Ten protokół opisuje, jak badać wszystkie możliwe kombinacje, które można uzyskać między czterema lekami w jednym eksperymencie. Metoda ta opiera się na standardowym teście mikrorozcieńczania na 96-dołkowej płytce i obliczeniu frakcyjnych stężeń hamujących (FIC) w celu oceny wyników.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Poczwórna szachownica: modyfikacja trójwymiarowej szachownicy do badania kombinacji leków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Koncepcja terapii skojarzonej staje się bardzo ważna, głównie wraz z drastycznym wzrostem oporności na leki. Poczwórna szachownica, zwana również szachownicą Q, ma na celu maksymalizację liczby możliwych kombinacji, które można uzyskać między czterema lekami w jednym eksperymencie, aby zminimalizować czas i pracę potrzebną do osiągnięcia tych samych wyników przy użyciu innych protokołów. Protokół ten opiera się na prostej technice mikrorozcieńczania, w której leki są rozcieńczane i łączone razem w kilku 96-dołkowych płytkach.
W pierwszym zestawie 96-dołkowych płytek dodaje się bulion Mullera-Hintona, a następnie pierwszy wymagany lek (np. tutaj Cefotaxim), aby go seryjnie rozcieńczyć. Po wykonaniu pierwszego etapu, kolejny zestaw 96-dołkowych płytek jest używany do rozcieńczenia drugiego leku (np. Amikaci), który zostanie przeniesiony poprzez usunięcie określonej objętości leku 2 i umieszczony w odpowiednich dołkach w pierwszym zestawie 96-dołkowych płytek, który zawiera lek pierwszy. Trzeci krok polega na dodaniu wymaganych stężeń trzeciego leku (np. Lewofloksacyny) do odpowiednich płytek w zestawie początkowym zawierającym kombinację leku 1 i 2. Czwarty krok wykonuje się poprzez dodanie wymaganych stężeń czwartego leku (np. trimetoprimu-sulfametoksazolu) do odpowiednich płytek w pierwszym zestawie. Następnie zostanie przygotowany i dodany inokulum bakteryjne E. coli ESBL.
Ta metoda jest ważna do oceny wszystkich możliwych kombinacji i daje szerszy zakres możliwości do testowania dodatkowo do testów in vivo. Pomimo tego, że jest to męcząca technika wymagająca dużego skupienia, wyniki są niezwykłe i oszczędzają czas, ponieważ w jednym eksperymencie można przetestować wiele kombinacji.
Wprowadzenie
Wraz ze wzrostem oporności spowodowanym nadużywaniem i niewłaściwym stosowaniem antybiotyków1,2, potrzeba opracowania nowych leków i środków do leczenia infekcji bakteryjnych stała się kluczowa. Nowe podejścia, takie jak opracowywanie nowych leków, są bardzo ważne dla przezwyciężenia kryzysu związanego z opornością. Przemysł farmaceutyczny nie jest jednak zainteresowany opracowywaniem nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Co więcej, jeśli zostaną opracowane nowe leki, bakterie będą nadal ewoluować i rozwijać oporność przeciwko tym nowym lekom3,4. W ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Kroki przygotowawcze
- Przygotować bulion Müller-Hinton (MHB), dodając 25 g bulionu MH do 1 l wody destylowanej i wymieszać. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 2,5 h. Następnie przechowuj autoklawowane media w temperaturze pokojowej lub w lodówce.
- Przeprowadzić subhodowlę badanych bakterii (E. coli ESBL) na pożywce agarowej przy użyciu metody smug czterokwadrantowych i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- Za pomocą sterylnej pętli weź jedną kolonię i rozprowadź ją w pierwszej połowie płytki agarowej MacConkey, wykonując bliskie równoległe smugi.
- Za pomocą pętli rozprowadź bakterie w drugiej ćwiartce, przesu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 2A przedstawia wyniki uzyskane po połączeniu cefotaksimu i amikacyny z określonymi stężeniami lewofloksacyny oraz trimetoprymu-sulfametoksazolu. W lewej części rysunku widoczne są cztery płytki, których schematy wraz ze stężeniami leków znajdują się w prawej części rysunku. Strzałki wskazują studzienki na granicy wzrostu/braku wzrostu. Kolorowe studzienki to te, w których odnotowano wzrost. Zauważamy, że na czwartej płytce nie występuje wzrost w kwadrancie zawierającym kombinację lek.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda poczwórnej szachownicy przypomina w swoim protokole szachownicę i trójwymiarową szachownicę. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka kluczowych kroków, aby uniknąć błędów podczas eksperymentu.
Upewnij się, że przetestowałeś MIC każdego leku w stosunku do badanego izolatu przed rozpoczęciem protokołu, aby wiedzieć, jakie są stężenia, które są potrzebne do rozpoczęcia rozcieńczania dla leku 1 i leku 2, które należy seryjnie rozcieńczać w płytkach. W odniesieniu do leku 3 i leku 4 należy równi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1000 &mikro; L końcówki | Citotest | 4330000402 | |
| 200 & mikro; Końcówki L | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 ml probówka wirówkowa | 430828 do | przygotowania leku 3 i 4 | |
| 5 ml polistyrenu okrągłodenna probówka | Falcon | 352058 | Do przygotowania inokulum bakteryjnego 0,5 MacFarlanda |
| Szalki Petriego 90 mm | JRZ Plastilab | Jako łóżko do dodawania roztworów za pomocą pipety wielokanałowej | |
| 96-dołkowe płytki | corning | 3596 | Do seryjnego rozcieńczania i łączenia leków |
| Bactrim 200, 40 mg (trimetoprim-sulametoksazol | Przez CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, Francja | 10177403 | Lek 4 |
| Ceforan, 1 g (Cefotaksym) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Lek 1 |
| Densytometr | |||
| Szczep E. Coli ESBL | Odzyskany jako szczep medyczny z Saint-George Szpital Liban | Szczep bakteryjny | |
| Mac Conkey + agar krystaliczny | fioletowy BIO-RAD | 64169508 | Do wytwarzania płytek agarowych używanych do subkulturu |
| Miacin 500 mg/2 ml (Amikacyna) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Lek 2 |
| Rosół Muller-Hinton | BIO-RAD | 69444 | Do wytwarzania pożywek bakteryjnych |
| Pipeta wielokanałowa | Thermo Scientific | GJ54761 | Do seryjnego rozcieńczania i dodawania pożywki, bakterii i leków |
| Taśma | |||
| Pipety jednokanałowe | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | Do dodawania pożywki, bakterii i leków |
| Tavanic, 500 mg (Lewofloksacyna) | sanofi aventis | 221937/2009 | Lek 3 |
Bibliografia
- Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. <....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
