Protokół przedstawia metodę hodowli i przetwarzania organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych wyizolowanych z tylnej brodawki smakowej dorosłych myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie i hodowla organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych smakowych dorosłych myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zmysł smaku jest zapośredniczony przez kubki smakowe na języku, które składają się z szybko odnawiających się komórek receptorów smaku (TRC). Ta ciągła rotacja jest zasilana przez lokalne komórki progenitorowe i sprawia, że funkcja smaku jest podatna na zakłócenia przez wiele zabiegów medycznych, co z kolei poważnie wpływa na jakość życia. W związku z tym badanie tego procesu w kontekście leczenia farmakologicznego ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, czy i w jaki sposób wpływa to na funkcję progenitorów smaku i produkcję TRC. Biorąc pod uwagę obawy etyczne i ograniczoną dostępność ludzkiej tkanki smakowej, powszechnie stosuje się modele mysie, które mają system smakowy podobny do ludzkiego. W porównaniu z metodami in vivo, które są czasochłonne, drogie i nie nadają się do badań wysokoprzepustowych, organoidy językowe myszy mogą umożliwić szybkie przeprowadzanie eksperymentów z wieloma powtórzeniami i mniejszą liczbą myszy. W tym miejscu dostosowano wcześniej opublikowane protokoły i przedstawiono znormalizowaną metodę generowania organoidów smakowych z komórek progenitorowych smaku wyizolowanych z brodawki obwodowej (CVP) dorosłych myszy. Komórki progenitorowe smaku w CVP wyrażają LGR5 i można je wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją EGFP (FACS) od myszy z allelem Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. Posortowane komórki są siane na matrycowym systemie hodowli 3D na bazie żelu matrycowego i hodowane przez 12 dni. Organoidy rozwijają się przez pierwsze 6 dni okresu hodowli poprzez proliferację, a następnie wchodzą w fazę różnicowania, podczas której wytwarzają wszystkie trzy typy komórek smakowych wraz z komórkami nabłonkowymi bez smaku. Organoidy można zbierać po dojrzewaniu w 12 dniu lub w dowolnym momencie procesu wzrostu w celu ekspresji RNA i analizy immunohistochemicznej. Standaryzacja metod hodowli organoidów językowych z dorosłych komórek macierzystych poprawi odtwarzalność i przyczyni się do rozwoju organoidów językowych jako potężnego narzędzia badań przesiewowych leków w walce o pomoc pacjentom doświadczającym dysfunkcji smaku.
Wprowadzenie
U gryzoni językowe kubki smakowe są umieszczone w brodawkach grzybowych rozmieszczonych z przodu, obustronnych brodawkach liściastych z tyłu, a także w pojedynczej brodawce obwodowej (CVP) na tylnej linii środkowej języka1. Każdy kubek smakowy składa się z 50-100 krótkotrwałych, szybko odnawiających się komórek receptora smaku (TRC), w tym komórek podporowych typu I, komórek typu II, które wykrywają słodkie, gorzkie i umami, oraz komórek typu III, które wykrywają kwaśne2,3,4. U myszy CVP, komórki macierzyste LGR5+ wzdłuż blaszki podstawnej wytwarzają wszystkie typy TRC, a także komórki nabłonkowe bez smaku5. Podczas odnawiania linii smaku, komórki potomne LGR5 są najpierw określane jako postmitotyczne komórki prekursorowe smaku (komórki typu IV), które wchodzą do kubka smakowego i są zdolne do różnicowania się w dowolny z trzech typów TRC6. Szybki obrót TRC sprawia, że system smakowy jest podatny na zakłócenia spowodowane zabiegami medycznymi, w tym radioterapią i niektórymi terapiami lekowymi7,8,9,10,11,12,13. W związku z tym badanie układu smakowego w kontekście regulacji komórek macierzystych smaku i różnicowania TRC ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak łagodzić lub zapobiegać dysfunkcjom smaku.
Myszy są tradycyjnym modelem do badań in vivo w nauce o smaku, ponieważ mają system smaku zorganizowany podobnie jak ludzie14,15,16. Jednak myszy nie są idealne do badań wysokoprzepustowych, ponieważ są drogie w utrzymaniu i czasochłonne w obsłudze. Aby temu zaradzić, w ostatnich latach opracowano metody hodowli organoidów in vitro. Organoidy smakowe mogą być generowane z natywnej tkanki CVP, w procesie, w którym organoidy pączkują z izolowanego nabłonka CVP myszy hodowanego ex vivo17. Organoidy te wykazują wielowarstwowy nabłonek zgodny z systemem smaku in vivo. Bardziej wydajny sposób generowania organoidów, który nie wymaga hodowli CVP ex vivo, został opracowany przez Ren et al. w 201418. Adaptując metody i pożywki hodowlane opracowane po raz pierwszy do hodowli organoidów jelitowych, wyizolowali pojedyncze komórki progenitorowe Lgr5-GFP+ z CVP myszy i posiali je w żelu macierzowym19. Te pojedyncze komórki wygenerowały organoidy językowe, które namnażają się w ciągu pierwszych 6 dni hodowli, zaczynają różnicować się około 8 dnia, a pod koniec okresu hodowli zawierają komórki nabłonkowe bez smaku i wszystkie trzy typy TRC18,20. Do tej pory opublikowano wiele badań wykorzystujących lingwalny model organoidowy17,18,20,21,22; jednak metody i warunki hodowli stosowane do generowania tych organoidów różnią się w zależności od publikacji (tabela uzupełniająca 1). W związku z tym metody te zostały tutaj dostosowane i zoptymalizowane, aby przedstawić szczegółowy znormalizowany protokół hodowli organoidów językowych pochodzących z progenitorów LGR5 + CVP dorosłych myszy.
Organoidy językowe stanowią unikalny model do badania procesów biologicznych komórek napędzających rozwój i odnowę komórek smakowych. Wraz z rozszerzaniem się zastosowań organoidów językowych i coraz większą liczbą laboratoriów zmierzających w kierunku wykorzystania modeli organoidów in vitro, ważne jest, aby dziedzina ta dążyła do opracowania i przyjęcia znormalizowanych protokołów w celu poprawy odtwarzalności. Ustanowienie organoidów językowych jako standardowego narzędzia w nauce o smaku umożliwiłoby przeprowadzenie badań o wysokiej przepustowości, które pozwoliłyby ustalić, w jaki sposób pojedyncze komórki macierzyste generują zróżnicowane komórki dorosłego układu smakowego. Ponadto organoidy językowe mogą zostać wykorzystane do szybkiego badania przesiewowego leków pod kątem potencjalnego wpływu na homeostazę smaku, co można następnie dokładniej zbadać na modelach zwierzęcych. Podejście to ostatecznie przyczyni się do zwiększenia wysiłków na rzecz opracowania terapii, które poprawią jakość życia przyszłych biorców leków.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone w obiekcie akredytowanym przez AAALAC, zgodnie z Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych, Ustawą o Dobrostanie Zwierząt oraz Polityką Publicznej Służby Zdrowia i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kolorado Kampus Medyczny Anschutz. Myszy Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 używane w tym protokole pochodzą z The Jackson Laboratory, numer magazynowy 008875.
UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonane przed rozpoczęciem, aby zapewnić płynny i terminowy postęp protokołu: ustawić łaźnię wodną na 37 °C, ustawić wirówkę na 4 °C, przygotować roztwory enzymów do wstrzykiwań i dysocjacji z 10 mg/ml roztworów podstawowych Dyspazy, Kolagenazy i Elastazy (zobacz Tabelę Materiałów), wyjąć żel matrycowy z zamrażarki o temperaturze -20 °C (~750 μl potrzebne na płytkę 48-dołkową) i rozmrozić, zanurzając fiolkę w lodzie na co najmniej 3-4 godziny, wstępnie pokryć probówki mikrowirówek w nierozcieńczonym FBS, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut (dwie probówki o pojemności 2 ml do pobrania tkanek, dwie probówki o pojemności 1,5 ml do komórek zdysocjowanych, oraz jedną probówkę o pojemności 1,5 ml do pobierania pojedynczych komórek z sortownika komórek; usuń nadmiar FBS przed użyciem).
1. Izolacja nabłonka CVP
UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą ilość komórek LGR5+ na pełną 48-dołkową płytkę, zbierz trzy CVP Lgr5-EGFP w tej samej probówce i przetwarzaj jednocześnie. Co ważne, należy zebrać i przetworzyć CVP co najmniej jednego rodzeństwa z miotu typu dzikiego równolegle w osobnej probówce i wykorzystać je jako kontrolę bramkowania do ustawienia parametrów FACS (patrz Reprezentatywne wyniki).
- Poddać myszy eutanazji za pomocą uduszenia CO2 zgodnie z przepisami IACUC, a następnie zatwierdzoną metodą wtórną, taką jak obustronna torakotomia, zwichnięcie szyjki macicy, dekapitacja lub wykrwawienie.
- Użyj dużych sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć policzki i złamać szczękę. Podnieś język i przetnij wędzidełko językowe, aby oddzielić język od dna jamy ustnej. Wytnij język i zbierz go w sterylnej, lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (dPBS) z Ca2+ i Mg2+.
- Usuń i odrzuć przedni język, przecinając żyletką tylko przednią część wyniosłości międzytrzonowej (Rysunek 1A, linia przerywana). Użyj delikatnej chusteczki do włosów, aby usunąć wszelkie włosy i nadmiar płynu z tylnego języka.
- Napełnij 1 ml strzykawki 200-300 μl roztworu enzymu do wstrzykiwań (końcowe stężenie: 2 mg/ml kolagenazy typu I i 5 mg/ml dypazy II w Ca2+/Mg2+ zawierającym dPBS, rozcieńczonym z roztworów podstawowych 10 mg/mL) i włóż igłę 30 G x 1/2 tuż nad wyniosłością międzytrzonową (Rysunek 1B, strzałka) aż do przodu CVP (Rysunek 1B, skrzynka). Wstrzyknąć roztwór enzymu pod i na bocznych krawędziach CVP między nabłonkiem a leżącymi pod nim tkankami (blaszka właściwa, mięsień). Podczas wykonywania wstrzyknięcia należy powoli i w sposób ciągły wyjmować strzykawkę z języka.
- Inkubować język w sterylnym dPBS wolnym od Ca2+/Mg2+ w temperaturze pokojowej dokładnie przez 33 minuty.
- Wykonuj małe nacięcia w nabłonku obustronnie i tuż przed CVP za pomocą bardzo drobnych nożyczek preparacyjnych i delikatnie obierz nabłonek, podnosząc go cienkimi kleszkami. Gdy nabłonek rowu zostanie wolny od leżącej pod nim tkanki łącznej, umieść go w pustej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml wstępnie pokrytej FBS. Wykonaj przycinanie nabłonka przed lub po odłączeniu nabłonka CVP (Rysunek 1C,D).
2. Dysocjacja nabłonka CVP
UWAGA: Dysocjacja nabłonka CVP i poszycia jest przedstawiona graficznie w Rysunek 2.
- Dodać koktajl enzymów dysocjacyjnych (końcowe stężenie: 2 mg/ml kolagenazy typu I, 2 mg/ml elastazy i 5 mg/ml dypazy II w Ca2+/Mg2+ zawierających dPBS, rozcieńczony z roztworów podstawowych 10 mg/mL) do probówek zawierających złuszczony nabłonek CVP (200 μl na CVP). Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 45 minut. Wirować krótko co 15 minut.
UWAGA: Podgrzej 0,25% trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C podczas ostatnich 15 minut inkubacji koktajlu enzymatycznego. - Po inkubacji wirować (trzy impulsy), a następnie rozcierać szklaną pipetą Pasteura przez 1 minutę. Po ustabilizowaniu się fragmentów tkanki, należy pipetować supernatant zawierający pierwszą kolekcję zdysocjowanych komórek do nowych probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml pokrytych FBS odpowiadających genotypowi. Pozostałe fragmenty tkanki należy poddać dalszej obróbce zgodnie z opisem w kroku 2.3. poniżej.
- Wirować supernatant przez 5 minut w temperaturze 370 x g i temperaturze 4 °C do osadzania komórek.
- Usunąć powstały supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7,0) i 1% FBS w PBS wolnym od Ca2+/Mg2+ (50 μL na CVP)). Przechowywać na lodzie.
- Wykonując kroki 2.2.1 i 2.2.2, należy oddzielić pozostałe fragmenty tkanek z kroku 2.2, dodając wstępnie podgrzane 0,25% trypsyny-EDTA (200 μl na CVP) do oryginalnych probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. Wirować krótko co 10 minut.
- Po inkubacji należy zwirować probówkę zawierającą kawałki tkanki (trzy impulsy), a następnie rozcierać szklaną pipetą Pasteura przez 1 minutę. Po ustabilizowaniu się fragmentów tkanki należy odpipetować supernatant do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających komórki z kroku 2.2.2. Wyrzucić probówki zawierające pozostałe kawałki tkanki.
- Wirować probówki ze zdysocjowanymi komórkami przez 5 minut w temperaturze 370 x g i 4 °C do osadzania komórek.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w buforze FACS (100 μl na CVP). Przechowywać na lodzie.
- Przepuść komórki przez nylonowy filtr siatkowy o grubości 30 μm i dodaj DAPI (emisja λ = 450 nm) do mieszanin komórek przed FACS. Wyizolować komórki Lgr5-GFP+ za pomocą FACS za pomocą kanału białka zielonej fluorescencji (wzbudzenie λ = 488 nm;emisja λ = 530 nm). Sortuj komórki za pomocą dyszy 100 μm do świeżej, pokrytej FBS probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 300 μl dPBS wolnego od Ca2 + / Mg2+. Umieść komórki na lodzie do momentu poszycia.
3. Posiewanie komórek Lgr5-EGFP
- Określ objętość zawiesiny komórek LGR5+ otrzymanej z cytometru przepływowego.
- Na podstawie liczby komórek uzyskanych z sortera oblicz liczbę komórek na μl. Następnie określ objętość potrzebną do uzyskania pożądanej liczby komórek do posiewu (używamy 200 komórek na dołek 48-dołkowej płytki) i przenieś tę całkowitą objętość zawieszonych komórek do nowej probówki mikrowirówkowej.
- Wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 370 x g i 4 °C, aby osadzać komórki (osadka może nie być widoczna). Usunąć supernatant i umieścić probówkę na lodzie.
- Delikatnie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości żelu matrycowego (15 μl na studzienkę dla płytek 48-dołkowych); delikatnie pipetować w górę i w dół, aby dokładnie rozprowadzić komórki w żelu matrycowym. Umieść 15 μl mieszaniny żelu matrycowego i komórek na środku każdej studzienki. Podczas galwanowania trzymaj probówkę mikrowirówki na lodzie w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby zapobiec żelowaniu matrycy. Kontynuuj mieszanie mieszaniny żelu matrycowego i komórek przez cały czas powlekania, pipetując w górę iw dół co trzy dołki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w dołkach.
- Umieść płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, ~95% wilgotności) na 10 minut, aby umożliwić żelowanie matrycy. Następnie dodaj 300 μl pożywki WENRAS + Y27632 o temperaturze pokojowej do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.
4. Utrzymanie organoidów
UWAGA: Organoidy są hodowane na konwencjonalnych podłożach organoidowych (WENR) składających się z rekombinowanego EGF i 50% kondycjonowanych pożywek zawierających Wnt3a, Noggin i R-spondin23. Leki A8301 i SB202190 dodaje się przez pierwsze 6 dni okresu hodowli w celu optymalizacji wzrostu (pożywka WENRAS) (Rysunek 5), a następnie usuwa się w celu promowania różnicowania (pożywki WENR )20. Y27632 jest dodawany na pierwsze 2 dni kultury, aby zwiększyć przetrwanie. Warunki pożywki w odniesieniu do osi czasu hodowli są przedstawione w Rysunek 4.
- Dwa dni po posiewie usuń pożywkę WENRAS + Y27632 z każdej studzienki za pomocą pipety o pojemności 1 ml, upewniając się, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego. Dodać 300 μl pożywki WENRAS po bokach studzienki, aby nie zakłócić działania żelu matrycowego. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
- Zmieniaj pożywkę co 2 dni, używając pożywki odpowiedniej do etapu hodowli (Rysunek 4). Utrzymuj organoidy do 12 dnia, kiedy organoidy są gotowe do zbioru.
5. Przetwarzanie RNA
- Pozyskiwanie organoidów na RNA
- Umieścić 48-dołkową płytkę na lodzie na 30 minut w celu depolimeryzacji żelu matrycowego.
- Używając pipety o pojemności 1 ml, wyciągnij podłoże organoidowe, a następnie, gdy podłoże zostanie zwrócone do studzienki, użyj końcówki pipety, aby zadrapać i dalej rozdrobnić żel matrycowy. Przenieść zawartość do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, zbierając zawartość trzech studzienek w jednej probówce. Wirować probówki przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
- Usunąć jak najwięcej supernatantu pożywki, nie usuwając żadnych organoidów, a następnie ponownie odwirowywać probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej o sile 300 x g.
- Usunąć pozostałą pożywkę i ponownie zawiesić organoidy w 350 μl buforu do lizy + β-merkaptoetanolu (βME) (10 μL βME na 1 ml buforu do lizy). Umieścić próbki na lodzie w celu natychmiastowej ekstrakcji RNA lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Ilościowa analiza RT-PCR
- Zmierz ilość RNA za pomocą spektrofotometru. Odwrotna transkrypcja RNA przy użyciu zestawu do syntezy cDNA.
- Wymieszaj cDNA odpowiadające 5 ng RNA z wstępnie zwalidowanymi starterami do przodu i do tyłu o długości 200 nM (Tabela 1) i fluorescencyjną mieszanką PCR Master. Przeprowadzić reakcję qRT-PCR przez 40 cykli w temperaturze: 95 °C przez 15 s, a następnie w temperaturze 60 °C przez 60 s.
6. Immunohistochemia
- Zbieranie i utrwalanie organoidów
- Umieść 48-dołkową płytkę na lodzie na 30 minut, aby poluzować żel matrycowy.
- Usuń pożywkę organoidową i dodaj 400 μl lodowatego PBS do każdej studzienki. Następnie usuń PBS i dodaj 400 μl lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek do każdej studzienki. Delikatne kołysanie w temperaturze 4 °C przez 30 min.
- Pokryj końcówkę pipety o pojemności 1 ml 1% BSA w PBS i delikatnie odpipetuj zawartość studzienki w górę i w dół, aby rozbić żel matrycowy. Przenieść organoidy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml umieszczonej na lodzie.
- Przepłukać każdą studzienkę 300 μl PBS + 1% BSA i przenieść pozostałe organoidy do odpowiednich probówek. Usuń Cell Recovery Solution/PBS + BSA z każdej probówki. Dodać 400 μl lodowatego PBS, a następnie powtórzyć z kolejnym lodowatym płukaniem PBS.
- Usunąć PBS i utrwalić organoidy za pomocą 300 μl lodowatego 4% PFA (w 0,1 M PB) przez 20 minut, inkubując w temperaturze pokojowej. Usunąć PFA i opłukać organoidy 400 μl lodowatego PBS.
- Usunąć PBS, a następnie dodać 400 μl PBS + 1% BSA. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Barwienie immunofluorescencyjne
- Opłucz organoidy w 500 μl PBS + 1% BSA. Następnie inkubuj organoidy w roztworze blokującym (5% normalnej surowicy koziej lub osłej, 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,3% Triton X 100 w 1x PBS pH 7,3) przez 2 godziny, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej.
- Dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym) i delikatnie kołysać przez 3 noce w temperaturze 4 °C.
- Organoidy myć 4x przez 1 godzinę 500 μL PBS + 0,2% Triton, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Dodać na noc roztwór przeciwciał drugorzędowych (przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym) i organoidy skalne, chronione przed światłem, w temperaturze 4 °C.
- Organoidy myć 3x przez 1 godzinę 500 μL PBS + 0,2% Triton, chronić przed światłem i delikatnie kołysać w temperaturze pokojowej. Inkubować z DAPI rozcieńczonym w stosunku 1:10 000 w 0,1 M PB przez 20 minut, kołysząc i przykrywając w temperaturze pokojowej.
- Płukać organoidy 3x przez 20 minut 0,1 M PB, delikatnie kołysząc i przykryć w temperaturze pokojowej.
- Mocowanie szkiełek organoidowych do odwróconej mikroskopii konfokalnej.
UWAGA: Zdjęcia krok po kroku procesu montażu prowadnicy są pokazane w Rysunek 7.- Stwórz kwadratowy obwód o grubości ~1 mm 22 x 22 mm z nietoksycznej plasteliny na szkiełku mikroskopowym.
- Usunąć 0,1 M PB z probówki do mikrowirówki i delikatnie zawiesić organoidy w wybranym podłożu montażowym o pojemności 100 μl, a następnie przenieść na środek glinianego kwadratu.
- Wypełnij gliniany kwadrat, aż podłoże montażowe znajdzie się prawie do góry. Następnie umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm na glinie i mocno dociśnij boki szkiełka nakrywkowego, aby je uszczelnić. Pozostaw do utwardzenia zgodnie z instrukcją producenta (tutaj w temperaturze pokojowej przez 1-2 dni) i przechowuj w temperaturze 4 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Myszy posiadają jeden CVP, zlokalizowany w tylnej części języka, z którego można wyizolować komórki macierzyste LGR5+ (Rysunek 1A, czarna ramka). Iniekcja roztworu enzymów pod i wokół CVP (Rysunek 1B) prowadzi do niewielkiego obrzęku nabłonka i trawienia tkanki łącznej. Wystarczające trawienie zostaje osiągnięte po 33 min inkubacji, co umożliwia łatwe oddzielenie nabłonka CVP od leżącej poniżej tkanki. Podczas próby oddzielenia nabłon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano tutaj wydajną i łatwo powtarzalną metodę hodowli, utrzymania i przetwarzania organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych smaku dorosłych myszy. Stwierdzono, że użycie trzech CVP od 8 do 20-tygodniowych myszy Lgr5-EGFP jest wystarczające do uzyskania ~ 10 000 komórek GFP+ do użytku eksperymentalnego, co daje 50 dołków posianych o gęstości 200 komórek na studzienkę na 48-dołkowych płytkach. Usuwanie nabłonka rowów CVP optymalizuje się poprzez wstrzyknięcie do nabłonka językowego ś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Dr. Peterowi Dempseyowi i Monice Brown (University of Colorado, Anschutz Medical Campus, Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) za dostarczenie mediów i cennych dyskusji. Dziękujemy również Centrum Onkologii Uniwersytetu Kolorado ds. Technologii Komórkowych i Cytometrii Przepływowej, a w szczególności Dmitrijowi Baturinowi, za specjalistyczną wiedzę w zakresie sortowania komórek. Praca ta została sfinansowana przez: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 oraz NIH/NCI R21 CA236480 do LAB oraz R21DC016131 i R21DC016131-02S1 do DG oraz F32 DC015958 do EJG.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciała | |||
| Alexa Fluor 546 Sondy molekularne IgG przeciwko kozom osłom | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 | |
| Alexa Fluor 546 Kozie sondy | molekularne | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Koza anty świnka morska IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 | Sondy molekularne | Osiołkowi A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Kozie anty szczurze IgG | Sondy molekularne | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (dla FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (do immunohistochemii) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Kozia anty-CAR4 | R& D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| anty-KRT13 | Acris | świnki morskiej BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Królik anty-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Królik anty-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Szczur anty-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Cyfrowy timer/stoper | Fisher Scientific | S407992 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 Zbiornik | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Inkubator CO2 z podnośnikiem wodnym | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, polerowana stal nierdzewna Model Steel |
| Incucyte | Sartorius | : | S3 Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Rdzeń cytometrii przepływowej Gates, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Wytrząsarka orbitalna | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| System PCR w czasie rzeczywistym | Biosystems Applied Biosystems | 4376600 | |
| Wirówka z chłodzeniem | Eppendorf | 5417R | |
| Spektrofotometr | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Termocykler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Łaźnia wodna | Precyzyjna | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stężenie zapasu 10 mM, końcowe stężenie 500 nM |
| Zaawansowane DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Suplement | Gibco | 17504044 | Stężenie zapasowe 50X, stężenie końcowe 1X |
| Gentamycyna | Gibco | 15750-060 | Koncentracja zapasowa 1000X, stężenie końcowe 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stężenie zapasu 100X, stężenie końcowe 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stężenie zapasu 100X, stężenie końcowe 1X |
| Mysz EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stężenie zapasu 500 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stężenie zapasowe 50 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 25 ng/mL |
| N-acetylo-L-cysteina | Sigma | A9165 | Stężenie zapasowe 0,5 M, stężenie końcowe 1 |
| mM Nikotynamid | Sigma | N0636-100g | Stężenie zapasowe 1 M, stężenie końcowe 1 mM |
| Długopis/Strep | Gibco | 15140-122 | Stężenie zapasowe 100X, stężenie końcowe 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Koncentracja zapasowa 500X, koncentracja końcowa 1X |
| SB202190 | R& D Systems | 1264 | Stężenie zapasów 10 mM, stężenie końcowe 0,4 &mikro; M |
| WRN Kondycjonowane podłoża | Otrzymane z Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Pochodzi od L-WRN (ATCC® CRL-3276&handel ;) komórki | ||
| Y27632 dihydochlorek 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stężenie zapasowe 10 mM, stężenie końcowe 10 &mikro; M |
| Inne | |||
| 1 ml TB Strzykawka | BD Strzykawka | 309659 | |
| 2-merkaptoetanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-merkaptoetanol |
| 2,0 ml Probówki do mikrowirówek | USA Scientific | 1420-2700 1420-2700 | |
| Płytki 48-dołkowe | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 cala Pipety Pasteura | Fisherbrand | 12-678-8A Albumina | |
| z surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Bufor do lizy RLT | QIAGEN | 1015750 | |
| Roztwór do odzyskiwania komórek | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Kolagenaza z Clostridium histolyticum, typ I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Typ 2, Pathclear | R& D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (proteaza obojętna, stopień II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Filtry jednorazowe | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ za darmo) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami z Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Kleszcze | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 11252-30 | |
| EDTA, 0,5 M (pH 8,0) | Promega | V4231 | |
| Liofilizowana elastaza | Worthington Biochemiczne | LS002292 | |
| Bardzo drobne nożyczki do bonn | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Roztwór HEPES | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0,25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| Zestaw do syntezy cDNA iScript | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modelina, szara | Sargent Art | 22-4084 | |
| Strzykawka z | igłą | 305106 | |
| Normalna surowica osła | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normalna surowica kozia | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Probówki Safe-Lock 1,5 ml | Eppendorf | 022363204 | |
| Chlorek sodu | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny | Bioreodczynniki Fisher | 7558-80-7 | |
| Szkiełka mikroskopowe SuperFrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| Szkło osłonowe VWR z mikro | VWR | 48366067 | 22x22mm |
Bibliografia
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12(2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285(2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442(2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934(2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185(2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004(2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118(2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
