Method Article

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka miozyny wiążą się i oddziałują z nitkowatą aktyną (F-aktyną) i znajdują się w organizmach w całym drzewie filogenetycznym. Ich struktura i właściwości enzymatyczne są dostosowane do konkretnej funkcji, jaką pełnią w komórkach. Miozyna 5a procesowo chodzi na F-aktynie, aby transportować melanosomy i pęcherzyki w komórkach. I odwrotnie, miozyna 2b bez mięśni działa jako bipolarne włókno zawierające około 30 cząsteczek. Przesuwa F-aktynę o przeciwnej polaryzacji w kierunku środka włókna, gdzie cząsteczki miozyny działają asynchronicznie, aby związać aktynę, nadać uderzenie mocy i dysocjować przed powtórzeniem cyklu. Miozyna 2b niemięśniowa, wraz z innymi izoformami miozyny 2 bez mięśni, pełni role obejmujące adhezję komórek, cytokinezę i utrzymanie napięcia. Mechanochemię miozyn można badać, wykonując testy ruchliwości in vitro przy użyciu oczyszczonych białek. W teście ślizgania się włókien aktynowych miozyny są wiązane z powierzchnią szkiełka nakrywkowego mikroskopu i przemieszczają fluorescencyjnie znakowaną F-aktynę, którą można śledzić. Jednak w teście ruchliwości pojedynczej cząsteczki/zespołu F-aktyna jest związana ze szkiełkiem nakrywkowym i obserwuje się ruch znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek miozyny na F-aktynie. W niniejszym raporcie przedstawiono oczyszczanie rekombinowanej miozyny 5a z komórek Sf9 za pomocą chromatografii powinowactwa. Następnie przedstawiamy dwa testy oparte na mikroskopii fluorescencyjnej: test ślizgowych włókien aktynowych i test odwróconej ruchliwości. Z tych testów można wyodrębnić takie parametry, jak prędkości translokacji aktyny oraz długości i prędkości przebiegu pojedynczej cząsteczki, za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Techniki te mogą być również stosowane do badania ruchu pojedynczych włókien izoform miozyny 2 bez mięśni, omówionych w niniejszym dokumencie w kontekście miozyny niemięśniowej 2b. Ten przepływ pracy reprezentuje protokół i zestaw narzędzi ilościowych, które można wykorzystać do badania dynamiki pojedynczej cząsteczki i zespołu miozyn niemięśniowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miozyny to białka motoryczne, które wywierają siłę na filamenty aktynowe, wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy adenozynotrifosforanu (ATP)1. Miozyny zawierają domenę głowy, szyi i ogona. Domena główna zawiera region wiążący aktynę, a także miejsce wiązania i hydrolizy ATP. Domeny szyi składają się z motywów IQ, które wiążą się z łańcuchami świetlnymi, kalmoduliną lub białkami podobnymi do kalmoduliny2,3. Region ogonowy ma kilka funkcji specyficznych dla każdej klasy miozyn, w tym między innymi dimeryzację dwóch łańcuchów ciężkich, wiązanie cząsteczek ładunku i regulację miozyny poprzez interakcje autohamujące z domenami głównymi1.

Właściwości ruchliwe miozyny różnią się znacznie między klasami. Niektóre z tych właściwości obejmują współczynnik wypełnienia (ułamek cyklu mechanicznego miozyny, w którym miozyna jest związana z aktyną) i procesywność (zdolność silnika do wykonywania wielu kroków na swojej torze przed odłączeniem)4. Na podstawie analiz sekwencji określono ponad 40 klas miozyn5,6,7,8. Miozyny klasy 2 są klasyfikowane jako "konwencjonalne", ponieważ były pierwszymi, które zostały zbadane; Wszystkie inne klasy miozyn są zatem klasyfikowane jako "niekonwencjonalne".

Myosin 5a (M5a) jest miozyną klasy 5 i jest motorem procesowym, co oznacza, że może wykonać wiele kroków wzdłuż aktyny przed dysocjacją. Ma wysoki współczynnik obciążenia, co wskazuje, że spędza dużą część swojego cyklu mechanicznego związanego z actin9,10,11,12,13,14. Podobnie jak inne miozyny, łańcuch ciężki zawiera N-końcową domenę motoryczną, która obejmuje zarówno miejsce wiązania aktyny, jak i hydrolizy ATP, po którym następuje obszar szyi, który służy jako ramię dźwigniowe, z sześcioma motywami IQ, które wiążą się z niezbędnymi łańcuchami lekkimi (ELC) i kalmoduliną (CaM)15. Obszar ogona zawiera α-spiralne zwinięte cewki, które dimeryzują cząsteczkę, a następnie kulisty obszar ogona do wiązania ładunku. Jego kinetyka odzwierciedla jego udział w transporcie melanosomów w melanocytach i retikulum endoplazmatycznego w neuronach Purkinjego16,17. M5a jest uważany za prototypowy silnik do transportu ładunków18.

Klasa 2 miozyny, czyli konwencjonalne miozyny, obejmują miozyny, które napędzają skurcze mięśni szkieletowych, sercowych i gładkich, oprócz izoform niemięśniowych miozyny 2 (NM2), NM2a, 2b i 2c19. Izoformy NM2 znajdują się w cytoplazmie wszystkich komórek i odgrywają wspólne role w cytokinezie, adhezji, morfogenezie tkanek i migracji komórek19,20,21,22. W tym artykule omówiono konwencjonalne protokoły miozyny w kontekście niemięśniowej miozyny 2b (NM2b)23. NM2b, w porównaniu do M5a, ma niski współczynnik obciążenia i jest enzymatycznie wolniejszy zV max 0,2 s-1 23 w porównaniu do M5a Vmax ≈18 s-1 24. Warto zauważyć, że obcięte konstrukty NM2b z dwiema głowicami nie poruszają się łatwo procesowo na aktynie; Raczej każde spotkanie z aktyną skutkuje udarem mocy, po którym następuje dysocjacja cząsteczki25.

NM2b zawiera dwa ciężkie łańcuchy miozyny, każdy z jedną domeną głowy kulistej, jednym ramieniem dźwigniowym (z jednym ELC i jednym regulatorowym łańcuchem lekkim (RLC)) oraz α-spiralną domeną pręta/ogona z cewką zwijaną, o długości około 1100 aminokwasów, która dimeryzuje te dwa ciężkie łańcuchy. Aktywność enzymatyczna i stan strukturalny NM2b są regulowane przez fosforylację klasy RLC23. Nieufosforylowany NM2b, w obecności ATP i fizjologicznych sił jonowych (około 150 mM soli), przyjmuje zwartą konformację, w której dwie głowy uczestniczą w asymetrycznym oddziaływaniu, a ogon składa się z powrotem nad głowami w dwóch miejscach23. W tym stanie miozyna nie oddziałuje silnie z aktyną i ma bardzo niską aktywność enzymatyczną. Po fosforylacji RLC przez zależną od kalmoduliny kinazę łańcucha lekkiego miozyny (MLCK) lub kinazę białkową związaną z Rho, cząsteczka rozciąga się i łączy z innymi miozynami przez obszar ogona, tworząc dwubiegunowe włókna około 30 cząsteczek miozyny23. Wspomniana fosforylacja RLC prowadzi również do około czterokrotnego zwiększenia aktywności ATPazy NM2b aktywowanej aktyną26,27,28. Ten bipolarny układ włókien, wyposażony w wiele silników miozyny na każdym końcu, jest zoptymalizowany pod kątem ról w skurczu i utrzymaniu napięcia, gdzie filamenty aktynowe o przeciwstawnych polaryzacjach mogą być przesuwane względem siebie23,29. W związku z tym wykazano, że NM2b działa jako zespół silników podczas interakcji z aktyną. Duża liczba silników w tym żarniku pozwala włóknom NM2b na procesowe poruszanie się po filamentach aktynowych, dzięki czemu procesywność filamentu in vitro jest możliwa do scharakteryzowania29.

Chociaż poczyniono postępy w zrozumieniu roli miozyn w komórce, istnieje potrzeba zrozumienia ich indywidualnych cech na poziomie białka. Aby zrozumieć interakcje aktomiozyny na prostym poziomie interakcji białko-białko, a nie wewnątrz komórki, możemy wyrazić i oczyścić rekombinowane miozyny do wykorzystania w badaniach in vitro. Wyniki takich badań informują następnie mechanobiologów o właściwościach biofizycznych określonych miozyn, które ostatecznie napędzają złożone procesy komórkowe12,13,14,25,29. Zazwyczaj osiąga się to poprzez dodanie znacznika powinowactwa do pełnowymiarowego lub skróconego konstruktu miozyny i oczyszczenie za pomocą chromatografii powinowactwa29,30,31. Dodatkowo, konstrukt może być zmodyfikowany tak, aby zawierał genetycznie kodowalny fluorofor lub znacznik do znakowania białek za pomocą syntetycznego fluoroforu. Dodając taką etykietę fluorescencyjną, można przeprowadzić badania obrazowania pojedynczych cząsteczek w celu obserwacji mechaniki i kinetyki miozyny.

Po oczyszczeniu, miozynę można scharakteryzować na kilka sposobów. Aktywność ATPazy można mierzyć metodami kolorymetrycznymi, zapewniając wgląd w ogólne zużycie energii i powinowactwo do aktyny silnika w różnych warunkach32. Aby poznać mechanochemię jego ruchliwości, wymagane są dalsze eksperymenty. W artykule opisano dwie metody oparte na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro, które można wykorzystać do scharakteryzowania właściwości ruchliwych oczyszczonego białka miozyny.

Pierwszą z tych metod jest test włókien aktynowych ślizgowych, który może być wykorzystany do ilościowego badania właściwości zespołów silników miozynowych, jak również do jakościowego badania jakości partii oczyszczonego białka33. Chociaż w tym artykule omówiono zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do tego testu, eksperymenty te można skutecznie przeprowadzić przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową, powszechnie spotykaną w wielu laboratoriach34. W tym teście warstwa nasycająca silniki miozyny jest przymocowana do szkiełka nakrywkowego. Można to osiągnąć m.in. za pomocą nitrocelulozy, przeciwciał, membran, powierzchni derywatyzowanych2-SiO (takich jak trimetylochlorosilan)29,33,35,36,37,38. Znakowane fluorescencyjnie włókna aktyny są przepuszczane przez komorę szkiełka nakrywkowego, na której aktyna wiąże się z miozyną przyczepioną do powierzchni. Po dodaniu ATP (i kinaz w badaniu NM2), komora jest obrazowana w celu obserwacji translokacji włókien aktyny przez miozyny związane z powierzchnią. Oprogramowanie śledzące może być używane do korelacji prędkości i długości każdego ślizgającego się filamentu aktynowego. Oprogramowanie analityczne może również zapewnić pomiar liczby zarówno ruchomych, jak i stacjonarnych filamentów aktyny, co może być przydatne do określenia jakości danego preparatu miozyny. Proporcja zatrzymanych włókien może być również celowo modulowana przez powierzchniowe wiązanie aktyny z innymi białkami i mierzona w celu określenia zależności obciążenia miozyny39. Ponieważ każde włókno aktyny może być napędzane przez dużą liczbę dostępnych silników, test ten jest bardzo powtarzalny, a końcowa zmierzona prędkość jest odporna na zakłócenia, takie jak zmiany początkowego stężenia miozyny lub obecność dodatkowych czynników w roztworze. Oznacza to, że można go łatwo zmodyfikować w celu zbadania aktywności miozyny w różnych warunkach, takich jak zmieniona fosforylacja, temperatura, siła jonowa, lepkość roztworu i skutki obciążenia indukowanego przez więzy powierzchniowe. Chociaż czynniki takie jak silnie wiążące "martwe głowy" miozyny niezdolne do hydrolizy ATP mogą powodować zatrzymanie włókien aktynowych, istnieje wiele metod łagodzenia takich problemów i pozwalania na dokładne pomiary. Właściwości kinetyczne miozyny różnią się znacznie w zależności od klas i, w zależności od konkretnej użytej miozyny, prędkość ślizgania się włókien aktynowych w tym teście może wahać się od poniżej 20 nm / s (miozyna 9) < klasa sup = "xref">40,41 i do 60 000 nm / s (miozyna Characean 11)42.

Drugi test odwraca geometrię testu z włókien aktynowych ślizgowych12. W tym przypadku filamenty aktynowe są przyłączane do powierzchni szkiełka nakrywkowego i wizuowany jest ruch pojedynczych cząsteczek M5a lub pojedynczych bipolarnych włókien NM2b. Test ten można wykorzystać do ilościowego określenia długości i prędkości pojedynczych cząsteczek lub włókien miozyny na aktynie. Szkiełko nakrywkowe jest pokryte związkiem chemicznym, który blokuje niespecyficzne wiązanie i jednocześnie funkcjonalizuje powierzchnię, takim jak glikol biotynowo-polietylenowy (biotyna-PEG). Dodanie zmodyfikowanych pochodnych awidyny następnie zagruntowuje powierzchnię, a biotynylowana aktyna jest przepuszczana przez komorę, w wyniku czego warstwa F-aktyny jest stabilnie związana z dnem komory. Wreszcie, aktywowana i znakowana fluorescencyjnie miozyna (zwykle 1-100 nM) przepływa przez komorę, która jest następnie obrazowana w celu obserwacji ruchu miozyny nad nieruchomymi włóknami aktyny.

Te modalności reprezentują szybkie i powtarzalne metody, które mogą być wykorzystane do zbadania dynamiki zarówno niemięśniowych, jak i mięśniowych miozyn. Niniejszy raport przedstawia procedury oczyszczania i charakterystyki zarówno M5a, jak i NM2b, reprezentujących odpowiednio niekonwencjonalne i konwencjonalne miozyny. Następnie omówiono niektóre adaptacje specyficzne dla miozyny, które można wykonać, aby osiągnąć pomyślne uchwycenie ruchu w dwóch typach testu.

Ekspresja i biologia molekularna
cDNA dla interesującej nas miozyny musi zostać sklonowane na zmodyfikowany wektor pFastBac1, który koduje albo C-końcowy znacznik FLAG (DYKDDDDK), jeśli wyraża M5a-HMM, lub N-końcowy znacznik FLAG, jeśli wyraża pełnowymiarową cząsteczkę NM2b23,43,44,45,46. C-końcowe znaczniki FLAG na NM2b powodują osłabienie powinowactwa białka do kolumny powinowactwa do FLAG. W przeciwieństwie do tego, N-końcowe białko oznaczone flagą zwykle dobrze wiąże się z kolumną powinowactwa FLAG23. N-końcowe białko zachowuje aktywność enzymatyczną, aktywność mechaniczną i regulację zależną od fosforylacji23.

W tym artykule użyto obciętego konstruktu podobnego do ciężkiej meromyozyny M5a z GFP między znacznikiem FLAG a C-końcem ciężkiego łańcucha miozyny. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do NM2b, M5a-HMM może być z powodzeniem oznaczony i oczyszczony za pomocą N- lub C-końcowych znaczników FLAG i w obu przypadkach wynikowa konstrukcja będzie aktywna. Łańcuch ciężki M5a został obcięty na aminokwasie 1090 i zawiera łącznik trzech aminokwasów (GCG) między GFP a regionem cewki zwijanej klasy M5a47. Nie dodano żadnego dodatkowego konsolidatora między GFP a znacznikiem FLAG. M5a-HMM ulegał jednoczesnej ekspresji z kalmoduliną. Pełnowymiarowy ludzki konstrukt NM2b uległ jednoczesnej ekspresji z ELC i RLC. N-końce RLC zostały połączone z GFP za pośrednictwem łącznika pięciu aminokwasów (SGLRS). Bezpośrednio do znacznika FLAG przymocowany był HaloTag. Pomiędzy HaloTag a N-końcem łańcucha ciężkiego miozyny znajdował się łącznik zbudowany z dwóch aminokwasów (AS).

Oba preparaty miozyny zostały oczyszczone z jednego litra hodowli komórek Sf9 zakażonych bakulowirusem o gęstości około 2 x 106 komórek/ml. Objętości bakulowirusa dla każdej podjednostki zależały od wielości infekcji wirusa, określonej w instrukcjach producenta. W przypadku M5a komórki były jednocześnie zakażone dwoma różnymi bakulowirusami - jednym dla kalmoduliny, a drugim dla łańcucha ciężkiego M5a. W przypadku NM2b komórki zostały zakażone trzema różnymi wirusami - jednym dla ELC, jednym dla RLC i jednym dla łańcucha ciężkiego NM2b. W przypadku laboratoriów pracujących z różnymi miozynami (lub innymi wielozłożonymi białkami) podejście to jest skuteczne, ponieważ pozwala na wiele kombinacji łańcuchów ciężkich i lekkich, a powszechnie stosowane łańcuchy lekkie, takie jak kalmodulina, mogą być współtransfekowane z wieloma różnymi łańcuchami ciężkimi miozyny. Wszystkie prace na celi zostały wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednią sterylną techniką, aby uniknąć kontaminacji.

Dla ekspresji zarówno M5a, jak i NM2b, komórki Sf9 produkujące rekombinowane miozyny zostały zebrane 2-3 dni po zakażeniu, poprzez wirowanie, i przechowywane w temperaturze -80 °C. Granulki komórek uzyskano przez odwirowanie współzakażonych komórek Sf9 w temperaturze 4 °C przez 30 minut przy 2,800 x g. Proces oczyszczania białka jest szczegółowo opisany poniżej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanie białka

  1. Liza komórek i ekstrakcja białek
    1. Przygotuj 1,5x bufor ekstrakcyjny w oparciu o Tabelę 1. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Rozpocznij rozmrażanie granulek komórkowych na lodzie. Podczas rozmrażania granulek uzupełnij 100 ml buforu ekstrakcyjnego 1,2 mM ditiotreitolem (DTT), 5 μg/ml leupeptyny, 0,5 μM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i dwiema tabletkami inhibitora proteazy. Trzymaj na lodzie.
    3. Po rozmrożeniu osadu dodać 1 ml uzupełnionego buforu ekstrakcyjnego na 10 ml hodowli komórkowej. Na przykład, jeśli osadki komórkowe zostały utworzone z 500 ml hodowli komórkowej, dodaj 50 ml uzupełnionego buforu ekstrakcyjnego do osadu.
    4. Poddaj sonikacji granulki komórek, utrzymując je na lodzie. Dla każdej pastylki należy zastosować następujące warunki: 5 s WŁ., 5 s WYŁ., czas trwania 5 min, moc 4-5.
    5. Zebrać cały homogenizowany lizat do zlewki i dodać ATP (0,1 M roztwór podstawowy; pH 7,0) tak, aby końcowe stężenie ATP wynosiło 1 mM. Mieszaj przez 15 minut w chłodnym pomieszczeniu. ATP dysocjuje aktywną miozynę od aktyny, umożliwiając jej oddzielenie w następnym etapie wirowania. Dlatego ważne jest, aby natychmiast przejść do następnego kroku, aby zminimalizować możliwość wyczerpania ATP i ponownego wiązania się z aktyną.
    6. Odwirować lizaty w temperaturze 48 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. W tym czasie należy rozpocząć płukanie 1-5 ml 50% zawiesiny żywicy o powinowactwie Anti-FLAG (dla osadu utworzonego z 1 litra komórek) 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), zgodnie z instrukcjami producenta. Na przykład na 5 ml żywicy umyj 10 ml 50% zawiesiny. Na ostatnim etapie mycia ponownie zawiesić żywicę z 1-5 ml PBS o objętości wystarczającej do wytworzenia 50% zawiesiny.
    7. Po odwirowaniu lizatu połączyć supernatant z przemytą zawiesiną żywicy i delikatnie rozdrabniać w chłodni przez 1-4 godziny. W czasie oczekiwania należy sporządzić opisane w tabeli 1 i przechowywać je na lodzie.
  2. Preparat oczyszczający powinowactwo FLAG
    1. Odwirować roztwór opisany w kroku 1.7 przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Żywica zostanie zapakowana na dnie tuby. Nie naruszając żywicy, usuń supernatant.
    2. Zawiesić żywicę w 50 ml buforu A, jak opisano w tabeli 1 i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Nie naruszając żywicy, usuń supernatant.
    3. Zawiesić żywicę w 50 ml buforu B, jak opisano w tabeli 1 i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok jeszcze raz i ponownie zawiesić żywicę w 20 ml buforu B. Następnie dokładnie wymieszaj żywicę i bufor, delikatnie odwracając ręcznie probówkę około 10 razy.
  3. Elucja i koncentracja białek
    1. Przygotować 30 ml buforu elucyjnego zgodnie z opisem w Tabeli 1 i pozostawić do ochłodzenia na lodzie.
    2. Ustaw kolumnę elucyjną w chłodni. Delikatnie wlej zawiesinę żywicy do kolumny. Umyj kolumnę 1-2 objętościami buforu B, gdy żywica pakuje się na dnie, upewniając się, że żywica nie wysycha.
    3. Przepuść 1 ml buforu elucyjnego przez żywicę i zbierz przepływ do probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz tak, aby zebrać 12, 1 ml frakcji.
    4. W tym momencie wykonaj surowy test Bradforda na frakcjach, aby jakościowo określić, które frakcje są najbardziej skoncentrowane48. Na jednym rzędzie płytki 96-dołkowej odpipetować 60 μl 1x odczynnik Bradford. Po zebraniu frakcji wymieszaj 20 μl każdej frakcji na studzienkę. Ciemniejsze niebieskie zabarwienie wskazuje na bardziej skoncentrowane frakcje.
    5. W probówce o pojemności 50 ml zebrać pozostałe białko, delikatnie pipetując pozostały bufor elucyjny przez kolumnę, aby uwolnić pozostałą miozynę związaną z żywicą w przepływie przez kolumnę. Ten przepływ zostanie skoncentrowany w następnym kroku. Upewnij się, że żywica jest następnie regenerowana do ponownego użycia i przechowywana zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Zebrać trzy najbardziej skoncentrowane frakcje i dalej zagęścić przepływ w probówce o pojemności 50 ml, a także pozostałe frakcje o pojemności 1 ml za pomocą probówki zagęszczającej o mocy 100 000 MWCO. Załadować zbiorczą próbkę do probówki zagęszczającej i odwirowywać przy 750 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i powtarzać, aż całe eluowane białko zostanie zagęszczone do końcowej objętości około 0,5-1 ml.
      UWAGA: Ta wielkość porów pozwala na zatrzymanie cząsteczek miozyny, których masa jest kilkakrotnie większa od granicy masy cząsteczkowej. Łańcuchy lekkie pozostają ściśle związane z domenami motorycznymi w tym czasie koncentracji, co zostało zweryfikowane poprzez wykonanie elektroforezy żelowej SDS-PAGE na produkcie końcowym.
  4. Dializy i błyskawiczne zamrażanie
    1. Przygotować 2 l buforu do dializy, jak opisano w Tabeli 1. Załaduj próbkę do worka lub komory dializacyjnej i dializuj przez noc w chłodni. Należy zauważyć, że skład dializacyjnych różni się w przypadku NM2b i M5a.
      UWAGA: W przypadku NM2b celem tego etapu dializy jest wytworzenie włókien miozyny w buforze o niskiej sile jonowej. Sedymentacja tych włókien zapewnia następnie dodatkowy etap oczyszczania i pozwala na zagęszczenie próbki. W związku z tym następnego dnia w komorze dializacyjnej pojawi się widoczny biały osad. Filamenty te zostaną zebrane przez odwirowanie i zdepolimeryzowane w kroku 5.1. W przypadku M5a-HMM, po całonocnej dializie, białko będzie wystarczająco czyste, aby można je było wykorzystać w kolejnych testach. W razie potrzeby można przeprowadzić dalsze etapy oczyszczania, takie jak filtracja żelowa lub chromatografia jonowymienna. Aby uzyskać informacje na temat odzyskiwania M5a po dializie, przejdź do kroku 5.2.
  5. Odzyskiwanie miozyny po dializie
    1. W przypadku NM2b ostrożnie wyładować całą próbkę z worka lub komory dializacyjnej i odwirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 49 000 x g w celu zebrania włókien miozyny. Odrzucić supernatant i stopniowo dodawać bufor do przechowywania osadu, jak opisano w tabeli 1, aż do jego rozpuszczenia. Delikatne pipetowanie w górę i w dół pomaga w rozpuszczaniu granulek. Zwykle nie wymaga to więcej niż 500 μl na probówkę. Po upewnieniu się, że osad jest całkowicie rozpuszczony w buforze magazynowym o wysokiej sile jonowej, można przeprowadzić dodatkowy etap wirowania (15 min przy 49 000 x g) w celu usunięcia niepożądanych agregatów, jeśli jest to wymagane, ponieważ miozyna będzie teraz niespolimeryzowana i pozostanie w supernatancie.
    2. W przypadku M5a-HMM należy ostrożnie pobrać całą próbkę z komory dializacyjnej i odwirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 49 000 x g, w przypadku obecności jakichkolwiek niepożądanych agregatów. Weź supernatant.
  6. Oznaczanie stężenia i błyskawiczne zamrażanie
    1. Aby określić stężenie produktu, należy zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru przy długościach fal 260, 280, 290 i 320 nm. Obliczyć stężenie w mg/ml (cmg/ml) za pomocą równania 1, gdzie A280 oznacza absorpcję przy 280 nm, a A320 oznacza absorpcję przy 320 nm. Wynikowe stężenie w mg / ml można przeliczyć na μM cząsteczek miozyny za pomocą równania 2, gdzie M jest masą cząsteczkową całego białka (w tym łańcuchów ciężkich, łańcuchów lekkich, fluoroforów i wszystkich znaczników).
      cmg/ml = (A280 - A320) / ε (1)
      Cząsteczki μM = 1000c mg/ml/M (2)
      UWAGA: Jeśli konieczne jest rozcieńczenie, należy to zrobić w buforze o wysokiej sile jonowej. Współczynnik ekstynkcji (ε) można określić, importując sekwencję aminokwasową białka do programu takiego jak ExPASy. Typowa wydajność dla M5a-HMM wynosi około 0,5-1 ml białka 1-5 mg/ml, a dla pełnej długości NM2b wynosi 0,5-1 ml 0,5-2 mg/ml. Współczynnik ekstynkcji dla M5a-HMM użyty w tej pracy wynosił 0,671. Współczynnik ekstynkcji dla NM2b użyty w tej pracy wynosił 0,611.
    2. Oczyszczoną miozynę należy przechowywać na jeden z dwóch sposobów. Podwielokrotność podamy od 10 do 20 μl do cienkościennej probówki, takiej jak probówka do polimeryzacji w procesie reakcji łańcuchowej, i wrzuć probówkę do pojemnika z ciekłym azotem w celu błyskawicznego zamrożenia. Alternatywnie, bezpośrednio odpipetować od 20-25 μl miozyny do ciekłego azotu i przechowywać zamrożone kulki białka w sterylnych probówkach kriogenicznych. W obu przypadkach powstałe probówki można przechowywać w temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie do wykorzystania w przyszłości.
      UWAGA: Ponieważ oba opisane poniżej testy ruchliwości wymagają bardzo małych ilości białka, przechowywanie w małych porcjach, zgodnie z opisem, jest ekonomiczne.

2. Test włókien aktynowych ślizgowych

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
    1. Przygotować 1% roztwór nitrocelulozy w octanie amylu.
    2. Zaopatrzyć się w naczynie do hodowli tkankowej (150 x 25 mm) i na dno naczynia dodać okrągłą bibułę filtracyjną (o średnicy 125 mm).
    3. Załaduj osiem kwadratowych szkiełek nakrywkowych nr 1,5 o grubości 22 mm na stojak i umyj około 2-5 ml 200-procentowego etanolu, a następnie 2-5 ml wody destylowanej (dH2O). Powtórz ten krok prania, kończąc na wodzie. Następnie całkowicie wysusz szkiełka nakrywkowe za pomocą przefiltrowanego przewodu powietrznego lub przewodu N2.
    4. Weź jedno szkiełko nakrywkowe i powoli odpipetuj 10 μl 1% roztworu nitrocelulozy wzdłuż jednej krawędzi szkiełka. Następnie, jednym płynnym ruchem, rozprowadź go na pozostałej części szkiełka nakrywkowego, używając strony gładkiej końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Umieść to szkiełko nakrywkowe na naczyniu do hodowli tkankowych nitrocelulozową stroną do góry. Powtórzyć tę czynność dla pozostałych szkiełek nakrywkowych i pozostawić je do wyschnięcia, przygotowując pozostałe odczynniki, a następnie użyć szkiełek nakrywkowych w ciągu 24 godzin po nałożeniu.
  2. Przygotowanie komory
    1. Przetrzyj szkiełko mikroskopowe papierem do soczewek optycznych, aby usunąć duże zanieczyszczenia. Wytnij dwa kawałki taśmy dwustronnej o długości około 2 cm.
    2. Umieść jeden kawałek wzdłuż środka dłuższej krawędzi szkiełka mikroskopowego. Upewnij się, że krawędź taśmy jest wyrównana z krawędzią suwaka. Umieść drugi kawałek taśmy około 2 mm poniżej pierwszego kawałka taśmy, tak aby oba były równoległe i wyrównane. W ten sposób powstaje komora przepływowa, która może pomieścić około 10 μl roztworu (patrz Rysunek 1).
    3. Weźmy jedno z szkiełek nakrywkowych pokrytych nitrocelulozą z części 1. Ostrożnie przyklej szkiełko nakrywkowe do taśmy tak, aby strona pokryta nitrocelulozą stykała się bezpośrednio z taśmą (patrz Rysunek 1). Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij złącze taśmy ślizgowej, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe prawidłowo przylega do szkiełka. Odetnij nadmiar taśmy zwisającej z krawędzi zjeżdżalni za pomocą żyletki.
  3. Przygotowanie aktyny
    1. Otrzymać 20 μM F-aktyny przez polimeryzację aktyny globularnej (G-aktyny) w buforze polimeryzacyjnym (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Rozcieńczyć F-aktynę do 5 μM w buforze ruchliwości (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Oznaczyć co najmniej 1,2x molowym nadmiarem rodaminy-falloidyny. Pozostaw (przykryte folią aluminiową) na co najmniej 2 godziny na lodzie. Można go używać do 1-2 miesięcy, przechowywany na lodzie.
  4. Wykonywanie testu ślizgowego włókna aktynowego miozyny 5a
    UWAGA: W tej sekcji podano szczegółowe informacje na temat testu ślizgowego miozyny 5a (HMM).
    1. Przygotować roztwory miozyny 5a opisane w Tabeli 2 i przechowywać je na lodzie.
    2. Przepuścić 10 μl miozyny 5a (50-100 nM) przez komorę przepływową i odczekać 1 min.
    3. Przepływ w 10 μl 1 mg/ml BSA w 50 mM MB z 1 mM DTT (bufor o niskiej zawartości soli). Powtórz to pranie jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibułki lub bibuły filtracyjnej, aby przesiąknąć roztwór przez kanał, delikatnie umieszczając róg bibuły przy wyjściu z komory przepływowej.
    4. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    5. Przepłyń w 10 μl roztworu czarnej aktyny (5 μM F-aktyny, 1 μM kalmoduliny i 1 mM ATP w 50 mM MB z 1 mM DTT), aby wyeliminować "martwe głowy", jak omówiono w sekcji Dyskusja.
      1. Odpipetować roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27 G, aby ściąć włókna aktyny przed wprowadzeniem roztworu do komory. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim razie. Wystarczy około 20 pipetowania.
      2. Aby wykonać wirowanie "martwej głowy", dodaj stechiometryczną ilość F-aktyny do miozyny w obecności 1 mM ATP i 1 mM MgCl2 przy stężeniu soli 500 mM. Następnie ultrawirować przy 480 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Martwa miozyna będzie w granulce.
    6. Przepływ w 50 μL z 50 mM MB z 1 mM DTT i 1 mM ATP w celu wyczerpania komory wolnych filamentów aktynowych.
    7. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy, aby opróżnić komorę z dowolnego ATP.
    8. Przepłynąć w 10 μl roztworu 20 nM aktyny rodaminy (Rh-aktyny) zawierającego 1 mM DTT w 50 mM MB i odczekać 1 minutę, aby umożliwić ścisłe wiązanie włókien aktyny z miozyną 5a przyczepioną do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    9. Umyć 10 μl 50 mM MB za pomocą 1 mM DTT, aby zmyć włókna Rh-aktyny niezwiązane z powierzchnią. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    10. Przepłynąć w 30 μl buforu końcowego.
    11. Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu długości fali wzbudzenia 561 nm w celu wizualizacji Rh-aktyny. Odpowiedni czas naświetlania to 200 ms przy mocy lasera 1,4 mW, co daje łączny czas akwizycji 0,5-1 min.
      UWAGA: Upewnij się, że szybkość akwizycji jest odpowiednio wyskalowana do prędkości poruszających się włókien. Ważną kwestią przed zebraniem danych do wykorzystania w programach śledzących jest liczba klatek na sekundę podczas akwizycji. Ruchy subpikseli między klatkami spowodują przeszacowanie prędkości, a do uzyskania dokładnych wartości wymagane są ruchy rzędu kilkuset nanometrów. Optymalna szybkość akwizycji obejmuje ślizganie się aktyny przez co najmniej jeden piksel odległości między klatkami. W przypadku mikroskopu TIRF użytego do obrazowania tutaj próg ten przekłada się na 130 nm; W związku z tym, miozyna, która ma przemieszczać się z prędkością 1 μm/s, musi być obrazowana z szybkością 5 klatek/s (interwał 0,2 s), aby osiągnąć 200 nm ruchu, podczas gdy miozyna, która ma przemieszczać się z prędkością 10 nm/s, wymaga 0,05 klatki/s (odstępy 20 s). W związku z tym na tym etapie dane mogą być próbkowane w dół na tym etapie (więcej szczegółów można znaleźć w dyskusji).
  5. Wykonywanie testu na poślizgowe włókien aktynowych 2b bez mięśni
    UWAGA: W tej sekcji podano szczegółowe informacje na temat testu ślizgowego miozyny 2b na całej długości. Protokół testu ślizgowego włókien aktynowych niemięśniowych miozyny 2b różni się od protokołu miozyny 5a na niektórych etapach. Upewnij się, że dla każdego z tych kroków są używane odpowiednie. Na przykład test NM2b wymaga przyłączenia miozyny do szkiełka nakrywkowego w buforze o wysokiej zawartości soli, podczas gdy M5a może być przyłączony do szkiełka nakrywkowego w o wysokiej lub niskiej soli. Dodatkowo, test ślizgowych włókien aktynowych M5a wykorzystuje niższe stężenie miozyny w celu złagodzenia częstotliwości rozpadania się włókien aktynowych podczas akwizycji.
    1. Przygotować roztwory NM2b zgodnie z opisem w Tabeli 2 i przechowywać je na lodzie.
    2. Przepłynąć 10 μl niemięśniowej miozyny 2b (0,2 μM) w 500 mM buforze ruchliwości (MB) (bufor o wysokiej zawartości soli) i 1 mM ditiotreitolu (DTT) przez komorę przepływową i odczekać 1 min.
      UWAGA: o wysokiej zawartości soli dysocjują włókna miozyny i pozwalają na przyłączenie pojedynczych cząsteczek miozyny do powierzchni, ponieważ miozyna 2b bez mięśni może polimeryzować do włókien przy stężeniu jonowym <150 mM.
    3. Przepływ w 10 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1 mg/ml w 500 mM MB z 1 mM buforem DTT ("o wysokiej zawartości soli"), jak opisano w tabeli 2. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibuły lub bibuły filtracyjnej, aby przesączyć roztwór przez kanał.
    4. Przemyć 10 μl 500 mM MB za pomocą 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej, jak opisano w tabeli 2. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    5. Przelej 10 μl roztworu czarnej aktyny, jak opisano w Tabeli 2, aby wyeliminować "martwe głowy", jak omówiono w dalszej części sekcji Dyskusja. Roztwór czarnej aktyny zawiera 5 μM nieznakowanej F-aktyny, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2, 1 μM CaM i 1 mM DTT w 50 mM buforze ruchliwości NaCl w celu fosforylacji niemięśniowej miozyny 2b na powierzchni komory.
      1. Odpipetować roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27 G, aby ściąć włókna aktyny przed wprowadzeniem roztworu do komory. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim razie. W przybliżeniu wystarczy 20 pipetowania.
    6. Przepływ w 50 μL z 50 mM MB z 1 mM DTT i 1 mM ATP w celu wyczerpania komory wolnych filamentów aktynowych.
    7. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy, aby opróżnić komorę z dowolnego ATP.
    8. Przepłynąć w 10 μl roztworu Rh-aktyny o stężeniu 20 nM zawierającego 1 mM DTT w 50 mM MB i odczekać 1 minutę, aby umożliwić ścisłe wiązanie włókien aktynowych z niemięśniową miozyną 2b przyczepioną do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    9. Umyć 10 μl 50 mM MB za pomocą 1 mM DTT, aby zmyć włókna Rh-aktyny niezwiązane z powierzchnią. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    10. Przepłynąć w 30 μl buforu końcowego. W przypadku testu włókien aktynowych ślizgowych niemięśniowych 2b, końcowy bufor zawiera również kalmodulinę, CaCl2 i kinazę łańcucha lekkiego miozyny, aby zapewnić pełną fosforylację niemięśniowej miozyny 2b podczas obrazowania wideo. 0,7% metylocelulozy może być również zawarte w końcowym buforze, jeśli włókna aktyny są tylko luźno związane lub nie są związane z powierzchnią. Jest to omówione w dalszej części sekcji Dyskusja.
    11. Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu długości fali wzbudzenia 561 nm. Odpowiedni czas naświetlania to 200 ms przy mocy lasera 1,4 mW, co daje łączny czas akwizycji 0,5 -3 min.
      UWAGA: Upewnij się, że szybkość akwizycji jest odpowiednio wyskalowana do prędkości poruszających się włókien. Ważną kwestią przed zebraniem danych do wykorzystania w programach śledzących jest liczba klatek na sekundę podczas akwizycji. Ruchy subpikseli między klatkami spowodują przeszacowanie prędkości, a do uzyskania dokładnych wartości wymagane są ruchy rzędu kilkuset nanometrów. Optymalna szybkość akwizycji obejmuje ślizganie się aktyny przez co najmniej jeden piksel odległości między klatkami. W przypadku mikroskopu TIRF użytego do obrazowania tutaj próg ten przekłada się na 130 nm; W związku z tym, miozyna, która ma przemieszczać się z prędkością 1 μm/s, musi być obrazowana z szybkością 5 klatek/s (interwał 0,2 s), aby osiągnąć 200 nm ruchu, podczas gdy miozyna, która ma przemieszczać się z prędkością 10 nm/s, wymaga 0,05 klatki/s (odstępy 20 s). W związku z tym na tym etapie dane mogą być próbkowane w dół, jeśli to konieczne (więcej szczegółów można znaleźć w Dyskusji).

3. Test TIRF dla pojedynczej cząsteczki

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
    1. Podzielić podstawowy proszek na 10 mg podwielokrotności (w probówkach 1,5 ml) metoksy-Peg-silanu (mPEG) i 10 mg podwielokrotności biotyny-Peg-silanu (bPEG). Przechowywać w temperaturze -20 °C w szczelnym, odtłuszczonym pojemniku i zużyć w ciągu 6 miesięcy.
    2. Załaduj osiem kwadratowych szkiełek nakrywkowych nr 1,5 H (wysoka precyzja) o grubości 22 mm na stojak i umyj 2-5 ml 200-procentowego etanolu, a następnie 2-5 ml wody destylowanej. Powtórz ten krok prania, kończąc na wodzie. Następnie całkowicie wysusz szkiełka nakrywkowe za pomocą przewodu powietrznego lub N2 i wyczyść plazmowo argonem przez 3 minuty.
    3. Umieścić czyste szkiełka nakrywkowe na bibule filtracyjnej (90 mm) w naczyniu do hodowli tkankowych (100 x 20 mm) i inkubować w piecu o temperaturze 70 °C, wykonując następujące czynności.
      UWAGA: Czyszczenie plazmowe można zastąpić innymi metodami czyszczenia chemicznego49.
    4. Przygotować 80% roztwór etanolu zdH2O i dostosować pH do 2,0 za pomocą HCl. Dodać 1 ml tego roztworu do 10 mg podwielokrotności mPEG i 1 ml do 10 mg podwielokrotności bPEG. Wir do rozpuszczenia, który nie powinien trwać dłużej niż 30 s.
    5. Weź 100 μl roztworu bPEG i dodaj 900 μl 80% etanolu (pH 2,0). Ten roztwór to 1 mg/ml bPEG. Następnie przygotuj roztwór obu PEG-ów w następujący sposób, dokładnie mieszając.
      1. 200 μL 10 mg/ml mPEG (stężenie końcowe: 2 mg/mL).
      2. 10 μl 1 mg/ml bPEG (stężenie końcowe: 10 μg/ml).
      3. 790 μl 80% roztworu etanolu (pH 2,0).
    6. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z piekarnika. Ostrożnie dozować 100 μl roztworu PEG na środek każdego szkiełka nakrywkowego, upewniając się, że mokra jest tylko górna powierzchnia. Następnie włóż zrazy z powrotem do piekarnika i inkubuj przez 20 do 30 minut.
    7. Kiedy szkiełka nakrywkowe zaczną nabierać dziurawego wyglądu, z małymi kółkami widocznymi na powierzchni, wyjmij je z piekarnika.
    8. Umyj każde szkiełko nakrywkowe 100% etanolem, osusz przewodem powietrznym i włóż z powrotem do piekarnika. Inkubować tylko przez czas wymagany do stworzenia komór w kroku 2.
  2. Przygotowanie komory
    1. Wyczyść szkiełko mikroskopowe do użycia w komorze . Wytnij dwa kawałki taśmy dwustronnej o długości około 2 cm.
    2. Umieść jeden kawałek wzdłuż środka dłuższej krawędzi szkiełka mikroskopowego. Upewnij się, że krawędź taśmy jest wyrównana z krawędzią suwaka. Umieść drugi kawałek taśmy około 2 mm poniżej pierwszego kawałka taśmy, tak aby oba były równoległe i wyrównane.
    3. Weź z pieca jedno z funkcjonalnych szkiełek nakrywkowych (utworzonych w ppkt 3.1). Ostrożnie przyklej szkiełko nakrywkowe do taśmy tak, aby strona pokryta PEG była skierowana w dół i stykała się bezpośrednio z taśmą, jak pokazano na Rysunek 1. Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij złącze taśmy ślizgowej, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe prawidłowo przylega do szkiełka.
    4. Odetnij nadmiar taśmy zwisającej nad zjeżdżalnią za pomocą żyletki. Komory te mogą być używane natychmiast lub umieszczone parami w probówce o pojemności 50 ml i przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Ważne jest, aby przechowywać natychmiast , w przeciwnym razie powierzchnia ulegnie degradacji.
  3. Wykonanie testu mikroskopowego miozyny 5a TIRF
    1. Przygotować roztwory do testu odwróconej ruchliwości miozyny 5a opisanego w Tabeli 3 i trzymać je na lodzie.
    2. Umyj komorę 10 μl 50 mM MB za pomocą 1 mM DTT.
    3. Przepływ w 10 μl 1 mg/ml BSA w 50 mM MB z 1 mM DTT. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibuły lub bibuły filtracyjnej, aby przesączyć roztwór przez kanał.
    4. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    5. Przepłynąć 10 μL roztworu NeutrAwidin w 50 mM MB z 1 mM DTT i odczekać 1 min.
    6. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    7. Przelej 10 μL biotynylowanej aktyny rodaminy (bRh-aktyny) zawierającej 1 mM DTT w 50 mM MB i odczekaj 1 min. Na tym etapie należy użyć końcówki do pipet o dużym otworze i unikać pipetowania w górę i w dół, aby zminimalizować ścinanie fluorescencyjnych włókien aktynowych, aby zapewnić możliwość przymocowania długich włókien aktynowych do powierzchni (20-30 μm lub więcej). Skuteczną alternatywą jest przecięcie stożka standardowej końcówki pipety (o otworze ≈1-1,5 mm).
    8. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    9. Przelej 30 μl końcowego buforu z dodaną miozyną 5a 10 nM, a następnie natychmiast załaduj do mikroskopu TIRF i zapisz po znalezieniu optymalnej ostrości dla metody obrazowania TIRF. Czasy ekspozycji między 100-200 ms są odpowiednie przy mocy lasera 1,4 mW dla aktyny i miozyny znakowanej GFP. Odpowiedni czas akwizycji do analizy prędkości to 3 min.
  4. Wykonanie testu mikroskopowego TIRF miozyny niemięśniowej 2b
    UWAGA: W tej sekcji przedstawiono szczegóły testu TIRF miozyny 2b bez mięśni przy użyciu spolimeryzowanych i fosforylowanych włókien. Dołączony jest szczegółowy protokół (sekcje 4.1-4.3) fosforylacji i polimeryzacji niemięśniowej miozyny-2b w probówce.
    1. Aby fosforylować oczyszczony NM2b, należy przygotować 10-krotną mieszankę kinaz w następujących warunkach: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK i 0,1 mM ATP. Można go zwiększyć do głośności za pomocą 500 mM MB za pomocą 10 mM DTT. Dodaj 10-krotną mieszankę kinaz do miozyny w stosunku objętościowym 1:10 i pozostaw do inkubacji przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj stężenie miozyny na tym etapie wynosi 1 μM.
    2. Aby spolimeryzować ufosforylowaną miozynę we włókna, należy obniżyć stężenie soli NM2b do 150 mM NaCl. Aby to zrobić, utwórz 1x bufor ruchliwości (1x MB) bez soli, rozcieńczając 4x MB czterokrotnie w dH2O. Ten 1x MB może być użyty do obniżenia stężenia soli, ponieważ NM2b został zamrożony w buforze soli o pojemności 500 mM.
    3. Na każde 3 μl podstawowego NM2b dodaj 7 μl 1x MB, aby obniżyć stężenie soli do 150 mM NaCl i inkubuj na lodzie przez 20-30 minut, aby utworzyć włókna NM2b.
      UWAGA: Kolejność w sekcjach 4.1-4.3 nie jest kluczowa, o ile NM2b jest fosforylowany, a końcowe stężenie soli wynosi 150 mM. Inkubacja rzędu 30 min-1 h daje wystarczająco dużo czasu na pełną fosforylację i polimeryzację.
    4. Przygotować roztwory do testu odwróconej ruchliwości niemięśniowej miozyny 2b opisanego w Tabeli 3 i przechowywać je na lodzie.
    5. Umyj komorę 10 μl 150 mM MB za pomocą 1 mM DTT.
    6. Przepływ w 10 μl 1 mg/ml BSA w 150 mM MB z 1 mM DTT Powtórz to pranie jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibuły lub bibuły filtracyjnej, aby przesączyć roztwór przez kanał.
    7. Umyć 10 μl 150 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    8. Przepłynąć 10 μl roztworu NeutrAwidyny w 150 mM MB z 1 mM DTT i odczekać 1 min.
    9. Umyć 10 μl 150 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    10. Wlej 10 μl bRh-aktyny i odczekaj 1 minutę. Na tym etapie należy użyć końcówki do pipet o dużym otworze i unikać pipetowania w górę i w dół, aby zminimalizować ścinanie fluorescencyjnych włókien aktynowych, aby zapewnić możliwość przymocowania długich włókien aktynowych do powierzchni (20-30 μm lub więcej). Skuteczną alternatywą jest przecięcie stożka standardowej końcówki pipety.
    11. Umyć 10 μl 150 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    12. Wlej 10 μl roztworu miozyny 2b (około 30 nM) i odczekaj 1 minutę.
    13. Umyć 10 μL 150 MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    14. Wlej 30 μl końcowego buforu, a następnie natychmiast załaduj do mikroskopu TIRF i zapisz po znalezieniu optymalnej ostrości dla metody obrazowania TIRF. Czasy ekspozycji między 100-200 ms są odpowiednie przy mocy lasera 1,4 mW dla aktyny i miozyny znakowanej GFP. Odpowiedni czas akwizycji do analizy prędkości to 3 min.

4. Analiza obrazu

  1. Analiza obrazu do oznaczania ślizgowego filamentu aktynowego
    UWAGA: Obrazy można analizować za pomocą oprogramowania i instrukcji obsługi, do których linki znajdują się na liście materiałów. Ważne jest, aby pamiętać, że opisany tutaj program wymaga stosów TIFF do analizy. Proces analizy testu ślizgowego filamentu aktynowego jest następujący50.
    1. Prześlij nieprzetworzone stosy filmów do określonej struktury folderów i wprowadź do programu najwyższy katalog folderów z filmami.
      UWAGA: Program analizuje pliki w tym katalogu i podkatalogach, traktując katalogi najniższego poziomu jako replikacje. Zostaną opracowane średnie statystyki dla każdej grupy powtórzeń. W tym przypadku użyto jednego filmu dla każdej miozyny. Podczas charakteryzowania nowej miozyny lub badania nowego stanu eksperymentalnego zaleca się analizę filmów z trzech pól widzenia (FOV) na komorę, co daje w sumie trzy komory i powtórzenie tego przepływu pracy dla trzech preparatów badanej miozyny.
    2. Użyj skryptu "stack2tifs" w połączeniu z liczbą klatek na sekundę wprowadzoną przez użytkownika, aby przekonwertować każdy stos TIFF na folder zawierający serię pojedynczych plików TIFF i odpowiadający mu plik metadata.txt zawierający czas rozpoczęcia każdej klatki. W przypadku danych, które nie są w formacie stosu TIFF, należy najpierw przeprowadzić konwersję za pomocą oprogramowania, takiego jak wymienione w Tabeli materiałów.
      UWAGA: Ten skrypt jest częścią pakietu oprogramowania. Informacje o skrypcie można znaleźć tutaj: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Użyj parametru -px, który jest rozmiarem piksela (w nm) podczas akwizycji. W tym przypadku rozmiar piksela wynosi 130 nm. Użyj parametrów -xmax i -ymax do skalowania osi dla danych wyjściowych wykresu punktowego. Odpowiadają one najdłuższej długości wykreślanego włókna i maksymalnej prędkości wykreślanej (w nm/s).
      UWAGA: Są to wartości szacunkowe i można je ustawić na wartości wyższe niż oczekiwane, aby zapewnić zawarcie danych na wykresie. Po analizie surowe dane można również wyeksportować do wykorzystania w innym oprogramowaniu statystycznym lub graficznym do przeglądania i analizy.
    4. Użyj parametru -minv, który jest parametrem odcięcia prędkości minimalnej, aby zdefiniować włókna, które się nie poruszają i dlatego mogą być wyłączone z analizy. W przypadku powolnej miozyny, takiej jak NM2b, parametr ten musi być niski (w tym przykładzie 5 nm/s), aby uniknąć wycinania prawdziwych ruchów ślizgowych. W przypadku szybkiej miozyny, takiej jak M5a, parametr ten może być wyższy (w tym przykładzie 100 nm/s), aby zastosować bardziej rygorystyczny filtr, zachowując jednocześnie rzeczywisty rozkład prędkości poślizgu.
    5. Użyj parametru odcięcia -pt, aby zidentyfikować płynny ruch. Dla każdego okna próbkowania obliczana jest wartość odpowiadająca 100 x odchylenie standardowe prędkości/średnia prędkość. Tory o wyższych wartościach niż granica odcięcia, mają bardziej zmienne prędkości i są wyłączone z dalszej analizy. W tym przykładzie użyto wartości odcięcia 33. Tory o wyższych wartościach mają bardziej zmienne prędkości i są wyłączone z dalszej analizy.
    6. Użyj -maxd, aby ustawić maksymalną dozwoloną odległość połączenia między ramkami. Jest to obliczona odległość między klatkami przesunięta przez środek ciężkości żarnika w jednostkach nm. Może być przydatny do wykluczenia sporadycznych ruchów lub nieprawidłowego połączenia między włóknami. W poniższych przykładach parametr został pozostawiony na domyślnej wartości 2 000 nm.
  2. Analiza obrazu do testu mikroskopowego TIRF
    UWAGA: Proces analizy testu TIRF dla pojedynczej cząsteczki w oprogramowaniu do obrazowania wymienionym w Tabeli materiałów jest następujący29.
    1. Kliknij i przeciągnij nagrany film z mikroskopii do obszaru roboczego oprogramowania, aby go otworzyć51. Następnie podziel kanały pozyskiwania. Kliknij Obraz > Kolor > Podziel kanały.
      UWAGA: W przypadku znacznego dryfu stopnia podczas akwizycji, obrazy muszą być ustabilizowane w celu skorygowania dryfu instrumentalnego na płaszczyźnie obrazowania. W tym przypadku nie zastosowano kompensacji dryftu osi Z, ponieważ mikroskop użyty do uzyskania tych danych dobrze stabilizuje ognisko Z. Aby ustabilizować obraz w programie do analizy obrazu, zainstaluj odpowiednią wtyczkę stabilizatora, która jest podłączona do >listy materiałów. Stabilizator obrazu przyjmuje stałe pozycje obiektów na obrazie i używa średniej kroczącej poprzednich klatek jako odniesienia. Zalecaną procedurą jest zatem rozpoczęcie od kanału zawierającego obrazy znakowanej aktyny, ponieważ znajduje się on w ustalonej pozycji.
    2. Kliknij Wtyczki, a następnie znajdź Stabilizator obrazu; upewnij się, że wybrana jest opcja Tłumaczenie i zachowaj ustawienia domyślne. Zaznacz pole obok opcji Logarytmiczne współczynniki transformacji. Zastosowanie tego kroku Log umożliwia zastosowanie obliczonych parametrów przesunięcia do drugiego kanału w następnym kroku. Poczekaj, aż proces się zakończy.
    3. Następnie otwórz kanał z oznaczoną miozyną i zastosuj stabilizację, klikając Wtyczki > Image Stabilizer Log Applier. Jeśli obrazy aktyny nie mogą być uzyskane podczas tej samej akwizycji ze względu na wymóg obrazowania z większą szybkością w jednym kanale, dryf ustabilizuj stos obrazów, wybierając region zawierający obiekty statyczne, takie jak biotynylowany marker fiducial lub fluorofory związane niespecyficznie z powierzchnią biotyny-PEG. Ten obszar może zostać przycięty z oryginalnego stosu i ustabilizowany, a następnie zastosowany wynikowy wartość przesunięcia do oryginalnego stosu.
      UWAGA: W praktyce dryft obserwowany w eksperymentach z ruchliwością będzie znikomy w stosunku do ruchu miozyny, które poruszają się z prędkością kilkuset nm/s, ale dla najwolniejszych miozyn staje się to ważnym czynnikiem.
    4. Następnie otwórz TrackMate, kliknij Wtyczki, a następnie w menu rozwijanym kliknij Śledzenie, a na końcu TrackMate. W tym momencie analiza obrazu podlega optymalizacji w oparciu o parametry fluoroforu i warunki testu. Jednak idealne parametry wyjściowe są następujące.
      1. Ustawienia kalibracji: zachowaj wszystkie wartości domyślne.
      2. Detektor: Detektor LoG.
      3. Szacowana średnica plamki: 0,5-1,0 mikrona.
      4. Próg: 25-200. (Można to ustalić, klikając Podgląd po wybraniu liczby, aby sprawdzić, czy wykryte miejsca pasują do filmu i odpowiednio dostosować.)
      5. Progowanie początkowe: nie ustawione.
      6. Widok: HyperStack Displayer.
      7. Ustaw filtry w miejscach: nie ustawione.
      8. Tracker: Prosty tracker okrążeń.
        UWAGA: Zależą one od liczby klatek na sekundę i prędkości miozyny i muszą być wystarczająco duże, aby połączyć kolejne pozycje, wykluczając niepożądane połączenia między różnymi cząstkami.
      9. Maksymalna odległość łączenia: 1,0 mikrona.
      10. Maksymalna odległość zamykania szczeliny: 1,0 mikrona.
      11. Maksymalny odstęp między ramkami zamykający lukę: 1.
      12. Ustaw filtry na ścieżkach: Przemieszczenie ścieżki (>0,39 piksela, aby uwzględnić tylko punkty poruszające się o więcej niż 3 piksele), Miejsca na ścieżkach (>3 – aby uwzględnić tylko ścieżki z co najmniej 3 punktami). Inne filtry, takie jak Minimalna prędkość, mogą zostać wprowadzone, aby wykluczyć miejsca, które zatrzymują się przez długi czas. Wyniki filtrowania muszą być sprawdzone poprzez oględziny ścieżek w celu zapewnienia, że fałszywe ścieżki (tj. ruch miozyny w tle, który nie znajduje się wzdłuż ścieżki aktyny) są usuwane przy zachowaniu ścieżek związanych z aktyną.
    5. Gdy pojawi się ekran Opcje wyświetlania, kliknij Analiza, aby uzyskać odpowiednie wyniki. Zapisz trzy utworzone tabele (Statystyki ścieżek, Łącza w statystykach śledzenia i Miejsca w statystykach ścieżek). Tabela Track Statistics będzie zawierać dane dotyczące prędkości i przemieszczenia, które mogą być następnie analizowane w celu scharakteryzowania nowego białka lub skutków określonego warunku eksperymentalnego, na przykład.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie miozyny można ocenić, wykonując redukującą elektroforezę żelową z użyciem dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu (SDS-PAGE), jak pokazano w Rysunek 2. Podczas gdy liczba ta reprezentuje końcową, podializowaną miozynę, SDS-PAGE można wykonać na podwielokrotnościach z różnych etapów procedury oczyszczania w celu zidentyfikowania wszelkich produktów utraconych przez supernatant. Miozyna 5a HMM ma pasmo w zakresie 120-130 kDa, a pełnowymiarowa miozyna niemięśniowa 2b ma pasmo w zakresie 200...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj przebieg oczyszczania i charakterystyki in vitro miozyny 5a i miozyny 2b bez mięśni. Ten zestaw eksperymentów jest przydatny do ilościowego określania właściwości mechanochemicznych oczyszczonych konstruktów miozyny w szybki i powtarzalny sposób. Chociaż pokazane tutaj dwie miozyny to tylko dwa konkretne przykłady z wielu możliwości, warunki i techniki mogą być zastosowane, z pewnym dostosowaniem, do większości miozyn i wielu innych białek motorycznych.

Omawiane tutaj proto...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Fang Zhangowi za pomoc techniczną w przygotowaniu odczynników używanych do zbierania tych danych. Praca ta była wspierana przez fundusze NHLBI/NIH Intramural Research Program HL001786 J.R.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL StrzykawkaBD309628
2 M CaCl2 SolutionVWR10128-558
2 M MgCl2 SolutionIgła miernika VWR10128-298
27Becton Dickinson309623
5 M roztwór NaClKD MedicalRGE-3270
kwas octowyThermoFisher Scientific984303
Amyl AcetateLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATPMillipore SigmaA7699
Biotynylowana G-aktynaCytoskeleton, Inc.AB07
Albumina surowicy bydlęcejMillipore Sigma5470
bPEG-silanLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Koncentrat odczynnikaBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatlazaeMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) w SF-900 II SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Lab - Test ślizgowyMillipore SigmaWHA1001125
Circular Filter Paper - Odwrócony testMillipore SigmaWHA1001090
cOmpete, wolne od EDTA tabletki z inhibitorem proteazyMillipore Sigma5056489001Należy go przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Tabletki mogą być używane bezpośrednio lub mogą być rozpuszczone w postaci 25-krotnego roztworu podstawowego, rozpuszczając 1 tabletkę w 2 ml wody destylowanej. Otrzymany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez 1-2 tygodnie lub co najmniej 12 tygodni w temperaturze -20 stopni C.
Concentrating Tubes (100 000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024MWCO probówki niekoniecznie jest "uniwersalny", o ile MWCO jest mniejsze niż całkowita masa cząsteczkowa oczyszczanego białka. NM2b w tym przypadku został skoncentrowany za pomocą lampy o mocy 100 000 MWCO, a M5a został skoncentrowany za pomocą lampy o mocy 30 000 MWCO.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
strong>Coverslips: Test włókien ślizgowychVWR International48366-227
Szkiełka nakrywkowe: Test odwróconej ruchliwości Azer ScientificES0107052
(3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5A Średnicarurki do dializy może się różnić, ale MWCO powinno być takie samo. Zastosowany w tym artykule NM2b był dializowany w rurze dializacyjnej o średnicy 18 mm. Probówki można przechowywać w 20% roztworze alkoholu w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Dwustronna taśmaOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptydGenScriptRP10586Można go rozpuścić w buforze zawierającym 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3 i 10 mM MOPS (pH 7,2) do końcowego stężenia 50 mg/ml. Można to zapisać w temperaturze -20 ° C jak 300 &mikro; Porcje L. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Kolumna elucyjnaBio-Rad761-1550Można je ponownie wykorzystać. Aby wyczyścić, przepłucz kolumnę 2-3 objętościami PBS i wodą destylowaną. Schłodzić kolumnę w temperaturze 4° C przed użyciem.
EtanolFischer ScientificA4094
G-actinPMID: 4254541zapas G-aktyny może być przechowywany w temperaturze 200 μ; M w cieczy N2.
GlukozeMillipore SigmaG8270
Oksydaza glukozowaMillipore SigmaG2133
Roztwór buforowy glicyny, 100 mM, pH 2-2,5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Końcówki do pipet z dużym otworemFischer Scientific02-707-134
Inhibitor proteazy leupeptynyThermoFisher Scientific78435
Mark12 Niebarwiona drabina standardowaThermoFisher ScientificLC5677
metanolowaMillipore SigmaMX0482
MetylocelulozaMillipore SigmaM0512
Szkiełka mikroskopoweFischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
miozynowa kinaza łańcucha lekkiegoPMID: MLCK 23148220znakowany FLAGA może być oczyszczany w taki sam sposób, w jaki myozyna znakowana FLAGA została oczyszczona w niniejszym dokumencie. 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelulozaLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 do 12% Bis-Tris Mini żel białkowy, 15-dołkowyThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF może być wytwarzany jako 0,1 M roztwór podstawowy w izopropanolu i przechowywany w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodanie izopropanolu powoduje wytrącanie się kryształów, które można rozpuścić przez mieszanie w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem PMSF można dodawać kroplami do szybko mieszającego roztworu do końcowego stężenia 0,1 mM.
Razor BladesOffice Depot397492
Rhodamine-PhalloidinThermoFisher ScientificR415Stock można rozcieńczyć w 100% metanolu do końcowego stężenia 200 μM.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027Należy go przechowywać w temperaturze 4& stopni C. Jego okres trwałości wynosi 18 miesięcy od daty produkcji.
Tissue Culture Dish - Gliding AssayCorning353025Każda szalka do hodowli tkankowej może pomieścić około dziewięciu szkiełek nakrywkowych.
Tissue Culture Dish - Inverted AssayCorning353003Każda szalka do hodowli tkankowej może pomieścić około czterech szkiełek nakrywkowych.
Gładki bok 200 & mikro; L Końcówki do pipetThomas Scientific1158U38
SPRZĘT
WirówkaThermoFisher Scientific75006590
mikroskopNikonModel: Eclipse Ti z systemem H-TIRF z obiektywem TIRF 100x (brak danych 1,49)
Kamera mikroskopowa< / silna>AndorModel: Kamera iXon DU888 EMCCD (format czujnika 1024 x 1024)
< silna>Mikroskopowa skrzynka kontroli środowiska< / mocna>Tokai HITNiestandardowy termobox
Jednostka laserowa mikroskopu< / mocna>Czteroczęściowa jednostka laserowa Nikon LU-n4 z laserami półprzewodnikowymi do 405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm
Mid Wirówka stołowaThermoFisherModel naukowy: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-Xp Ultrawirówka stołowaBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem Typ: Sonda Zepto
Sonicator (3,2 mm)Qsonica4418
Standard InkubatorBinderModel: 56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads<
strong>FAST (wersja 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST jest dostępny dla systemów Mac OSX i Linux.
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
Imaging SoftwareNIS Elements (pakiet AR)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
< Rurka do dializy File:TrackMate-manual.pdf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myosin Motility AssaysFluorescence MicroscopyGliding Actin FilamentInverted Motility AssayNonmuscle Myosin 2bMyosin 5a PurificationActin Filament TrackingSingle Molecule DynamicsTotal Internal ReflectionAffinity Chromatography

Related Articles