Kwantyfikacja maksymalnej siły prostownika kolana jest niezbędna do zrozumienia funkcjonalnych adaptacji do starzenia się, chorób, urazów i rehabilitacji. Przedstawiamy nowatorską metodę wielokrotnego pomiaru in vivo izometrycznego szczytowego momentu obrotowego tężcowego wyprostu kolana.
Artykuł metodologiczny
Pomiar in vivo funkcji mięśni prostowników stawu kolanowego u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plastyczność mięśni szkieletowych w odpowiedzi na niezliczone warunki i bodźce pośredniczy w jednoczesnej adaptacji funkcjonalnej, zarówno negatywnej, jak i pozytywnej. W klinice i laboratorium badawczym maksymalna siła mięśniowa jest szeroko mierzona wzdłużnie u ludzi, przy czym najczęściej zgłaszanym wynikiem funkcjonalnym jest muskulatura prostowników kolana. Patologia kompleksu mięśni prostownika kolana jest dobrze udokumentowana w starzeniu się, urazach ortopedycznych, chorobach i nieużywaniu; Siła prostownika kolana jest ściśle związana ze zdolnością funkcjonalną i ryzykiem kontuzji, co podkreśla znaczenie wiarygodnego pomiaru siły prostownika kolana. Powtarzalna ocena in vivo siły prostownika stawu kolanowego w przedklinicznych badaniach na gryzoniach dostarcza cennych funkcjonalnych punktów końcowych dla badań dotyczących choroby zwyrodnieniowej stawów lub urazu kolana. Informujemy o nieinwazyjnym i inwazyjnym protokole in vivo wielokrotnego pomiaru izometrycznego szczytowego momentu tężcowego prostowników kolana u myszy w czasie. Wykazujemy spójność przy użyciu tej nowatorskiej metody pomiaru siły prostownika kolana z wielokrotną oceną na wielu myszach, dając podobne wyniki.
Wprowadzenie
Mięśnie szkieletowe to wysoce adaptująca się tkanka z kompensacyjnymi zmianami masy i struktury w odpowiedzi na niezliczone bodźce, takie jak ćwiczenia, odżywianie, kontuzje, choroby, starzenie się i nieużywanie. Wiele badań dotyczących adaptacji mięśni szkieletowych u ludzi wykorzystuje metody pomiaru zarówno wielkości mięśni szkieletowych, jak i wpływu na ich funkcję, ponieważ oceny siły według złotego standardu są łatwo powtarzalne u ludzi.
Konkretnie, siła prostownika kolana i zginacza są najczęściej oceniane w badaniach klinicznych. Zmiany w sile prostownika kolana były szeroko zgłaszane w badaniach na ludziach dotyczących starzenia się, ćwiczeń, urazów ortopedycznych, choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego, chorób przewlekłych i nieużywania1,2,3,4,5,6,7. Jednak metody wielokrotnej i nieinwazyjnej analizy siły mięśnia prostownika kolana (mięśnia czworogłowego) w badaniach mechanistycznych gryzoni były stosunkowo ograniczone. Wcześniej opracowano metodę określania kurczliwości mięśnia czworogłowego uda in vivo u szczurów8; Konieczna jest jednak szeroko zakrojona budowa sprzętu niedostępnego na rynku. Biorąc pod uwagę szeroki zakres modeli gryzoni opracowanych do badania wyników układu mięśniowo-szkieletowego po urazie kolana/chorobie zwyrodnieniowej stawów9,10,11,12,13 istnieje potrzeba nieinwazyjnej oceny siły mięśnia czworogłowego.
Ponadto, badania na gryzoniach badające mechanizmy molekularne leżące u podstaw adaptacji mięśni szkieletowych często wykorzystują modele mysie ze względu na prostotę modyfikacji genetycznej, podobnie jak wiele badań nad interwencjami farmakologicznymi ze względu na zmniejszone koszty finansowe związane z niższym dawkowaniem leku u myszy w porównaniu do szczurów. Przedstawiamy nieinwazyjną metodę wielokrotnego pomiaru funkcji prostownika kolana in vivo u tej samej myszy w czasie przy użyciu dostępnego na rynku sprzętu z niewielkimi modyfikacjami, ułatwiając odtwarzalność między różnymi laboratoriami i zapewniając bardziej bezpośrednie porównanie z wynikami siły ludzkiej.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kentucky.
1. Konfiguracja sprzętu
- Upewnij się, że maszyny są podłączone zgodnie ze specyfikacjami producenta.
- Jeśli silnik 300D-305C-FP z aparatem do prostowania kolan nie jest jeszcze na miejscu, podłącz go do platformy dla zwierząt 809C.
- Włącz pompę wodną do 37 °C, aby rozpocząć podgrzewanie platformy.
- Jeśli komputer nie jest jeszcze włączony, włącz go, a następnie włącz stymulator dwufazowy o dużej mocy i 2-kanałowy system dźwigni dwumodowych.
- Wlej izofluran do waporyzatora do linii maksymalnego napełnienia.
2. Konfiguracja oprogramowania
- Otwórz oprogramowanie (szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów).
- Aby użyć funkcji natychmiastowej stymulacji w połączeniu z monitorem danych na żywo w celu optymalizacji umieszczenia sondy (krok 4), wybierz opcję Przygotuj eksperyment, a następnie Konfiguruj natychmiastowy stymulator (Rysunek 1). Ustaw częstotliwość impulsów (Hz) na 125, szerokość impulsu (ms) na 0,2, liczbę impulsów na 1, częstotliwość pociągu (Hz) na 0,5, a czas pracy (s) na 120.
- Wybierz Plik i otwórz Live Data Monitor.
- Aby przeprowadzić eksperymenty drgań (krok 5) i częstotliwości momentu obrotowego (krok 6), wybierz wcześniej zaprogramowane badanie, które obejmuje odpowiednie eksperymenty z częstotliwością momentu obrotowego drgań i wyprostu kolana (szczegółowo opisane poniżej w kroku 5 i kroku 6).
- Wybierz odpowiednią mysz eksperymentalną lub Dodaj nowe zwierzę i wprowadź odpowiednie informacje o myszy, które mają być przechowywane wraz z danymi dotyczącymi momentu obrotowego.
- Wybierz opcję Następny eksperyment lub Poprzedni eksperyment, aby przejść z protokołu drgań do sekwencji momentu obrotowego i częstotliwości.
3. Ustawienia myszy
- Umieść pojedynczą mysz w komorze anestezjologicznej.
- Zwolnij zawór butli tlenu i ustaw natężenie przepływu tlenu na 1 l/min z 2,5% izofluranem.
- Upewnij się, że mysz pozostaje w komorze z bezpiecznie zamkniętą pokrywą, aż do całkowitej utraty przytomności. Potwierdź całkowitą utratę przytomności przez brak odruchu stopy ze szczypnięciem palca.
- Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej z głową w stożku na podgrzewanej platformie z natężeniem przepływu tlenu 1 l/min z 2,5% izofluranem.
- Ogol włosy z prawej tylnej kończyny za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia. Usuń włosy z ogolonego obszaru za pomocą wacika nasączonego alkoholem i niewielkiego odkurzacza. Oczyścić, usunięte włosy z tylnej kończyny i platformy.
- Bezpiecznie zaciśnij górną kończynę tylną, z tyłu kolana (Rysunek 2).
UWAGA: Upewnij się, że zakres ruchu kolana nie jest utrudniony. - Umieść dolną kończynę tylną w aparacie do prostowania kolana, tak aby przednia kość piszczelowa delikatnie dotykała regulowanego elementu z tworzywa sztucznego (odczyt kanału Force In powinien wynosić od 0 do -1.0 mN*m). W zależności od rozmiaru dolnej tylnej kończyny myszy, taśma chirurgiczna może być owinięta wokół dolnej części regulowanego plastikowego elementu, aby umożliwić nogę bezpiecznego odpoczynku.
UWAGA: Szczegółowe zdjęcia i wymiary wykonanego na zamówienie elementu z tworzywa sztucznego pokazano na rysunku uzupełniającym 1. - Wyreguluj pokrętła na platformie, aby upewnić się, że kolano jest zgięte pod kątem 60°.
- Lekko umieść kawałek taśmy na tułowiu myszy na platformie, aby zapobiec kompensacyjnemu ruchowi przy maksymalnym wyprostu kolana.
4. Umiejscowienie elektrod
- Umieść elektrody podskórnie 2-4 mm proksymalnie do kolana bezpośrednio nad mięśniami czworogłowymi/prostownikami kolana (Rysunek 2). Elektrody powinny być oddalone od siebie o około 1-2 mm.
- Aby określić optymalne rozmieszczenie elektrod, skorzystaj z funkcji natychmiastowej stymulacji z monitorem danych na żywo. Ustaw natężenie prądu/prąd na 50 mA dla powtarzających się drgań, aby potwierdzić wyprost kolana (prostowniki kolana wytworzą ujemną krzywą drgania). Wyreguluj sondy podczas natychmiastowej stymulacji, aby osiągnąć maksymalny moment drgania wyprostu kolana, mierzony w oknie Live Data Monitor.
UWAGA: Rysunek 3 pokazuje reprezentatywny wynik Natychmiastowej Stymulacji, potwierdzający wyprost kolana. Film uzupełniający 1 i film uzupełniający 2 pokazują drgania prostownika kolana w czasie rzeczywistym i w zwolnionym tempie bez ramienia motorycznego na miejscu, co pozwala na wizualne potwierdzenie wyprostu kolana. - Podczas powtarzających się drgań z natychmiastową stymulacją palpuj palpacyjnie mięśnie zginaczy kolana palcem wskazującym, aby potwierdzić, że nie ma aktywacji mięśni antagonistycznych. Aby maksymalnie stymulować prostowniki stawu kolanowego, może być konieczna zmiana położenia sondy w zależności od składu ciała myszy i niewielkich różnic anatomicznych w dokładnym położeniu punktu motorycznego nerwu udowego i mięśni prostowników kolana.
UWAGA: Punkt motoryczny mięśnia to miejsce, w którym gałąź motoryczna nerwu wchodzi do brzucha mięśniowego i jest punktem o najmniejszym oporze przewodnictwa elektrycznego, a co za tym idzie, o najwyższej reakcji na stymulację elektryczną14,15. W zastosowaniach klinicznych wykorzystujących stymulację elektryczną punkt ten jest identyfikowany przez skanowanie elektrodą długopisową w celu znalezienia miejsca nad mięśniem, w którym występuje skurcz mięśnia przy najniższym wstrzykniętym prądzie14,15. Identyfikacja punktu motorycznego mięśnia jest niezbędna do zapewnienia optymalnej stymulacji elektrycznej nerwowo-mięśniowej15. W badaniach klinicznych na ludziach punkty motoryczne mięśnia czworogłowego uda zostały zidentyfikowane w dystalnej połowie mięśnia mięśniowego14. Aby osiągnąć optymalną stymulację prostowników kolana u myszy, technikę tę podsumowano za pomocą umieszczenia elektrod ze stymulacją natychmiastową, aby jak najbardziej zbliżyć lokalizacje punktów motorycznych mięśni zwykle znajdujących się w dystalnej połowie prostowników kolana. Istnieje pewna zmienność w umieszczeniu elektrod (od stosunkowo powierzchownych do głębokich), co skutkuje maksymalnym momentem obrotowym, a funkcja natychmiastowej stymulacji ułatwia optymalne umieszczenie elektrody.
5. Określenie optymalnego prądu
- Po ustaleniu optymalnego umieszczenia sondy wykonaj serię progresywnych drgań, aby określić optymalne natężenie prądu/prądu, które należy zastosować w eksperymencie z momentem obrotowym, w celu określenia najniższego prądu, aby osiągnąć maksymalny wyjściowy moment drgania. Zacznij od bieżącego ustawienia na 50 mA i wybierz Uruchom eksperyment, aby wytworzyć pojedynczy drgaw. Wybierz opcję Analizuj wyniki, aby wyświetlić wyjściowy moment obrotowy. Zapisz moment drgań wyświetlany pod maksymalną siłą z odjętą linią bazową.
UWAGA: Wybierz opcję odwrócenia kanału siły, aby przekonwertować pomiary z ujemnego momentu obrotowego na dodatni. - Zwiększ prąd do 60-70 mA i powtórz eksperyment drgający. Zapisz moment drgań wyświetlany pod maksymalną siłą z odjętą linią bazową.
- Kontynuuj serię eksperymentów drgań w ten sposób (zwiększając o około 10-20 mA z każdą progresją), aż moment drgania przestanie rosnąć (albo ustabilizuje się, albo zacznie spadać). Przykład serii drgań przedstawiono w tabeli 1.
- Zapisz najniższy prąd, przy którym osiągnięto najwyższy moment drgania. Prąd ten zostanie wykorzystany i pozostanie stały podczas zbliżającego się eksperymentu siły i częstotliwości. Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne drgania szczytowe.
6. Eksperyment z częstotliwością momentu obrotowego w celu określenia szczytowego izometrycznego momentu tężcowego
- W oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów) wybierz wstępnie zaprogramowany eksperyment z częstotliwością momentu obrotowego dla wyprostu kolana, zapewniając następujące ustawienie. Czas trwania bodźca: 0,35 s, Sekwencja częstotliwości: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, Okres odpoczynku między impulsami/skurczami: 120 s
UWAGA: Częstotliwość próbkowania wynosi 10 000 Hz (ustawienie domyślne). - Uruchom eksperyment, przeanalizuj wyniki i ręcznie zarejestruj moment obrotowy wyświetlany pod maksymalną siłą z odjętą linią bazową (upewnij się, że kanał siły jest odwrócony, ponieważ skurcz prostownika kolana spowoduje ujemny moment obrotowy) przy każdej częstotliwości. Zwróć uwagę na najwyższą wartość siły maksymalnej jako szczytowy izometryczny moment tężcowy. Przykład danych dotyczących momentu obrotowego i częstotliwości jest pokazany w tabeli 2 i Rysunek 5 przedstawia reprezentatywną krzywą tężca dla szczytowego izometrycznego tężcowego momentu obrotowego osiąganego przy 120 Hz.
7. Zakończenie eksperymentu
- Po zakończeniu eksperymentu z momentem obrotowym i częstotliwością wykonaj drganie uzupełniające i porównaj z początkowym szczytowym drganiem przy tym samym prądzie, aby ocenić uszkodzenie/zmęczenie.
UWAGA: W niektórych modelach urazów i chorób oczekuje się zwiększonej męczliwości mięśni szkieletowych i nie stanowi to problemu z konfiguracją eksperymentalną lub myszą. - Po zakończeniu wszystkich pomiarów momentu obrotowego delikatnie wyjmij sondy elektrod i odblokuj kolano.
- Wyłącz izofluran i wyjmij mysz ze stożka nosowego.
- Umieść mysz z powrotem w odpowiedniej klatce umieszczonej na podkładce rozgrzewającej. Monitoruj, jak mysz wraca do zdrowia i przytomności.
UWAGA: Mysz powinna być przytomna i poruszać się w ciągu 2-3 minut.
8. Analiza danych
- Wyodrębnij dane po eksperymencie z oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).
- Otwarte oprogramowanie analityczne.
- Wybierz opcję Pobierz dane z oprogramowania.
- Wybierz datę, w której przeprowadzono eksperyment i odpowiedni kod myszy.
- Wybierz częstotliwość, która Cię interesuje (zostaną wyświetlone wszystkie eksperymenty drgań i każda częstotliwość eksperymentu z momentem obrotowym).
- Wybierz Analiza mięśni.
- Upewnij się, że opcja Użyj korekty linii bazowej jest zaznaczona.
UWAGA: Podstawowy moment obrotowy jest obliczany przez oprogramowanie jako średnia z pierwszych 100 punktów pobranych i odjętych od bezwzględnej maksymalnej wartości momentu obrotowego. - Zapisz wartość momentu obrotowego podaną w polu Maksimum.
UWAGA: Prezentowane tutaj dane są niefiltrowane; W razie potrzeby w oprogramowaniu można jednak wybrać filtr .
- Alternatywnie, jak opisano powyżej w kroku 6.2, ręcznie zarejestruj wyjściowy moment obrotowy wyświetlany w obszarze Maksymalna siła w czasie rzeczywistym w każdym punkcie/skurczu momentu obrotowego/częstotliwości za pomocą okna Analizuj wyniki.
- Upewnij się, że linia bazowa została odjęta, a kanał siły jest odwrócony.
- Wprowadź dane do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia normalizacji masy ciała (moment obrotowy/masa ciała w gramach) oraz wykresów i analiz statystycznych. Do wytworzenia wykresów krzywych momentu obrotowego i częstotliwości oraz obliczenia pola powierzchni pod krzywą wykorzystano oprogramowanie statystyczne.
UWAGA: Dane dotyczące momentu obrotowego są mierzone w mN.m (miliniutonometrach).
- Aby wygenerować krzywe tężcowe, wyeksportuj pełne dane z każdej częstotliwości z oprogramowania analitycznego.
- Powtórz kroki 8.1.1-8.1.4 powyżej.
- Wybierz opcję Eksportuj dane.
- Wybierz opcję Surowe filtrowane dane i zapisz w wybranej lokalizacji. MATLAB może być używany do generowania krzywych tężcowych z wyeksportowanego pliku tekstowego i/lub do dalszej analizy.
UWAGA: Kod MATLAB do generowania krzywej tężcowej z pliku tekstowego jest dostępny na żądanie.
9. Dwutrybowa kalibracja systemu dźwigni
- Przed pierwszym użyciem należy skalibrować system, aby zapewnić dokładne i wiarygodne dane, a następnie okresowo powtarzać wzorcowanie przy użyciu oprogramowania do gromadzenia danych i znanych wzorców masy.
- Otwarte oprogramowanie do gromadzenia danych.
- Kliknij kartę Setup (Konfiguracja) i wybierz opcję Channel Setup (Ustawienia kanału).
- Wybierz 305C-FP wymieniony w obszarze My Instruments (Moje instrumenty).
- Kliknij przycisk Kalibruj wybrane, aby otworzyć okno Edytor kalibracji.
- Aby skalibrować długość, wprowadź serię napięć testowych, w tym napięcia ujemne i dodatnie (np. -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).
- Kliknij przycisk Ustaw dla pierwszego wiersza.
- Kliknij przycisk Przeczytaj.
- Zmierz dokładną długość ramienia dźwigni w milimetrach i wprowadź do odpowiedniego pudełka.
- Powtórz dla następnego napięcia.
- Po zarejestrowaniu wszystkich napięć kliknij przycisk Oblicz współczynniki calowe (rejestrowane w mm/wolt).
- Aby skalibrować siłę, użyj zestawu znanych ciężarów rosnących w ciągu liniowym.
- Wyreguluj silnik tak, aby spoczywał na krawędzi ławki lub stołu z ramieniem dźwigni równoległym do blatu i zwisającym z krawędzi, aby ciężar mógł zwisać.
- Zawieś pierwszy ciężar na ramieniu dźwigni za pomocą gumki. W polu Przyłożona siła wprowadź znaną masę w gramach, odpowiadającą masie gumki.
- Wybierz pozycję Odczytuj.
- Powtórz dla co najmniej 3 znanych mas.
- Wybierz opcję Oblicz współczynnik kalibracji.
- Aby zweryfikować obliczenia, wykreśl dane kalibracyjne i dopasowanie krzywej, wybierając opcję Drukuj cal.
- Aby skalibrować wymuszone wyjście, wprowadź napięcia kalibracyjne (do 10 woltów)
- Kliknij przycisk Ustaw bezpośrednio obok napięcia kalibracji.
- Powtórz dla każdej linii napięcia.
- Delikatnie dociśnij ramię dźwigni palcem, aż Force Out przestanie się zmieniać, a ramię silnika zacznie się poruszać.
- Utrzymaj tę pozycję. Wybierz pozycję Odczytuj.
- Powtórz dla każdej linii napięcia.
- Wybierz opcję Oblicz współczynnik kalibracji.
Wyniki
Krzywa momentu obrotowego i częstotliwości wykorzystuje niskie częstotliwości do wywołania wielu izolowanych skurczów izometrycznych o stosunkowo niskim momencie obrotowym, a następnie przechodzi przez coraz wyższe częstotliwości, co prowadzi do fuzji skurczów i powstania izometrycznego skurczu tężcowego, w którym uzyskiwany jest szczytowy moment tężcowy. Przedstawiony protokół pomiaru szczytowego momentu tężcowego dla wyprostu kolana w krzywej siła-częstotliwość rozpoczyna się od 10 Hz, co wywołuje 3 izolowane skurcze. Częściowa fuzja skurczów następuje przy 40 Hz, a szczytowy moment tężcowy jest osiągany w zakresie 120-180 Hz (Rycina 5).
Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne krzywe zależnośc momentu obrotowego wyprostu kolana od częstotliwości u samic myszy C57BL/6. W punkcie wyjściowym przebadano trzy oddzielne myszy, a następnie eksperyment powtórzono u każdej z nich po 2 tygodniach w celu oceny powtarzalności. Krzywe zależność momentu od częstotliwości przedstawiono dla surowych wartości momentu obrotowego (Rysunek 6A), a także dla surowych wartości momentu obrotowego znormalizowanych do masy ciała myszy (Rysunek 6B). Powtórzone obserwacje wykazują porównywalne wyniki u wszystkich 3 myszy przy 2-tygodniowym okresie odpoczynku między eksperymentami. Dane dotyczące momentu znormalizowanego do masy ciała należy rozpatrywać dodatkowo do surowego momentu obrotowego, ponieważ niewielkie wahania masy mogą wpływać na wynik funkcjonalny i nie są uwzględniane przy samym surowym momencie obrotowym. Ponadto dane dotyczące momentu znormalizowanego do masy ciała ułatwiają porównywanie myszy o różnych rozmiarach. Moment obrotowy można również znormalizować do mokrej masy mięśnia lub pola przekroju poprzecznego włókna mięśniowego, co wykazaliśmy wcześniej16.
Rysunek 7A przedstawia pole pod krzywą z wykorzystaniem danych momentu obrotowego izometrycznego znormalizowanych do masy ciała, uzyskanych z pełnych eksperymentów zależność momentu od częstotliwości (10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz) u 4 osobnych myszy C57BL/6, co podkreśla podobną całkowitą wartość momentu obrotowego oraz współczynniki zmienności od 5,6% do 8,8% w powtórzonych eksperymentach u tych samych myszy. Dane są najprościej raportowane jako szczytowy moment tetaniczny (Rysunek 7B), który stanowi maksymalną wartość momentu obrotowego z powtórzonych izometrycznych skurczów tetanicznych w zakresie 120-200 Hz. Wartość szczytowego momentu tetanicznego jest porównywalna u 6-8 miesięcznych samic myszy C57BL/6 (Rysunek 7B), przy współczynnikach zmienności między 4,8% a 8,7% w ocenie podłużnej u tych samych myszy. Szczytowy moment tetaniczny jest najbardziej porównywalny ze złotym standardem oceny siły w badaniach na ludziach: maksymalnym momentem izometrycznym.
Ponadto protokół pomiaru szczytowego momentu obrotowego tężcowego prostowników kolana jest użytecznym narzędziem do wykrywania różnic w sile w wielu modelach mysich. Rysunek 8 pokazuje wyraźny kontrast między siłą prostowników kolana u nieurazionej, zdrowej 6-miesięcznej samicy myszy C57BL/6 (linia czarna) a u transgenicznego modelu mysiego z nadfizjologiczną hipertrofią, w którym wyłączono gen miostatyny/GDF8 (linia niebiesza). Przedstawiamy również krzywą szczytowego tężca u myszy C57BL/6 7 dni po chirurgicznym przecięciu więzadła krzyżowego przedniego (ACL-T) (linia czerwona), co wykazuje niemal 50% spadek szczytowego momentu obrotowego po urazie, co wykracza poza współczynniki zmienności obserwowane podczas powtórnych testów u nieurazionych myszy. Zgodnie z danymi u ludzi17,18, siła jest wyraźnie zmniejszona w przypadku ACL-T. Wszystkie myszy są samicami w podobnym wieku (6-8 miesięcy).
| Eksperyment skurczu pojedynczego | Natężenie prądu (mA) | Moment obrotowy (mN•m) |
| 1 | 50 | 1.279 |
| 2 | 70 | 1.341 |
| 3 | 90 | 1.36 |
| 4 | 110 | 1.362 |
| 5 | *130 | 1.449 |
| 6 | 150 | 1.436 |
| 7 | 140 | 1.333 |
Tabela 1: Przykład serii drgań.* oznacza optymalne natężenie prądu.
| Częstotliwość (Hz) | Moment obrotowy (mN•m) |
| 10 | 1.385 |
| 40 | 1.869 |
| 120 | *18.765 |
| 150 | 18.375 |
| 180 | 17.97 |
| 200 | 17.548 |
Tabela 2: Przykład danych krzywej momentu obrotowego w funkcji częstotliwości. * oznacza szczytowy moment obrotowy tetaniczny.
Rysunek 1: Konfiguracja oprogramowania do gromadzenia danych. Ilustracja konfiguracji oprogramowania do gromadzenia danych z monitorem danych w czasie rzeczywistym (Live Data Monitor). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Przygotowanie myszy i rozmieszczenie elektrod. (A-B) Pozycja grzbietna myszy poddawanej znieczuleniu za pomocą maski nosowej na podgrzewanej platformie. Górna kończyna tylna jest bezpiecznie unieruchomiona zaciskiem za kolanem, aby umożliwić swobodny ruch w stawie kolanowym. Ramię motoryczne jest ustawione tak, aby kolano było zgięte pod kątem około 60°. Punkt motoryczny nerwu udowego jest stymulowany za pomocą elektrod igłowych w celu wywołania skurczu prostowników kolana. Przygotowanie myszy przedstawiono w widoku z boku (A) oraz z góry (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Wyznaczenie optymalnego rozmieszczenia elektrod w celu uzyskania izometrycznego wyprostu kolana. Przedstawienie powtarzalnych drgań negatywnych stymulowanych prądem 50 mA przy użyciu funkcji Instant Stimulation i wyświetlanych w monitorze Live Data Monitor. Czerwone strzałki wskazują pierwsze trzy drgania wyprostu kolana. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Reprezentatywny skurcz w celu wyznaczenia optymalnego natężenia prądu. Najniższe natężenie prądu wywołujące najwyższy izometryczny moment obrotowy podczas skurczu pojedynczego musi zostać określone dla eksperymentu siła-częstotliwość poprzez powtarzanie prób skurczowych z progresywnie zwiększanym natężeniem prądu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Reprezentatywne krzywe momentu tężcowego podczas eksperymentu zależnośc momentu od częstotliwości dla tej samej myszy. (A) Podmaksymalny izometryczny moment tężcowy generowany przy 10 Hz. (B) Podmaksymalny izometryczny moment tężcowy przy 40 Hz. (C) Szczytowy izometryczny moment tężcowy przy 120 Hz. (D) Izometryczny moment tężcowy przy 150 Hz. (E) Izometryczny moment tężcowy przy 180 Hz. (F) Izometryczny moment tężcowy przy 200 Hz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Reprezentatywne dane krzywej zależności momentu obrotowego od częstotliwości. (A-B). Krzywa momentu obrotowego w funkcji częstotliwości w dwóch różnych punktach czasowych (tydzień 1 i 3) u trzech osobnych myszy, przedstawiona jako surowy szczytowy moment obrotowy (A) oraz surowy szczytowy moment obrotowy znormalizowany do masy ciała (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Reprezentatywne dane dotyczące pola pod krzywą (AUC) i szczytowego momentu tężcowego. (A) AUC dla 4 oddzielnych myszy, przedstawione jako surowy moment znormalizowany do masy ciała. (B) Szczytowy moment tężcowy dla tych samych 4 myszy, przedstawiony jako surowy szczytowy moment tężcowy znormalizowany do masy ciała. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 8: Szczytowy moment obrotowy tężcowy prostowników kolana w wielu modelach mysich. Reprezentatywne krzywe szczytowego momentu obrotowego tężcowego dla transgenicznego modelu mysiego z wyraźną hipertrofią (GDF8 KO), zdrowej, nieuszkodzonej myszy C57BL/6 (mysz 2) oraz myszy C57BL/6 7 dni po przecięciu więzadła krzyżowego przedniego (ACL-T). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina uzupełniająca 1: Wymiary wykonanego na zamówienie tworzywa sztucznego. Wstawka w kolorze czerwonym pokazuje wymiar głębokości. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Wideo uzupełniające 1: Drganie prostowników kolana w czasie rzeczywistym bez ramienia silnika. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Wideo uzupełniające 2: Drganie prostownika kolana w zwolnionym tempie bez ramienia silnika. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Dyskusja
Pomiar i analiza funkcji mięśni w modelach gryzoni jest niezbędna do wyciągnięcia translacyjnych i znaczących wniosków dotyczących histologicznych i molekularnych adaptacji mięśni szkieletowych obserwowanych podczas ćwiczeń, urazów, chorób i leczenia terapeutycznego. Demonstrujemy metodę wiarygodnej i wielokrotnej oceny maksymalnej siły prostownika kolana u myszy przy użyciu dostępnego na rynku sprzętu, przy czym regulowany plastikowy element utrzymujący dolną tylną kończynę w przedniej części piszczelowej jest jedyną niestandardowo wykonaną częścią, którą można powielić.
Typowe narzędzia oceny funkcjonalnej są szeroko stosowane do wielokrotnej oceny sprawności fizycznej w ramach tej samej myszy, takich jak bieganie na bieżni do zmęczenia wolicjonalnego, test wydajności rotarod, test odwróconego przylegania i test siły chwytu. Jednak, choć pouczające, oceny te obejmują komponent (komponenty) sercowo-płucny i behawioralny, które mogą zaciemniać badanie funkcji nerwowo-mięśniowej związanych z tymi pomiarami sprawności fizycznej. Co więcej, elementy wytrzymałości, koordynacji i równowagi są obecne w wielu z tych ocen funkcjonalnych na różnych poziomach, co ogranicza jasną interpretację w odniesieniu do siły mięśni. Zdolność mięśni gryzoni do wytwarzania siły można zmierzyć in vitro, in situ lub in vivo. Każde z tych podejść ma swoje zalety i ograniczenia. W szczególności, w przypadku oceny in vitro, mięsień jest całkowicie izolowany i usuwany z ciała zwierzęcia, tak aby nie było wpływu perfuzji lub unerwienia19. Daje to dobrze kontrolowane środowisko w celu ustalenia zdolności skurczowej, ale ogranicza rozmiar badanego mięśnia poprzez zależność od biernej dyfuzji tlenu i składników odżywczych podczas testów. Testy in situ utrzymują unerwienie i ukrwienie mięśnia, ale są ograniczone do pojedynczej oceny końcowej, jak w przypadku testów in vitro20. Wreszcie, badanie in vivo jest najmniej inwazyjne, ponieważ mięsień pozostaje w swoim naturalnym środowisku z przezskórnymi elektrodami umieszczonymi w pobliżu nerwu ruchowego w celu elektrycznej stymulacji mięśnia. Mocną stroną podejścia in vivo jest możliwość przeprowadzenia badań podłużnych w czasie 21,22,23.
Ocena in vivo szczytowej kurczliwości mięśni optymalnie mierzy maksymalną siłę, ponieważ normalna anatomia i fizjologia myszy pozostaje nienaruszona, a metodę można powtarzać na tej samej myszy przed i po interwencji lub przez całe życie. W szczególności pomiar in vivo siły prostownika kolana u myszy jest oceną siły myszy o największym znaczeniu translacyjnym dla badań na ludziach, ponieważ maksymalny moment wyprostu kolana jest powszechnie mierzony i uważany za złoty standard testu wytrzymałości u ludzi z korelacją z różnymi wynikami funkcjonalnymi i zdrowotnymi 24,25,26,27. Co więcej, patologia prostowników stawu kolanowego jest obserwowana wraz z wiekiem, a także niezliczonymi urazami i chorobami 1,2,4,5,6, ale ocena wpływu tych stanów na siłę prostownika kolana wzdłużnie u myszy nie była łatwo osiągalna.
Chociaż metoda ta jest użyteczna do określenia szczytowego momentu obrotowego prostownika kolana w sposób podłużny, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia protokołu. Niższe częstotliwości od 40 Hz do 120 Hz zostały pominięte w protokole momentu obrotowego i częstotliwości, co może ograniczać zdolność do wykrywania przesunięć w lewo lub w prawo na krzywej momentu obrotowego i częstotliwości w przypadku urazu lub choroby. Jednak korzystając z tego protokołu momentu obrotowego i częstotliwości, byliśmy w stanie wykryć zmiany szczytowego tężcowego momentu obrotowego w modelu urazu ACL oraz między myszami dzikiego typu C56BL / 6 a transgenicznym mysim modelem suprafizjologicznej masy mięśniowej (ryc. 8). Zwracamy uwagę, że korzystne może być zabezpieczenie elektrod pomocnymi rękami lub podobnym aparatem, ponieważ skurcze mięśni mogą nieznacznie przesuwać elektrody. Nie zauważyliśmy żadnego oczywistego przemieszczenia elektrod z postępującymi skurczami; Nie można jednak wykluczyć możliwości nieznacznego przesunięcia elektrod, co może mieć wpływ na stymulację mięśni. Ponadto elektromiografia domięśniowa (EMG) nie została wykonana w połączeniu z protokołem bodźca; jednakże włączenie pomiarów EMG może być wykonalne, jeśli jest to pożądane i właściwe dla modelu eksperymentalnego będącego przedmiotem zainteresowania.
Ocena siły prostownika kolana w mysich modelach urazów i chorób ortopedycznych ułatwi badania przedkliniczne o znaczącym znaczeniu translacyjnym dla klinicznych miar siły. Nasz protokół umożliwia precyzyjną i wielokrotną ocenę maksymalnej siły prostownika stawu kolanowego u myszy za pomocą komercyjnie dostępnego sprzętu dostępnego w każdym laboratorium.
Oświadczenia
Matthew Borkowski jest zatrudniony w Aurora Scientific Inc., firmie, która może potencjalnie skorzystać z wyników badań, a także jest dyrektorem wykonawczym firmy.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Rosario Maroto za pomoc techniczną. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody R01 AR072061 (CSF). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1300A: 3-w-1 Whole Animal System - Mysz | Aurora Scientific Incorporated | 300D-305C-FP: silnik dwutrybowy z niestandardowym aparatem do prostowania kolana, 605A: Dynamiczny system akwizycji i analizy danych mięśniowych, 701C: Stymulator elektryczny, 809C: in-situ Aparat | |
| 6100 Dynamiczna kontrola mięśni Oprogramowanie LabBook | Aurora Scientific Incorporated | DMC v6.000 | |
| 611A Dynamiczny Analiza mięśni | Aurora Scientific Incorporated | DMA v5.501 | |
| Maszynki do strzyżenia włosów BravMini | Wahl Clipper Corporation | ASIN: B00IN24ILE | |
| Smar do oczu | Optixcare | Numer artykułu: 142422 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| V-1 Stołowy laboratoryjny system znieczulenia zwierząt | VetEquip Systemy znieczulenia wziewnego | Numer przedmiotu: 901806 | |
| Prism 8 | GraphPad Software, LLC | Wersja 8.3.0 (328) |
Bibliografia
- Brightwell, C. R., et al. Moderate-intensity aerobic exercise improves skeletal muscle quality in older adults. Translational Sports Medicine. 2 (3), 109-119 (2019).
- Moro, T., et al. Muscle protein anabolic resistance to essential amino acids does not occur in healthy older adults before or after resistance exercise training. Journal of Nutrition. 148 (6), 900-909 (2018).
- Angelozzi, M., et al. Rate of force development as an adjunctive outcome measure for return-to-sport decisions after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Orthopedic Sports Physical Therapy. 42 (9), 772-780 (2012).
- Kalyani, R. R., et al. Quadriceps strength, quadriceps power, and gait speed in older U.S. adults with diabetes mellitus: results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2002. Journal of American Geriatric Society. 61 (5), 769-775 (2013).
- Culvenor, A. G., Ruhdorfer, A., Juhl, C., Eckstein, F., Øiestad, B. E. Knee extensor strength and risk of structural, symptomatic, and functional decline in knee osteoarthritis: A systematic review and meta-analysis. Arthritis Care Res (Hoboken). 69 (5), 649-658 (2017).
- Abramowitz, M. K., et al. Skeletal muscle fibrosis is associated with decreased muscle inflammation and weakness in patients with chronic kidney disease. American Journal of Physiology and Renal Physiology. 315 (6), 1658-1669 (2018).
- Arentson-Lantz, E. J., English, K. L., Paddon-Jones, D., Fry, C. S. Fourteen days of bed rest induces a decline in satellite cell content and robust atrophy of skeletal muscle fibers in middle-aged adults. Journal of Applied Physiology. 120 (1985), 965-975 (2016).
- Pratt, S. J. P., Lovering, R. M. A stepwise procedure to test contractility and susceptibility to injury for the rodent quadriceps muscle. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Kwok, J., et al. Histopathological analyses of murine menisci: implications for joint aging and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 24 (4), 709-718 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
- Wurtzel, C. N., et al. Pharmacological inhibition of myostatin protects against skeletal muscle atrophy and weakness after anterior cruciate ligament tear. Journal of Orthopedic Research. 35 (11), 2499-2505 (2017).
- Botter, A., et al. Atlas of the muscle motor points for the lower limb: implications for electrical stimulation procedures and electrode positioning. European Journal of Applied Physiology. 111 (10), 2461-2471 (2011).
- Gobbo, M., Maffiuletti, N. A., Orizio, C., Minetto, M. A. Muscle moter point identification is essential for optimizing neuromuscular electrical stimulation use. Journal of Neuroengineering and Rehabililitation. 11, 17(2014).
- Neelakantan, H., et al. Small molecule nicotinamide N-methyltransferase inhibitor activates senescent muscle stem cells and improves regenerative capacity of aged skeletal muscle. Biochemical Pharmacology. 163, 481-492 (2019).
- Kline, P. W., Morgan, K. D., Johnson, D. L., Ireland, M. L., Noehren, B. Impaired quadriceps rate of torque development and knee mechanics after anterior cruciate ligament reconstruction with patellar tendon autograft. American Journal of Sports Medicine. 43 (10), 2553-2558 (2015).
- Hiemstra, L. A., Webber, S., MacDonald, P. B., Kriellaars, D. J. Knee strength deficits after hamstring tendon and patellar tendon anterior cruciate ligament reconstruction. Medicine and Science in Sports and Exercise. 32 (8), 1472-1479 (2000).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198(2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. Journal of Visualized Experiments. (56), e3167(2011).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskeletal Disorder. 12, 246(2011).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487(2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696(2019).
- Davis, C. C., Ellis, T. J., Amesur, A. K., Hewett, T. E., Di Stasi, S. Improvements in knee extension strength are associated with improvements in self-reported hip function following arthroscopy for femoroacetabular impingement syndrome. International Journal of Sports Physical Therapy. 11 (7), 1065-1075 (2016).
- Omori, G., et al. Quadriceps muscle strength and its relationship to radiographic knee osteoarthritis in Japanese elderly. Journal of Orthopedic Science. 18 (4), 536-542 (2013).
- Wilk, K. E., Romaniello, W. T., Soscia, S. M., Arrigo, C. A., Andrews, J. R. The relationship between subjective knee scores, isokinetic testing, and functional testing in the ACL-reconstructed knee. Journal of Orthopedic Sports and Physical Therapy. 20 (2), 60-73 (1994).
- Bobowik, P., Wiszomirska, I. Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly. Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).
Przedruki i uprawnienia
