Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

Podsumowanie

Przedstawiony tutaj jest protokół zachowania kurczliwości naczyniowej mysiej tkanki płucnej PCLS, co daje wyrafinowany trójwymiarowy obraz układu oddechowego i dróg oddechowych, który może być zachowany przez okres do 10 dni, który jest podatny na liczne zabiegi.

Streszczenie

Wizualizacja mysiej tkanki płucnej dostarcza cennych informacji strukturalnych i komórkowych dotyczących leżących pod nią dróg oddechowych i naczyń krwionośnych. Jednak zachowanie naczyń płucnych, które naprawdę reprezentują warunki fizjologiczne, nadal stanowi wyzwanie. Ponadto delikatna konfiguracja mysich płuc powoduje wyzwania techniczne związane z przygotowaniem próbek do wysokiej jakości obrazów, które zachowują zarówno skład, jak i architekturę komórkową. Podobnie, testy kurczliwości komórkowej można przeprowadzić w celu zbadania potencjału komórek do reagowania na środki zwężające naczynia krwionośne in vitro, ale testy te nie odtwarzają złożonego środowiska nienaruszonego płuca. W przeciwieństwie do tych problemów technicznych, metoda precyzyjnie wyciętego plastra płuc (PCLS) może być stosowana jako skuteczna alternatywa do wizualizacji tkanki płucnej w trzech wymiarach bez odchyleń regionalnych i służyć jako żywy model kurczliwości zastępczej przez okres do 10 dni. Tkanka przygotowana za pomocą PCLS zachowała strukturę i orientację przestrzenną, dzięki czemu idealnie nadaje się do badania procesów chorobowych ex vivo. Lokalizacja endogennych komórek znakowanych tdTomato w PCLS pobranych z indukowalnego mysiego modelu reporterowego tdTomato można z powodzeniem uwidocznić za pomocą mikroskopii konfokalnej. Po ekspozycji na leki zwężające naczynia krwionośne, PCLS wykazuje zachowanie zarówno kurczliwości naczyń, jak i struktury płuc, które mogą być uchwycone przez moduł poklatkowy. W połączeniu z innymi procedurami, takimi jak western blot i analiza RNA, PCLS może przyczynić się do kompleksowego zrozumienia kaskad sygnałowych, które leżą u podstaw wielu różnych zaburzeń i prowadzić do lepszego zrozumienia patofizjologii w chorobach naczyń płucnych.

Wprowadzenie

Postępy w przygotowaniu i obrazowaniu tkanki płucnej, która zachowuje składniki komórkowe bez poświęcania struktury anatomicznej, dostarczają szczegółowego zrozumienia chorób płuc. Zdolność do identyfikacji białek, RNA i innych związków biologicznych przy zachowaniu struktury fizjologicznej dostarcza istotnych informacji na temat przestrzennego rozmieszczenia komórek, które mogą poszerzyć wiedzę na temat patofizjologii w wielu chorobach płuc. Te szczegółowe obrazy mogą prowadzić do lepszego zrozumienia chorób naczyń płucnych, takich jak nadciśnienie tętnicze płucne, w zastosowaniu do modeli zwierzęcych, potencjalnie prowadząc do poprawy strategii terapeutycznych.

Pomimo postępu technologicznego, uzyskanie wysokiej jakości obrazów tkanki płucnej myszy pozostaje wyzwaniem. Cykl oddechowy jest napędzany przez ujemne ciśnienie w klatce piersiowej wytwarzane podczas inhalacji¹. Podczas tradycyjnego pobierania biopsji i przygotowywania próbek płuc do obrazowania, gradient podciśnienia jest tracony, co powoduje zapadnięcie się dróg oddechowych i naczyń krwionośnych, które nie reprezentują już swojego obecnego stanu. Aby uzyskać realistyczne obrazy odzwierciedlające aktualne warunki, płucne drogi oddechowe muszą zostać ponownie napompowane, a naczynia krwionośne ukrwione, zmieniając dynamiczne płuco w statyczne urządzenie. Zastosowanie tych odrębnych technik pozwala na zachowanie integralności strukturalnej, układu naczyniowego płuc i składników komórkowych, w tym komórek odpornościowych, takich jak makrofagi, co pozwala na oglądanie tkanki płucnej jak najbardziej zbliżonej do jej stanu fizjologicznego.

Precision cut lung sliting (PCLS) to idealne narzędzie do badania anatomii i fizjologii układu krążenia płuc². PCLS zapewnia szczegółowe obrazowanie tkanki płucnej w trzech wymiarach, przy jednoczesnym zachowaniu składników strukturalnych i komórkowych. PCLS został wykorzystany w modelach zwierzęcych i ludzkich, aby umożliwić uzyskanie na żywo obrazów funkcji komórkowych w wysokiej rozdzielczości w trzech wymiarach, co czyni go idealnym narzędziem do badania potencjalnych celów terapeutycznych, pomiaru skurczu małych dróg oddechowych i badania patofizjologii przewlekłych chorób płuc, takich jak POChP, ILD i rak płuc³. Stosując podobne techniki, narażenie próbek PCLS na działanie środków zwężających naczynia krwionośne może zachować strukturę płuc i kurczliwość naczyń, odtwarzając warunki in vitro. Oprócz zachowania kurczliwości, przygotowane próbki mogą zostać poddane dodatkowej analizie, takiej jak sekwencjonowanie RNA, Western blot i cytometria przepływowa, jeśli są prawidłowo przygotowane. Wreszcie, komórki oznaczone kolorem reporterowym oznaczone fluorescencją tdTomato po pobraniu płuc mogą zachować etykietowanie po przygotowaniu mikroplasterków, co czyni je idealnymi do badań śledzenia komórek. Integracja tych technik zapewnia zaawansowany model zachowujący przestrzenny układ komórek i kurczliwość naczyń, który może prowadzić do bardziej szczegółowego zrozumienia kaskad sygnałowych i potencjalnych opcji terapeutycznych w chorobie naczyń płucnych.

W tym manuskrypcie mysia tkanka płucna PCLS jest narażona na działanie czynników zwężających naczynia krwionośne, wykazując zachowaną integralność strukturalną i kurczliwość naczyń. Badanie pokazuje, że tkanka przygotowana i odpowiednio traktowana może pozostać żywotna przez 10 dni. Badanie wykazało również zachowanie komórek z endogenną fluorescencją (tdTomato), co pozwala próbkom na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości naczyń i architektury płuc. Na koniec opisano sposoby obchodzenia się z wycinkami tkanek i przygotowywania ich do pomiaru RNA i Western blot w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw.

Protokół

Cała opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi Szpitala Dziecięcego w Bostonie oraz zatwierdzonymi protokołami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Myszy użyte w tym badaniu to myszy typu dzikiego C57 / B6 i myszy skrzyżowane Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj wcześniej fosforanowy roztwór buforowy (1x PBS) i 2% roztwór agarozy wymagany podczas eksperymentu.
   1. Wymieszaj 2 g agarozy w proszku ze 100 ml wody w autoklawie. Podgrzewaj go w kuchence mikrofalowej przez kilka sekund, aż roztwór będzie klarowny.
   2. Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Zarówno PBS, jak i 2% agaroza mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez tygodnie.

2. Ekstrakcja płuca myszy

1. Poddaj mysz eutanazji przez przedawkowanie izofluranu. Przedawkowanie izofluranu należy uzyskać, umieszczając niewielką ilość izofluranu na bibułce na dolnym poziomie i umieszczając mysz na górnym poziomie w eksykatorze. Mysz pozostaje w eksykatorze do utraty przytomności.
2. Upewnij się, że mysz umrze, wywierając mniejszy nacisk na szyję i ciągnąc ogon za ogon. Przyłóż mysz do powierzchni preparcyjnej.
3. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj ją do stołu taśmą klejącą, przyklejając łapy i nos do stołu.
4. Spryskaj brzuszną powierzchnię myszy 70% etanolem i zetrzyj nadmiar etanolu.
5. Podnieś skórę brzucha myszy kleszczami w miejscu pęcherza moczowego i przetnij w linii środkowej nożyczkami chirurgicznymi, przesuwając się wyżej do odcinka szyjnego, odsłaniając tchawicę.
6. Podnieś leżącą pod spodem warstwę powięziową za pomocą pęsety i przetnij nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić narządy trzewne i przedział śródpiersia, ponownie przecinając poniżej góry.
7. Przetnij mostek w linii środkowej, aby odsłonić serce i płuco.
8. Za pomocą rozwarstwienia odłącz przeponę od wątroby i przedziału brzusznego.
9. Zlokalizuj żyłę główną dolną (IVC) pod jelitami i przetnij IVC.
10. Zlokalizuj prawą komorę.
    UWAGA: Prawa komora będzie miała jaśniejszy wygląd w porównaniu z lewą komorą i należy uwidocznić przegrodę śródkomorową, oddzielającą prawą komorę od lewej komory.
11. Wstrzyknąć 0,5 ml 1% frakcjonowanej heparyny do prawej komory za pomocą igły motylkowej 25-30 G, a następnie powoli, ale równomiernie przepłukać 10-15 ml 1x PBS (Rysunek 1A).
    1. Należy uważać, aby nie wprowadzać igły przez serce i nie wstrzykiwać heparyny do jamy śródpiersia.
       UWAGA: Wstrzyknięcie 1x PBS sprawia, że tkanka płucna staje się biała. Płyn wynaczyniony z aorty brzusznej powinien być przezroczysty i bezbarwny, a wątroba może stać się biała po udanym płukaniu.
12. Zlokalizuj krtań i wypreparuj otaczającą powięź i tkankę za pomocą pęsety z końcówką.
13. Umieść szew chirurgiczny pod tchawicą i luźno zawiąż węzeł chirurgiczny.
14. Umieść mały otwór w tchawicy powyżej sznurka i kanaluj igłą o końcu 20 G.
15. Zaciśnij szew wokół igły i tchawicy za pomocą węzła chirurgicznego.
16. Wstrzyknąć 2,5-4 ml agarozy do tchawicy i monitorować napompowanie płuc.
17. Po wkropleniu agarozy wlej zimny, schłodzony 1x PBS na płuca, aby agaroza zestaliła się.
18. Przeciąć tchawicę powyżej szwu chirurgicznego i wypreparować płuco i serce ze śródpiersia, usuwając wszelkie zrosty i powięź.
19. Po zestaleniu umieść w 1x DMEM (wystarczająco dużo, aby zanurzyć tkankę) na szalce Petriego, aby utrzymać na lodzie. Natychmiast przetnij jeden płat za pomocą maszyny wibratomicznej (Rysunek 1B).

3. Precyzyjnie wycięte plastry płuc

1. Przymocuj próbkę do platformy za pomocą kleju superglue, trzymając środkową stronę próbki skierowaną do góry.
2. Napełnij pojemnik na próbkę 1x PBS, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona.
3. Napełnij pojemnik otaczający pojemnik na próbkę lodem, aby utrzymać otaczający PBS i próbkę w niskiej temperaturze.
4. Włącz wibratomium i dostosuj żądane ustawienia poniżej.
   1. Ustaw grubość na 300um.
   2. Ustaw częstotliwość na 100 Hz.
   3. Ustaw amplitudę na 0,6 mm.
   4. Ustaw prędkość na 5 μm/s.
5. Za pomocą klucza imbusowego obróć uchwyt ostrza do bezpiecznej pozycji i otwórz szczęki, aby włożyć ostrze.
6. Dokręć szczęki kluczem imbusowym i obróć uchwyt ostrza do odpowiedniej pozycji do krojenia.
7. Umieść próbkę i platformę na pudełku i wsuń przed ostrze.
8. Napełnij pudełko wokół platformy próbki 1x PBS, aż próbka zostanie zanurzona.
9. Przyłóż ostrze wibratomu do krawędzi bloku i ręcznie opuść ostrze, aż zrówna się z górną częścią próbki.
10. Potwierdź odpowiednie ustawienia i uruchom wibratomem (Rysunek 2).
11. Gdy świeże plastry są krojone, wyjmij próbki z PBS i umieść je na sterylnej szalce Petriego z 10 ml 1x DMEM zawierającego 1x antybiotyk-antybiotyk.
12. Po zakończeniu całkowicie schuj ostrze, a następnie użyj klucza imbusowego, aby podnieść ostrze do bezpiecznej pozycji.
13. Przechowywać próbki w 1x DMEM w inkubatorze w temperaturze 37 °C z zachowaniem żywotności przez okres do 10 dni (patrz doświadczenie żywotności poniżej).

4. Przykładowy eksperyment z czynnikiem zwężającym naczynia krwionośne

1. Umieść plasterek wibratomu na szkiełku mikroskopowym.
2. Przed umieszczeniem go na szkiełku użyj chusteczki czyszczącej, aby pozbyć się nadmiaru podłoża (PBS).
3. Umieść próbkę pod mikroskopią z kontrastem fazowym i użyj 10-20-krotnego powiększenia, aby zidentyfikować naczynie.
4. Umieść 500 μl środków zwężających naczynia krwionośne, takich jak 60 mM KCl lub 1 μM Endothelin-1, aby całkowicie zanurzyć szkiełko.
5. Obserwuj i nagrywaj wideo, nagrywając przez 30 s-60 s (Wideo 1).

5. Przygotowanie tkanki do lizy RNA lub białka na PCLS

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu napełnij małe pudełko z pianki polistyrenowej 1 litrem ciekłego azotu.
2. Przed rozpoczęciem umieść dwie małe probówki do mikrowirówek (1,5 ml) w pojemniku z ciekłym azotem.
   UWAGA: Ciekły azot powinien ochładzać się na zewnątrz rur, jednak nie powinien znajdować się w środku. Należy ostrożnie obchodzić się z ciekłym azotem i nie wystawiać skóry na działanie ciekłego azotu. Użyj kleszczyków i rękawiczek, aby umieścić i wyjąć probówki z pudełka.
3. Umieść 4-5 świeżych plasterków wibratomu w misce z moździerzem.
4. Wlej 5-10 ml płynu N2 na plastry w misce moździerza.
5. Szybko użyj tłuczka, aby zmielić plastry błyskawicznego zamrażania na proszek, zanim ciekły azot wyparuje.
   UWAGA: Tkanka powinna skondensować się w drobny proszek. Jeśli nie, dodaj więcej ciekłego azotu, aż do uzyskania tego celu.
6. Za pomocą stalowej łyżki laboratoryjnej (wstępnie schłodzonej ciekłym azotem) nabierz proszek do dwóch schłodzonych probówek do mikrowirówek.
7. Zjonizuj proszek, dodając 500 μl odczynnika do ekstrakcji RNA, aby przystąpić do izolacji RNA lub 500 μl buforu RIPA (zawiera 1x inhibitory proteazy), aby kontynuować lizę białek.
8. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dodatkowej izolacji RNA, pomiaru BCA i western blot.

6. Określanie żywotności

1. Po przygotowaniu wibratomu umieść dwa wycinki płuc na 24-dołkowej płytce hodowlanej z 450 μl pożywki DMEM i 50 μl odczynnika żywotności komórek (upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona).
2. Umieścić próbki z powrotem w 5% CO₂ w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc, przy minimalnym naświetleniu.
3. Rano obserwuj roztwór pod kątem zmiany koloru. Niebieski roztwór zmienia kolor na różowy, gdy tkanka jest żywotna.

7. Zachowanie oznakowania komórek

1. Leczyć transgeniczną Cdh5-CreERT2 skrzyżowaną z myszą Ai14 tdTomato wstrzyknięciem IP tamoksyfenu (2 mg / dobę) przez łącznie 5 dni (całkowita dawka 10 mg tamoksyfenu) w celu indukcji komórek Cre dodatnich znakowania tdTomato.
2. Tydzień po wstrzyknięciu należy przygotować płuca, wykonując powyższe czynności od 1 do 3.
3. Po przygotowaniu precyzyjnie wyciętego wycinka płuca należy umieścić tkankę na szkiełku mikroskopowym i umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu tkanki.
4. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby wykryć barwienie tdPomidor (przy użyciu długości fali wzbudzenia 555 nm).

Wyniki

Po dodaniu do komórek lub tkanki, odczynnik do badania żywotności zostaje zmodyfikowany przez środowisko redukujące w żywej tkance i zmienia barwę na różową/czerwoną, stając się silnie fluorescencyjnym. Reprezentatywne zmiany koloru wykryte w dniach 0-1 oraz 9-10 przedstawiono na Ryc. 3. Jak zauważono, roztwór początkowo był niebieski, a w ciągu nocy stał się różowy, co potwierdziło żywotność. Zmiana barwy następuje zazwyczaj w ciągu 1-4 h, jednak może być wymagany dłuższy czas. Aby ocenić ż...

Dyskusja

W tym artykule opisano ulepszoną metodę wytwarzania obrazów o wysokiej rozdzielczości mysiej tkanki płucnej, która zachowuje strukturę naczyniową i optymalizuje elastyczność eksperymentalną, w szczególności wykorzystując zastosowanie PCLS do uzyskania mikroplasterków tkanki płucnej, które można oglądać w trzech wymiarach z zachowaną kurczliwością naczyń krwionośnych. Korzystając z odczynnika żywotności, protokół wykazuje, że starannie przygotowane i zakonserwowane plastry mogą zachować żywotność przez ponad tydzień. Zach...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 cm³ frakcjonowanej heparyny w strzykawce	BD	100 jednostek USP na ml
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 cala igła końcowa do kaniulacji tchawicy	Cml Supply	90120050D
30cc strzykawka	BD	309650
Zautomatyzowany mikrotom z ostrzem wibracyjnym	Odczynnik	VT1200S
(alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Konfokalny	Zeiss	880
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium i GLutaMAX, uzupełniony o 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Moździerz i tłuczek	Amazon
RIPA bufor do lizy i ekstrakcji	Thermoscientific	89900
Szew chirurgiczny 6/0	FST	18020-60
Odczynnik TRIzol	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Skrzydlaty zestaw do pobierania krwi (igła motylkowa) 25-30G	BD	25-30G

Anti Anti Solution Gibco 15240096 do żywotności komórek Leica