Poczwórna szachownica: modyfikacja trójwymiarowej szachownicy do badania kombinacji leków

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak badać wszystkie możliwe kombinacje, które można uzyskać między czterema lekami w jednym eksperymencie. Metoda ta opiera się na standardowym teście mikrorozcieńczania na 96-dołkowej płytce i obliczeniu frakcyjnych stężeń hamujących (FIC) w celu oceny wyników.

Streszczenie

Koncepcja terapii skojarzonej staje się bardzo ważna, głównie wraz z drastycznym wzrostem oporności na leki. Poczwórna szachownica, zwana również szachownicą Q, ma na celu maksymalizację liczby możliwych kombinacji, które można uzyskać między czterema lekami w jednym eksperymencie, aby zminimalizować czas i pracę potrzebną do osiągnięcia tych samych wyników przy użyciu innych protokołów. Protokół ten opiera się na prostej technice mikrorozcieńczania, w której leki są rozcieńczane i łączone razem w kilku 96-dołkowych płytkach.

W pierwszym zestawie 96-dołkowych płytek dodaje się bulion Mullera-Hintona, a następnie pierwszy wymagany lek (np. tutaj Cefotaxim), aby go seryjnie rozcieńczyć. Po wykonaniu pierwszego etapu, kolejny zestaw 96-dołkowych płytek jest używany do rozcieńczenia drugiego leku (np. Amikaci), który zostanie przeniesiony poprzez usunięcie określonej objętości leku 2 i umieszczony w odpowiednich dołkach w pierwszym zestawie 96-dołkowych płytek, który zawiera lek pierwszy. Trzeci krok polega na dodaniu wymaganych stężeń trzeciego leku (np. Lewofloksacyny) do odpowiednich płytek w zestawie początkowym zawierającym kombinację leku 1 i 2. Czwarty krok wykonuje się poprzez dodanie wymaganych stężeń czwartego leku (np. trimetoprimu-sulfametoksazolu) do odpowiednich płytek w pierwszym zestawie. Następnie zostanie przygotowany i dodany inokulum bakteryjne E. coli ESBL.

Ta metoda jest ważna do oceny wszystkich możliwych kombinacji i daje szerszy zakres możliwości do testowania dodatkowo do testów in vivo. Pomimo tego, że jest to męcząca technika wymagająca dużego skupienia, wyniki są niezwykłe i oszczędzają czas, ponieważ w jednym eksperymencie można przetestować wiele kombinacji.

Wprowadzenie

Wraz ze wzrostem oporności spowodowanym nadużywaniem i niewłaściwym stosowaniem antybiotyków^1,2, potrzeba opracowania nowych leków i środków do leczenia infekcji bakteryjnych stała się kluczowa. Nowe podejścia, takie jak opracowywanie nowych leków, są bardzo ważne dla przezwyciężenia kryzysu związanego z opornością. Przemysł farmaceutyczny nie jest jednak zainteresowany opracowywaniem nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Co więcej, jeśli zostaną opracowane nowe leki, bakterie będą nadal ewoluować i rozwijać oporność przeciwko tym nowym lekom^3,4. W związku z tym problem oporności nie zostanie rozwiązany, co sprawia, że potrzeba innego podejścia jest koniecznością, którą należy rozważyć i zbadać, aby przezwyciężyć oporność bakterii.

Kombinacja leków to bardzo ważna koncepcja leczenia infekcji bakteryjnych, głównie tych, które są wywoływane przez patogeny wielolekooporne^5,6. Skraca przebieg leczenia, zmniejsza podawaną dawkę; W ten sposób zmniejszenie toksyczności danego leku, pomaga w zmniejszeniu tempa rozwoju oporności i w pewnym sensie uwrażliwia bakterie na dane leki, zgodnie z opisem w pojęciu czułości ubocznej^5,7,8,9.

Rozwój oporności na jeden lek wymaga pojedynczej mutacji; jednak rozwój oporności na kombinację leków ukierunkowanych na wiele szlaków wymaga kilku niezależnych mutacji, które są spowalniane przez tę kombinację. Przykładem zmniejszonej oporności podczas stosowania terapii skojarzonej jest obniżony wskaźnik oporności na ryfampicynę w Mycobacterium tuberculosis¹⁰. Innym przykładem jest badanie przeprowadzone przez Gribble i wsp., które wykazało, że tempo pojawiania się opornych szczepów u pacjentów przyjmujących samą piperacylinę jest wyższe niż u pacjentów przyjmujących kombinację karboksypenicyliny i aminoglikozydu¹⁰. Badania wykazały, że rozwój oporności na aminoglikozydy u ewoluujących bakterii sprawił, że szczepy te stały się wrażliwe na różne inne leki⁵. Połączenie leku z grupy beta-laktamów amoksycyliny i inhibitora laktamazy, kwasu klawulanowego, wykazało sukces w leczeniu opornych szczepów bakteryjnych⁸.

Skrócenie czasu leczenia jest dobrą zaletą wynikającą z kombinacji leków. Na przykład, terapia skojarzoną penicyliną lub ceftriaksonem z gentamycyną przez 2 tygodnie da taką samą skuteczność, jak penicylina lub sam ceftriakson, gdy jest podawana przez 4 tygodnie¹¹. Łączenie leków pozwala na stosowanie niższych dawek leków, które nie są skuteczne, gdy są podawane samodzielnie, takich jak Sub-MIC. Przykład sulfonamidów można podać, gdzie stosowanie potrójnych sulfonamidów minimalizuje, przy niższych dawkach, wytwarzaną toksyczność, którą jest tworzenie się kryształów lub krystaluria przy stosowaniu nierozpuszczalnych sulfonamidów w pełnych dawkach¹².

Tak więc, zmniejszenie podawanej dawki i czasu leczenia ostatecznie zmniejszy toksyczność leków na organizm. Pomysł opracowania metod oceny interakcji między lekami złożonymi jest bardzo ważny. W jednym z badań wyniki wykazały, że terapia skojarzona jest bardziej skuteczna w leczeniu opornych gatunków Acinetobacter i P. aeruginosa⁸.

Podawanie leków w połączeniu
Istnieją różne metody, za pomocą których możemy badać kombinacje leków, takie jak metoda szachownicy, metoda krzywej zabijania w czasie i metoda testu E¹³. Metoda szachownicy może badać wszystkie możliwe kombinacje między dwoma danymi lekami w jednym eksperymencie. Ponadto został opracowany do badania kombinacji trzech leków¹⁴. Teraz rozszerzamy tę metodę, aby zbadać kombinację czterech leków, głównie do leczenia patogenów wielolekoopornych.

Test krzywej zabijania w czasie jest zwykle wykonywany w celu sprawdzenia bakteriobójczego działania określonego leku. Stosowano go również do testowania wpływu kombinacji leków, w których kilka leków jest łączonych w określonych stężeniach. Protokół ten wymaga przygotowania kilku sterylnych probówek lub kubków, w których do każdej filiżanki dodajemy bulion, kombinację leków i wymagany szczep bakterii. Po inkubacji i zarejestrowaniu gęstości optycznej w kilku punktach czasowych, wyniki są porównywane z normalnym tempem wzrostu użytego szczepu, aby sprawdzić, czy tempo wzrostu wzrosło, zmniejszyło się, czy nie uległo zmianie¹³.

Metoda testu E jest zwykle wykonywana w celu sprawdzenia minimalnego stężenia hamującego (MIC), gdzie pasek zawierający gradientowe stężenie danego leku jest umieszczany na zaszczepionej płytce. Został on również wykorzystany do przetestowania kombinacji między dwoma lekami, w której dwa paski są dodawane do płytki w sposób prostopadły, przecinając się w ich MICs¹³.

Według literatury, nie ma złotego standardu do definiowania i badania synergii; dlatego trudno jest ocenić, która z metod używanych do badania kombinacji jest lepsza i która daje lepsze i bardziej wiarygodne wyniki¹³. Jednak test zabijania czasu jest pracochłonny, czasochłonny i kosztowny^15,16, podczas gdy metoda E-test została opracowana do badania kombinacji tylko dwóch leków. Checkerboard może badać wszystkie możliwe kombinacje między dwoma testowanymi lekami i dlatego ta technika została wybrana do opracowania.

Protokół

1. Kroki przygotowawcze

1. Przygotować bulion Müller-Hinton (MHB), dodając 25 g bulionu MH do 1 l wody destylowanej i wymieszać. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 2,5 h. Następnie przechowuj autoklawowane media w temperaturze pokojowej lub w lodówce.
2. Przeprowadzić subhodowlę badanych bakterii (E. coli ESBL) na pożywce agarowej przy użyciu metody smug czterokwadrantowych i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   1. Za pomocą sterylnej pętli weź jedną kolonię i rozprowadź ją w pierwszej połowie płytki agarowej MacConkey, wykonując bliskie równoległe smugi.
   2. Za pomocą pętli rozprowadź bakterie w drugiej ćwiartce, przesuwając ją od pierwszej ćwiartki.
   3. Z drugiej ćwiartki przedłuż smugi w trzeciej ćwiartce, używając bliskich równoległych smug.
   4. Rozprowadź bakterie w środku czwartej ćwiartki, przesuwając ją z trzeciej ćwiartki.

2. Przygotowanie panelu

1. Umieść cztery 96-dołkowe płytki obok siebie, aby utworzyć kwadrat. Za pomocą taśmy sklej ich spód razem.
2. Powtórz ten krok, aby uzyskać cztery panele, z których każdy zawiera 4 tabliczki i nazwij je A1, A2, A3 i A4.
3. Dodać 50 μl bulionu MH do studzienek między kolumną 2 a kolumną 11 w 16 96-dołkowych płytkach czterech paneli.
4. Dodać 200 μl bulionu MH do studzienki H12 służącej jako studzienka kontroli ujemnej w 16 96-dołkowych płytkach czterech paneli.
5. Dodać 150 μl bulionu MH do studzienek A1 i H1 służących jako studzienki kontroli pozytywnej w 16 96-dołkowych płytkach czterech paneli.

3. Lek 1, Cefotaksym, seryjne rozcieńczanie

1. Do stożkowej probówki dodać 15 ml sterylnego dH₂O.
   1. Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku zgodnie ze wzorem C₁V₁ = C₂V₂. Zatem V₁ = (C₂ x 15 ml) / C₁,
      UWAGA: W naszym przypadku roztwór podstawowy cefotaksymu wynosi 10⁵ μg / ml, a C₂ to 256 μg / ml; zatem V₁ = 38,4 μL.
2. Usunąć obliczoną objętość z 15 ml sterylnego dH₂O, a następnie dodać lek.
3. Odmierzyć pipetą 50 μl przygotowanego roztworu leku do każdego studzienki w kolumnie 11 i kolumnie 12 z wyjątkiem H12.
4. Rozcieńczanie seryjne rozpocząć od usunięcia 50 μl z kolumny 11 i umieszczenia go w odpowiednich studzienkach w kolumnie 10, a następnie od 10 aż do osiągnięcia kolumny 2, gdzie 50 μl pobrane z kolumny 2 zostanie odrzucone.
5. Powtórz kroki 3.4 i 3.5 dla wszystkich 16 96-dołkowych płytek z czterech paneli.

4. Lek 2, Amkacyna, seryjne rozcieńczanie

1. Do stożkowej probówki dodać 10 ml sterylnego dH₂O.
2. Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku zgodnie ze wzorem C₁V₁ = C₂V₂. Zatem V₁ = (C₂ x 10 ml) / C₁,
   UWAGA: W naszym przypadku roztwór podstawowy amikacyny wynosi 10³ μg / ml, a C₂ to 64 μg / ml; zatem V₁ = 64 μL.
3. Usunąć obliczoną objętość z 10 ml sterylnego dH₂O, a następnie dodać lek.
4. Weź osiem oddzielnych płytek 96-dołkowych.
5. Do każdej płytki dodać 100 μl MHB do studzienek między rzędami G i B.
6. Dodaj 100 μl wcześniej przygotowanego roztworu leku 2 do studzienek rzędu G.
7. Rozcieńczyć szeregowo od rzędu G do rzędu B, pobierając 100 μl z każdej studzienki i na koniec wyrzucić 100 μl z dołków rzędu B.
8. Powtórz kroki 4.5, 4.6 i 4.7, aby przygotować osiem płytek.

5. Przeniesienie leku 2 do czterech paneli

1. Pobrać pipetą 50 μl leku 2 ze studzienek między rzędami G i B do odpowiednich studzienek w każdej płytce w czterech panelach. Jedna przygotowana płytka 96-dołkowa zawiera 100 μl leku 2, co wystarcza na dwie płytki w jednym panelu.

6. Lek 3, Lewofloksacyna, dodatek

1. Do czterech różnych stożkowych probówek dodać 14 ml sterylnego dH₂O.
2. Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku zgodnie ze wzorem C₁V₁ = C₂V₂. Zatem V₁ = (C₂ x 14 ml) / C₁,
   UWAGA: W naszym przypadku lewofloksacyna jest przygotowywana w czterech różnych stężeniach z roztworu podstawowego 5 x 10³ μg/mL.
   C₁ = 2 μg/ml, V₁ = 5,6 μl
   C₂ = 4 μg/ml, V₁ = 11,2 μl
   C₃ = 8 μg/ml, V₁ = 22,4 μl
   C₄ = 16 μg/ml, V₁ = 44,8 μl
3. Z każdej probówki usunąć obliczoną objętość z 14 ml sterylnego_dH2O, a następnie dodać lek.
4. Po przygotowaniu wymaganych stężeń trzeciego leku, pobrać 50 μl i dodać go do odpowiednich studzienek między rzędami B i G oraz kolumnami 2 i 12 na odpowiedniej płytce w każdym panelu, gdzie C1 odpowiada czterem płytkom P1 w czterech panelach, C2 odpowiada czterem płytkom P2 w czterech panelach, C3 odpowiada czterem płytkom P3 w czterech panelach, a C4 odpowiada czterem tabliczkom P4 w czterech panelach.

7. Lek 4, trimetoprim-sulfametoksazol, dodatek

1. Do stożkowej probówki dodać 14 ml sterylnego dH₂O.
2. Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku zgodnie ze wzorem C₁V₁ = C₂V₂. Zatem V₁ = (C₂ x 14 ml) / C₁,
   UWAGA: W naszym przypadku trimetoprim-sulfametoksazol jest przygotowywany w czterech różnych stężeniach z roztworu podstawowego 48 x 10³ μg/ml.
   C₁ = 512 μg/ml, V₁ = 149,33 μL
   C₂ = 1024 μg/ml, V₁ = 298,66 μL
   C₃ = 2048 μg/ml, V₁ = 597,33 μL
   C₄ = 4096 μg/ml, V₁ = 1 194,66 μL
3. Usunąć obliczoną objętość z 14 ml sterylnego dH₂O z każdej probówki, a następnie dodać lek.
4. Po przygotowaniu wymaganych stężeń czwartego leku należy pobrać 50 μl i dodać go do odpowiednich studzienek między rzędami B i G oraz kolumnami 2 i 12 na czterech płytkach w odpowiednim panelu, gdzie C1 odpowiada panelowi 1, C2 odpowiada panelowi 2, C3 odpowiada panelowi 3, a C4 odpowiada panelowi 4.

8. Przygotowanie i dodanie inokulum bakteryjnego E. coli ESBL

1. Za pomocą sterylnej pętli przenieś jedną kolonię izolatu bakteryjnego E. coli ESBL uprzednio wyhodowanego na płytce do 2 ml sterylnego MHB i wiru.
2. Sprawdź zmętnienie w miejscu, w którym powinno wynosić 0,5 McFarlanda za pomocą densytometru.
3. Dodaj 80 ml sterylnego bulionu MH do sterylnego kubka na mocz.
4. Dodać inokulum bakteryjne z inokulum 0,5 McFarlanda do kubka na mocz zgodnie z C₁V₁ = C₂V₂, gdzie V₁ = (10⁶ x 80 ml) / 10⁸ = 800 μL.
5. Odpipetować 50 μl roztworu inokulum 10⁶ jtk/ml do każdej studzienki z wyjątkiem H12, która jest studzienką kontrolną sterylności.
6. Inkubować panele w temperaturze 37 °C przez noc.
7. Po inkubacji dodaj 50 μl jodotetrazolu, aby zarejestrować wzrost w studzienkach.

9. Protokół dla szablonu FIC (plik uzupełniający)

1. Wpisz najwyższe stężenie leku 1 (cefotaksym) w żółtej komórce w panelu A.
2. Wpisz najwyższe stężenie leku 2 (amikacyny) w żółtej krwince w panelu B.
3. Wpisz najwyższe stężenie leku 3 (lewofloksacyny) w żółtej krwince w panelu C.
4. Wpisz najwyższe stężenie leku 4 (trimetoprim-sulfametoksazol) w panelu D.
5. Śledź czerwoną linię (interfejs Wzrost/brak wzrostu), podświetlając na czerwono studnie z wzrostem.
6. Wpisz wartość MIC leku 1 w tabeli leku 1 (ATB1).
7. Wpisz wartość MIC leku 2 w tabeli leku 2 (ATB2).
8. Wpisz wartość MIC leku 3 w tabeli leku 3 (ATB3).
9. Wpisz wartość MIC leku 4 w tabeli leku 4 (ATB4).
10. Aby obliczyć FIC dla ATB1
    1. Określ studnie w interfejsie Wzrost/brak wzrostu.
    2. W tabeli ATB1 kliknij dwukrotnie komórkę obok FIC1 i przeciągnij żółtą komórkę po lewej stronie panelu A do pierwszej wybranej studni.
    3. Powtórz krok 9.10.2 dla każdej wybranej studzienki, w której studzienka 1 odpowiada FIC1, studzienka 2 odpowiada FIC2 i tak dalej.
11. Aby obliczyć FIC dla ATB2
    1. W tabeli ATB2 kliknij dwukrotnie komórkę obok FIC1 i przeciągnij żółtą komórkę po lewej stronie panelu B do pierwszej wstępnie wybranej studni.
    2. Powtórz krok 9.11.1 dla każdej wstępnie wybranej studni.
12. Aby obliczyć FIC dla ATB3
    1. W tabeli ATB3 kliknij dwukrotnie komórkę obok FIC1 i przeciągnij żółtą komórkę po lewej stronie panelu C do pierwszej wstępnie wybranej studni.
    2. Powtórz krok 9.12.1 dla każdej wstępnie wybranej studni.
13. Aby obliczyć FIC dla ATB4
    1. W tabeli ATB4 kliknij dwukrotnie komórkę obok FIC1 i przeciągnij żółtą komórkę po lewej stronie panelu D do pierwszej wstępnie wybranej studni.
    2. Powtórz krok 9.13.1 dla każdej wstępnie wybranej studzienki.
14. W tabeli oznaczonej ATB1+2+3+4 automatycznie zsumuj FIC1 każdego ATB. To samo stanie się z innymi FIC (FIC2, FIC3 itd.).
    1. W komórce zawierającej FIC i podświetlonej na żółto kliknij na nią dwukrotnie i wybierz zsumowane ΣFIC z tabeli ATB1+2+3+4.
15. Powtórz te kroki dla każdego z dziewięciu arkuszy reprezentujących dziewięć płyt.
    UWAGA: W arkuszu FIC all tabela pokaże ostateczną zsumowaną FIC wraz z interpretacją uzyskanej wartości.

10. Oznaczanie MIC za pomocą testu mikrorozcieńczenia dla czterech leków

1. Oznacz cztery różne wiersze skrótem każdego badanego leku. Na przykład CTX dla cefotaksymu, AMK dla amikacyny, LEVO dla lewofloksacyny i SXT dla trimetoprimu-sulfametoksazolu.
2. Odpipetować 200 μl sterylnego bulionu Muller Hinton do dołka nr 1 i dołka nr 12 w każdym używanym rzędzie. Studnia numer 12 będzie służyć jako studnia kontroli negatywnej.
3. Odpipetować 100 μl sterylnego bulionu Mullera Hintona do studzienek od 2 do 11 w każdym używanym rzędzie.
4. Obliczyć objętość każdego leku, który ma zostać dodany, korzystając ze wzoru C₁V₁ = C₂V₂. Zatem V₁ = (C₂ x 4 x V₂) / C₁. V₂ to końcowa objętość w studzienkach, która wynosi 200 μl, C₁ to stężenie roztworu podstawowego, a C₂ to początkowe stężenie, które musimy mieć w pierwszym dołku.
   UWAGA: W tym przypadku używamy następujących elementów:
   Cefotaksym: C₁ = 10⁵ μg/ml, gdzie rozcieńczamy go do 10⁴ μg/ml, C₂ = 256 μg/ml; zatem V₁ = 20,48 μL
   Amikacyna: C₁ = 10³ μg/ml, C₂ = 64 μg/ml; zatem V₁ = 51,2 μL
   Lewofloksacyna: C₁ = 5 x 10³ μg/ml, gdzie rozcieńczamy ją do 5 x 10² μg/ml, C₂ = 16 μg/ml; zatem V₁ = 25,6 μL
   trimetoprim-sulfametoksazol: C₁ = 48 x 10³ μg/ml, C₂ = 4096 μg/ml; zatem V₁ = 68,26 μL
5. Odpipetować wymaganą objętość dla każdego leku w pierwszym dołku odpowiedniego rzędu po usunięciu tej samej objętości z bulionu o objętości 200 μl, aby uzyskać całkowitą objętość 200 μl po dodaniu leku.
6. Seryjnie rozcieńczać, usuwając 100 μl z dołka 1 do studzienki 2 i tak dalej, aż do osiągnięcia studzienki 10, gdzie 100 μl usunięte z dołka 10 zostanie odrzucone. Należy zauważyć, że studzienka 11 służy jako studnia kontroli pozytywnej.
7. Odpipetować 100 μl z 10⁶ przygotowanych inokulum bakteryjnych do każdej studzienki w każdym używanym rzędzie, z wyjątkiem studzienki nr 12 służącej jako kontrola ujemna.
8. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

Wyniki

Rysunek 2A przedstawia wyniki uzyskane przez połączenie cefotaksymu i amikacyny z określonymi stężeniami lewofloksacyny i trimetoprimu-sulfametoksazolu. W lewej części rysunku możemy zobaczyć cztery tablice, które są schematycznie przedstawione ze stężeniami leków w prawej części rysunku. Strzałki reprezentują dołki w interfejsie Wzrost/brak wzrostu. Kolorowe studnie to studnie, które zawierają wzrost. Zauważamy, że czwarta płytka nie zawiera wzrostu w kwadrancie zawierającym kombinację. Dzi...

Dyskusja

Metoda poczwórnej szachownicy przypomina w swoim protokole szachownicę i trójwymiarową szachownicę. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka kluczowych kroków, aby uniknąć błędów podczas eksperymentu.

Upewnij się, że przetestowałeś MIC każdego leku w stosunku do badanego izolatu przed rozpoczęciem protokołu, aby wiedzieć, jakie są stężenia, które są potrzebne do rozpoczęcia rozcieńczania dla leku 1 i leku 2, które należy seryjnie rozcieńczać w płytkach. W odniesieniu do leku 3 i leku 4 należy równi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1000 &mikro; L końcówki	Citotest	4330000402
200 & mikro; Końcówki L	Citotest	4330-0013-17
50 ml probówka wirówkowa	430828 do		przygotowania leku 3 i 4
5 ml polistyrenu okrągłodenna probówka	Falcon	352058	Do przygotowania inokulum bakteryjnego 0,5 MacFarlanda
Szalki Petriego 90 mm	JRZ Plastilab		Jako łóżko do dodawania roztworów za pomocą pipety wielokanałowej
96-dołkowe płytki	corning	3596	Do seryjnego rozcieńczania i łączenia leków
Bactrim 200, 40 mg (trimetoprim-sulametoksazol	Przez CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, Francja	10177403	Lek 4
Ceforan, 1 g (Cefotaksym)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Lek 1
Densytometr
Szczep E. Coli ESBL	Odzyskany jako szczep medyczny z Saint-George Szpital Liban		Szczep bakteryjny
Mac Conkey + agar krystaliczny	fioletowy BIO-RAD	64169508	Do wytwarzania płytek agarowych używanych do subkulturu
Miacin 500 mg/2 ml (Amikacyna)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Lek 2
Rosół Muller-Hinton	BIO-RAD	69444	Do wytwarzania pożywek bakteryjnych
Pipeta wielokanałowa	Thermo Scientific	GJ54761	Do seryjnego rozcieńczania i dodawania pożywki, bakterii i leków
Taśma
Pipety jednokanałowe	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	Do dodawania pożywki, bakterii i leków
Tavanic, 500 mg (Lewofloksacyna)	sanofi aventis	221937/2009	Lek 3