Artykuł metodologiczny

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62146

⸱

2 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Vector Biology Department, Liverpool School of Tropical Medicine, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, 3Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Streszczenie

Funkcjonalna analiza genomiczna i związane z nią strategie genetycznej kontroli malarii opierają się na sprawdzonych i powtarzalnych metodach dokładnej modyfikacji genomu komarów Anopheles. Wśród tych metod, system φC31 umożliwia precyzyjną i stabilną integrację transgenów ukierunkowaną na miejsce lub substytucję zintegrowanych kaset transgenicznych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy (RMCE). Metoda ta opiera się na działaniu integrazy bakteriofagowej Streptomyces φC31 w celu katalizowania rekombinacji między dwoma specyficznymi miejscami przyłączenia oznaczonymi jako attP (pochodzące z faga) i attB (pochodzące od bakterii gospodarza). System wykorzystuje jedno lub dwa miejsca attP, które zostały wcześniej zintegrowane z genomem komara i miejscem (miejscami) attB w DNA dawcy dawcy. Tutaj pokazujemy, jak stabilnie modyfikować genom linii dokujących Anopheles zawierających attP za pomocą dwóch plazmidów: dawcy znakowanego attB przenoszącego szablon integracji lub wymiany oraz plazmidu pomocniczego kodującego integrazę φC31. Podajemy dwa reprezentatywne wyniki modyfikacji ukierunkowanej na miejsce za pośrednictwem φC31: pojedyncza integracja transgenicznej kasety w An. stephensi i RMCE w An. komary gambiae. Manipulacja genomem za pośrednictwem φC31 oferuje przewagę w postaci powtarzalnej ekspresji transgenu z zwalidowanych, neutralnych pod względem dopasowania miejsc genomowych, umożliwiając porównawcze analizy jakościowe i ilościowe fenotypów. Ukierunkowany na miejsce charakter integracji znacznie upraszcza również walidację pojedynczego miejsca insercji i schematu kojarzenia w celu uzyskania stabilnej linii transgenicznej. Te i inne cechy sprawiają, że system φC31 jest niezbędnym składnikiem genetycznego zestawu narzędzi do transgenicznej manipulacji malarią, komarami i innymi wektorami owadów.

Wprowadzenie

Zdolność do niezawodnej i powtarzalnej modyfikacji genomu komarów będących wektorami chorób wzmocniła walidację funkcjonalną genów in vivo i otworzyła drogę do możliwych do zrealizowania strategii genetycznej kontroli wektorów, takich jak te skierowane przeciwko komarom z rodzaju Anopheles, które przenoszą malarię1.

Wczesne edytowanie genomu komarów opierało się wyłącznie na transformacji za pośrednictwem elementów transpozycyjnych (TE), przy czym piggyBac był najczęściej stosowanym transposonem u Anopheles2,3,4. Jednakże losowy charakter integracji TE może prowadzić do niepożądanych modyfikacji, takich jak nokauty genów (mutogeneza insercyjna) oraz znaczące efekty pozycji wpływające na ekspresję transgenu5,6,7,8. Przy użyciu piggyBac często występują również wielokrotne insercje5,9, co sprawia, że walidacja i izolacja linii transgenicznych z pojedynczymi insercjami są pracochłonne. Inne wady obejmują ich potencjalną remobilizację, zaobserwowaną w linii zarodkowej Anopheles stephensi po dostarczeniu źródła transpozazy piggyBac10,11,12, a także ograniczoną wielkość ładunku DNA (długość 10-15 kb), przy czym wydajność transformacji spada wraz ze wzrostem wielkości plazmidu donora13,14.

W celu rozwiązania tych problemów wprowadzono metody integracji celowanej. Najczęstsza modyfikacja genomu celowana u komarów jest oparta na systemie φC31 (Rycina 1a). Proces ten jest napędzany przez viralną integrazę, która katalizuje rekombinację między dwoma heterospecyficznymi miejscami przyłączenia (att) występującymi naturalnie w genomie bakteriofaga φC31 (attP) oraz w organizmie gospodarza, bakterii z rodzaju Streptomyces (attB)15. Rekombinacja tych dwóch miejsc jest jednokierunkowa i prowadzi do powstania miejsc hybrydowych (attL oraz attR). Rekombinacja takich miejsc hybrydowych (prowadząca do wycięcia DNA) wymagałaby nie tylko obecności aktywnej integrazu viralnej, ale także innego czynnika rekombinacyjnego kodowanego przez faga16,17. W ten sposób generowane jest stabilne miejsce integracji, co eliminuje problem potencjalnej, niepożądanej remobilizacji15. Ponadto system ten umożliwia integrację dużych ładunków (np. zgłoszono integrację konstruktów o wielkości >100 kb u D. melanogaster18), co znacząco zwiększa pojemność przenoszenia. Integracja zachodzi w pojedynczym, zdefiniowanym locus genomicznym, co znacznie upraszcza walidację insercji oraz schemat krzyżowania w celu uzyskania stabilnej linii transgenicznej. Wreszcie, celowany charakter integracji pozwala na normalizację ekspresji, ponieważ alternatywne transgeny znajdują się w tym samym locus i są zatem regulowane w tym samym sąsiednim kontekście genomicznym. Rzeczywiście, jednym z głównych zastosowań tej techniki jest bezpośrednie porównanie fenotypów nadawanych przez różne transgeny po ich insercji do identycznego locus.

Osiągnięcie integracji pośredniczonej przez φC31 składa się z dwóch faz: faza I to tworzenie transgenicznych linii dokujących zawierających miejsce(a) attP, a faza II to ukierunkowana integracja ładunku flankowanego przez attB w genomie linii dokującej19. Tworzenie linii dokujących w fazie I opierało się na losowej integracji konstruktów z tagiem attP pośredniczonej przez TE, co wiązało się z początkowym, żmudnym procesem (obejmującym analizy southern blot i odwrotny PCR u potomstwa pojedynczych samic) w celu wyizolowania i walidacji linii transgenicznych z pojedynczym zdarzeniem integracji w unikalnych, transkrypcyjnie aktywnych i neutralnych pod względem kondycji genomowych lokalizacjach. Niemniej jednak, kilka linii dokujących do pojedynczej integracji pośredniczonej przez φC31 zostało opracowanych i zwalidowanych u An. gambiae19,20,21,22 oraz u An. stephensi23,24,25 (Tabela 1). Każda z tych linii różni się lokalizacją miejsca dokowania w genomie oraz specyficznym dla szczepu tłem genetycznym, a na ich podstawie można stworzyć ogromną różnorodność nowych linii transgenicznych. Złożoną walidację integracji pośredniczonych przez TE w celu wytworzenia linii dokujących można obecnie pominąć dzięki technologii CRISPR/Cas926; wymaga to jednak a priori wiedzy o neutralnych locus, które mają być celem, oraz o ich sekwencjach otaczających.

φC31-pośrednia integracja była szeroko stosowana w edycji genomów owadów, od organizmu modelowego D. melanogaster27, przez komary Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 i An. stephensi24, aż po inne owady, w tym Ceratitis capitata30 i Bombyx mori31.

Ograniczeniem integracji zapośredniczonej przez φC31, szczególnie w kontekście potencjalnych uwolnień do środowiska w celu kontroli wektorów, jest integracja w genomie komara całego plazmidu donora zawierającego attB, w tym niepożądanych sekwencji, takich jak markery genów oporności na antybiotyki i elementy szkieletu plazmidu pochodzenia bakteryjnego. Aby temu zaradzić, wdrożono modyfikację standardowego systemu – wymianę kasety zapośredniczoną przez rekombinazę (RMCE), która umożliwia precyzyjne zastąpienie wcześniej zintegrowanej kasety transgenicznej nowym DNA donora (Rysunek 1b). Osiąga się to poprzez zastosowanie dwóch odwróconych miejsc att flankujących kasety donora i biorcy na każdym końcu, co prowadzi do jednoczesnego zajścia dwóch niezależnych zdarzeń rekombinacji, skutkując wymianą kasety bez integracji szkieletu plazmidu. Ta ulepszona konstrukcja zapobiega integracji niepożądanych sekwencji i rozszerza zastosowanie systemów φC31, umożliwiając na przykład integrację nieoznaczonych ładunków DNA poprzez przesiewanie w kierunku utraty wcześniej zintegrowanego markera fluorescencyjnego32.

RMCE osiągnięto po raz pierwszy u D. melanogaster32, a następnie z sukcesem zastosowano u owadów niebędących organizmami modelowymi, w tym u An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 oraz B. mori35. W przypadku An. gambiae opracowano i zwalidowano kilka linii dokujących dla RMCE (Tabela 15,9,26). Z naszej wiedzy wynika, że RMCE nie zostało jeszcze zbadane u innych gatunków wektorów z rodzaju Anopheles.

Do tej pory system φC31 był szeroko stosowany u komarów z rodzaju Anopheles w celu wprowadzenia i badania różnych cząsteczek, w tym efektorów przeciwmalarycznych19,24,36, komponentów systemu GAL4/UAS do nadekspresji i wyciszania genów w badaniach nad odpornością na insektycydy9,33, elementów regulacyjnych, genów reporterowych5,21,37 oraz elementów napędu genowego (gene-drive)26,38.

Niniejszy protokół opisuje sposób przeprowadzenia 1) celowanej integracji ładunku flankowanego sekwencjami attB oraz 2) RMCE konstruktu flankowanego odwróconymi sekwencjami attB do genomu linii dockingowych Anopheles. Jest to osiągane przy użyciu dwóch plazmidów: plazmidu donora z tagiem attB niosącego interesujący transgen oraz plazmidu pomocniczego wykazującego ekspresję integrazji φC31. Główne wektory malarii An. gambiae oraz An. stephensi zostały wykorzystane jako konkretne przykłady, jednak protokoły te mają zastosowanie również do innych gatunków Anopheles.

Integracja φC31, formuła attP-attB, schemat przedstawiający proces integracji plazmidu w modyfikacji genetycznej.
Rysunek 1. Modyfikacje genomu ukierunkowane na konkretne miejsce, pojedyncza integracja oraz wymiana kasety pośredniczona przez rekombinazę (RMCE) z wykorzystaniem systemu φC31. Integraza φC31 (INT, szara podwójna strzałka) katalizuje rekombinację między miejscami attB (fioletowe paski) obecnymi w plazmidzie donora a miejscami attP (niebieskie paski) obecnymi w linii odbiorczej (docking line), co prowadzi do powstania hybrydowych miejsc attL i attR. A) Integracja zachodzi, gdy pojedyncze miejsca attB i attP ulegają rekombinacji, co skutkuje obecnością dwóch zintegrowanych markerów (niebieskiego i czerwonego). B) RMCE zachodzi, gdy dwa miejsca attB/P rekombinują jednocześnie, co prowadzi do zastąpienia kasety znajdującej się między miejscami att linii odbiorczej (niebieski marker) kasetą niesioną przez plazmid donora (czerwony marker). C) Częściowe sekwencje nukleotydowe attP (niebieskie), attB (fioletowe) oraz hybrydowych miejsc attL/R. Rekombinacja zachodzi pomiędzy rdzeniowymi sekwencjami „TT” zaznaczonymi pogrubionym czarnym kolorem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

UWAGA: Schematyczny przebieg przedstawionego protokołu ukazano na Rysunku 2.

1. Projektowanie plazmidów oznaczonych sekwencją φC31 attB (Rysunek 3)

  1. Utwórz attB plazmidy donorowe zawierające następujące niezbędne elementy
    1. Dominujący marker fluorescencyjny
      1. Wybierz promotor do sterowania ekspresją markera fluorescencyjnego.
        UWAGA: Dla Anopheles transgeneza, markery fluorescencyjne znajdują się zazwyczaj pod regulacją 3xP3 promotor39, co napędza ekspresję w oczach i sznurze nerwowym. Alternatywnie, the PUBc promotor5 można stosować, gdy pożądana jest ekspresja w wielu tkankach. Plazmidy donora oraz linie dokujące wykorzystane jako przykłady w niniejszym protokole są znakowane za pomocą 3xP3 promotor
      2. Wybierz białko fluorescencyjne (FP), które jest kompatybilne z białkiem linii przyjmującej (docking line), tak aby były one łatwo rozróżnialne.
        UWAGA: Nie należy używać tego samego markera, który jest już obecny w linii dockingowej, oraz należy unikać jednoczesnego stosowania GFP (zielony)/YFP (żółty) i GFP (zielony)/CFP (cyjan), ponieważ ich wiarygodne rozróżnienie jest bardzo trudne. Plasmidy donorowe użyte jako przykłady w tym protokole są oznakowane markerem DsRed lub YFP, ponieważ mają zostać zintegrowane w linii dockingowej oznakowanej markerem CFP.
    2. attB miejsce(a) rekombinacji
      1. Użyj pojedynczy attB miejsce integracji kasety transgenicznej (pojedyncza-attB projekt) (Rycina 3A).
      2. Zastosowanie dwie odwrócone attB miejsca dla RMCE (podwójna-attB układ), w którym miejsca te są zorientowane odwrócone względem siebie i flankują matrycę donora DNA (Rycina 3B).
        UWAGA: Orientacja attB miejsce (miejsca) musi być zgodne z miejscem attP miejsca obecne w linii dokowania.
    3. Pożądany ładunek transgenu
      1. Należy wykorzystać wszelkie inne funkcje przeznaczone do integracji w genomie komara, zależnie od konkretnego celu eksperymentu. W niniejszej pracy opisujemy integrację przeciwmalarycznej cząsteczki efektorowej w genomie An. stephensi or integracja komponentów systemu GAL4/UAS w obrębie An. gambiae komary
    4. Komponenty szkieletu plazmidu
      1. Należy uwzględnić, obok innych niezbędnych elementów replikacji plazmidu w bakteriach, marker do selekcji plazmidu in vitro (tj.., gen oporności na antybiotyki).
        UWAGA: Szkielet plazmidu zostanie zintegrowany z genomem komara w pojedynczej-attB projektowanie do integracji (Rycina 3A), natomiast nie zostanie on wstawiony w podwójną-attB projekt dla RMCE (Rysunek 3B).

2. Przygotowanie plazmidów do mieszaniny do mikroiniekcji

UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół zakłada użycie dwóch plazmidów: plazmidu donora z tagiem attB przenoszącego interesujący transgen oraz plazmidu pomocniczego, który wykazuje ekspresję integraz φC31 pod regulacją promotora Drosophila Hsp7040.

  1. Oczyść plazmidy donorowe i pomocnicze za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidów bez endotoksyn.
    UWAGA: Przeprowadź sekwencjonowanie końcowego preparatu plazmidu użytego do iniekcji, aby zweryfikować integralność wszystkich komponentów.
  2. Połącz odpowiednie ilości obu plazmidów, aby uzyskać mieszaninę o końcowej koncentracji 350 ng/µL plazmidu donorowego i 150 ng/µL plazmidu pomocniczego po resuspensji w buforze do iniekcji.
    UWAGA: Obliczając niezbędną objętość mieszaniny, należy wziąć pod uwagę, że 10-15 µL jest wystarczające na każdy dzień planowanych iniekcji, a DNA można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C. W literaturze zgłaszano również stężenia plazmidu pomocniczego integrazu w zakresie 60-500 ng/µL oraz stężenia plazmidu donorowego w zakresie 85-200 ng/µL21,22,26,41.
  3. Wytrąć DNA, dodając 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH 5.2) oraz 2,5 objętości lodowatego 100% EtOH, a następnie wymieszaj na wirówce typu vortex. Biały osad powinien być natychmiast widoczny. Zastosowanie wysokoskoncentrowanych początkowych preparatów plazmidów (tzn. ~1 µg/µL) poprawia wydajność wytrącania.
    UWAGA: Punkt przerwania – osad można przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc.
  4. Wiruj przy 15,000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C, odlej nadsącz i przemyj osad 1 mL lodowatego 70% EtOH.
  5. Przemyj osad 1 mL lodowatego 70% EtOH i wiruj przy 15,000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  6. Odlej nadsącz, nie naruszając osadu, i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  7. Resuspenduj osad w 1x buforze do iniekcji (0,1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,2, sterylizowany filtrem 0,22 µm), aby osiągnąć całkowitą końcową koncentrację 500 ng/µL.
    UWAGA: Należy założyć, że część DNA zostanie utracona podczas procesu wytrącania; dlatego najpierw dodaj mniejszą objętość buforu do iniekcji, sprawdź stężenie za pomocą spektrofotometru (np. Nanodrop), a następnie dodaj odpowiednią pozostałą objętość, aby osiągnąć 500 ng/µL.
  8. Upewnij się, że DNA zostało dokładnie zresuspendowane, przygotuj alikwoty po 10-15 µL każda i przechowuj je w temperaturze -20 °C.
  9. W dniu iniekcji rozmroź jedną alikwot i wiruj przy 15,000 x g przez 5 min, aby usunąć wszelkie pozostałości cząsteczkowe.
    ​UWAGA: Alternatywną metodą usuwania cząsteczek jest przefiltrowanie roztworu przez filtr 0,22 µm. Należy unikać obecności pozostałości cząsteczkowych w mieszaninie do iniekcji, ponieważ prowadzą one do zatykania igły podczas mikroiniekcji embrionów.

3. Mikroiniekcja embrionów z linii dokującej Anopheles

  1. Karmy krwią 4–7-dniowe komary z wybranej linii dokującej na 72 h przed mikroiniekcją (np. w przypadku iniekcji w poniedziałek i wtorek, karm samice w poprzedni piątek; w przypadku iniekcji w czwartek i piątek, karm samice w poniedziałek tego samego tygodnia).
  2. W tym samym dniu podać krew komarom typu dzikiego (WT, tj. komarom o tym samym tle genomicznym co linia docking); będą one potrzebne do krzyżowania zwrotnego.
    UWAGA: Wielkość i jakość posiłku z krwi wpływają na jakość jaj, dlatego zaleca się zawsze stosowanie świeżej krwi (tj.., krew pobrana w ciągu ostatnich 7 dni). Karmienie z ramienia lub karmienie myszami może zwiększyć jakość i ilość jaj, jednak metody te nie są zalecane. Do pracy z ludźmi i zwierzętami niezbędne będą konkretne, zatwierdzone protokoły.
  3. Wykonanie mikroiniekcji embrionów
    1. Wykonaj An. gambiae mikroiniekcje zarodków w 25 mM NaCl42 poprzez celowanie w biegun tylny zarodka pod kątem 45 stopni. Szczegółowy protokół dotyczący pobierania, ustawiania i mikroiniekcji zarodków znajduje się w pracy Pondeville i wsp.43 oraz Lobo i wsp.44.
    2. Wykonaj *An. stephensi* mikroiniekcje zarodków w oleju halowęglowym 700:27 (2:1) poprzez celowanie w biegun tylny zarodka pod kątem 30 stopni. Szczegółowy protokół zbioru, ustawienia i mikroiniekcji zarodków znajduje się w pracy Terenius et al.45 oraz Lobo i wsp.44.
    3. Przenieść jaja bezpośrednio po wstrzyknięciu do szalki Petriego wypełnionej sterylną wodą destylowaną (pH 7,2) i zwrócić je do warunków insekteryjnych.
  4. Po wykluciu przenieść G0 larwy codziennie przenosić do kuwety z zasoloną wodą destylowaną (0,1% soli fizjologicznej) i hodować do stadium poczwarki.
  5. Zarejestruj wskaźnik wylęgowości (t. j.., liczba wyklutych larw/liczba wstrzykniętych embrionów).
    UWAGA: Ruch zarodków wspomaga wykluwanie, dlatego zaleca się delikatne mieszanie zawiesiny ruchem wirowym. Wykluwanie powinno rozpocząć się około 48 h po iniekcji. Ponieważ iniekcja może spowodować niewielkie opóźnienie w rozwoju, zaleca się monitorowanie larw pod kątem późnego wyklucia przez kolejne 3–4 dni.

4. Krzyżowanie i przesiewanie osobników transformowanych

  1. [KROK OPCJONALNY] Przesiewowe badanie larw G0 (po wstrzyknięciu) w 1st lub 2nd stadium (L1-L2) pod kątem przejściowej ekspresji markera fluorescencyjnego.
    1. Za pomocą szklanej pipety z cienką końcówką przenieść larwy G0 L1-L2 na szkiełka przedmiotowe z wgłębieniami. W każdym wgłębieniu umieścić jedną larwę.
    2. Użyć stereoskopu fluorescencyjnego z odpowiednim filtrem, aby sprawdzić obecność przejściowej ekspresji markera fluorescencyjnego.
      UWAGA: Wzorzec przejściowej ekspresji jest determinowany przez użyty promotor. Przy zastosowaniu promotora 3xP3 przejściowa ekspresja markera fluorescencyjnego jest widoczna w brodawkach analnych (patrz Rycina 6 w Pondeville et al.43)
    3. Hodować osobniki G0 wykazujące pozytywny wynik osobno.
  2. Posortować poczwarki G0 według płci pod stereoskopem52.
  3. Pozwolić samcom wykluć się do osobnych klatek w grupach po 3-5 osobników (rodziny założycielskie) i dodać 10-krotną nadwyżkę samic WT w tym samym wieku.
    UWAGA: Ponieważ samce kopulują wielokrotnie, ważne jest zapewnienie nadwyżki samic WT, aby zmaksymalizować szanse na kopulację każdego samca.
  4. Pozwolić samicom wykluć się do osobnych klatek w grupach po 10-15 osobników (rodziny założycielskie) i dodać taką samą liczbę samców WT w tym samym wieku.
    UWAGA: W przypadku ograniczonej przestrzeni w insekterium samice mogą wykluć się wspólnie w jednej klatce. Stosunek samic do samców może być tak niski, jak 3 samice na 1 samca.
  5. Pozostawić dorosłe osobniki do kopulacji przez 4-5 dni i zapewnić samicom posiłek z krwi.
    ​UWAGA: Karmić krwią i zbierać jaja od samic G0 wielokrotnie, aby zmaksymalizować szanse na uzyskanie transformantów z wielu cykli gonotroficznych.
  6. Karmić krwią osobniki WT w tym samym czasie w celu krzyżowania wstecznego.
  7. Zebrać jaja i hodować wykluwające się osobniki kolejnego pokolenia G1.
  8. Przesiewowo badać larwy G1 L3-L4 pod kątem odpowiedniej fluorescencji w celu zidentyfikowania transformantów.
    1. Zebrać larwy do szalki Petriego wyłożonej papierem filtrowanym lub na szkiełko przedmiotowe i przebadać za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami pod kątem obecności markera wprowadzonego wraz z ładunkiem z tagiem attB.
      ​UWAGA: Fluorescencja sterowana przez promotor 3xP3 jest widoczna we wszystkich stadiach poembrionalnych i badanie można przeprowadzić na młodszych larwach, jednak są one bardziej delikatne i muszą być obchodzone z dużą ostrożnością. Można również badać poczwarki.
      1. W przypadku projektów z pojedynczym attB dla integracji badać obecność nowego i istniejącego wcześniej markera; oba powinny być obecne, ponieważ nowa kaseta jest wstawiana obok oryginalnej (Rycina 3A, Rycina 4).
        ​UWAGA: Wyjątek w badaniu dla projektów z pojedynczym attB: przy stosowaniu linii dokujących bez markera22 badać obecność tylko nowego markera. Przy stosowaniu linii dokujących, w których integracja prowadzi do inaktywacji istniejącego wcześniej markera21, badać obecność nowego markera i utratę poprzedniego.
      2. W przypadku projektów z podwójnym attB dla RMCE badać obecność nowego markera i utratę poprzedniego; obecny powinien być tylko nowo wprowadzony marker, ponieważ nowa kaseta zastępuje oryginalną (Rycina 3B, Rycina 5).
        ​UWAGA: W eksperymentach RMCE można odzyskać sporadyczne zdarzenia integracji, w których zrekombinował się tylko jeden attP, w związku z czym obecne będą oba markery. Badanie osobników G1 można przeprowadzić również w stadium poczwarki zgodnie z tą samą procedurą52.
  9. Przenieść transformowane osobniki G1 do tacy dla larw i hodować do stadium poczwarki. Odrzucić osobniki niefluorescencyjne oraz osobniki z nieoczekiwanym wzorcem ekspresji markera.
  10. Posortować transformowane poczwarki G1 według płci i skrzyżować je en masse z osobnikami WT przeciwnej płci w tym samym wieku.
  11. Pozostawić dorosłe osobniki do kopulacji przez 4-5 dni, zapewnić posiłek z krwi, zebrać jaja i hodować potomstwo kolejnego pokolenia G2.
    1. W przypadku eksperymentów z pojedynczą integracją zbierać jaja bezpośrednio z krzyżówki en masse, ponieważ miejsce integracji jest identyczne u wszystkich osobników.
    2. W przypadku eksperymentów RMCE zbierać jaja od pojedynczych samic i utrzymywać potomstwo osobno do czasu zakończenia oceny molekularnej ze względu na możliwość wystąpienia dwóch alternatywnych orientacji kasety (Rycina 3B).
  12. Przebadać potomstwo G2 (w stadium larwy lub poczwarki) pod kątem obecności markera fluorescencyjnego (oczekuje się, że 50% osobników będzie pozytywnych); odrzucić potomstwo niefluorescencyjne.
  13. Odsączyć podzbiór pozytywnych osobników G2 do analizy molekularnej, resztę hodować do stadium dorosłego.
    UWAGA: Jeśli wszystkie osobniki G2 muszą pozostać żywe, analizę molekularną można przeprowadzić na odległościach pojedynczego dorosłego osobnika46 lub na ekstrakcjach DNA z łupiny poczwarki (komunikacja osobista L. Grigoraki). Alternatywnie analizę molekularną można przeprowadzić po tym, jak wszystkie osobniki G2 zniosą jaja i jaja te się wyklują.
  14. Pozwolić dorosłym samcom i samicom na wzajemne krzyżowanie się w tej samej klatce w celu ustanowienia nowej linii transgenicznej.
    ​UWAGA: W eksperymentach RMCE wzajemne krzyżowanie osobników dorosłych musi zachodzić między rodzeństwem pochodzącym od jednej samicy, dopóki orientacja wstawki nie zostanie określona za pomocą analizy molekularnej.

5. Walidacja molekularna miejsca insercji poprzez amplifikację DNA (PCR)

  1. Przygotuj mapę przewidywanego miejsca insercji w genomie linii dockingowej po transformacji.
    1. Integracja pojedyncza: Upewnij się, że przewidywane miejsce insercji zawiera oryginalny konstrukt dockingowy oraz pełną sekwencję plazmidu donora pomiędzy dwoma hybrydowymi miejscami attL i attR (Rycina 3A).
    2. RMCE: Upewnij się, że przewidywane miejsce insercji jest identyczne z miejscem w linii dockingowej, gdzie hybrydowe odwrócone miejsca attL zastępują oryginalne odwrócone miejsca attP, a matryca wymiany zastępuje kasetę pierwotnie znajdującą się pomiędzy nimi (Rycina 3B).
  2. Zaprojektuj startery oligonukleotydowe do amplifikacji złącza insercyjnego po obu stronach locus integracji.
    1. Integracja pojedyncza: Zaprojektuj pary starterów oligonukleotydowych obejmujących miejsca attR i/lub attL. Jeden starter musi wiązać się z wcześniej zintegrowanym konstruktem dockingowym, a drugi z nowo zintegrowanym transgenem (Rycina 3A).
    2. RMCE: Wymiana kasety może zajść w dwóch różnych orientacjach względem chromosomu (oznaczonych jako A i B). Zaprojektuj alternatywne kombinacje 4 starterów oligonukleotydowych, aby uzyskać dyskretny produkt tylko w jednej z orientacji, przy czym jedna para będzie diagnostyczna dla orientacji A, a druga dla orientacji B (Rycina 3B, Rycina 6).
  3. Wyizoluj DNA genomiczne od osobników pozytywnych G2 i przeprowadź diagnostyczną reakcję PCR oraz elektroforezę w żelu, aby zwizualizować obecność oczekiwanych amplikonów diagnostycznych zgodnie z mapami przewidywanego miejsca integracji.
    UWAGA: DNA można alternatywnie wyizolować z odnóży pojedynczych osobników dorosłych46 lub z poczwerek (komunikacja osobista z L. Grigoraki).
  4. Wykonaj sekwencjonowanie produktów PCR, aby potwierdzić oczekiwane sekwencje.

Proces edycji genów; schemat krok po kroku; klonowanie plazmidów, mikroiniekcje, tworzenie linii transgenicznych.
Rysunek 2. Schemat przepływu pracy dla celowanej modyfikacji genomu za pomocą φC31 u komarów z rodzaju Anopheles. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat integracji φC31 przedstawiający procesy transferu genów; metody pojedynczej integracji oraz RMCE.
Rysunek 3Podstawy molekularne φC31pośredniczona pojedyncza integracja (A) oraz RMCE (B). A) Schematy map insercji genomowej w an *An. stephensi* linia dokująca (80,9, Tabela 1) przenosząca pojedynczy attP miejsce i oznakowane białkiem CFP (góra), pojedyncze-attB projekt plazmidu donora znakowanego białkiem DsRed (środek) oraz oczekiwane miejsce insercji po udanej integracji (dół). B) Schematy map insercji genomicznej w An. gambiae linia dokująca (A11, tabela 1) przenosząca dwie odwrócone attP miejsca i oznakowane CFP (góra), podwójne-attB projekt plazmidu donora znakowanego YFP (środek) oraz spodziewane miejsce insercji powstałe po pomyślnym RMCE (dół). Linia falista: genom komara; Prążkowane strzałki: piggyBac ramiona transpozonu; 3xP3promotor markera fluorescencyjnego; SV40: terminator wirusowy; Ori: miejsce początku replikacji; AmpR: gen oporności na ampicylinę. Przecinające się linie reprezentują miejsce (miejsca) rekombinacji pomiędzy attP i attB miejsca. Ponumerowane czarne strzałki reprezentują miejsca wiązania starterów służących do walidacji molekularnej miejsca insercji (krok 5 protokołu). W pełni adnotowane pojedyncze i podwójne attBPlazmidy z tagiem są dostępne u autorów na żądanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia wytworzenie stabilnej linii transgenicznej Anopheles w ciągu ok. 10 tygodni (przy założeniu 21-dniowego cyklu życiowego komarów).

Oczekuje się, że wskaźniki wykluwania się larw po iniekcji u An. gambiae są zazwyczaj niższe niż u An. stephensi, jednak zgłaszano wskaźniki wykluwania na poziomie 10-50%9,20,24,26,33,43,47. Przy zastosowaniu odpowiedniej techniki iniekcji wskaźniki wykluwania ≥20% są zazwyczaj wystarczające do uzyskania transformantów. Pobór DNA przez embriony można ocenić poprzez przesiewowe badanie młodych larw pod kątem przejściowej ekspresji markera fluorescencyjnego. W udanych eksperymentach RMCE u An. gambiae z wykorzystaniem promotora 3xP3 do 50% przeżywających larw G0 wykazywało episomalną ekspresję markera w brodawkach odbytu48.

Uogólnione szacunki wydajności transformacji są trudne do oceny pomiędzy laboratoriami, a nawet pomiędzy poszczególnymi eksperymentami, ponieważ transformacja zależy od złożonej interakcji wielu zmiennych, w tym czystości, stężenia, wielkości i potencjalnej toksyczności wstrzykiwanego DNA, jakości jaj, obchodzenia się z jajami przed i po iniekcji, hodowli komarów, a przede wszystkim doświadczenia operatora. W przypadku RMCE u An. gambiae uzyskano wskaźniki transformacji do 7% (obliczone jako liczba niezależnych zdarzeń transformacji w całkowitej liczbie osobników G0)9,26,33, natomiast dla integracji u An. stephensi wskaźnik transformacji wyniósł do 2,2%. Sugerujemy iniekcję co najmniej 500 embrionów, co powinno prowadzić do wyklucia co najmniej 100 larw G0 oraz do uzyskania 2-7 dorosłych osobników założycielskich G0, z których można pozyskać stabilnie transformowane potomstwo. W przypadku przesiewania pod kątem ekspresji przejściowej w larwach G0 można spodziewać się do 40 larw pozytywnych.

Przykłady walidacji fenotypowej transformacji poprzez przesiewanie markerów fluorescencyjnych regulowanych przez 3xP3 doniesiono o obecności promotorów w Rysunek 4 i Rysunek 5. Rysunek 4 pokazuje nową *An. stephensi* linia uzyskana poprzez insercję kasety znakowanej białkiem DsRed do linii dokującej znakowanej CFP (80,9, Tabela 1), co skutkuje G1 potomstwo wykazujące ekspresję obu markerów, o czym świadczy czerwona i niebieska fluorescencja wykryta w oczach.

Oczekuje się, że projekty RMCE doprowadzą do zastąpienia markera pierwotnie wprowadzonego do linii dokującej markerem z plazmidu donora. Rysunek 5A oraz Rysunek B ilustrują tę wymianę markerów w linii dokującej An. gambiae znakowanej CFP (A11, Tabela 1), gdzie po pomyślnym RMCE marker CFP zostaje utracony, a nabyty zostaje marker YFP, co skutkuje żółtą (ale nie niebieską) fluorescencją oczu i sznura nerwowego33. Sporadycznie RMCE może prowadzić do pojedynczego zdarzenia integracji zamiast wymiany pożądanej kasety transgenicznej, co zilustrowano na Rysunku 5C, gdzie pokazano larwę znakowaną zarówno oryginalnym markerem CFP, jak i nowym markerem YFP. Donosi się, że do 50% całkowitej liczby zdarzeń transformacji to pojedyncze integracje9, 33.

Podczas przesiewania w celu wykrycia obecności znacznika fluorescencyjnego kluczowe jest odróżnienie jego sygnału od możliwej autofluorescencji tła. Jest to szczególnie istotne przy użyciu CFP, ponieważ larwy Anopheles wykazują naturalną niebieską autofluorescencję (Rysunek 6A). Aby zidentyfikować prawdziwe osobniki CFP-dodatnie, konieczne jest zwiększenie powiększenia i skupienie uwagi na tkankach oraz organach, w których oczekuje się ekspresji fluorescencji sterowanej przez promotor, co zilustrowano na Rysunku 6B przy użyciu znacznika 3xP3-CFP.

Pojedyncze transformanty są ostatecznie oceniane molekularnie za pomocą PCR w celu potwierdzenia oczekiwanego miejsca insercji. Rysunek 7 przedstawia walidację PCR u osobników z linii wymiany An. gambiae, wykazującą dwie potencjalne orientacje insercji w genomie komara33.

Proces edycji genów poprzez integrację φC31 na kolorowych obrazach mikroskopowych; analiza efektów linii dokującej.
Rycina 4. Walidacja pojedynczej integracji φC31 w larwach An. stephensi (widok grzbietowy). A) Linia dokująca (80.9, Tabela 1) wykazuje ekspresję CFP w oczach pod regulacją promotora 3xP3. B) Skuteczna integracja skutkuje ekspresją nowo nabytego DsRed oraz oryginalnego markera CFP w oczach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Edycja genów φC31; mikroskopia fluorescencyjna; proces RMCE; wyniki integracji genów.
Rycina 5. Walidacja RMCE φC31 u larw An. gambiae (widok brzuszny). A) Linia dokująca (A10, Tabela 1) wykazuje ekspresję CFP pod regulacją promotora 3xP3 w oczach (e) i rdzeniu nerwowym (nc)5. B) Pomyślne RMCE skutkuje zamianą markera fluorescencyjnego z CFP na YFP33. C) Pojedyncze zdarzenie integracji wystąpiło podczas eksperymentu RMCE, w którym larwa transformowana wykazuje ekspresję obu markerów, CFP i YFP. Larwa ta niesie komponenty GAL4/UAS, które powodują szeroki wzorzec ekspresji YFP, szczególnie silny w mięśniach odwłoka (am). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza fluorescencji CFP, schemat przedstawiający organizmy znakowane CFP- oraz CFP+ pod wpływem wzbudzenia światłem niebieskim.
Rycina 6. Autofluorescencja CFP w larwach An. gambiae (widok grzbietowy). A) Obraz porównawczy larwy dodatniej (CFP+) i ujemnej (CFP-) w stadium L4 z zastosowaniem filtra CFP. B) Powiększony obraz oczu larwy, ujawniający osobnika CFP+ vs CFP-. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz żelu z analizy PCR pokazujący wzory prążków DNA dla orientacji A i B wraz ze schematami genetycznymi.
Rycina 7. Walidacja molekularna orientacji insercji kasety w reprezentatywnych osobnikach transgenicznych An. gambiae stworzonych za pomocą φC31 RMCE. Kaseta transgeniczna może zostać wstawiona w jednej z dwóch alternatywnych orientacji (A lub B) względem miejsca insercji. W każdej reakcji PCR (I - IV) zastosowano kombinację starterów (5-8)33 zaprojektowanych tak, aby uzyskać diagnostyczny fragment amplifikacji dla każdej orientacji, zgodnie ze schematami map plazmidów. T1: reprezentatywny osobnik transgeniczny z orientacją insercji A; T2: reprezentatywny osobnik transgeniczny z orientacją insercji B; WT: typ dziki; DL: linia dockingowa; -: ujemna kontrola reakcji, w której jako matrycy użyto wody. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Adolfi et al. (2019)33. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

GatunekSzczepNazwaattP(s)ChromosomPromotor-markerInstytucja pochodzeniaReferencja
An. stephensiIndiana26.10bPojedynczy2R3xP3-eCFPUniv. of California Irvine25
An. stephensiIndiana44CbPojedynczyX3xP3-eCFPUniv. of California Irvine23, 24
An. stephensiIndiana80.9bPojedynczy2L3xP3-eCFPUniv. of California IrvineNiniejsze badanie
An. gambiaeG3113Pojedynczy2R3xP3-eCFPUniv. of California IrvineNiniejsze badanie
An. gambiaeKILEcPojedynczy3R3xP3-eCFPKeele Univ.19, 43
An. gambiaeG3X1Pojedynczy2LBrak markeraUniv. of Strasbourg22
An. gambiaeG3YAttPPojedynczyY3xP3-RFPImperial College London21
An. gambiaeG3A10bPodwójny2R3xP3-eCFPLiverpool School Trop. Med.5
An. gambiaeG3A11bPodwójny2R3xP3-eCFPLiverpool School Trop. Med.9
a. Szczep z Johns Hopkins University (dar od M. Jacobs-Lorena) utrzymywany w kulturze w Univ. of California Irvine przez >20 lat.
b. Linie te są dostępne od autorów na uzasadnioną prośbę.
c. Linia ta jest dostępna w repozytorium BEI pod adresem www.beiresources.org jako MRA-1163.

Tabela 1. Linie dockingowe Anopheles attP .

Dyskusja

Dokładna konstrukcja plazmidów znakowanych attB, które są kompatybilne z wybraną linią dokowania, ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Należy zwrócić szczególną uwagę na wybór znacznika używanego do przesiewania transformantów, w tym barwę fluorescencji i jej wzór wyrazu, który będzie podlegał wzorowi już obecnemu w linii dokowania. Konieczne jest stosowanie markerów fluorescencyjnych, które są łatwe do odróżnienia: dobre kombinacje znaczników obejmują RFP (czerwony)/CFP (cyjan), RFP (czerwony)/GFP (zielony), RFP (czerwony)/YFP (żółty) i YFP (żółty)/CFP (cyjan), podczas gdy kombinacje, których należy unikać, to YFP (żółty)/GFP (zielony) i CFP (cyjan)/GFP (zielony). Promotor 3xP3 39, specyficzny dla oczu i rdzenia nerwowego, jest najczęściej stosowany do kierowania ekspresją markerów fluorescencyjnych transgenezy komarów. Rzeczywiście, wszystkie obecnie dostępne linie dokujące Anopheles wykorzystują ten promotor. Alternatywnymi regionami regulatorowymi są gen poliubikwityny An. gambiae (PUBc)5 lub promotor wirusa IE120, które napędzają ekspresję w wielu tkankach. W przypadku stosowania razem z 3xP3, promotory te rozszerzyłyby możliwe kombinacje kolorów, a nawet użycie tego samego fluoroforu. Wskazane promotory są aktywne przez cały cykl życiowy komara, umożliwiając badania przesiewowe i monitorowanie fluorescencji na wszystkich etapach życia. Dodatkową kwestią braną pod uwagę podczas projektowania plazmidu jest rozmiar ładunku, który ma być zintegrowany lub wymieniony. Chociaż układ φC31 ma niezwykłą nośność18, należy wziąć pod uwagę, że rozmiar plazmidu dawcy na ogół koreluje ujemnie ze wydajnością transformacji22.

W opisanym protokole źródłem integrazy jest plazmid pomocniczy wykazujący wszechobecną ekspresję enzymu40. Wszechobecna obecność integrazy może prowadzić do transformacji komórek somatycznych, jeśli mikroiniekcje nie są precyzyjnie skierowane w miejsce, w którym tworzy się linia zarodkowa. Chociaż takie zdarzenia transformacji zostaną utracone, ponieważ nie są dziedziczne, efekty somatyczne mogą zmniejszyć sprawność osób, którym wstrzyknięto zastrzyk. Aby tego uniknąć i zwiększyć wydajność transformacji, ekspresję integrazy można ograniczyć do linii zarodkowej, na przykład za pomocą promotora vasa 22,26. Inne protokoły opisują użycie transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA (mRNA) jako źródła integrazy φC31 19,24,43. Wiąże się to jednak z pracochłonnym przygotowaniem mRNA i wymaga ostrożnego obchodzenia się z mieszanką iniekcyjną oraz stosowania odczynników wolnych od RNaz, aby uniknąć degradacji. Wykazano, że plazmidowe źródła integrazy zarówno w An. gambiae 9,21,22,26,33,37, jak i An. stephensi (osobista komunikacja AA) są niezawodne i prowadzą do efektywnej transformacji, a zatem są naszą preferowaną opcją. Kolejną opcją dostarczania integrazy jest jej produkcja in vivo w samodokujących liniach pomocniczych. Takie linie zostały stworzone w An. gambiae, które wyrażają integrazę φC31 pod regulacją nanos promotora specyficznego dla linii zarodkowej i stwierdzono, że prowadzą do poprawy wydajności przeżycia i transformacji20. Należy jednak wziąć pod uwagę potencjalne obciążenia kondycyjne wynikające z produkcji enzymu integrazy in vivo na linii pomocniczej.

Podobnie jak w przypadku innych technik transgenicznych, szczególną uwagę należy zachować przy hodowli i krzyżowaniu osobników pochodzących z wstrzykniętych zarodków, aby zmaksymalizować szanse na odzyskanie transformantów. Osoby, które stabilnie odziedziczyły transgen, mogą być najpierw odzyskane u potomstwa G1. Jednak wczesne oznaki potencjalnej transformacji można ocenić na podstawie obecności przejściowej episomalnej ekspresji markera fluorescencyjnego w brodawkach odbytu i/lub rdzeniu nerwowym larw G0 pierwszego i drugiego stadium rozwojowego podczas stosowania promotora 3xP3 43. Chociaż obecność przejściowej fluorescencji sugeruje pomyślne dostarczenie plazmidu, nie gwarantuje dziedzicznej transformacji linii zarodkowej. Podobnie, brak wyrażenia przejściowego nie wyklucza udanej transformacji. Niemniej jednak zaobserwowano, że osoby przejściowo dodatnie mają większe szanse na wydanie transgenicznego potomstwa w porównaniu z osobnikami przejściowo ujemnymi43,48. W rękach ekspertów hodowla i krzyżowanie tylko pozytywnych osobników może być opcją na zmniejszenie liczby komarów. Jednak biorąc pod uwagę znaczenie i kruchość małych larw G0, nadal zaleca się najmniejszą ilość manipulacji i zawsze zaleca się hodowlę wszystkich osobników G0.

Schemat krycia opisany w tym protokole ma na celu maksymalizację szansy na krycie i odizolowanie niezależnych zdarzeń transformacji. Jeśli jednak problemem jest przestrzeń dla owadów lub dostępność personelu, dorosłe osobniki G0 można gromadzić według płci w pojedynczych klatkach, jeśli zapewniona jest wystarczająca liczba osobników płci przeciwnej. Taki układ nie pozwoli na rozróżnienie między wieloma zdarzeniami transformacji występującymi u osób z tej samej klatki. W zależności od konfiguracji doświadczalnej, podczas procesu przesiewowego spodziewana jest obecność markera podwójnego (pojedyncza całkacja) lub pojedynczego (RMCE). W eksperymentach z pojedynczą integracją ważne jest zweryfikowanie obecności oryginalnego znacznika z linii dokowania, natomiast w RMCE ważne jest zweryfikowanie utraty wcześniej zintegrowanego znacznika. Rzeczywiście, nierzadko w projektach RMCE dochodzi do odzysku transformantów, w których nastąpiła pojedyncza integracja zamiast wymiany w wyniku rekombinacji pojedynczego miejsca attP 9,33. U takich osób obecne są oba markery fluorescencyjne, a także cały szkielet plazmidu dawcy, co podkreśla znaczenie przeprowadzenia dokładnych badań przesiewowych pod kątem obu markerów fluorescencyjnych.

Podczas gdy obecność oczekiwanych wzorców fluorescencyjnych wskazuje na pomyślną transformację, należy podjąć charakterystykę molekularną miejsca insercji. W tym celu przygotowanie dokładnych map przewidywanego locus insercji, w tym bocznych regionów genomowych linii dokowania, ma kluczowe znaczenie dla zaprojektowania odpowiednich diagnostycznych starterów oligonukleotydowych do analiz amplifikacji genów. Pojedyncze zdarzenia integracyjne skutkują powstawaniem miejsc hybrydowych attR i attL na styku nowo zintegrowanego DNA i wcześniej wstawionej kasety. Te witryny mogą być przeznaczone do walidacji witryny wstawiania. W projektach RMCE wprowadzenie kasety dawcy może nastąpić w dwóch alternatywnych orientacjach w odniesieniu do locus genomu, dzięki czemu cztery startery mogą być użyte w alternatywnych kombinacjach PCR w celu wykrycia, jaką orientację przenosi linia. Ponieważ orientacja insercji kasety może wpływać na ekspresję transgenu, w porównawczej analizie ekspresji genów ważne jest, aby używać linii o tej samej orientacji insercji.

Podczas pracy z małą liczbą transformantów poświęcanie całych osobników do analizy molekularnej może nie być pożądane. Opcją jest przeprowadzenie analizy molekularnej DNA wyekstrahowanego z nóg pojedynczej osoby dorosłej46 , ponieważ utrata nóg nie wpływa na zdolność dorosłej samicy do kojarzenia się i składania jaj49. Istnieje jednak ryzyko uszkodzenia osoby w procesie usuwania nogi. Sukces osiągnięto przy użyciu odrzuconych przypadków poczwarek (komunikacja osobista L. Grigoraki), jednak najbezpieczniejszym podejściem jest przeprowadzenie analizy molekularnej na rodzicach G2 po uzyskaniu zdolnego do życia potomstwa G3 .

W ostatnich latach CRISPR/Cas9 zrewolucjonizował sposób wykonywania edycji genomu specyficznego dla danego miejsca 26,41,50,51. W przeciwieństwie do RMCE kierowanego na miejsce, integracje genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 (knock-in) są niezależne od obecności wstępnie wstawionych miejsc rekombinacji, a wymagane jest tylko jednoetapowe zdarzenie transformacji. Niemniej jednak system CRISPR/Cas9 opiera się na obecności dużych znanych sekwencji genomowych otaczających pożądane miejsce insercji w celu skutecznej naprawy kierowanej homologią, a także na skutecznym rozpoznawaniu miejsc za pośrednictwem przewodnikowych RNA. Warunki te nie zawsze mogą być spełnione lub mogą być pracochłonne do rozwiązania, a biorąc pod uwagę dostępność wielu linii dokujących w An. gambiae i An. stephensi oraz linii pochodzących z nich, system φC31 pozostaje bardzo cennym narzędziem do przeprowadzania bezpośrednich porównań fenotypowych między transgenami w tych samych lokalizacjach genomowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Kionie Parker (UCI) za dostarczenie zdjęć transgenicznych larw An. stephensi, oraz Fraserowi Colmanowi (LSTM) i Beth Poulton (LSTM) za dostarczenie transgenicznych larw An. gambiae. Beth Poulton (LSTM) również udzieliła cennej pomocy podczas obrazowania larw An. gambiae. Praca ta została sfinansowana przez Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) oraz LSTM's Director Catalyst Fund, przyznany AA (DCF2014AA). A.A.J. jest profesorem Donalda Brena na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki eppendorfa
8-dołkowe mikroszkiełkaVWRMARI1216690
DNeasy Blood & Zestaw chusteczekhigienicznych Qiagen69504
EndoFree  Plazmid  Maxi  Zestaw (10)Qiagen12362
Etanol, absolutny, klasa
Zestaw filtrów CFP do Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nmLeica10446363
Zestaw filtrów dsRED do Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nmZestaw
Leica dostosowany do Leica MZ FLIIIOmega Optical500QM25, 500QM35
Olej halowęglowy 27SigmaH8773
Olej halowęglowy 700SigmaH8898
Szalki
Potas 
Chlorek
sodu Fosforan sodu dwuzasadowy
Sód  Octan  Roztwór (3 M),  pH  5.2Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)R1181
Stabilna szczotka Rozmiar 0
1,5 mlbiologii molekularnej filtrów 10447079 Petriegochlorek

Bibliografia

  1. Adolfi, A., Lycett, G. J. Opening the toolkit for genetic analysis and control of Anopheles mosquito vectors. Current Opinion in Insect Science. 30, 8-18 (2018).
  2. Grossman, G. L., Rafferty, C. S., Clayton, J. R., Stevens, T. K., Mukabayire, O., Benedict, M. Q. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 10 (6), 597-604 (2001).
  3. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. Journal of Biological Chemistry. 277 (11), 8759-8762 (2002).
  4. Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Molecular Biology. 11 (4), 291-297 (2002).
  5. Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
  6. Carballar-Lejarazú, R., Jasinskiene, N., James, A. Exogenous gypsy insulator sequences modulate transgene expression in the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7176-7181 (2013).
  7. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977(2014).
  8. Nolan, T., Petris, E., Müller, H. M., Cronin, A., Catteruccia, F., Crisanti, A. Analysis of two novel midgut-specific promoters driving transgene expression in Anopheles stephensi mosquitoes. PLoS ONE. 6 (2), 16471(2011).
  9. Lynd, A., Balabanidou, V., Vontas, J., Lycett, G. J. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: appliction to cuticular hydrocarbon synthesis. BioRxiv. , (2019).
  10. O'Brochta, D. A., Alford, R. T., Pilitt, K. L., Aluvihare, C. U., Harrell, R. A., Harrell, R. A. piggyBac transposon remobilization and enhancer detection in Anopheles mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16339-16344 (2011).
  11. O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based enhancer-trapping in the malaria mosquito Anopheles stephensi. G3. 2 (11), Bethesda. 1305-1315 (2012).
  12. Macias, V. M., et al. nanos-Driven expression of piggyBac transposase induces mobilization of a synthetic autonomous transposon in the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 87, 81-89 (2017).
  13. Nimmo, D. D., Alphey, L., Meredith, J. M., Eggleston, P. High efficiency site-specific genetic engineering of the mosquito genome. Insect Molecular Biology. 15 (2), 129-136 (2006).
  14. Kim, A., Pyykko, I. Size matters: Versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354, 301-309 (2011).
  15. Thorpe, H. M., Smith, M. C. M. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5505-5510 (1998).
  16. Khaleel, T., Younger, E., Mcewan, A. R., Varghese, A. S., Smith, M. C. M. A phage protein that binds φC31 integrase to switch its directionality. Molecular Microbiology. 80 (6), 1450-1463 (2011).
  17. Farruggio, A. P., Chavez, C. L., Mikell, C. L., Calos, M. P. Efficient reversal of phiC31 integrase recombination in mammalian cells. Biotechnology Journal. 7 (11), 1332-1336 (2012).
  18. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  19. Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS ONE. 6 (1), 14587(2011).
  20. Meredith, J. M., Underhill, A., McArthur, C. C., Eggleston, P. Next-Generation Site-Directed Transgenesis in the Malaria Vector Mosquito Anopheles gambiae: Self-Docking Strains Expressing Germline-Specific phiC31 Integrase. PLoS ONE. 8 (3), 59264(2013).
  21. Bernardini, F., et al. Site-specific genetic engineering of the Anopheles gambiae Y chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7600-7605 (2014).
  22. Volohonsky, G., et al. Tools for Anopheles gambiae Transgenesis. G3. 5 (6), Bethesda. 1151-1163 (2015).
  23. Amenya, D. A., et al. Comparative fitness assessment of Anopheles stephensi transgenic lines receptive to site-specific integration. Insect Molecular Biology. 19 (2), 263-269 (2010).
  24. Isaacs, A. T., et al. Transgenic Anopheles stephensi coexpressing single-chain antibodies resist Plasmodium falciparum development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 1922-1930 (2012).
  25. Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440(2019).
  26. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2015).
  27. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of Transgenic Drosophila by Using the Site-Specific Integrase from Phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  28. Franz, A. W. E., et al. Comparison of transgene expression in Aedes aegypti generated by mariner Mos1 transposition and site-directed recombination. Insect Molecular Biology. 20 (5), 587-598 (2011).
  29. Labbé, G., Nimmo, D., Alphey, L. piggybac-and PhiC31-Mediated Genetic Transformation of the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (8), 788(2010).
  30. Schetelig, M. F., Scolaric, F., Handler, A. M., Kittelmann, S., Gasperi, G., Wimmer, E. A. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18171-18176 (2009).
  31. Yonemura, N., et al. phiC31-integrase-mediated, site-specific integration of transgenes in the silkworm, Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Applied Entomology and Zoology. 43 (11), 997-1008 (2013).
  32. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phiC31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  33. Adolfi, A., Poulton, B., Anthousi, A., Macilwee, S., Ranson, H., Lycett, G. J. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
  34. Haghighat-Khah, R. E., et al. Site-specific cassette exchange systems in the aedes aegypti mosquito and the Plutella xylostella moth. PLoS ONE. 10 (4), 0121097(2015).
  35. Long, D., Lu, W., Zhang, Y., Bi, L., Xiang, Z., Zhao, A. An efficient strategy for producing a stable, replaceable, highly efficient transgene expression system in silkworm, Bombyx mori. Scientific Reports. 5 (1), 8802(2015).
  36. Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006113(2017).
  37. Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019(2020).
  38. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  39. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  40. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  41. Dong, Y., Simões, M. L., Marois, E., Dimopoulos, G. CRISPR/Cas9 -mediated gene knockout of Anopheles gambiae FREP1 suppresses malaria parasite infection. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006898(2018).
  42. Lombardo, F., Lycett, G. J., Lanfrancotti, A., Coluzzi, M., Arcà, B. Analysis of apyrase 5' upstream region validates improved Anopheles gambiae transformation technique. BMC research notes. 2, 24(2009).
  43. Pondeville, E., et al. Efficient ΦC31 integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
  44. Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nature protocols. 1 (3), 1312-1317 (2006).
  45. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. 5, 216(2007).
  46. Lynd, A., et al. Insecticide resistance in Anopheles gambiae from the northern Democratic Republic of Congo, with extreme knockdown resistance (kdr) mutation frequencies revealed by a new diagnostic assay. Malaria Journal. 17 (1), 412(2018).
  47. Marinotti, O., et al. Development of a population suppression strain of the human malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Malaria Journal. 12 (1), 142(2013).
  48. Adolfi, A. In vivo functional genetic analysis of insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. University of Liverpool. , PhD thesis (2017).
  49. Isaacs, A. T., Lynd, A., Donnelly, M. J. Insecticide-induced leg loss does not eliminate biting and reproduction in Anopheles gambiae mosquitoes. Scientific Reports. 7, 46674(2017).
  50. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  51. Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly efficient site-specific mutagenesis in malaria mosquitoes using CRISPR. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  52. Poulton, B. C., et al. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Integracja PhiC31komary Anophelesintegracja celowanawymiana kasety za po rednictwem rekombinazykomary transgenicznemikroiniekcja zarodk wprzesiewanie marker w fluorescencyjnychwalidacja PCRmodyfikacja genomu

Powiązane artykuły