl próbki DNA (lub wzorców), 0,4 μl starterów (5 μM), 3,6 μl wody destylowanej i 5 μl mieszanki wzorcowej SYBR Green. Startery, znajdujące się na ITR, to 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ i 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w następujących warunkach: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 60 s, 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s oraz wyżarzanie i rozciąganie w temperaturze 60 °C przez 30 s, a następnie krzywa topnienia.
    13. Na podstawie norm i wartości Ct maszyna do PCR w czasie rzeczywistym zapewnia liczbę kopii genomu wektora w 1 μl próbki. Oblicz pierwotne miano AAV za pomocą następującego równania: liczba kopii dostarczona przez PCR w czasie rzeczywistym (vg / μL) x 8 x 103 x 2, gdzie 8 x 103 jako współczynnik rozcieńczenia podczas izolacji genomu AAV i 2 jako współczynnik różnicowy AAV (pojedyncza nić) i plazmid (podwójna nić).
  7. Transdukcja do PSC-CM
    1. Policz PSC-CM w dodatkowym dołku lub dodatkowym naczyniu.
    2. Rozcieńczyć AAV (1 x 104 do 1 x 106 vg / komórkę) do uzupełnienia 50 μl PBS. Zastosować AAV przy wielokrotności infekcji (MOI) 1 x 104 do 1 x 106 vg / komórkę do PSC-CM i hodowli PSC-CM przez 3 dni z AAV w odpowiednich pożywkach różnicujących dla mysich i ludzkich PSC-CM, a następnie zmienić pożywkę na pożywkę hodowlaną bez AAV.
    3. Stosować PSC-CM do obrazowania żywych komórek po 7 dniach lub więcej po transdukcji.

4. [Opcjonalnie] Oczyszczanie PSC-CM oparte na AAV

  1. Przygotowanie AAV
    1. Przygotować AAV zgodnie z opisem w kroku 3 przy użyciu wektora wahadłowego wykazującego ekspresję genu oporności na blasticydynę pod kontrolą promotora cTNT.
  2. Transdukcja do różnicujących się komórek iPS
    1. Różnicuj ludzkie komórki iPS przez 4 dni zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2 i policz liczbę komórek w dodatkowym dołku.
    2. Po zmianie pożywki w 4 dniu zastosuj AAV w MOI 1 x 105 vg / komórkę do różnicujących PSC w pożywce RPMI+B27-Ins.
    3. W dniu 7 odśwież pożywkę za pomocą RPMI+B27+Ins i dodaj 2,5-10 μg/ml blasticydyny.
    4. W 10 dniu PSC-CM są gotowe do ponownego powlekania.

5. Przygotowanie pieczęci PDMS

  1. Zaprojektuj wzór urządzenia składający się z pasków o grubości 200 μm wraz z rowkami 10-25 μm między paskami za pomocą oprogramowania do rysowania wspomaganego komputerowo (CAD).
  2. Narysuj wzór urządzeń na chromowej fotomasce pokrytej AZP1350 za pomocą światła UV bezmaskowego narzędzia litograficznego.
  3. Rozwiń wzór na fotomasce w serii dodatnich wywoływaczy fotorezystu (np. wytrawiacza chromowa) i spłucz wodą DI.
  4. Odwodnić wafel krzemowy na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C przez 15 minut.
  5. Pozostawić wafel do ostygnięcia do temperatury pokojowej i pokryć ujemnym fotorezystem SU-8 3010 na wysokość 10-20 μm z prędkością 1500 obr./min przez 30 s za pomocą wirownicy.
  6. Wafelek upieczemy na miękko w dwóch krokach na gorącej płycie zgodnie z protokołem producenta.
  7. Po ostygnięciu wafla do temperatury pokojowej załaduj go na nakładkę maski.
  8. Użyj wyrównywacza maski, aby wyrównać maskę na płytce i wystawić płytkę na działanie światła UV.
  9. Pieczenie poekspozycyjne na wafelku należy przeprowadzić w dwóch krokach na gorącej płycie zgodnie z protokołem producenta.
  10. Rozwiń wafel w serii wywoływacza SU-8 i 2-Propanolu, a następnie wysusz wafel strumieniem azotu.
  11. Przenieś wafel na szalkę Petriego o odpowiedniej wielkości.
  12. Wymieszać elastomer PDMS i jego utwardzacz w stosunku 10:1 w/w i wlać mieszaninę na szalkę Petriego.
  13. Odgazować PDMS w eksykatorze do momentu zniknięcia wszystkich pęcherzyków powietrza, a następnie utwardzić PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.
  14. Oderwij utwardzony PDMS od formy głównej za pomocą pęsety, a następnie wytnij część z wzorem, który ma być pieczęcią PDMS.
    UWAGA: Kształt może być kwadratowy, jednak kształt ośmiokątny lepiej przenosi wzór na krawędzi.

6. Wzorzysta hodowla kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Usuń kurz z powierzchni stempli PDMS za pomocą taśmy naprawiającej.
  2. Zanurz stemple w 70% etanolu w celu sterylizacji. Następnie zdmuchnij etanol z powierzchni stempli za pomocą miotełki do kurzu.
  3. Nałożyć 5-10 μl polimeru/etanolu 2-metakryloyloksyetylofosforylcholiny/etanolu o stężeniu 0,5% wag. na powierzchnię stempli PDMS.
    UWAGA: Nierównomierne rozprowadzenie polimeru MPC może spowodować zakłócenie wzoru.
  4. Inkubować 10-30 minut, aż polimer MPC całkowicie wyschnie.
  5. Umieścić stemple w kontakcie ze szkiełkami nakrywkowymi płytki hodowlanej ze szklanym dnem lub czaszą obrazową o średnicy 35 mm z polimerowym szkiełkiem nakrywkowym i przyłożyć ciężarek (np. baterię AAA) do stempla na 10 minut.
  6. Usuń ciężar i stemple. Następnie upewnij się, że wzór został przeniesiony pod mikroskopem.
    UWAGA: Tłoczone talerze/naczynia można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze pokojowej.
  7. Umyj wybite studzienki/naczynia dwukrotnie PBS.
  8. Rozcieńczyć LN511-E8 PBS w stężeniu 2-4 μg/ml i pokryć naczynie LN511-E8 w stężeniu 0,5-1 μg/cm2. W przypadku ludzkich PSC-CM rozcieńczyć LN511-E8 0,1% roztworem żelatyny zamiast PBS. Następnie inkubować przez co najmniej 1 godzinę (optymalnie ponad 4 godziny).
  9. Komórki płytkowe zgodnie z opisem w poprzednich sekcjach.

7. Obrazowanie poklatkowe sarkomerów pod mikroskopem fluorescencyjnym

  1. Włącz i podłącz mikroskop, powiązany komputer, a także wszystkie wymagane urządzenia peryferyjne.
  2. Aby wykonać obrazowanie poklatkowe, rób zdjęcia poklatkowe z największym powiększeniem (soczewka obiektywu 100X z emerją olejową).
  3. Wybierz warunki obrazowania na żywo. Aby uzyskać dobre reprezentatywne dane, spróbuj dostosować się do najwyższej liczby klatek na sekundę (zalecane jest minimum 20 ms lub 50 klatek na sekundę). Otwórz migawkę i zastosuj niezbędne binning (4 X 4) oraz kadrowanie obszaru akwizycji, aby uzyskać jak najkrótsze odstępy czasu między obrazami podczas obrazowania poklatkowego.
    UWAGA: Ustawienia mogą się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopów. Kamera musi mieć wysoką czułość i być w stanie wystarczająco szybko przesłać dane do podłączonego komputera. W tym celu użyliśmy lampy błyskowej ORCA z Camera-link. Przetestowaliśmy wirującą mikroskopię konfokalną i uzyskaliśmy obrazy z prędkością 400 klatek na sekundę.
    1. [Opcjonalnie] Jeśli szybkość dudnienia komórek jest niska, wywołaj komórki poprzez stymulację polem elektrycznym.
  4. Uruchamianie nagrania poklatkowego
    1. Upewnij się, że obrazowane pola pozostają ostre podczas nagrywania obrazu poklatkowego.
    2. Zapisz zdjęcia poklatkowe w odpowiednim folderze.

8. Analiza obrazowania poklatkowego za pomocą SarcOptiM, wtyczki ImageJ/Fiji

  1. Załaduj serię obrazów poklatkowych do ImageJ. W przypadku formatu Olympus VSI otwórz pliki za pomocą wtyczki OlympusViewer.
  2. Dostosuj jasność i kontrast obrazu, aby wyraźnie obserwować wzór sarkomerowy (Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast).
  3. Otwórz SarcOptiM, klikając menu Więcej narzędzi (>>) i wybierając SarcOptiM.
  4. Skalibruj program, naciskając Ctrl + Shift + P i przycisk 1 μm na pasku narzędzi i postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w oknach dialogowych.
  5. Narysuj linię w poprzek obszaru sarkomeru, który zostanie użyty do zmierzenia skrócenia sarkomeru.
  6. Rozpocznij analizę skracania sarkomeru, naciskając SingleCell (AVI) na pasku narzędzi. Reprezentatywne dane są pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomiar skracania się sarkomerów z wykorzystaniem linii reporterowych PSC-CMs z knock-in. Do pomiaru skracania się sarkomerów wykorzystano PSC-CMs z oznakowanymi sarkomerami. Linie te wykazują ekspresję Myom2-RFP oraz ACTN2-mCherry z locus endogennego. TagRFP wprowadzono do Myom2, kodującego białka M lokalizujące się w linii M, natomiast mCherry wprowadzono metodą knock-in do ACTN2, kodującego α-aktyninę, która lokalizuje się w linii Z18...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

PSC-CM mają ogromny potencjał do wykorzystania jako platforma in vitro do modelowania chorób serca i testowania działania leków. Niemniej jednak najpierw należy opracować dokładną, ujednoliconą metodę oceny funkcji PSC-CMs. Większość testów funkcjonalnych dotyczy PSC-CM, np. elektrofizjologia, przemijające wapń i metabolizm26, a jedno z pierwszych badań PSC-CM pochodzących od pacjentów dotyczyło zespołu wydłużonego odstępu QT27. Jednak kurczliwość, jedna z najważni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

H.U. złożył wniosek patentowy związany z tym rękopisem.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium z Wydziału Medycyny Regeneracyjnej Uniwersytetu Medycznego Jichi za pomocną dyskusję i pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez granty Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED; JP18bm0704012 i JP20bm0804018), Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS; JP19KK0219) oraz Japońskie Towarzystwo Obiegowe (grant na badania podstawowe) dla H.U.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-TioglycerolSigma-AldrichM6145-25
2-merkaptoetanol (55mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
polimer 2-metakryloyloksyetylofosforylcholiny (MPC),NOF Corp.LIPIDURE-CM5206
2-PropanolFujifilm wako166-04836
35-milimetrowa miska obrazowa z polimerowym szkiełkiem nakrywkowym (µ-Dish 35 mm, wysoka)ibidi81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(wektory; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		Takara6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCN.A.Umieściliśmy kasetę oporną na IRES-puromycynę do 3' UTR locus TNNT2 i mCherry wokół kodonu stop ACTN2 w linii hiPSC 610B1, postępując zgodnie z metodą opisaną gdzie indziej (Anzai, Methods Mol Biol, w druku)
Suplement B-27 (50X), bez surowicySuplement Thermo Fisher Scientific17504-044
B-27, bez insulinySuplement Thermo Fisher ScientificA18956-01
B27 (50X), bez witaminy AThermo Fisher Scientific12587-010
Benzonaza (25 U/&mikro; L)Merck Millipore70746
Chlorowodorek blasticidyny SFujifilm wako029-18701
BMP-4, ludzki, rekombinowany,R& D Systems, Inc.314-BP-010
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)abcamab142216
Oprogramowanie do rysowania CAD,Robert McNeel and Associates, WA, USARhinoceros 6.0
(100k MWCO), Vivaspin-20SartoriusVS2042
CHIR99021Cayman13122
Wytrawiacz chromuNihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., JaponiaN14B
pokryta AZP1350Clean Surface Technology Co., JaponiaCBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Nośnik strącania (20 mg / ml glikogenu, 3 M octan sodu (pH 5,2))Takara9094
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM) - wysoki poziom glukozySigma-AldrichD6429-500
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM) - wysoka glukoza, bez pirogronianu soduSigma-AldrichD5796
Etanol (99,5)Fujifilm wako057-00456
Surowica bydlęcapłodu Moregate59301104
FGF-10, ludzka, rekombinowana,R& D Systems, Inc.345-FG-025
Czynnik wzrostu fibroblastów (podstawowy), ludzki, rekombinowanyFujifilm wako060-04543
Żelatyna ze skóry świń w proszkuSigma-AldrichG1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)Sigma-AldrichG5154-500
SZKLANE DNO płytki hodowlaneMatTekP24G-1.5-13-F/H
Szynka& rsquo; s F-12Thermo Fisher Scientific11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440-061
L-alanino-L-glutamina (suplement GlutaMAX, 200mM)Thermo Fisher Scientific35050-061
L(+)-sól sodowa kwasu askorbinowegoFujifilm wako196-01252
fragment Laminin-511 E8 ( LN511-E8, iMatrix-511)Nippi892012
Mask alignerUnion Optical Co., Ltd., JaponiaPEM-800
Bezmaskowe narzędzie litograficzneNanoSystem Solutions, Inc., JaponiaD-Light DL-1000
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0,45 i mikro; m, PVDF (0,45-&mikro; m filtr)Merck MilliporeSLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)N.A.Opracowany w naszym poprzednim artykule (Chanthra, Sci Rep, 2020)
Suplement N-2 (100X)Thermo Fisher Scientific17502-048
Cyfrowa kamera CMOS ORCA-Flash4.0 V3HamamatsuC13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Szalka PetriegoSansei medical co. Ltd01-004
Fenol / Chloroform / Alkohol izoamylowy (25:24:1)Gen nippon311-90151
Elastomer polidimetylosiloksanu (PDMS)Dow Corning Corp., MI, USASILPOT 184
polietyleniminy MAX (MW. 40 000)Polyscience24765-1
Pozytywny twórca fotorezystuTokyo Ohka Kogyo Co. , Ltd., JaponiaNMD-3
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
Proteinaza KTakara9034
Dichlorowodorek puromycynyFujifilm wako166-23153
Rekombinowane białko aktywiny A dla ludzi / myszy / szczurówR& D Systems, Inc.338-AC-050
Rekombinowana proteaza trypsyna podobna (rTrypsin; ThermoFisher Scientific12604-039
RPMI1640 MediumThermo Fisher Scientific11875-119
Wafel krzemowyMatsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., JaponiaN.A.
Pirogronian sodu (100 mM)Thermo Fisher Scientific11360-070
PowlekarkaMikasa Co., Ltd., JaponiaMS-A100
Mikroskopia konfokalna SpininngOxford InstrumentsAndor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mysz, rekombinant, roztwór (10^6U)Fujifilm wako195-16053
SU-8 3010Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 3010
SU-8deweloper Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USATwórca
Tris-EDTANippon Gen314-90021
Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego-A165 (VEGF), ludzki, rekombinowanyFujifilm wako226-01781
Ultrafiltracja odśrodkowa Maska chromowa SU-8

Bibliografia

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pluripotencjalne kom rki macierzyster nicowanie kardiomiocyt wfluorescencyjne obrazowanie ywych kom rekwzorcowana hodowla kom rkowatransdukcja AAVobrazowanie poklatkowemodelowanie chor b sercaImageJ SarcOptiM
Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.