Badanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy

Podsumowanie

Ten przepływ pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia testów wrażliwości na antybiotyki przy użyciu ustalonego modelu ex vivo biofilmu bakteryjnego w płucach osób z mukowiscydozą. Zastosowanie tego modelu może zwiększyć ważność kliniczną testów MBEC (minimalne stężenie eradykacji biofilmu).

Streszczenie

Skuteczne przepisywanie antybiotyków na biofilmy bakteryjne obecne w płucach osób z mukowiscydozą (CF) jest ograniczone przez słabą korelację między wynikami testów wrażliwości na antybiotyki (AST) przy użyciu standardowych metod diagnostycznych (np. mikrorozcieńczenie bulionu, dyfuzja dysku lub Etest) a wynikami klinicznymi po leczeniu antybiotykami. Próby poprawy AspAT poprzez zastosowanie gotowych platform wzrostu biofilmu wykazują niewielką poprawę wyników. Ograniczona zdolność systemów biofilmu in vitro do naśladowania środowiska fizykochemicznego płuc z mukowiscydozą, a tym samym fizjologii bakterii i architektury biofilmu, również hamuje odkrywanie nowych metod leczenia zakażenia mukowiscydozą. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania AspAT patogenów mukowiscydozy wyhodowanych jako dojrzałe, podobne do in vivo biofilmy w modelu płuc ex vivo CF składającym się z tkanki oskrzelików świni i syntetycznej plwociny CF (płuca świni ex vivo, EVPL).

Istnieje kilka testów in vitro do testowania podatności biofilmu, przy użyciu standardowego podłoża laboratoryjnego lub różnych preparatów syntetycznej plwociny CF na płytkach do mikromiareczkowania. Zarówno pożywka wzrostowa, jak i podłoże biofilmu (płytka polistyrenowa vs. tkanka oskrzelowa) mogą wpływać na tolerancję biofilmu na antybiotyki. Wykazujemy zwiększoną tolerancję klinicznych izolatów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w modelu ex vivo; efekty antybiotykoterapii biofilmów nie są skorelowane z minimalnym stężeniem hamującym (MIC) w standardowych testach mikrorozcieńczenia lub klasyfikacją czułą/oporną w testach dyfuzji krążkowej.

Platforma ex vivo mogłaby być wykorzystana do indywidualnego badania AST biofilmu próbek pacjentów oraz jako ulepszona platforma testowa dla potencjalnych środków przeciwbiofilmowych podczas badań i rozwoju farmaceutycznego. Poprawa przepisywania lub przyspieszanie procesu odkrywania leków przeciwbiofilmowych poprzez wykorzystanie większej liczby platform testowych podobnych do badań in vivo może radykalnie poprawić wyniki zdrowotne osób z mukowiscydozą, a także obniżyć koszty leczenia klinicznego i badań odkrywczych.

Wprowadzenie

Przewlekłe infekcje biofilmu dotykają osoby, których normalna obrona immunologiczna jest zagrożona. Do grup ryzyka należą osoby z chorobą genetyczną mukowiscydozy (CF)¹. Kolonizacja nienormalnie gęstego, adhezyjnego śluzu w drogach oddechowych we wczesnym okresie niemowlęctwa prowadzi do trudnych do opanowania infekcji biofilmem oskrzelików^2,3. Wzrost bakterii w postaci rozległych biofilmów otoczonych matrycą jest jednym z czynników, który odróżnia przewlekłe infekcje osób z obniżoną odpornością od ostrych infekcji zdrowych gospodarzy, a stan biofilmu zarówno chroni bakterie przed ekspozycją na antybiotyki (ze względu na zmniejszoną dyfuzję przez matrycę), jak i zmniejsza ich podatność na antybiotyki (np. poprzez indukcję spoczynku lub regulację w górę pomp wypływowych)^{4, 5}. Jednak specyficzne dla choroby zmiany w fizjologii i chemii tkanek gospodarza dodatkowo zmieniają fizjologię bakterii w porównaniu z obserwowaną w ostrych infekcjach lub w standardowych warunkach wzrostu laboratoryjnego. Kluczowymi przykładami w mukowiscydozie są wykorzystanie nietypowych źródeł węgla, takich jak kwasy tłuszczowe i aminokwasy uwalniane z środków powierzchniowo czynnych płuc i wytwarzane w wyniku mikrobiologicznej degradacji mucyny, uwalnianie mikroelementów, takich jak żelazo z uszkodzonych tkanek, oraz mikroaerobioza^6,7,8.

Specyficzne warunki fizykochemiczne w konkretnym kontekście infekcji biofilmem mogą zatem wpływać na reakcje na antybiotyki. Po pierwsze, struktura i głębokość macierzy zewnątrzkomórkowej zależy od lokalnych warunków środowiskowych, takich jak składniki odżywcze lub siły ścinające. Po drugie, sygnały środowiskowe mogą wyzwalać ekspresję określonych genów oporności na antybiotyki. Na przykład patogen mukowiscydozy Pseudomonas aeruginosa wykazuje zwiększoną ekspresję beta-laktamazy i zmniejszoną ekspresję porin w plwocinie mukowiscydozy w porównaniu z in vitro⁹, podczas gdy inny patogen mukowiscydozy, Burkholderia cenocepacia, zwiększa poziom beta-laktamaz i pomp wypływowych, gdy rośnie w plwocinie mukowiscydozy¹⁰. Po trzecie, warunki panujące w organizmie gospodarza mogą wskazywać na fizjologiczne lub genetyczne przejście na fenotypy tolerujące antybiotyki, które są trudne do odtworzenia in vitro. Należą do nich małe warianty kolonii patogenu mukowiscydozy Staphylococcus aureus^11,12.

Wszystkie te dane wskazują, że gdy laboratoria diagnostyczne izolują pojedyncze klony z patogennego biofilmu i przeprowadzają AST na kulturach hodowanych na planktonie lub płytkach agarowych w standardowych pożywkach laboratoryjnych (mikrorozcieńczenie bulionu, dyfuzja krążkowa lub Etest), wyniki często nie przewidują, które antybiotyki faktycznie zadziałają in vivo. Nawet jeśli stosuje się testy biofilmu in vitro, mogą one nie wskazywać na fenotyp podobny do biofilmu in vivo ze względu na różnice w użytej pożywce i powierzchni przyłączenia, więc testy z wykorzystaniem komórek przepływowych lub wysokoprzepustowych platform mikropłytek mogą przeszacować wrażliwość na antybiotyki¹³. Ten sam problem dotyczy naukowców ze środowisk akademickich i przemysłu, którzy chcą opracować nowe środki przeciw biofilmowi: testowanie potencjału leków przy użyciu platform in vitro, takich jak komórki przepływowe, płytki mikromiareczkowe lub reaktory biofilmu Centrum Kontroli Chorób może ustawić poprzeczkę skuteczności biofilmu zbyt nisko i dać fałszywie dodatnie wyniki w procesie badawczo-rozwojowym.

Słaba korelacja między wynikami AST a wynikami klinicznymi po leczeniu antybiotykami w mukowiscydozie jest dobrze znana. Wielu klinicystów po prostu ignoruje laboratoryjne badanie AspAT, ponieważ nie ma jednolitych, specyficznych dla mukowiscydozy wytycznych dotyczących interpretacji tych wyników, a zamiast tego podejmuje indywidualne decyzje dotyczące przepisywania leków. Podjęto próby poprawy CF AST za pomocą urządzenia do biofilmu z Calgary, które wykorzystuje biofilmy wyhodowane na powierzchni plastikowych kołków osadzonych w dołkach mikropłytki zawierającej standardowe podłoże AST (np. bulion Mullera-Hintona z regulacją kationów)^14,15. Ten test nie radzi sobie lepiej z przewidywaniem, które antybiotyki będą działać in vivo, niż standardowe planktonowe AST¹⁶. Wpływ na pacjentów z mukowiscydozą jest wyraźny. Pomimo wielokrotnego podawania antybiotyków (regularne antybiotyki wziewne i mediana 27 dni/rok otrzymujących dożylnie antybiotyki dla osób z mukowiscydozą w Wielkiej Brytanii)^17, częste i nieprzewidywalne epizody ostrego zaostrzenia płuc prowadzą do postępującego uszkodzenia płuc i, w około 90% przypadków, do zgonu z powodu niewydolności oddechowej. W niedawnej analizie bakteryjne zakażenie płuc było najsilniejszym czynnikiem prognostycznym kosztów leków w mukowiscydozie, dodając średnio 3,6 tys. €/pacjenta/rok do bezpośrednich kosztów opieki zdrowotnej^18,19.

Dla ostrych infekcji zdrowych osób, obecne badania i polityka skupiające się na szybkim AST na podstawie, na przykład, przewidywania genomu w miejscu opieki nad pacjentem są idealne²⁰. Jednak w przypadku przewlekłych zakażeń mukowiscydozą oczywiste jest, że potrzebne jest inne podejście: wdrożenie AST w modelach naśladujących gospodarza, które lepiej odwzorowują środowisko in vivo i stan metaboliczny patogenu oraz pozwalają na tworzenie realistycznej struktury biofilmu.

Wcześniej opracowaliśmy model biofilmu mukowiscydozy, który składa się z odcinków oskrzelików świń inkubowanych w syntetycznej plwocinie CF i zakażonych P. aeruginosa lub S. aureus. Niezakażony EVPL zachowuje normalną histopatologię przez 7 dni, ale laboratoryjne lub kliniczne izolaty P. aeruginosa i S. aureus odtwarzalnie tworzą wokół tkanki agregaty podobne do vivo, naśladując etiologię zakażenia mukowiscydozą^21,22,23. Przedstawiamy protokół wykorzystania tego modelu o wysokiej trafności i przepustowości jako dostosowanej platformy AST do biofilmu dla mukowiscydozy i przedstawiamy przykładowe wyniki pokazujące wysoką tolerancję biofilmów patogenów na klinicznie stosowane antybiotyki podczas hodowli w modelu. Model ten może być z łatwością włączony do prac badawczo-rozwojowych w zakresie zarządzania lub zapobiegania tworzeniu się biofilmu, a potencjalnie także do diagnostyki AST. Większość używanego sprzętu (patrz Tabela materiałów) można łatwo znaleźć w typowym laboratorium mikrobiologicznym, chociaż trzepaczka do koralików jest niezbędna, a dzięki pracy ze współpracownikami stwierdziliśmy, że może być również konieczne zaopatrzenie się w odpowiednią szafkę bakteriobójczą w ultrafiolecie. Ponieważ płuca pochodzą z komercyjnych rzeźni lub rzeźni, model ten nie budzi żadnych obaw etycznych.

Protokół

Ten protokół wykorzystuje płuca świń pochodzące z komercyjnej rzeźni, która dostarcza mięso do spożycia przez ludzi. Zgodnie z ustawodawstwem brytyjskim wykorzystanie resztek tkanek ze zwierząt poddanych ubojowi na mięso nie wymaga zgody etycznej; Radzimy czytelnikom, aby przed rozpoczęciem pracy zapoznali się z odpowiednimi lokalnymi przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie syntetycznych pożywek do plwociny CF (SCFM)

1. Aby przygotować SCFM do użytku z tkanką EVPL, postępuj zgodnie z przepisem opisanym przez Palmera i wsp.²⁴ z modyfikacją polegającą na usunięciu glukozy z przepisu.
   UWAGA: Receptura Palmera i wsp. zawiera wolne aminokwasy, kationy, aniony i mleczan w stężeniach reprezentatywnych dla średnich stężeń stwierdzonych w wybranych próbkach plwociny od pacjentów z mukowiscydozą. Wykazano, że wskazuje na porównywalne szlaki zużycia węgla i ekspresję sygnałów quorum sensing przez P. aeruginosa PA14 do wzrostu w pożywce wykonanej z liofilizowanej plwociny pacjenta²⁴. Przepis na 1 l zmodyfikowanego SCFM znajduje się w tabeli S1.
2. Filtr wysterylizować SCFM natychmiast po przygotowaniu i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

2. Sekcja i zakażenie tkanki płuc świni ex vivo (EVPL)

1. Przed preparacją należy przygotować płytkę agarową z wymaganym szczepem lub szczepami bakteryjnymi do infekcji przy użyciu dowolnego agaru, który jest standardem w laboratorium dla P. aeruginosa/S. aureus (np. bulion lizogeniczny + 1,2% agar
).
2. Oblicz, ile fragmentów tkanki oskrzelików świń jest potrzebnych do eksperymentu, w tym niezakażonych fragmentów tkanki kontrolnej. Pomnóż tę liczbę przez dwa, aby powtórzyć eksperyment w dwóch powtórzonych płucach, aby potwierdzić powtarzalność wyników.
3. Pomnóż całkowitą liczbę wymaganych fragmentów tkanek przez 0,5, aby określić objętość agarozy SCFM (ml) potrzebną do przygotowania wacików agarozowych, aby uzyskać wystarczającą ilość podłoża na 400 μl / kawałek tkanki plus zapasowy agar SCFM, aby uwzględnić wszelkie błędy pipetowania lub parowanie podczas przygotowania.
4. Dodać 0,12 g agarozy do każdych 15 ml SCFM wymaganych do uzyskania pożądanej całkowitej objętości SCFM z 0,8% wagowo-objętościowej agarozy.
5. Podgrzewać roztwór agarozy SCFM, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Zalecana jest domowa kuchenka mikrofalowa o małej mocy. Wymagany czas zależy od mocy kuchenki mikrofalowej. Pozwól agarozie ostygnąć do około 50 °C (ciepła w dotyku, ale wygodna w trzymaniu). Nie dopuścić do dalszego ostygnięcia.
6. Za pomocą pipety dodać 400 μl agarozy SCFM do jednego dołka 24-dołkowej płytki na potrzebny kawałek tkanki.
7. Sterylizować 24-dołkową płytkę (płytki) zawierające agarozę SCFM w świetle ultrafioletowym przez 10 minut.
8. Przygotuj trzy powtórzone płukania dla każdego nienaruszonego płuca poddawanego sekcji, używając 20 ml sterylnego zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco oraz 20 ml sterylnego Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionego 50 μg/ml ampicyliny.
9. Wykonać porcję 40 ml SCFM jako końcowe płukanie dla każdego nienaruszonego płuca poddawanego sekcji. Wszystkie prania można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub natychmiast zużyć.
10. Płuca należy pozyskać z wyznaczonego źródła tak szybko, jak to możliwe po uboju, upewniając się, że są one przechowywane w niskiej temperaturze, transportując je do laboratorium w domowej lodówce.
    UWAGA: Płuca bliżej dnia uboju wykazują mniej siniaków po przechowywaniu, ale można również wykorzystać tkanki przechowywane w chłodni do 4 dni po uboju. Ponieważ lodówka musi zostać zabrana do sklepu mięsnego lub rzeźni, po każdym użyciu musi zostać odkażona zgodnie z lokalnymi wytycznymi laboratoryjnymi i przechowywana poza laboratorium mikrobiologicznym, gdy nie jest używana, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i naruszenia zabezpieczeń.
11. Pracując na wysterylizowanej powierzchni i pod płomieniem, umieść płuca na czystej plastikowej desce do krojenia pokrytej autoklawowaną folią aluminiową. Sprawdź, czy oskrzeliki pozostają nienaruszone. Jeśli doszło do jakiegokolwiek uszkodzenia w rzeźni lub podczas transportu, płuca nie nadają się do użytku.
12. Podgrzej szpachlówkę pod płomieniem i bardzo krótko przyłóż nóż do obszaru płuca otaczającego oskrzelik, aby wysterylizować powierzchnię tkanki.
13. Odetnij tkankę powierzchniową otaczającą oskrzelik za pomocą sterylnie zamontowanej żyletki. Wykonuj nacięcia równolegle do oskrzelików, aby zapobiec uszkodzeniom.
14. Po odsłonięciu oskrzelików wykonaj nacięcie przekroju poprzecznego przez oskrzelik w najwyższym widocznym punkcie, aby uwolnić oskrzelik.
15. Za pomocą sterylnych kleszczy lekko przytrzymaj wolny koniec oskrzelika i odetnij pozostałą niechcianą tkankę za pomocą sterylnie zamontowanej żyletki. Wykonaj ostatnie nacięcie w przekroju poprzecznym w poprzek oskrzelików, zanim widoczne będą jakiekolwiek rozgałęzienia, aby usunąć oskrzeliki z płuc.
16. Umieść oskrzelik w pierwszym płukaniu DMEM/RPMI 1640. Pozostawić oskrzelik w płuczce i powtórzyć kroki 2.11-2.14 w celu pobrania dodatkowych skrawków oskrzelików z tego samego płuca, zgodnie z wymaganiami w celu uzyskania wystarczającej ilości skrawków tkanki do planowanego doświadczenia.
17. Umieścić w płuczce wszelkie dodatkowe skrawki oskrzelików z tego samego płuca (krok 2.16). Pozostaw w praniu na co najmniej 2 minuty.
18. Usunąć oskrzeliki z pierwszego płukania DMEM/RPMI 1640 i umieścić próbki na sterylnej szalce Petriego.
19. Trzymaj lekko każde oskrzelik za pomocą sterylnych kleszczyków, uważając, aby nie uszkodzić tkanki. Usuń jak najwięcej pozostałej tkanki miękkiej i pokrój tkankę na paski o szerokości ~5 mm za pomocą sterylnych nożyczek do rozwarstwiania.
20. Umieść wszystkie paski tkanki oskrzelowej w drugim płukaniu DMEM/RPMI 1640. Pozostaw w praniu na co najmniej 2 minuty.
21. Usuń paski tkanek z drugiego mycia za pomocą sterylnych kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić tkanki. Umieść tkankę na czystej, sterylnej szalce Petriego.
22. Usuń pozostałą tkankę miękką przyczepioną do oskrzelików i pokrój paski na kwadraty (~5 mm x 5 mm) za pomocą sterylnych nożyczek do rozwarstwiania.
23. Dodaj trzecie płukanie DMEM/RPMI 1640 do szalki Petriego. Lekko wymieszaj kawałki chusteczki w praniu, obracając naczynie.
24. Wylej trzecie płukanie z szalki Petriego, nie usuwając kawałków tkanki.
25. Dodać końcowe płukanie SCFM do płytki Petriego zawierającej tkanki, upewniając się, że wszystkie kawałki tkanki są pokryte.
26. Sterylizuj kawałki tkanek w SCFM w świetle UV przez 5 minut.
27. Użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść każdy wysterylizowany fragment tkanki oskrzelikowej do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki / płytek zawierających płatki agarozowe SCFM.
28. Aby zainfekować każdy fragment tkanki pożądanym szczepem bakteryjnym, należy dotknąć kolonii wyhodowanej na płytce agarowej końcówką igły 29 G przymocowanej do sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml. Następnie dotknij kolonii na kawałku tkanki, delikatnie nakłuwając powierzchnię tkanki.
    UWAGA: Używanie strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę 29 G pozwala na dokładne i wygodne trzymanie igły przy jednoczesnym utrzymaniu palców w bezpiecznej odległości zarówno od igły, jak i tkanki płucnej. Możliwe jest wykonanie tego kroku przy użyciu igieł 29 G, które nie są przymocowane do strzykawki, ale wymaga to większej zręczności i zwiększa ryzyko zranienia igłą. Strzykawki insulinowe są łatwo dostępne.
29. W przypadku niezakażonych grup kontrolnych delikatnie nakłuć powierzchnię każdego z kawałków tkanki końcówką igły 29 G przymocowanej do sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml.
30. Użyj pipety, aby dodać 500 μl SCFM do każdego dołka.
31. Sterylizuj oddychającą membranę uszczelniającą dla każdej 24-dołkowej płytki w świetle ultrafioletowym przez 10 minut (tabela materiałów).
32. Zdejmij pokrywkę z 24-dołkowej płytki i zastąp ją oddychającą membraną.
33. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez żądany czas inkubacji (infekcji) bez wstrząsania. Sprawdzić, czy na niezakażonych próbkach kontrolnych nie ma widocznego wzrostu zaszczepionego patogenu (kontrola skażenia).
    UWAGA: W razie potrzeby ampicylinę można dodać do płatków agarozowych SCFM w kroku 2.5 i pokrywających SCFM w kroku 2.30 do końcowego stężenia 20 μg/ml. Spowoduje to zahamowanie wzrostu większości endogennych bakterii w płucach bez wpływu na wzrost P. aeruginosa lub S. aureus, ale ponieważ obecność ampicyliny może wpływać na wrażliwość na inne antybiotyki, czytelnik musi dokonać tego wyboru w zależności od szczepów i antybiotyków, które chce przetestować.

3. Określanie skuteczności antybiotyku

UWAGA: Schemat szczegółowo opisujący etapy tego testu znajduje się na rysunku S1.

1. Aby zmierzyć tolerancję na antybiotyki biofilmów utworzonych na EVPL, podczas sekcji i infekcji należy utworzyć powtórzone zestawy fragmentów płuc z co najmniej dwóch niezależnych płuc. Jeden zestaw sztuk jest wymagany do kontroli negatywnej (brak leczenia antybiotykami), a jeden zestaw jest wymagany dla każdego stężenia antybiotyku, który ma być badany.
2. Po 48 godzinach inkubacji należy dokonać oględzin niezakażonych fragmentów tkanki. Mógł dojść do pewnego wzrostu bakterii endogennych dla płuc świni, co spowodowało, że SCFM wokół tych odcinków był zmętniały. W przypadku zaobserwowania wzrostu typowego dla wybranego badanego gatunku (np. diagnostyka niebiesko-zielonej pigmentacji P. aeruginosa), należy wznowić eksperyment ze świeżymi płucami.
3. Jeśli niezakażone skrawki tkanek nie wykazują żadnego lub tylko minimalny wzrost bakterii, należy przygotować jedną 24-dołkową płytkę do mycia i jedną 24-dołkową płytkę zabiegową, z których każda zawiera 500 μl świeżego SCFM bez antybiotyków lub z antybiotykiem będącym przedmiotem zainteresowania na studzienkę na kawałek tkanki płucnej.
4. Usunąć każdy zakażony fragment tkanki z płytki inkubacyjnej za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczy, krótko zawirować w świeżym dołku płytki do płukania w celu usunięcia wszelkich komórek bakteryjnych niezwiązanych z biofilmem i przenieść do odpowiedniego dołka płytki zabiegowej.
5. Uszczelnij płytki zabiegowe świeżą, oddychającą membraną.
6. Inkubować płytkę/płytki zabiegowe w temperaturze 37 °C bez wytrząsania przez 18-24 godziny.
7. Za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczy wyjmij każdy fragment płuca z płytki 24-dołkowej i umieść w sterylnej probówce homogenizacyjnej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 1 g metalowych kulek (Tabela materiałów).
8. Bicie koralików przez 40 sekund z prędkością 4 m/s.
   UWAGA: Bicie kulek za pomocą określonych kulek i homogenizatora sugerowanych w Tabeli Materiałów nie powoduje znaczącej lizy bakterii, ale każde laboratorium korzystające z protokołu powinno sprawdzić działanie wybranych przez siebie kulek i homogenizatora przed rozpoczęciem testów AST.
9. Seryjnie rozcieńczyć homogenat płucny za pomocą PBS i płytki na agarze Lysogeny Bulth (LB) w celu oznaczenia jednostek tworzących kolonie (CFU) w poszczególnych nieleczonych i traktowanych antybiotykami fragmentach tkanek zgodnie ze standardowymi metodami posiewu.
   UWAGA: Opcjonalnie: Przygotuj zduplikowane płytki na selektywnych pożywkach, aby potwierdzić tożsamość kolonii; np. przy użyciu agaru z solą mannitolu dla S. aureus.

Wyniki

Model EVPL zapewnia platformę do testów wysokoprzepustowych, umożliwiając jednoczesne badanie wrażliwości na antybiotyki dużej liczby izolatów bakteryjnych (Rysunki 1 i 2) lub badanie szczepów w zakresie różnych stężeń antybiotyków w jednym eksperymencie (Rysunek 3). Dzięki praktyce ustaliliśmy, że z płuc można przygotować około 200 przekrojów tkanki oskrzelików w ciągu 2 godzin. Cały eksperyment AST można przeprowadzić w normalnych godzinach pracy. Wzrost izolatów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus oraz tworzenie biofilmu 48 h w modelu są wiarygodne i, przy monitorowaniu za pomocą liczby komórek żywych, dają spójne obciążenie bakteryjne (Rysunki 1 i 2). Obrazy biofilmów związanych z tkanką Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus wyhodowanych w EVPL, wraz z protokołami przygotowania do mikroskopii świetlnej i barwienia histologicznego, można znaleźć w naszych publikacjach^21,23. Jednakże powtarzalność zliczania CFU różni się w zależności od gatunku bakterii. Można to określić ilościowo za pomocą standardowych obliczeń powtarzalności po analizie ANOVA²⁵; stwierdziliśmy, że zazwyczaj występuje większa zmienność CFU w powtórzonych próbkach płuc dla S. aureus niż dla P. aeruginosa. Zalecamy, aby po wdrożeniu modelu w laboratorium przeprowadzono powtórne obliczenia w eksperymentach pilotażowych w celu zoptymalizowania technik eksperymentalnych i określenia wielkości próbek do wykorzystania w końcowych eksperymentach (przykład można znaleźć w suplemencie danych do pracy Sweeney i wsp.²⁶).

W przypadku hodowli w EVPL, biofilmy P. aeruginosa oraz S. aureus wykazują zwiększoną tolerancję na antybiotyki w porównaniu do podatności w standardowych, zatwierdzonych przez przemysł testach MIC w bulionie (Rysunek 1) i testach dyskowych z użyciem standardowych pożywek (Rysunek 2). Różne efekty poszczególnych antybiotyków na biofilm utworzony w EVPL są rozróżnialne; na przykład w EVPL uzyskano zabicie P. aeruginosa przy zastosowaniu cyprofloksacyny w stężeniu 4-16X MIC, ale nie przy zastosowaniu chloramfenikolu w stężeniu 4-8X MIC (Rysunek 1). Dawka 600 mg linezolidu podawana dwa razy dziennie zapewnia stężenie w surowicy powyżej MIC₉₀ dla podatnych patogenów (4 µg/mL)²⁷ i jest uznawana za odpowiednią ekspozycję bez występowania działań niepożądanych²⁸. Dane przedstawione na Rysunku 2 pokazują, że populacje S. aureus, podatne na linezolid w teście dyskowym, są w stanie przetrwać w EVPL docelowe stężenia w surowicy, a nawet wyższe (12 µg/mL). Brak jest wyraźnej korelacji między MIC a działaniem antybiotyków na biofilmy hodowane w EVPL w przypadku P. aeruginosa (Rysunek 1). Uzyskanie dokładniejszego pomiaru tolerancji antybiotyków in vivo jest istotne, ponieważ nieoptymalne dawkowanie antybiotyków może zwiększyć ryzyko selekcji szczepów opornych w przebiegu infekcji przewlekłej.

Powszechnie wiadomo, że wzrost w formie biofilmu może znacznie zmniejszyć podatność bakterii na antybiotyki. Doprowadziło to do opracowania wielu testów biofilmu in vitro oraz stosowania minimalnego stężenia eradykacji biofilmu (MBEC)^14,15 zamiast MIC jako dokładniejszego wskaźnika podatności w infekcjach przewlekłych. Zalecano również stosowanie SCFM (w różnych formulacjach) w testach MIC lub MBEC²⁹. Wykazujemy tutaj, że nawet zoptymalizowany test in vitro nie pozwala na dokładne przewidzenie podatności P. aeruginosa na kolistynę w EVPL. Ilość antybiotyku wymagana do osiągnięcia 3 log₁₀ redukcji bakterii wyhodowanych w EVPL jest często znacznie wyższa niż MIC lub MBEC obliczone na podstawie standardowych testów in vitro, nawet gdy do tych testów wykorzystano SCFM (Rysunek 3). Jest to zgodne z przeglądem Cochrane, w którym stwierdzono, że obecne metody testowania podatności biofilmu in vitro nie zapewniają zwiększonej mocy predykcyjnej w dobieraniu antybiotykoterapii w mukowiscydozie (CF) w porównaniu do standardowych testów podatności¹⁶.

Model ten jest również prosty w zastosowaniu do oceny wpływu antybiotyków na bakterie w biofilmie w czasie, ponieważ można zaszczepić wystarczającą liczbę powtarzalnych fragmentów płuc, aby umożliwić pobieranie próbek niszczących. Oprócz rozróżniania różnic między środkami przeciwdrobnoustrojowymi, model może uwypuklić zmiany w podatności na różnych etapach wzrostu bakterii lub w zależności od wieku biofilmu oraz dla różnych odstępów między dawkami antybiotyku. Rysunek 4 ilustruje rosnącą tolerancję biofilmów P. aeruginosa na meropenem w miarę ich dojrzewania. Może to być przydatne do określenia skuteczności nowych środków, na przykład czy są one bardziej efektywne podczas szybkiego podziału komórek. Może to być również ważny aspekt przy określaniu ograniczeń eksperymentu, ponieważ konieczna może być standaryzacja i walidacja wieku biofilmu, aby uniknąć wpływu wieku na wyniki.

Na Rysunku 5 zmierzono przeżywalność S. aureus po 4 h i 24 h od ekspozycji na fluklozacylinę, co pozwoliło zaobserwować różnice w redukcji liczby komórek bakteryjnych w czasie oraz pomiędzy izolatami. Może to być przydatne w opracowywaniu leków, na przykład przy określaniu parametrów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych lub podczas wyjaśniania mechanizmu działania nowego związku.

Zróżnicowanie obciążenia bakteryjnego często wzrasta wraz z wydłużeniem czasu hodowli. Można to zaobserwować w grupie kontrolnej nieleczonej na Rysunku 5 po 48 h rozwoju biofilmu i dodatkowych 24 h ekspozycji w celu uwzględnienia odstępu między dawkami antybiotyku. Zmienność jest immanentną cechą modelu; każda próbka płuca jest niezależna od pozostałych i odzwierciedla naturalną zmienność płuc. Dlatego ważne jest zapewnienie wystarczającej liczby powtórzeń, aby umożliwić walidację i dokładną interpretację wyników. Odsyłamy czytelnika do naszej rekomendacji dotyczącej przeprowadzenia ponownych obliczeń na danych w celu umożliwienia wyboru odpowiedniej wielkości próby.

Dla uproszczenia przedstawiono reprezentatywne dane uzyskane z powtórzonych przekrojów tkanek pobranych z jednej pary płuc w każdym eksperymencie, jednak w praktyce konieczne jest przeprowadzenie powtórzonych doświadczeń na przekrojach tkanek pobranych od kilku osobników. Należy to zrobić w celu uwzględnienia zmienności biologicznej między poszczególnymi świniami; w kwestii spójności wyników między tkankami pobranymi od różnych osobników oraz sposobu uwzględnienia tej zmienności w analizie statystycznej danych z wykorzystaniem analizy wariancji (ANOVA)/ogólnych modeli liniowych (GLM), odsyłamy czytelnika do naszych opublikowanych prac^21,26.

Rycina 1Całkowita liczba CFU dla 11 CF Pseudomonas aeruginosa izolaty kliniczne pozyskane z modelu EVPL po leczeniu antybiotykami. Reprezentatywne wyniki leczenia antybiotykami P. aeruginosa w modelu EVPL. Każdy szczep hodowano na tkance EVPL przez 48 h, a następnie przeniesiono do roztworu antybiotyku (trójkąty) lub PBS jako kontroli (koła) na 18 h, po czym określono liczbę CFU/płuco. MIC dla odpowiedniego antybiotyku, wyznaczone w standardowym bulionie MHB z korektą kationową, podano w nawiasach obok każdego szczepu (oś X). Szczepy uszeregowano według rosnących wartości MIC. Dane analizowano przy użyciu testów t-Studenta (tam, gdzie było to właściwe) oraz testów U Manna-Whitneya dla zbiorów danych nieparametrycznych. Istotne różnice między tkankami traktowanymi antybiotykiem a nietraktowanymi oznaczono gwiazdkami (P < 0.05). A. Liczba odzyskanych jednostek zdolnych do wzrostu z P. aeruginosa biofilmy wyhodowane w modelu EVPL i poddane działaniu 64 µg/mL chloramfenikol (odnotowano najwyższą wartość MIC). Dla każdego izolatu obliczono standaryzowaną różnicę średnich CFU między przekrojami tkanki traktowanymi chloramfenikolem a nietraktowanymi, stosując współczynnik Cohen'a d. Nie stwierdzono korelacji między wartością MIC w teście standardowym a spadkiem liczby żywych komórek w modelu EVPL, zmierzonym za pomocą współczynnika Cohen’a. d (korelacja rang Spearmana, r_s = 0.45, p = 0.16) B. Wyniki P. aeruginosa biofilmy hodowane w modelu EVPL i poddane działaniu 64 µg/mL cyprofloksacyna (odnotowano najwyższą wartość MIC). Wartości poniżej linii przerywanej znajdowały się poniżej granicy wykrywalności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2Całkowita liczba CFU wyniosła 8 Staphylococcus aureus Izolaty kliniczne CF pozyskane z modelu EVPL po leczeniu linezolidem. Każdy szczep hodowano na tkance EVPL przez 48 h, a następnie przeniesiono do roztworu linezolidu (trójkąty) na 24 h lub pozostawiono bez obróbki jako kontrolę (koła). Wszystkie szczepy okazały się wrażliwe na linezolid w standardowym teście dyfuzyjnym z krążkami wykonanym zgodnie z wytycznymi EUCAST.³⁰ (strefa zahamowania wzrostu) > 21 mm). Dane analizowano przy użyciu testów t-Studenta, gdy było to odpowiednie, oraz testów U Manna-Whitneya w przypadku zbiorów danych nieparametrycznych (P < 0,05). Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami traktowanymi antybiotykiem a nietraktowanymi dla żadnego ze szczepów. Wartości poniżej linii przerywanej znajdowały się poniżej granicy wykrywalności. A. Wyniki S. aureus biofilmy w modelu EVPL traktowane 4 µg/mL linezolid (punkt odcięcia klinicznego dla wrażliwości/oporności zgodnie z klasyfikacją EUCAST)³¹). B. Wyniki S. aureus biofilmy w modelu EVPL poddane działaniu 12 µg/mL linezolid (dane powielone z pracy Sweeney et al.)²³). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3. Liczba żywych komórek Pseudomonas aeruginosa szczepu laboratoryjnego PA14 oraz 4 izolatów klinicznych z mukowiscydozy (CF) wyizolowanych z modelu EVPL po leczeniu zwiększającymi się stężeniami kolistyny. Każdy szczep hodowano na tkance EVPL przez 48 h, a następnie eksponowano na kolistynę przez 18 h. MIC określone w standardowym medium MHB z dostosowaną zawartością kationów przedstawiono w nawiasach obok nazwy każdego szczepu. Linie pionowe wskazują wartość MBEC określoną w MHB (linia ciągła) i SCFM (linia przerywana), z wyjątkiem szczepu SED6, w którym wartość była taka sama w obu mediach. Niewypełnione punkty danych reprezentują najniższe przetestowane stężenie kolistyny, które spowodowało redukcję CFU/lung o ≥ 3-log₁₀ w porównaniu z próbkami nieleczonymi (0 µg/mL kolistyny) (dane powtórzone z opracowania Sweeney et al²⁶). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 4. Reprezentatywne liczby żywych komórek Pseudomonas aeruginosa z przebiegu czasowego wzrostu w modelu EVPL przez 24 h i następnego leczenia meropenemem w stężeniu 64 µg/mL. Szczep laboratoryjny P. aeruginosa PA14 oraz 3 izolaty kliniczne z CF hodowano na tkance EVPL przez czas wskazany na osi x, a następnie przeniesiono do meropenemu (trójkąty) na 24 h lub pozostawiono bez leczenia jako kontrolę (koła). Następnie określono CFU/lung. MIC wyznaczone w medium MHB z dostosowaną zawartością kationów podano w nawiasach obok nazwy każdego szczepu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5. Reprezentatywne liczby żywych komórek Staphylococcus aureus po wzroście w modelu EVPL, a następnie leczeniu 5 µg/mL flukoksacyliny w ciągu 24 h. Szczep kontrolny ATCC29213 oraz dwa izolaty kliniczne z mukowiscydozy (CF) hodowano na tkance EVPL przez 48 h, a następnie przeniesiono do flukoksacyliny (trójkąty) lub pozostawiono bez leczenia jako grupę kontrolną (koła) na 4 h i 24 h, przed oznaczeniem CFU/płuco (dane powtórzone z Sweeney et al²³). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek S1.  Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Tabela S1.  Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Model płuc ex vivo jest wysokoprzepustowy i niedrogi, a ponieważ wykorzystuje odpady pokonsumpcyjne z przemysłu mięsnego, nie budzi żadnych obaw etycznych. Został on zaprojektowany tak, aby naśladować przewlekle zakażone ludzkie drogi oddechowe z mukowiscydozą lepiej niż obecnie dostępne platformy AspAT in vitro. Przedstawione wyniki pokazują, że może on dokładniej przewidywać wrażliwość na antybiotyki w tych okolicznościach.

Kluczowe etapy protokołu, które zapewnią wiarygodne i powtarzalne wyniki, obejmują:

1. Stosuj spójne metody czasu i przechowywania między ubojem, pobieraniem i przetwarzaniem próbek płuc. Ważne jest, aby jak najszybciej po uboju użyć płuc i ograniczyć do minimum możliwość zakażenia. Zaobserwowano różnice w zdolności kultur eksperymentalnych do wzrostu w płucach, jeśli nie są one tak świeże, jak to możliwe.
2. Niezbędne jest utrzymanie sterylności w produkcji SCFM i preparowaniu fragmentów płuc. Zdrowe płuca nie są sterylne, więc obecność bakterii komensalnych może odzwierciedlać "naturalne" środowisko przewlekłej infekcji. Niemniej jednak, jak wspomniano wcześniej, interakcje bakterii w populacjach wielogatunkowych mogą zmieniać wyniki i podatność na antybiotyki, dlatego należy unikać zanieczyszczenia, a płuca należy wysterylizować przed użyciem. Zalecamy stosowanie sterylizacji UV, ponieważ nie wydaje się, aby powodowała ona zmiany w integralności tkanki cyny i, jeśli to konieczne, dodatkowe płukanie antybiotykami. Należy jednak zachować ostrożność przy stosowaniu antybiotyków, ponieważ mogą one wpływać na wyniki poprzez wprowadzanie presji selekcyjnej i mogą zmieniać ekspresję genów w badanych populacjach bakterii.
3. Użyj pozorowanych próbek tkanek kontroli ujemnej i płytek z liczbą komórek wyhodowanych na nieselektywnym, bogatym podłożu, aby podkreślić wzrost wszelkich zanieczyszczeń lub bakterii komensalnych, które nie zostały usunięte podczas sterylizacji. Jest to niezbędne, aby złagodzić wpływ tych bakterii na AspAT. Pomocne jest również wytwarzanie zduplikowanych, selektywnych agarów, płytek do liczenia komórek specyficznych dla organizmu będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ zduplikowane płytki przyspieszają identyfikację kolonii i zliczanie komórek.
4. Przeprowadzanie eksperymentów pilotażowych przy pierwszym użyciu modelu i przy użyciu go z nowymi szczepami lub genotypem bakterii w celu oceny zmian biofilmu CFU między sekcjami tkanki, umożliwiając wybór optymalnych rozmiarów próbek eksperymentalnych (np. ile powtórzonych skrawków tkanki należy pobrać z ilu powtórzonych płuc) poprzez zastosowanie obliczeń mocy.
5. W teście wykorzystuje się niestandaryzowane inokulum, ponieważ umożliwia to szybką inokulację po 48 godzinach inkubacji i tworzenie stosunkowo stałych ładunków biofilmów (szczególnie dla P. aeruginosa). Aby ocenić skuteczność przeciwbakteryjną we wczesnych stadiach wzrostu biofilmu, rozważ inokulację standaryzowanym CFU bakterii hodowanych w koloniach zawieszonych w ASM. Nie zalecamy zaszczepiania bakteriami planktonicznymi: wczesne eksperymenty pilotażowe wykazały, że prowadzi to do ostrego, inwazyjnego wzrostu, a nie do niezawodnego tworzenia biofilmu.

Protokół ten tworzy solidny prototyp modelu do stosowania z P. aeruginosa, z dużym potencjałem rozwoju do stosowania z S. aureus, ale ma pewne ograniczenia, które będą musiały zostać rozwiązane w przypadku niektórych zastosowań w przyszłości. Tkanki inokulowano z pojedynczych kolonii, aby umożliwić rozwój populacji klonalnych. Wyniki pokazują, że w przypadku P. aeruginosa ma to niewielki wpływ na liczbę komórek po 48 godzinach. Jednak większą zmienność obciążenia bakteryjnego zaobserwowano w przypadku S. aureus , a biorąc pod uwagę, że różne bakterie mogą rosnąć w różny sposób w modelu, standaryzowane inokulum wyjściowe i rygorystyczna produkcja próbek tkanek o identycznej wielkości i masie mogą być zależne od badanego organizmu. Mogą również występować różnice między laboratoriami ze względu na różnice w precyzyjnych technikach preparacji/infekcji lub lokalnej rasie świń. W celu oceny odtwarzalności populacji bakterii dla poszczególnych implementacji modelu sugerujemy zastosowanie obliczeń powtarzalności w ramach analizy statystycznej wyników²⁵ oraz zastosowanie obliczeń powtarzalności/mocy opartych na eksperymentach pilotażowych w celu obliczenia optymalnej wielkości próby do ich wykorzystania w eksperymentach końcowych.

Jedną z kluczowych zalet EVPL w porównaniu z tradycyjnymi testami płytkowymi jest to, że zamiast testować bakterie rosnące planktonicznie lub na powierzchniach abiotycznych, pozwala na przestrzenne strukturyzowanie biofilmów bakteryjnych w środowisku gospodarza i różnicowanie komórek. Ma to ważne implikacje dla rozważenia wpływu gradientów fizykochemicznych i składników odżywczych na aktywność środków przeciwdrobnoustrojowych, a także dostarczanie i dostępność aktywnych terapii w różnych mikrośrodowiskach w ramach przewlekłej infekcji i interakcji komórka-komórka między bakteriami. Ten ostatni punkt jest szczególnie istotny, ponieważ zakażenia wielogatunkowe są rutynowo obserwowane w mukowiscydozie i stają się coraz ważniejsze dla infekcji związanych z innymi chorobami układu oddechowego, takimi jak astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc. Istnieje potencjał do opracowania tego modelu dla AspAT do zindywidualizowanego pobierania plwociny od pacjenta w diagnostyce klinicznej. Analogiczne badanie jest już w toku z wykorzystaniem naśladującego model in vitro do pomiaru wzrostu i AspAT oczyszczonego biofilmu z ran przewlekłych (Southwest Regional Wound Care Center w Lubbock, Texas, dr R. Wolcott).

Ponadto w modelu wykorzystano tkanki pośmiertne, dzięki czemu wpływ odpowiedzi immunologicznej gospodarza na wrażliwość na antybiotyki jest ograniczony. Obecne modele in vitro również nie uwzględniają odpowiedzi immunologicznej gospodarza, więc nie postrzegamy tego jako bariery dla przyszłego wykorzystania modelu w zastosowaniach AST. Odpowiedź immunologiczna jest jednak brana pod uwagę przy określaniu parametrów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych oraz wytycznych dotyczących dawkowania antybiotyków. Chociaż nasze badania wykazały istnienie szczątkowych komórek odpornościowych i odpowiedzi w tkance²³ (i S. Azimi, komunikacja osobista), jest to główny obszar do dalszej optymalizacji i rozwoju modelu, jeśli pożądane jest lepsze dopasowanie do warunków in vivo.

Zapewnienie bardziej wiarygodnej klinicznie AST w przypadku mukowiscydozy pomoże spełnić kluczowe zalecenie brytyjskiej ustawy o zdrowiu i opiece społecznej z 2008 r., zgodnie z którym "powinny istnieć procedury zapewniające rozsądne przepisywanie leków i zarządzanie środkami przeciwdrobnoustrojowymi". Uważamy, że EVPL jest idealnym kandydatem, który pomoże zaspokoić tę potrzebę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawki insulinowe 0,5 ml z igłą 29G z
płytkami
70% etanol lub podobny do sterylizacji powierzchniowej i sprzętu
Płytki agarowe do przygotowania smug P. aeruginosa/S. aureus (dowolne odpowiednie podłoże)
Agaroza
Folia aluminiowa - wstępnie wysterylizowana w autoklawie - do przykrycia deski do krojenia, na której będziesz przeprowadzać sekcję płuc.
Ubijak do koralików przeznaczony do przyjmowania probówek 2 ml	MP Biomedicals	116004500	FastPrep-24 Klasyczny młynek do ubijania koralików i system lizy
Membrana uszczelniająca Breathe-easy lub Breathe-easier do płytek wielodołkowych	Zróżnicowany palnik Bunsena Biotech	BEM-1 lub BERM-2000
nbsp;
Deska do krojenia - polecamy deskę z tworzywa sztucznego, aby umożliwić łatwą dekontaminację alkoholem.
Lodówka do transportu płuc do laboratorium
Nożyczki preparacyjne w różnych rozmiarach
Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium (DMEM)
Wzmocnione probówki Fisherbrand 2 ml	Thermo Fisher	15545809
Fisherbrand 2,38 mm koraliki metalowe	Thermo Fisher	15505809
Bakteriobójcza szafka
Strzykawki insulinowe -  0,5 ml z dołączoną igłą 29G.	VWR	BDAM324892
Duży nóż
LB Płytki agarowe do oceny CFU w homogenacie
Zamontowane
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0,1 i mikro; m x 500 ml sterylna jednostka filtrująca	Thermo Fisher	10474415	Do sterylizacji filtrów SCFM
Szalki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Plastikowa
deska do krojenia i folia aluminiowa do tworzenia sterylnej i łatwej do czyszczenia powierzchni
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 średni
Składniki SCFM wymienione w tabeli S1
Wybór kleszczy (zalecane końcówki)
Selektywne płytki agarowe do specyficznej oceny P. aeruginosa / S. aureus CFU w homogenacie biofilmu płuc, jeśli jest to wymagane.
Odpowiednie pojemniki do utylizacji zanieczyszczonych ostrych narzędzi i tkanek wieprzowych, zgodnie z polityką bezpieczeństwa i higieny pracy Twojej instytucji.

24-dołkowymi hodowlanymido preparacji Flamin Gof&UVpaletowybiofilmu płucżyletkiPetriegopreparacyjnej