Method Article

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

DOI:

10.3791/62396

⸱

May 27th, 2021

 ,  , 
1Department of Physics, Virginia Tech, 2Center for Soft Matter and Biological Physics, Virginia Tech

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwuwarstwy lipidowe tworzą główną matrycę błon komórkowych i są główną platformą wymiany składników odżywczych, interakcji białko-błona i pączkowania wirusów, wśród innych ważnych procesów komórkowych. Aby zapewnić wydajną aktywność biologiczną, błony komórkowe powinny być wystarczająco sztywne, aby zachować integralność komórki i jej przedziałów, a jednocześnie wystarczająco płynne, aby umożliwić składnikom błony, takim jak białka i domeny funkcjonalne, dyfuzję i interakcję. Ta delikatna równowaga właściwości elastycznych i płynnych błon oraz ich wpływ na funkcje biologiczne wymaga lepszego zrozumienia zbiorowej dynamiki błony w mezoskopowych skalach długości i czasu kluczowych procesów biologicznych, np. deformacji błony i zdarzeń wiązania białek. Jedną z technik, które mogą skutecznie badać ten zakres dynamiczny, jest spektroskopia neutronowego echa spinowego (NSE). W połączeniu z etykietowaniem deuterem, NSE może być używany do bezpośredniego dostępu do wahań gięcia i grubości, a także mezoskopowej dynamiki wybranych cech membrany. Niniejszy artykuł zawiera krótki opis techniki NSE i nakreśla procedury przeprowadzania eksperymentów NSE na błonach liposomalnych, w tym szczegóły dotyczące przygotowania próbek i schematów deuteracji, wraz z instrukcjami dotyczącymi zbierania i redukcji danych. W artykule przedstawiono również metody analizy danych wykorzystywane do wyodrębniania kluczowych parametrów membrany, takich jak moduł sztywności przy zginaniu, moduł ściśliwości obszarowej i lepkość w płaszczyźnie. Aby zilustrować biologiczne znaczenie badań NSE, omówiono wybrane przykłady zjawisk błonowych badanych przez NSE, a mianowicie wpływ dodatków na sztywność zginania błony, wpływ tworzenia domen na fluktuacje błony oraz dynamiczną sygnaturę interakcji błona-białko.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie błon komórkowych i ich funkcji znacznie się rozwinęło w ciągu ostatnich kilku dekad. Poprzedni pogląd na błony komórkowe jako pasywne dwuwarstwy lipidowe, które definiują granice komórek i mieszczą białka błonowe1 stopniowo przekształcił się w dynamiczny model, w którym dwuwarstwy lipidowe odgrywają ważną rolę w regulacji ważnych procesów biologicznych, w tym sygnalizacji komórkowej, wymiany molekularnej i funkcji białek — by wymienić tylko kilka2,3,4,5,6. Uświadomienie sobie, że błony komórkowe są bardzo dynamiczne, stale przechodzą przebudowę i redystrybucję molekularną, skłoniło naukowców do badań wykraczających poza struktury równowagi błon7,8,9. W związku z tym opracowano wiele podejść do badania różnych trybów dynamicznych w błonach lipidowych inspirowanych biologicznie i biologicznie. Do tej pory większość tych badań koncentrowała się przede wszystkim na dyfuzyjnych ruchach molekularnych10,11,12,13 i makroskopowe fluktuacje kształtu14,15,16, pozostawiając istotną lukę w zrozumieniu pośredniej dynamiki błony, tj. zbiorowych fluktuacji zespołów lipidowych składających się z kilku 10-100 cząsteczek lipidów. Dynamika ta występuje w skalach długości od kilkudziesięciu do kilku 100 A oraz w skalach czasowych od sub-ns do kilkuset ns (patrz Rysunek 1), określanych tutaj jako skale mezoskopowe. To właśnie na tych skalach kluczowa aktywność biologiczna zachodzi na poziomie błony17. Obejmuje to pączkowanie wirusa18, bramkowanie kanałów19 oraz interakcje błona-białko20. Ważne jest również, aby podkreślić, że krajobraz energetyczny białek błonowych21,22 pokazuje, że zmiany konformacyjne w białkach - niezbędne dla ich roli regulacyjnej - zachodzą w skalach czasowych ns23 zbiorowych fluktuacji błony, co dodatkowo podkreśla znaczenie dynamiki mezoskopowej w biologicznej funkcji błon komórkowych i ich bioinspirowanych analogów20. Ten artykuł skupia się na dwóch podstawowych mezoskopowych trybach dynamicznych w błonach lipidowych, a mianowicie fluktuacjach zginania i wahaniach grubości.

Głównym wyzwaniem w bezpośrednim badaniu tych modów fluktuacji jest trudność w jednoczesnym dostępie do ich skal przestrzennych i czasowych przy użyciu standardowych metod spektroskopii. Innym wyzwaniem jest to, że techniki bezpośredniego kontaktu mogą wpływać na te same fluktuacje, które mają mierzyć16. Sytuację pogarsza kompozycyjna i strukturalna złożoność błon biologicznych24,25, co skutkuje niejednorodnymi cechami błony, w tym tworzeniem domen lipidowych26,27,28,29,30 i asymetria membrany31,32,33— wymaganie selektywnych sond do zrozumienia dynamiki różnych cech membrany. Na szczęście wyzwania te można przezwyciężyć za pomocą nieinwazyjnych metod spektroskopii neutronów, takich jak neutron spin echo (NSE), które z natury zapewniają dostęp do wymaganych skal długości i czasu, a ponadto umożliwiają badania selektywnych cech błon bez zmiany ich środowiska fizykochemicznego34. Rzeczywiście, w ciągu ostatnich kilku lat spektroskopia NSE przekształciła się w unikalną i potężną sondę zbiorowej dynamiki błonowej35. Wyniki badań NSE nad błonami lipidowymi dostarczyły nowych informacji na temat właściwości błon lipidowych mechanical36,37 i viscoelastic38,39 właściwości błon lipidowych i rzuciły nowe światło na ich potencjalną rolę w funkcjach biologicznych40,41.

Technika spektroskopii NSE opiera się na projekcie instrumentu interferometrycznego, po raz pierwszy zaproponowanym przez Mezei42, wykorzystującym szereg spinów spinowych i magnetycznych do kontrolowania precesji spinu neutronu, gdy neutrony przechodzą przez instrument. Projekt opiera się na magnetycznym odbiciu lustrzanym elementów pola magnetycznego w odniesieniu do pozycji próbki (Rysunek 1A). Oznacza to, że przy braku wymiany energii między neutronem a próbką, neutron wykonuje taką samą liczbę precesji spinu, w przeciwnych kierunkach, w pierwszej i drugiej połowie instrumentu (zwróć uwagę na π-flipper pomiędzy dwiema cewkami precesji). W rezultacie, końcowy stan spinowy neutronu pozostaje niezmieniony w stosunku do stanu początkowego - zjawisko określane jako echo spinowe (patrz przezroczysty neutron w Rysunek 1A). Jednakże, gdy neutron energetycznie oddziałuje z próbką, wymiana energii modyfikuje liczbę precesji spinu w drugiej połowie instrumentu, prowadząc do innego końcowego stanu spinu (patrz Rysunek 1A). Jest to eksperymentalnie wykrywane jako utrata polaryzacji, co zostanie pokazane w dalszej części tego artykułu. Więcej szczegółów na temat techniki NSE można znaleźć w dedykowanych dokumentach technicznych42,43,44,45.

Tutaj prezentowany jest uproszczony opis, który w przybliżeniu przybliża skale długości i czasu dostępne z NSE. Skale długości są określane przez zakres osiągalnych transferów wektorów falowych, Q = 4π sin θ/λ, gdzie 2θ to kąt rozpraszania, a λ to długość fali neutronowej. Można zauważyć, że Q jest wyznaczane przez zakres długości fali i zakres obrotu drugiego ramienia spektrometru (patrz Rysunek 1A). Typowy zakres Q na spektrometrach NSE wynosi ~0,02-2 Å-1 46,47, i do 0,01-4 Å-1 z ostatnimi aktualizacjami48,49, co odpowiada skalom przestrzennym ~1-600 A. Z drugiej strony, dostępna skala czasowa jest obliczana na podstawie całkowitego kąta precesji (lub fazy) uzyskanego przez neutron w cewkach precesji magnetycznej i okazuje się, że jest to50: figure-introduction-1. W tym wyrażeniu t jest czasem Fouriera zdefiniowanym jako figure-introduction-2, gdzie figure-introduction-3 jest stosunkiem żyromagnetycznym neutronów, figure-introduction-4 jest długością cewki, a figure-introduction-5to natężenie pola magnetycznego cewki. Warto zwrócić uwagę, że czas Fouriera jest wielkością, która jest ściśle zależna od geometrii instrumentu, natężenia pola magnetycznego i długości fali neutronów. Na przykład, używając neutronów o długości fali figure-introduction-6 = 8 A i ustawień przyrządu figure-introduction-7 = 1,2 m i figure-introduction-8 = 0,4 T, czas Fouriera oblicza się jako t ~ 50 ns. Eksperymentalnie, czas Fouriera jest dostrajany poprzez zmianę prądu w cewkach precesji (tj. Natężenie pola magnetycznego) lub użycie różnych długości fal neutronów, co daje typowe skale czasowe NSE od ~ 1 ps do 100 ns. Jednak ostatnie ulepszenia spektrometrów NSE umożliwiły dostęp do dłuższych czasów Fouriera, do ~400 ns na spektrometrze J-NSE-Phoenix w Heinz Maier-Leibnitz Zentrum51 i spektrometrze SNS-NSE w Oak Ridge National Lab48, oraz do ~1,000 ns na spektrometrze IN15 NSE w Institut Laue-Langevin (ILL)49.

Oprócz bezpośredniego dostępu do długości i skali czasowej dynamiki membrany, NSE posiada nieodłączne możliwości czułości izotopów neutronów52. W szczególności zdolność neutronów do odmiennego oddziaływania z izotopami wodoru, najobficiej występującego pierwiastka w systemach biologicznych, skutkuje różną gęstością długości rozpraszania neutronów,34 lub NSLD (odpowiednik optycznego indeksu załamania50), gdy prot jest podstawiony przez deuter. Umożliwia to podejście znane jako zmienność kontrastu, które jest powszechnie stosowane w celu podkreślenia określonych cech błony lub ukrycia innych — ten ostatni scenariusz jest określany jako dopasowanie kontrastu. Częstym zastosowaniem zmienności/dopasowania kontrastu jest zastąpienie wody (NSLD = -0,56 × 10-6 A-2) ciężką wodą lub D2O (NSLD = 6,4 × 10-6 A-2) w celu wzmocnienia sygnału neutronowego z protowanych błon lipidowych (NSLD ~ 0 × 10-6 A-2). Podejście to jest bardzo skuteczne w badaniach struktury błony, ponieważ przenikanie D2O do obszaru grupy czołowej membrany pozwala na dokładne określenie grubości membrany (patrz Rysunek 2A, lewy panel) oraz lokalizacji różnych podgrup lipidów, gdy stosowane są bardziej wyrafinowane modele53,54. W artykule przedstawiono kilka przykładów wykorzystania zmienności kontrastu do badań dynamiki zbiorowej w błonach biomimetycznych i wybranych cechach błony.

Tutaj skuteczność NSE w dostarczaniu unikalnych wglądów w dynamiczne i funkcjonalne właściwości błony jest zilustrowana namacalnymi przykładami badań NSE nad modelowymi i biologicznie istotnymi systemami błon lipidowych, z naciskiem na dynamikę mezoskalową w membranach wolnostojących, w postaci zawiesin liposomalnych. W celu zapoznania się z pomiarami NSE dynamiki membrany w płaszczyźnie, czytelnik jest odsyłany do dedykowanych publikacji na temat spektroskopii spinowo-echa neutronowego (GINSES)55,56 i innych badań wyrównanych stosów membran wielopłytkowych57,58,59,60.

Dla uproszczenia, ten artykuł przedstawia trzy różne schematy deuteracji błonowej zilustrowane na dobrze zbadanym dwuwarstwowym systemie lipidowym tworzącym domenę lub rozdzielającym fazy, mieszaniny mieszanin 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DMPC) i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DSPC)61,62. Te dwa lipidy charakteryzują się niedopasowaniem długości łańcucha węglowodorowego (14 atomów węgla/ogon w DMPC vs 18 atomów węgla/ogon w DSPC) oraz temperaturą przejścia żel-płyn (Tm, DMPC = 23 °C vs Tm, DSPC = 55 °C). Powoduje to boczną separację faz w membranach DMPC:DSPC w temperaturach między górną i dolną temperaturą przejścia mieszaniny63. Rozważane tutaj schematy deuteracji zostały wybrane w celu zademonstrowania różnych trybów dynamicznych dostępnych w pomiarach NSE na błonach liposomalnych, a mianowicie fluktuacji zginania, wahań grubości i selektywnych wahań zginania/grubości domen bocznych. Wszystkie składy lipidowe są zgłaszane dla dwuwarstw DMPC:DSPC przygotowanych w ułamku molowym 70:30, przy użyciu dostępnych na rynku protiowanych i perdeuterowanych wariantów DMPC i DSPC. Wszystkie etapy przygotowania próbki opierają się na 4 ml zawiesiny liposomalnej w D2O o stężeniu lipidów 50 mg/ml, przy całkowitej masie lipidowej Mtot = 200 mg na próbkę.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Schemat deuteracji wymagany do eksperymentu

  1. Do pomiarów fluktuacji zginania należy wykonać w pełni protowane liposomy w buforze D2O (D 99,9%) lub D2O (np. Bufor fosforanowy przygotowany z D2O zamiast H2O). Użyj w pełni funkcjonalnego DMPC (C36H72NO8P) i DSPC (C44H88NO8P) z figure-protocol-1 133,4 mg, gdzie XDMPC i XDSPC są ułamkami molowymi DMPC i DSPC, tutaj ustawionymi odpowiednio na 0,7 i 0,3, a MwDMPC iMw DSPC są masami molowymi podanymi przez 677,9 g/mol i 790,1 g/mol, odpowiednio. Podobnie mDSPC = 66,6 mg. Ten schemat deuteracji zwiększa kontrast rozpraszania między membraną (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) a zdeuterowanym buforem (NSLD ~ 6,4 × 10-6 Å-2) i wzmacnia sygnał z falowania błony (patrz Rysunek 2A lewy panel).
  2. Do pomiaru dynamiki zginania wybranych cech membrany bocznej, np. dynamiki matrycy w membranach DMPC:DSPC rozdzielających fazy, należy użyć protowanego DMPC (C36H72NO8P) i deuterowanego, DSPC-d83 (C44H5NO8PD83, Mw 873.7 g/mol), tak że mDMPC = 128.8 mg i mDSPC-d83 = 71,2 mg. Ten schemat deuteracji minimalizuje rozpraszanie z niepożądanych domen bogatych w DSPC, umożliwiając selektywne pomiary fluktuacji ugięcia z matrycy bogatej w DMPC (patrz Rysunek 2B w środku).
    UWAGA: Aby znaleźć optymalną deuterację lipidów wymaganą dla określonego schematu dopasowania kontrastu, skorzystaj z dostępnych internetowych kalkulatorów gęstości długości rozpraszania (SLD), takich jak ten opracowany przez NIST Center for Neutron Research64. Te interfejsy internetowe są wyposażone w przyjazne dla użytkownika narzędzia do łatwego obliczania SLD lipidów o różnym stopniu deuteracji, a także mieszanin lipidowych.
  3. Do pomiarów NSE średnich wahań grubości błony (bez kontrastu bocznego) należy użyć wariantów lipidów składowych deuterowanych ogonowo, tj. DMPC-d54 (C36H18NO8PD54, 732,3 g/mol) i DSPC-d70 (C44H18NO8PD70, 860,1 g/mol)35,38, takie, że mDMPC-d54 = 133,0 mg i mDSPC-d70 = 67,0 mg. Ten schemat kontrastu (Rysunek 2A, prawy panel) wzmacnia sygnał rozpraszania z grup głównych lipidów (NSLD ~ 4,5 × 10-6 Å-2) poprzez kontrastowe dopasowanie grupy ogonowej (NSLD ~ 6,4 × 10-6 A-2) do deuterowanego buforu, umożliwiając wykrycie wahań grubości błony.
  4. W przypadku badań fluktuacji grubości wybranych przedziałów błonowych, np. matrycy bogatej w DMPC, należy zastosować tę samą strategię opisaną w kroku 1.2, zastępując protiowane lipidy DMPC ich analogami deuterowanymi ogonem, tj. DMPC-d54, tak aby domeny bogate w DSPC były dopasowane kontrastowo do buforu deuterowanego, a pierwotny sygnał rozpraszania pochodził z regionu grupy głównej matrycy bogatej w DMPC deuterowanej ogonem.

2. Przygotowanie zawiesiny lipidowej do ekstruzji

  1. Obliczyć masę każdego składnika w próbce, w zależności od składu próbki. Z reguły w przypadku próbek z wieloma składnikami molekularnymi masa składnika jest wyrażona przez jego masę molową, Mwi, ważoną przez jego ułamek molowy, Xi, i znormalizowaną dla wszystkich składników w taki sposób, że: figure-protocol-2 gdzie Mtot to masa całkowita, ustawiona tutaj na 200 mg. Zobacz powyższy przykład dla dwuwarstw lipidowych DMPC-DSPC z różnymi schematami deuteracji.
  2. Za pomocą cyfrowej półwagi zważyć obliczone masy lipidów (i innych składników próbki, np. białek, nanocząstek itp.) i dodać je do fiolki lub kolby okrągłodennej – należy pamiętać o wcześniejszym zważeniu fiolki lub kolby. Dodać 1 ml rozpuszczalnika, aby rozpuścić zważone składniki, ręcznie mieszając je w okapie. W przypadku czystych próbek lipidowych należy użyć chloroformu lub etanolu. W przypadku próbek z dodatkowymi, nielipidowymi składnikami (np. nanocząsteczkami) należy wybrać zwykły rozpuszczalnik, który rozprasza wszystkie składniki.
    1. W przypadku małych ilości lipidów (<10 mg) należy przygotować roztwór podstawowy i odpipetować wymaganą objętość do mieszaniny.
      UWAGA: Nie dodawaj nadmiernych ilości rozpuszczalnika, ponieważ znacznie spowolni to etap suszenia rozpuszczalnika opisany poniżej.
  3. Osuszyć roztwór lipidów pod kapturem, delikatnie wtłaczając gaz obojętny (np. azot, argon) do fiolki, powoli obracając fiolkę pod kątem. Utrzymuj fiolki w pozycji przechylonej, aby utworzyć cienką warstwę wysuszonego lipidu na ściankach fiolki, co pozwoli na równomierne wysuszenie. Okresowo umieszczać fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C, aby uniknąć chłodzenia za pośrednictwem parowania, które spowolni parowanie rozpuszczalnika.
  4. Umieścić fiolki na noc w piecu próżniowym w temperaturze ~35 °C, aby całkowicie usunąć pozostałości rozpuszczalnika. W przypadku nienasyconych lipidów należy przedmuchnąć próżnię gazem obojętnym, aby zminimalizować utlenianie.
  5. Aby zapewnić pełne usunięcie rozpuszczalnika, zważyć fiolkę po wysuszeniu lipidów i upewnić się, że nie ma nadmiaru masy poza zmierzonymi ilościami materiałów. W tym celu należy odjąć masę fiolki od masy zmierzonej po wysuszeniu. W przypadku nadmiaru masy należy wysuszyć próbkę w próżni przez kolejne 6 godzin. Powtórz ten proces w razie potrzeby.
  6. Uwodnić płaszcz lipidowy za pomocą 4 ml buforuD2Olub D2O-buffer, aby uzyskać stężenie lipidów 50 mg/ml. W przypadku lipidów o wysokich temperaturach przejścia, takich jak mieszaniny DMPC-DSPC, należy podgrzać bufor do temperatury wyższej niż temperatura przejścia (60 °C), aby zapewnić równomierne mieszanie.
    UWAGA: Ponieważ eksperymenty NSE wymagają stosunkowo dużych objętości próbki (~4 ml), należy rozważyć uwodnienie próbki przy użyciu połowy wymaganego buforu, tj. 2 ml, aby zminimalizować liczbę wytłaczeń na próbkę (patrz sekcja 3). W takim przypadku należy dodać pozostałą połowę wytłoczenia po wytłoczeniu bufora. Zwróć uwagę, że pojemność strzykawek używanych do wytłaczania jest ograniczona do 1 ml. Tak więc nawodnienie 4 ml buforu wymagałoby czterech zestawów wytłaczania.
  7. Uwodniony roztwór lipidowy należy mieszać wirowo, aż film lipidowy całkowicie się rozpuści i nie będzie już widoczny na ściankach fiolki. Na tym etapie uwodnione lipidy tworzą pęcherzyki wielopłytkowe i wielopłytkowe stosy o wielkości mikronów, a zawiesina wydaje się mlecznobiała.
  8. Aby ułatwić rozbijanie stosów lipidów i zmniejszyć wielopłytkowość, należy wykonać pięć cykli zamrażania/rozmrażania, umieszczając fiolkę z uwodnionym roztworem lipidów w zamrażarce laboratoryjnej (najlepiej zamrażarce o temperaturze -80 °C) do całkowitego zamrożenia, a następnie przenosząc fiolkę do łaźni wodnej o temperaturze 35 °C, aż roztwór lipidowy zostanie całkowicie rozmrożony. Zmieszaj rozmrożony roztwór, aż stanie się jednorodny. Powtórz jeszcze cztery razy.
    UWAGA: Alternatywnie można przygotować kąpiel z suchym lodem do szybkiego zamrażania, łącząc aceton i suchy lód.

3. Wytłaczanie uwodnionego roztworu lipidowego

  1. Zmontuj konfigurację ekstrudera za pomocą membrany poliwęglanowej między dwoma wspornikami membrany i dodając dwa filtry papierowe z każdej strony, aby zapewnić dodatkowe wsparcie. Użyj membrany poliwęglanowej o wielkości porów odpowiadającej docelowej wielkości liposomalnej (typowe rozmiary porów dla eksperymentów NSE to 50 nm i 100 nm – zazwyczaj liposomy o średnicy 100 nm pozwalają na mniej ograniczone wahania membrany, ale mniejsze liposomy 50 nm mogą być używane do badań krzywizny). Upewnij się, że membrana poliwęglanowa jest całkowicie rozciągnięta przed zakończeniem montażu i dokręceniem zewnętrznej obudowy ekstrudera.
  2. Uwodnić membranę poliwęglanową, przepuszczając ~0,3 ml buforu D2O lub D2O-buffer kilka razy przez zespół membrany za pomocą hermetycznych szklanych strzykawek. Użyć tego samego buforu, który jest używany do przygotowania próbki. Pozostawić na co najmniej 10 minut, a następnie całkowicie odessać bufor przed wprowadzeniem próbki.
  3. Napełnij gazoszczelną strzykawkę o pojemności 1 ml przygotowanym roztworem lipidowym i włóż do jednego końca aparatu wytłaczarki. Następnie włożyć pustą strzykawkę do przeciwległego końca. Po podłączeniu strzykawek do zespołu ekstrudera umieść go w bloku ekstrudera.
  4. Jeśli do wytłaczania potrzebne są podwyższone temperatury, jak w przypadku nasyconych lipidów o wysokich temperaturach przejścia (np. DSPC, Tm = 55 °C), należy podgrzać blok grzewczy ekstrudera powyżej temperatury przemiany lipidowej (np. 60 °C), umieszczając blok grzewczy na płycie grzejnej lub używając kąpieli cyrkulacyjnej, jak pokazano na Rysunek 3A.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia jednorodnego mieszania lipidów i uniknięcia wywierania ekstremalnego ciśnienia podczas wytłaczania, które mogłoby spowodować pęknięcie membrany poliwęglanowej. W przypadku próbek lipidów o niskich temperaturach przejścia (<25 °C) ekstruzję należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
  5. Aby wytłoczyć roztwór lipidowy, podłącz zestaw ekstrudera do programowalnej pompy strzykawkowej z aluminiowo-stalową ramą, jak pokazano na Rysunek 3A. W przypadku wytłaczania w kontrolowanej temperaturze dodaj specjalnie zbudowaną podstawę ekstrudera z kanałem płynu i podłącz do łaźni wodnej z obiegiem.
  6. Zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby wykonywała 15-20 cykli wytłaczania zgodnie z instrukcją producenta. Po wytłaczaniu kolor roztworu lipidowego zmienia się z mlecznobiałego na przezroczysty opalowy niebieski (Rysunek 3B, C), wskazując ostateczny rozmiar liposomalny mniejszy niż długość fali światła widzialnego, zgodnie z oczekiwaniami. Dla typu pompy strzykawkowej pokazanego na Rysunek 3A, wykonaj poniższe czynności.
    1. Zacznij od dostosowania ustawień pompy. Przytrzymaj przycisk Szybkość i wprowadź szybkość wytłaczania (50.99 ml/h), a następnie naciśnij przycisk Średnica i wprowadź średnicę strzykawki (4.606 mm). Użyj strzałek w górę pod każdą cyfrą na ekranie, aby zmienić tę wartość cyfry.
    2. Umieść zestaw ekstrudera ze strzykawką z próbką po prawej stronie (patrz Rysunek 3A). Naciskaj przycisk wycofania, aż zaświeci się kontrolka wycofywania. Naciśnij przycisk Start i poczekaj, aż próbka zostanie dozowana do lewej (pustej) strzykawki.
    3. Naciśnij przycisk Stop tuż przed całkowitym opróżnieniem strzykawki z próbką (po prawej). Zapisz dozowaną objętość i użyj jej do zaprogramowania cyklu wytłaczania. Przytrzymaj przycisk Rate, aż na ekranie pojawi się faza 1 (PH:01). Naciśnij przycisk głośności, aby wprowadzić nagraną wcześniej objętość dozowania. W tej fazie upewnij się, że kontrolka wycofania jest wyłączona – spowoduje to dozowanie próbki we właściwym kierunku.
    4. Naciśnij ponownie przycisk Rate (Stawka) i użyj skrajnej prawej strzałki w górę, aby uzyskać dostęp do fazy 2 (PH:02). Naciśnij przycisk Głośność, aby wprowadzić tę samą wartość dozowanej objętości, która została zarejestrowana wcześniej. W tej fazie naciskaj przycisk Wycofaj, aż zaświeci się kontrolka Wycofaj – spowoduje to dozowanie próbki w lewo.
    5. Aby powtórzyć ten cykl, ponownie naciśnij przycisk Rate i użyj skrajnej prawej strzałki w górę, aby uzyskać dostęp do fazy 3 (PH:03). Naciskaj przycisk głośności, aż na ekranie pojawi się LP:SE i ustaw go na 20. Jest to liczba pętli lub powtórzeń, które wykona pompa. Na koniec naciśnij przycisk Oceń, przejdź do fazy 4 (PH: 04) i naciśnij przycisk Głośność, aby przejść do funkcji Stop. Pompa jest teraz przystosowana do automatycznego wytłaczania.
    6. Naciśnij Start, aby rozpocząć cykl wytłaczania.
  7. Opróżnij strzykawkę zawierającą wytłaczaną zawiesinę lipidową do czystej fiolki i przygotuj do przechowywania lub pomiarów. W przypadku próbek lipidów o wysokiej temperaturze topnienia należy przechowywać próbkę powyżej przejścia fazowego płynu do czasu pomiaru. W przeciwnym razie próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
  8. Nie zamrażać wytłaczanych próbek, ponieważ zamrożenie spowoduje pęknięcie pęcherzyków (zawiesina ponownie zmieni kolor na mlecznobiały).

4. Pomiary NSE dla próby(-ów) i redukcja zebranych danych

  1. Przed eksperymentem NSE należy scharakteryzować wytłaczaną próbkę liposomalną z kroku 3.7 przy użyciu dostępnych metod, aby zapewnić odpowiednią jakość próbki. Lista potencjalnych metod charkatynacji, które można wykorzystać do oceny jakości zawiesin liposomalnych do eksperymentów NSE, np. rozkład wielkości, wielopłytkowatość, boczna struktura błony, znajduje się w sekcji dyskusji.
  2. Określ zakres Q i odpowiadające mu ustawienia przyrządu wymagane w eksperymencie. Do pomiarów sztywności zginania dwuwarstw lipidowych należy użyć zakresu Q ~(0,04 - 0,2) Å-1. Do badań wahań grubości membrany należy użyć zakresu Q ~(0,04 - 0,2) Å-1 odpowiadającego grubości membrany35,66,67.
    UWAGA: Omów konfigurację eksperymentu z naukowcem zajmującym się instrumentem przed rozpoczęciem eksperymentu. Jak wspomniano wcześniej, charakterystyka próbki metodą SANS jest konieczna, zwłaszcza jeśli wcześniejsze informacje o sygnale rozpraszania nie są dostępne, jak w przypadku membran selektywnie deuterowanych. Alternatywnie, można przeprowadzić pomiary statyczne (znane również jako dyfrakcja) w ograniczonym zakresie Q na instrumencie NSE, z zastrzeżeniem, że takie pomiary trwają znacznie dłużej w porównaniu z SANS.
  3. Za pomocą strzykawki lub pipety transferowej załaduj ekstrudowaną zawiesinę liposomalną (zawiesiny) liposomalną do wyznaczonych komórek próbkowych dostępnych na liniach badawczych NSE. Należy pamiętać, że standardowe komórki pomiarowe NSE są dostępne w grubościach 1, 2, 3 i 4 mm. Wybierz grubość ogniwa w taki sposób, aby zoptymalizować sygnał rozpraszania, jednocześnie utrzymując niespójny sygnał tła na rozsądnym natężeniu.
    UWAGA: Z reguły należy używać komórek próbnych o długości ścieżki 1 lub 2 mm dla liposomów protiowanych w buforze deuterowanym – grubsze komórki mogą powodować wielokrotne efekty rozpraszania, które są trudne do skorygowania. W przypadku liposomów o wyższym poziomie deuteracji (np. liposomy z dopasowanym kontrastem ogonowym lub liposomy asymetryczne z pojedynczymi listkami), rozważ użycie grubszej komórki próbki (np. Długość ścieżki 3 lub 4 mm) w celu poprawy statystyk liczenia, jeśli próbka jest dostępna w większych ilościach – czasami może to być zbyt kosztowne.
  4. Przygotować identyczną komorę próbki do buforu. Stosować ten sam bufor, co w zawiesinie liposomalnej. Pomiary na buforze są niezbędne do normalizacji intensywności i korekt tła (BKG).
  5. Umieść celę (komórki) próbki w uchwycie próbki spektrometru NSE, zaprogramuj przebiegi pomiarowe i zbierz dane echa. Skonsultuj się z naukowcem zajmującym się instrumentem w sprawie programowania pomiarów, jeśli korzystasz z NSE po raz pierwszy.
  6. Wykonaj dwa dodatkowe zestawy pomiarów potrzebnych do redukcji danych: pomiary rozdzielczości (R) i pomiary transmisyjne (T).
    1. Wykonaj pomiar rozdzielczości (R) na odniesieniu do rozpraszania sprężystego (np. węgla) — należy go przeprowadzić przy tych samych ustawieniach, tj. tym samym wektorze fali i czasach Fouriera, co pomiary próbki i bufora.
    2. Wykonać pomiary transmisyjne (T) na próbce i buforze, aby obliczyć intensywność transmitowanej wiązki neutronów (patrz krok 4.9 poniżej). Transmisję oblicza się jako stosunek liczby neutronów z próbki lub bufora podzielony przez liczbę neutronów dla otwartej wiązki (tj. z pustą pozycją próbki).
  7. Skorzystaj z dedykowanego oprogramowania do redukcji danych dla spektrometru NSE, na którym wykonywane są pomiary, aby zredukować zebrane dane.
    UWAGA: Różne spektrometry mogą wykorzystywać różne oprogramowanie lub interfejsy użytkownika. Poniżej znajduje się przykład redukcji danych NSE przy użyciu oprogramowania Data Analysis and Visualization Environment (DAVE)68 napisanego specjalnie dla spektrometru NSE w NIST Center for Neutron Research.
    1. Otwórz oprogramowanie DAVE i wybierz opcję Reduce NSE Data (Zmniejsz dane NSE) z menu redukcji danych. Pojawi się kilka wyskakujących okienek.
    2. Prześlij pliki danych dla różnych wartości Q za pomocą opcji Otwórz pliki .echo z menu plików. Pliki te odpowiadają plikom danych surowych z sygnałami echa wirowego i mają rozszerzenie .echo w nazwie pliku. Po zakończeniu przesyłania plików zostaną one wyświetlone w dostępnych zestawach danych.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy wybrany plik i oznacz go zgodnie z pomiarem, któremu odpowiada, tj. Próbka, Komórka (dla pustej komórki lub bufora) lub Rozdzielczość.
    4. Pogrupuj piksele detektora w 2 x 2, aby poprawić stosunek sygnału do szumu za pomocą karty Zestaw danych. Zastosuj tę samą kategoryzację do wszystkich plików, tj. Rozdzielczość, Komórka i Próbka.
    5. Sprawdź dane we wszystkich grupach pikseli i zamaskuj te, które mają słabe sygnały (patrz Rysunek 4B), naciskając m na klawiaturze. Naciśnij Enter, aby uzyskać dostęp do wyskakującego okienka w celu zastosowania tej samej maski do wszystkich czasów Fouriera lub kolejnych czasów Fouriera. Można to również zastosować do poszczególnych pikseli w dowolnym momencie podczas redukcji danych. Zamaskowane piksele zmienią kolor na zielony.
    6. Upewnij się, że zebrane dane mają postać sygnału echa, tj. funkcji cosinusowej pod względem prądu fazowego, nad każdym pikselem detektora (patrz Rysunek 4A).
      UWAGA: Prąd fazowy jest proporcjonalny do kąta precesji spinu neutronu; w związku z tym często przedstawia się prąd fazowy jako kąt fazowy, jak pokazano na Rysunek 4A. W przypadku pomiarów na źródłach impulsowych, do danych stosuje się dodatkowe obliczenia czasu lotu w celu uzyskania sygnałów echa w funkcji długości fali padającego neutronu w impulsie neutronowym.
    7. Zacznij od dopasowania pliku rozdzielczości. Wybierz plik rozdzielczości z listy przesłanych plików i kliknij go prawym przyciskiem myszy. Wybierz opcję Operacje dopasowania: Dopasuj echa (rozdzielczość) z menu podręcznego.
    8. Upewnij się, że pasowania sygnałów echa dają szereg parametrów dopasowania, w tym parametr A, wymagany w kroku 4.8. Pasowania są wykonywane automatycznie przy użyciu następującego wyrażenia.
      figure-protocol-3
      Tutaj ζ jest okresem sygnału echa (tj. funkcją cosinusa w Rysunek 4A), σ jest szerokością obwiedni Gaussa określoną przez średnią długość fali i rozpiętość długości fali padającej wiązki neutronów, Φc to prąd fazowy, a Φ0 to punkt echa, który zależy od ścieżki pola doświadczanej przez neutrony50. Informacja fizyczna o próbce jest zakodowana w amplitudzie A funkcji cosinusowej w równaniu (1).
      UWAGA: Szerokość obwiedni Gaussa jest oparta na wartościach z góry określonych przez naukowca zajmującego się instrumentem i nie powinna być zmieniana. Pozostałe parametry to zmienne, które są dopasowane do określonego sygnału echa w każdym pikselu.
    9. Sprawdź wyniki dopasowania, klikając każdy piksel, aby wyświetlić wynikowe parametry dopasowania, jakość dopasowania i średnie odchylenie kwadratowe dopasowania. Aby sprawdzić błąd związany z każdym parametrem dopasowania w całym detektorze, wybierz opcję Opcje obrazu, a następnie wybierz interesujący Cię parametr dopasowania. Spowoduje to wygenerowanie mapy z wartością parametru dopasowania dla każdego piksela. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz detektora. Pojawi się wyskakujące okienko z mapą paska błędów wybranego parametru dopasowania.
    10. Jeśli dopasowanie do określonego piksela jest niezadowalające (np. dopasowanie parametrów z dużymi paskami błędów), ponownie skieruj sygnał na ten konkretny piksel. Zaznacz ten piksel, naciśnij kartę Dopasowanie, a następnie naciśnij przycisk Dopasuj piksel. Wprowadź nowe parametry początkowe dla fazy (Φ0) i okresu (ζ) w zakładce Dopasowanie, aby uzyskać bardziej zadowalające dopasowanie.
      UWAGA: Przydatne jest wykreślenie dopasowanej fazy jako funkcji czasu Fouriera. W tym celu należy przejść do głównego okna wykresu i wybrać opcję Dopasuj fazę do czasu Fouriera. Ta fabuła powinna być płynna i ciągła. Sprawdź nieciągłości na tym wykresie i ponownie zamontuj piksele, którym odpowiadają.
  8. Zmniejsz plik próbki lub komórki, wybierając odpowiedni plik z listy przesłanych i oznaczonych plików.
    1. Sprawdź wszystkie piksele i zamaskuj te, które mają złe statystyki, zgodnie z opisem w kroku 4.7.5.
    2. Kliknij plik prawym przyciskiem myszy i wybierz Operacje dopasowania: Fazy importu (próbka, komórka). Spowoduje to zaimportowanie faz i zastosowanej maski z pliku rozdzielczości.
    3. Dopasuj sygnały echa, stosując tę samą procedurę, która została opisana wcześniej dla pliku Rozdzielczość (kroki 4.7.8-4.7.10). Dopasowując pliki próbki i komórki, nie zmieniaj wartości punktu fazy okresu i echa zaimportowanych z dopasowań rozdzielczości. Parametry te zależą od ustawień instrumentalnych i nie powinny się różnić w zależności od próbek.
    4. Przed przystąpieniem do redukcji danych należy wprowadzić środek belki dla wszystkich plików danych. Wybierz plik danych, przejdź do zakładki Ogólne i wprowadź wartości środka belki X i Y. Wartości te są rejestrowane podczas eksperymentu.
    5. Po zakończeniu dopasowań do plików próbki, komórki i rozdzielczości oblicz znormalizowaną funkcję rozpraszania pośredniego, która ma być używana później w analizie i interpretacji danych. Aby to zrobić, kliknij prawym przyciskiem myszy na Przykładowy plik do zmniejszenia z listy dopasowanych plików i wybierz Oblicz I(Q) z menu podręcznego. Pojawi się okno z opcjami do wyboru dla plików Resolution i Cell (tj. bufora) oraz liczbą Q-arcs (patrz krok 4.9). Po wprowadzeniu wszystkich wymaganych informacji naciśnij przycisk OK. Wyniki pojawią się w nowym oknie.
      UWAGA: Redukcja danych jest wykonywana zgodnie z następującym równaniem w celu uzyskania znormalizowanej funkcji rozpraszania pośredniego69.
      figure-protocol-4
      gdzie t jest czasem Fouriera, Nw górę i Nw dół są zliczeniami neutronów w konfiguracjach bez spin-flip i spin-flip (mierzonymi odpowiednio z wyłączonymi płetwami π/2 i wyłączonymi i włączonymi π-flipperami), a indeksy górne, BKG i R, odpowiadają odpowiednio pomiarom tła i rozdzielczości, jak określono w krokach 4.4 i 4.6. Zauważ, że polaryzacja wiązki figure-protocol-5, a więc zmiany stanu spinu spowodowane wymianą energii między neutronem a próbką są wykrywane jako spadek polaryzacji (od jedności).
  9. Na koniec pogrupuj piksele detektora w łuki Q, jak pokazano na Rysunek 4B, aby uzyskać zależność Q znormalizowanej funkcji rozpraszania pośredniego, S(Q,t) / S(Q,0). Technicznie nazywa się to binowaniem danych i powinno być wykonywane rozsądnie, tj. biorąc pod uwagę statystyki zliczania z próbki i oczekiwane odchylenie standardowe danych względem zgrupowanych pikseli.
  10. W przypadku próbek silnie rozpraszających należy podzielić detektor na więcej łuków Q, zachowując rozsądne słupki błędów wynikowej funkcji rozpraszania pośredniego, S(Q,t) / S(Q,0). Daje to więcej punktów danych Q i jest ważne dla procedury analizy danych opisanej poniżej. Należy pamiętać, że w przypadku próbek o słabym rozproszeniu, nadmierne kategoryzowanie powoduje słabe sygnały zaniku, tj. duże słupki błędów na S(Q,t) / S(Q,0), co może skutkować dużą niepewnością.

5. Analiza i interpretacja danych

  1. Dopasuj znormalizowane pośrednie funkcje rozpraszania, S(Q,t) / S(Q,0), uzyskane z powyższej redukcji danych, do rozciągniętej funkcji wykładniczej z wykładnikiem rozciągania 2/370.
    figure-protocol-6
    UWAGA: Przykład tych dopasowań znajduje się w Rysunek 5B. Pasowania S(Q,t) / S(Q,0) do równania (3) dają współczynniki relaksacji zależne od Q Γ(Q).
  2. Wykreślić Γ(Q) jako funkcję Q i dopasować do odpowiedniego modelu, aby wyodrębnić odpowiednie parametry membrany.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania NSE dotyczące fluktuacji zginania są zazwyczaj wykonywane w zakresie Q ~ (0,04 - 0,2) Å-1. Ten zakres Q odpowiada pośrednim skalom długości między grubością membrany a promieniem liposomalnym, gdzie dominuje dynamika zginania. Pomiar w rozszerzonym zakresie Q może zapewnić dostęp do dodatkowych trybów dynamicznych, w tym dyfuzji liposomalnej i dynamiki wewnątrzbłonowej. Aby uzyskać więcej informacji na temat krzyżowania się dynamiki membranowej, do której dostęp ma NSE, zapoznaj się z odpowiednimi publ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSE jest potężną i unikalną techniką pomiaru mezoskopowej dynamiki błon lipidowych w różnych warunkach. Efektywne wykorzystanie NSE zależy od jakości próbki, kontrastu neutronów i zakresu dostępnej dynamiki, którą można zbadać dla danej próbki. W związku z tym do przeprowadzenia udanych eksperymentów NSE i zebrania wysokiej jakości danych wymaganych jest kilka krytycznych kroków. Kluczowym krokiem w zapewnieniu efektywnego wykorzystania czasu wiązki neutronów podczas eksperymentu NSE jest scharakteryzowanie zawiesin lipo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie wykazują konfliktu interesów i nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R. Ashkar dziękuje M. Nagao, L.-R. Stingaciu i P. Żołnierczukowi za wiele pożytecznych dyskusji i za częstą pomoc w eksperymentach NSE na ich odpowiednich liniach badawczych. Autorzy przyznają się do stosowania spektrometrów echa spinowego neutronów w NIST i ORNL. Spektrometr NSE w NIST jest wspierany przez Center for High Resolution Neutron Scattering, partnerstwo między National Institute of Standards and Technology i National Science Foundation na mocy umowy nr. DMR-1508249. Spektrometr NSE w Plulacyjnym Źródle Neutronów ORNL jest wspierany przez Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC na podstawie umowy nr US DOE. DE-AC05-00LUB22725.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chloroform (klasa biotechnologiczna)Sigma Aldrich496189Biotech. klasa, ≥ 99,8%, zawiera 0,5-1,0% etanolu jako stabilizator
Łaźnia cyrkulacyjnaJulaboSE-12Cyrkulator grzewczy z inteligentną pompą, programowalnymi ustawieniami temperatury i przyłączem czujnika zewnętrznego do pomiaru i kontroli
Tlenek deuteruCambridge Isotopes LaboratoriesDLM-4Woda deuterowana; Ciężka waga (D2O) (D, 99,9%)
Cyfrowa półmikrowagaMettler ToledoMS105Półmikrowaga o nośności 120 g, dokładności odczytu 0,01 mg, czujniku wagowym o wysokiej rozdzielczości, ergonomicznych drzwiczkach i aplikacji do sprawdzania pipet
Etanol (klasa biologii molekularnej)Sigma AldrichE7023200-proof etanol do zastosowań w biologii molekularnej
Pipety szklaneVWR36360-536Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła sodowo-wapniowego
Fiolki szklaneThermo ScientificB7990-1Fiolki ze szkła borokrzemianowego z nasadkami przegrody PTFE/silionu
Zamrażarka laboratoryjnaFisher ScientificIU2886DZamrażarka o bardzo niskiej temperaturze (od -86 do -50 C) do długotrwałego przechowywania lipidów i białek
Lipidy (protaited lub perdeuterowane)Avanti Polar Lipidsróżni się w zależności od lipidówLipidy można kupić w Avanti w postaci proszku lub w roztworze chloroformu z wymaganymi ilościami i schematami deuteracji.
Oczyszczacz wody MilliporeMillipore SigmaZRQSVP3USDirect-Q®   3 System oczyszczania wody UV, który dostarcza zarówno czystą, jak i ultraczystą wodę z wbudowaną lampą UV w celu obniżenia poziomu substancji organicznych dla biologicznych   Zastosowania
Zestaw mini ekstruderówAvanti Polar Lipids610020Zestaw mini-ekstrudera zawiera mini-ekstruder, blok grzewczy, 2 strzykawki GasTight i 2 O-ringi, membrany poliwęglanowe i wsporniki filtrów
SzybkozłączkiGrainger2YDA1 i 2YDA7Złączki rurkowe z przyciskiem do zastosowań cyrkulacji wody QuickConnect, np. wytłaczanie pęcherzyków w wysokiej temperaturze
PompastrzykawkowaSyringePump.comNew Era-1000W pełni programowalna pompa strzykawkowa do infuzji i odstawiania; programuje do 41 faz pompowania z regulowaną szybkością pompowania, dozowanymi objętościami i cyklami wytłaczania
Kąpiel ultradźwiękowaFisher ScientificCPX2800Łaźnia ultradźwiękowa z regulacją temperatury z programowalną funkcją do zastosowań odgazowujących i ultradźwiękowych
Piec próżniowyThermo Scientific3608Piekarnik próżniowy o pojemności 0,7 stopy sześciennej z wbudowanym termostatem górnego limitu chroni przed przegrzaniem
Mieszalnik wirowyFisher Scientific02-215-414Zmienna prędkość, sterowanie analogowe, które umożliwia rozruch przy niskich obrotach w celu delikatnego wstrząsania lub szybkie mieszanie w celu energicznego wirowania próbek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175 (4023), 720-731 (1972).
  2. Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 107-130 (2007).
  3. Lundbæk, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. Journal of The Royal Society Interface. 7 (44), 373-395 (2010).
  4. Bradley, R. P., Radhakrishnan, R. Curvature-undulation coupling as a basis for curvature sensing and generation in bilayer membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 117-124 (2016).
  5. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  6. Jensen, M. Ø, Mouritsen, O. G. Lipids do influence protein function-the hydrophobic matching hypothesis revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 205-226 (2004).
  7. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  8. Katchalsky, A., Spangler, R. Dynamics of membrane processes. Quarterly Reviews of Biophysics. 1 (2), 127-175 (1968).
  9. Rheinstädter, M. C. Collective molecular dynamics in proteins and membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), 83-90 (2008).
  10. Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1082 (2002).
  11. Hac, A. E., Seeger, H. M., Fidorra, M., Heimburg, T. Diffusion in two-component lipid membranes--a fluorescence correlation spectroscopy and monte carlo simulation study. Biophysical Journal. 88 (1), 317-333 (2005).
  12. Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7208-7213 (2010).
  13. Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring lipid membrane viscosity using rotational and translational probe diffusion. Physical Review Letters. 112 (18), 188101(2014).
  14. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
  15. Bassereau, P., Sorre, B., Lévy, A. Bending lipid membranes: Experiments after W. Helfrich's model. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 47-57 (2014).
  16. Monzel, C., Sengupta, K. Measuring shape fluctuations in biological membranes. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (24), 243002(2016).
  17. Deserno, M. Mesoscopic membrane physics: concepts, simulations, and selected applications. Macromolecular Rapid Communications. 30 (9-10), 752-771 (2009).
  18. Reynwar, B. J., et al. Aggregation and vesiculation of membrane proteins by curvature-mediated interactions. Nature. 447 (7143), 461-464 (2007).
  19. Haswell, E. S., Phillips, R., Rees, D. C. Mechanosensitive channels: what can they do and how do they do it. Structure. 19 (10), 1356-1369 (2011).
  20. Phillips, R., Ursell, T., Wiggins, P., Sens, P. Emerging roles for lipids in shaping membrane-protein function. Nature. 459 (7245), 379-385 (2009).
  21. Dill, K. A., Chan, H. S. From Levinthal to pathways to funnels. Nature Structural Biology. 4 (1), 10-19 (1997).
  22. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  23. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7(2019).
  24. Lyman, E., Hsieh, C. -L., Eggeling, C. From dynamics to membrane organization: experimental breakthroughs occasion a "modeling manifesto". Biophysical Journal. 115 (4), 595-604 (2018).
  25. Arriaga, L. R., et al. Dissipative curvature fluctuations in bilayer vesicles: Coexistence of pure-bending and hybrid curvature-compression modes. The European Physical Journal. E, Soft Matter. 31 (1), 105-113 (2010).
  26. Honerkamp-Smith, A. R., Veatch, S. L., Keller, S. L. An introduction to critical points for biophysicists; observations of compositional heterogeneity in lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 53-63 (2009).
  27. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101(2002).
  28. Heberle, F. A., et al. Bilayer thickness mismatch controls domain size in model membranes. Journal of the American Chemical Society. 135 (18), 6853-6859 (2013).
  29. Nickels, J. D., et al. The in vivo structure of biological membranes and evidence for lipid domains. PLOS Biology. 15 (5), 2002214(2017).
  30. Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387 (6633), 569-572 (1997).
  31. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  32. Liu, S. -L., et al. Orthogonal lipid sensors identify transbilayer asymmetry of plasma membrane cholesterol. Nature Chemical Biology. 13, 268(2016).
  33. Rothman, J., Lenard, J. Membrane asymmetry. Science. 195 (4280), 743-753 (1977).
  34. Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D. 74 (12), 1129-1168 (2018).
  35. Woodka, A. C., Butler, P. D., Porcar, L., Farago, B., Nagao, M. Lipid bilayers and membrane dynamics: insight into thickness fluctuations. Physical Review Letters. 109 (5), 058102(2012).
  36. Chakraborty, S., et al. How cholesterol stiffens unsaturated lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (36), 21896-21905 (2020).
  37. Arriaga, L. R., et al. Stiffening effect of cholesterol on disordered lipid phases: a combined neutron spin echo + dynamic light scattering analysis of the bending elasticity of large unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 96 (9), 3629-3637 (2009).
  38. Nagao, M., Kelley, E. G., Ashkar, R., Bradbury, R., Butler, P. D. Probing elastic and viscous properties of phospholipid bilayers using neutron spin echo spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (19), 4679-4684 (2017).
  39. Kelley, E. G., Butler, P. D., Ashkar, R., Bradbury, R., Nagao, M. Scaling relationships for the elastic moduli and viscosity of mixed lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (38), 23365-23373 (2020).
  40. Rickeard, B. W., et al. Transverse lipid organization dictates bending fluctuations in model plasma membranes. Nanoscale. 12 (3), 1438-1447 (2020).
  41. Nickels, J. D., et al. Mechanical properties of nanoscopic lipid domains. Journal of the American Chemical Society. 137 (50), 15772-15780 (2015).
  42. Mezei, F. Neutron spin echo: A new concept in polarized thermal neutron techniques. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 255 (2), 146-160 (1972).
  43. Hayter, J. B., Penfold, J. Neutron spin-echo integral transform spectroscopy. Zeitschrift für Physik B Condensed Matter. 35 (2), 199-205 (1979).
  44. Monkenbusch, M., Richter, D. Neutrons in Soft Matter. Imae, T., Kanaya, T., Furusaka, M., Torikai, N. , Wiley. ch6 147-182 (2011).
  45. Pynn, R. Neutron Spin Echo. Mezei, F., Pappas, C., Gutberlet, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 159-177 (2003).
  46. Holderer, O., et al. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 19 (3), 034022(2008).
  47. Schleger, P., et al. The long-wavelength neutron spin-echo spectrometer IN15 at the Institut Laue-Langevin. Physica B: Condensed Matter. 241-243, 164-165 (1997).
  48. Holderer, O., Zolnierczuk, P., Pasini, S., Stingaciu, L., Monkenbusch, M. A better view through new glasses: Developments at the Jülich neutron spin echo spectrometers. Physica B: Condensed Matter. 562, 9-12 (2019).
  49. Farago, B., et al. The IN15 upgrade. Neutron News. 26 (3), 15-17 (2015).
  50. Ashkar, R. Selective dynamics in polymeric materials: Insights from quasi-elastic neutron scattering spectroscopy. Journal of Applied Physics. 127 (15), 151101(2020).
  51. Pasini, S., Holderer, O., Kozielewski, T., Richter, D., Phoenix Monkenbusch, M. J-NSE- Phoenix, a neutron spin-echo spectrometer with optimized superconducting precession coils at the MLZ in Garching. Review of Scientific Instruments. 90 (4), 043107(2019).
  52. Svergun, D. I., Koch, M. H. J., Timmins, P. A., May, R. P. Small Angle X-Ray and Neutron Scattering from Solutions of Biological Macromolecules. , Oxford University Press. (2013).
  53. Eicher, B., et al. Joint small-angle X-ray and neutron scattering data analysis of asymmetric lipid vesicles. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 419-429 (2017).
  54. Heberle, F. A., et al. Model-based approaches for the determination of lipid bilayer structure from small-angle neutron and X-ray scattering data. European Biophysics Journal. 41 (10), 875-890 (2012).
  55. Jaksch, S., Koutsioubas, A., Mattauch, S., Holderer, O., Frielinghaus, H. Long-range excitations in phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 225, 104788(2019).
  56. Jaksch, S., et al. Influence of ibuprofen on phospholipid membranes. Physical Review E. 91 (2), 022716(2015).
  57. Armstrong, C. L., et al. Effect of cholesterol on the lateral nanoscale dynamics of fluid membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 901-913 (2012).
  58. Rheinstädter, M. C., Häußler, W., Salditt, T. Dispersion relation of lipid membrane shape fluctuations by neutron spin-echo spectrometry. Physical Review Letters. 97 (4), 048103(2006).
  59. Armstrong, C. L., Häußler, W., Seydel, T., Katsaras, J., Rheinstädter, M. C. Nanosecond lipid dynamics in membranes containing cholesterol. Soft Matter. 10 (15), 2600-2611 (2014).
  60. Nickels, J. D., et al. Lipid rafts: buffers of cell membrane physical properties. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (9), 2050-2056 (2019).
  61. Michonova-Alexova, E. I., Sugár, I. P. Component and state separation in DMPC/DSPC lipid bilayers: a Monte Carlo simulation study. Biophysical Journal. 83 (4), 1820-1833 (2002).
  62. Sugár, I. P., Thompson, T. E., Biltonen, R. L. Monte Carlo simulation of two-component bilayers: DMPC/DSPC mixtures. Biophysical Journal. 76 (4), 2099-2110 (1999).
  63. Mabrey, S., Sturtevant, J. M. Investigation of phase transitions of lipids and lipid mixtures by sensitivity differential scanning calorimetry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 73 (11), 3862-3866 (1976).
  64. Neutron activation and scattering calculator. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2021).
  65. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  66. Ashkar, R., et al. Tuning membrane thickness fluctuations in model lipid bilayers. Biophysical Journal. 109 (1), 106-112 (2015).
  67. Carrillo, J. -M. Y., Katsaras, J., Sumpter, B. G., Ashkar, R. A computational approach for modeling neutron scattering data from lipid bilayers. Journal of Chemical Theory and Computation. 13 (2), 916-925 (2017).
  68. Azuah, R. T. DAVE: a comprehensive software suite for the reduction, visualization, and analysis of low energy neutron spectroscopic data. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 114 (6), 341-358 (2009).
  69. Van Hove, L. Correlations in space and time and born approximation scattering in systems of interacting particles. Physical Review. 95 (1), 249-262 (1954).
  70. Zilman, A. G., Granek, R. Undulations and dynamic structure factor of membranes. Physical Review Letters. 77 (23), 4788-4791 (1996).
  71. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. Collective dynamics in model biological membranes measured by neutron spin echo spectroscopy. , Walter de Gruyter, Inc. 131-176 (2019).
  72. Zheng, Y., Michihiro, N., Dobrin, P. B. Bending elasticity of saturated and monounsaturated phospholipid membranes studied by the neutron spin echo technique. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (15), 155104(2009).
  73. Sharma, V. K., Qian, S. Effect of an antimicrobial peptide on lateral segregation of lipids: a structure and dynamics study by neutron scattering. Langmuir. 35 (11), 4152-4160 (2019).
  74. Boggara, M. B., Faraone, A., Krishnamoorti, R. Effect of pH and Ibuprofen on the Phospholipid Bilayer Bending Modulus. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (24), 8061-8066 (2010).
  75. Lee, J. -H., et al. Thermal fluctuation and elasticity of lipid vesicles interacting with pore-forming peptides. Physical Review Letters. 105 (3), 038101(2010).
  76. Chakraborty, S., Abbasi, A., Bothun, G. D., Nagao, M., Kitchens, C. L. Phospholipid bilayer softening due to hydrophobic gold nanoparticle inclusions. Langmuir. 34 (44), 13416-13425 (2018).
  77. Hoffmann, I., et al. Softening of phospholipid membranes by the adhesion of silica nanoparticles - as seen by neutron spin-echo (NSE). Nanoscale. 6 (12), 6945-6952 (2014).
  78. Watson, M. C., Brown, F. L. H. Interpreting membrane scattering experiments at the mesoscale: the contribution of dissipation within the bilayer. Biophysical Journal. 98 (6), 9-11 (2010).
  79. Seifert, U., Langer, S. A. Viscous modes of fluid bilayer membranes. Europhysics Letters (EPL). 23 (1), 71-76 (1993).
  80. Bingham, R. J., Smye, S. W., Olmsted, P. D. Dynamics of an asymmetric bilayer lipid membrane in a viscous solvent. EPL (Europhysics Letters). 111 (1), 18004(2015).
  81. Rawicz, W., Olbrich, K. C., McIntosh, T., Needham, D., Evans, E. Effect of chain length and unsaturation on elasticity of lipid bilayers. Biophysical Journal. 79 (1), 328-339 (2000).
  82. Doktorova, M., LeVine, M. V., Khelashvili, G., Weinstein, H. A new computational method for membrane compressibility: bilayer mechanical thickness revisited. Biophysical Journal. 116 (3), 487-502 (2019).
  83. Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. The Journal of Physical Chemistry. 91 (16), 4219-4228 (1987).
  84. Lesieur, S., Grabielle-Madelmont, C., Paternostre, M. T., Ollivon, M. Size analysis and stability study of lipid vesicles by high-performance gel exclusion chromatography, turbidity, and dynamic light scattering. Analytical Biochemistry. 192 (2), 334-343 (1991).
  85. Heberle, F. A., et al. Direct label-free imaging of nanodomains in biomimetic and biological membranes by cryogenic electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 19943-19952 (2020).
  86. Cornell, C. E., Mileant, A., Thakkar, N., Lee, K. K., Keller, S. L. Direct imaging of liquid domains in membranes by cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 19713-19719 (2020).
  87. Yao, X., Fan, X., Yan, N. Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18497-18503 (2020).
  88. Kučerka, N., Nieh, M. -P., Katsaras, J. Fluid phase lipid areas and bilayer thicknesses of commonly used phosphatidylcholines as a function of temperature. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1808 (11), 2761-2771 (2011).
  89. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Lund, R. Resolving the structural interactions between antimicrobial peptides and lipid membranes using small-angle scattering methods: the case of indolicidin. Soft Matter. 14 (43), 8750-8763 (2018).
  90. Kučerka, N., et al. Lipid bilayer structure determined by the simultaneous analysis of neutron and X-ray scattering data. Biophysical Journal. 95 (5), 2356-2367 (2008).
  91. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. Scaling of lipid membrane rigidity with domain area fraction. Soft Matter. 15 (13), 2762-2767 (2019).
  92. Brüning, B. -A., et al. Bilayer undulation dynamics in unilamellar phospholipid vesicles: Effect of temperature, cholesterol and trehalose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1838 (10), 2412-2419 (2014).
  93. Kučerka, N., et al. Areas of monounsaturated diacylphosphatidylcholines. Biophysical Journal. 97 (7), 1926-1932 (2009).
  94. Sharma, V. K., Mamontov, E., Anunciado, D. B., O'Neill, H., Urban, V. S. Effect of antimicrobial peptide on the dynamics of phosphocholine membrane: role of cholesterol and physical state of bilayer. Soft Matter. 11 (34), 6755-6767 (2015).
  95. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. Collective dynamics in lipid membranes containing transmembrane peptides. Soft Matter. , (2021).
  96. Yu, J., et al. Structure and dynamics of lipid membranes interacting with antivirulence end-phosphorylated polyethylene glycol block copolymers. Soft Matter. 16 (4), 983-989 (2020).
  97. Stingaciu, L. -R., et al. Revealing the dynamics of thylakoid membranes in living cyanobacterial cells. Scientific Reports. 6 (1), 19627(2016).
  98. Stingaciu, L. -R., O'Neill, H. M., Liberton, M., Pakrasi, H. B., Urban, V. S. Influence of chemically disrupted photosynthesis on cyanobacterial thylakoid dynamics in synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 9 (1), 5711(2019).
  99. Miller, I. R. Energetics of fluctuation in lipid bilayer thickness. Biophysical Journal. 45 (3), 643-644 (1984).
  100. Nagao, M. Observation of local thickness fluctuations in surfactant membranes using neutron spin echo. Physical Review E. 80 (3), 031606(2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 8/06/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

In the Introduction, the fith pargraph was updated from:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

to:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

In the Protocol, step 1.1 was updated from:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research. 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

to:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research. 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis., where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

to:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis., where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:

Lipid bilayer structures; neutron scattering analysis; molecular arrangement diagram; lipid vesicles.
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Lipid bilayer diagrams with charts, nanostructure spheres, and membrane model in research context.
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

Tags

Neutron Spin EchoLipid Membrane DynamicsMembrane Protein InteractionsMembrane FluctuationsDeuterium LabelingLiposomal MembranesBending RigidityMembrane Thickness FluctuationsSample PreparationData Reduction

Related Articles