Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62405

⸱

16 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institutes of Brian Science, Fudan University, 4Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Streszczenie

Złożoność ludzkich astrocytów pozostaje słabo zdefiniowana w pierwotnej tkance ludzkiej, co wymaga lepszych narzędzi do ich izolacji i charakterystyki molekularnej. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS) może być wykorzystane do skutecznego izolowania i badania populacji ludzkich jąder neuronalnych (NeuN+) z zamrożonej tkanki archiwalnej, unikając w ten sposób problemów związanych z obchodzeniem się ze świeżą tkanką. Brakuje jednak prób podobnego wyizolowania astrogleju od elementu nieneuronalnego (NeuN-). Niedawno opracowana i zwalidowana strategia znakowania immunologicznego wykorzystuje trzy przeciwciała przeciwko czynnikom transkrypcyjnym do jednoczesnej izolacji wzbogaconych populacji jąder neuronalnych (NeuN+), astrocytów (sparowane białko pudełkowe 6 (PAX6)+NeuN-) i progenitorów oligodendrocytów (OLIG2+NeuN-) z niechorych, świeżych (nieutrwalonych) zamrożonych pośmiertnie ludzkich tkanek skroniowej kory nowej.

Wykazano, że ta technika jest przydatna do charakterystyki zmian transkryptomu specyficznych dla typu komórki w pierwotnej patologicznej korze nowej padaczki. Analizy transkryptomiczne potwierdziły, że populacje posortowane w rodzaju PAX6+NeuN są silnie wzbogacone o markery panastrocytów i wychwytują astrocyty zarówno w stanie spoczynku, jak i reaktywności. W artykule opisano metodologię FANS izolacji populacji jąder wzbogaconych w astrocyty ze świeżo zamrożonej kory człowieka, w tym dysocjacji tkanek do zawiesiny jednojądrowej (sn); znakowanie immunologiczne jąder przeciwciałami fluorescencyjnie sprzężonymi anty-NeuN i anty-PAX6; Strategie bramkowania FANS i wskaźniki kontroli jakości w celu optymalizacji czułości i swoistości podczas sortowania oraz potwierdzania wzbogacenia astrocytów; oraz zalecane zamówienia na dalsze sekwencjonowanie transkryptomu i dostępności chromatyny w rozdzielczości zbiorczej lub SN. Protokół ten ma zastosowanie do nienekrotycznych, świeżo mrożonych, ludzkich próbek kory mózgowej z różnymi patologiami i zalecanym pośmiertnym pobraniem tkanek w ciągu 24 godzin.

Wprowadzenie

Złożoność molekularna ludzkich astrocytów pozostaje słabo zdefiniowana w tkance pierwotnej, co wymaga lepszych narzędzi do ich izolacji i charakterystyki w wysokiej rozdzielczości, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Oddzielenie nienaruszonych ludzkich neuronów i komórek glejowych od ich niszy okazało się trudne ze względu na ograniczony dostęp do świeżych próbek tkanki mózgowej, silnie powiązany charakter procesów glejowych i neuronalnych oraz nieuniknioną aktywację komórkową podczas przetwarzania, z których wszystkie ograniczają charakterystykę molekularną tych typów komórek ex vivo1. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS) stało się alternatywą dla sortowania żywych komórek, umożliwiając dysocjację i immunoznakowanie populacji jąder z zamrożonej tkanki. W ciągu ostatniej dekady FANS stał się szeroko stosowany do izolowania i molekularnego charakteryzowania populacji ludzkich jąder neuronalnych (NeuN+) w różnych próbkach mózgu i regionach anatomicznych1,2,3,4.

Jednak podobne metody izolowania określonych subpopulacji jąder glejowych od ludzkiej kory mózgowej były ograniczone, co prowadzi do względnego braku wyrafinowania w zrozumieniu złożoności astrocytów zarówno w normalnych, jak i chorych tkankach. W tym celu zaadaptowano wcześniej opublikowany protokół do izolowania ludzkich populacji neuronów za pomocą FANS4, a także zatwierdzono metodę wzbogacania astrocytów (i oligodendroglialnych progenitorów) przy użyciu kombinacji potrójnych przeciwciał, wychwytując astrocyty zarówno w stanie spoczynku, jak i reaktywnym5. Aby specyficznie wzbogacić astrocyty we frakcji NeuN-, zastosowano przeciwciała przeciwko jednemu z dwóch czynników transkrypcyjnych, o których wiadomo, że mają różną ekspresję w populacjach astrocytów, PAX6 lub czynnikowi transkrypcyjnemu SRY-box 9 (SOX9)6,7. PAX6 ulega silnej ekspresji we wczesnym okresie rozwoju płodu w promienistych progenitorach podobnych do gleju w strefach rozrodczych i przyczynia się zarówno do neurogenezy, jak i glejogenezy8,9,10,11, a także do specyfikacji neuronów siatkówki12. U osoby dorosłej PAX6 ulega zróżnicowanej nadekspresji w spoczynkowych ludzkich astrocytach6 i wykazuje koekspresję białka z kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP) w ludzkich astrocytach tkankowych padaczki13.

Ten protokół opisuje jednoczesną izolację populacji neuronów w korze nowej i wzbogaconych w astrocyty przez FANS. Świeża (nieutrwalona) zamrożona (tj. świeżo zamrożona) tkanka pośmiertna pobrana z dorosłej kory jest najpierw mechanicznie i chemicznie dysocjowana. Po lizie i ultraodwirowaniu w gradiencie sacharozy składniki cytoplazmatyczne i zewnątrzkomórkowe są odrzucane, podczas gdy jądra są zatrzymywane. Jądra są następnie znakowane fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami jądrowymi odpowiadającymi pożądanym liniom docelowym i sortowane za pomocą FANS. Zgodnie z tym podejściem, wykazano wzbogacenie astrocytów w zebranych populacjach PAX6 + NeuN-, co zostało potwierdzone zarówno przez celowany panel qPCR, jak i przez sekwencjonowanie jądrowego RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Program Ochrony Ludzi w Icahn School of Medicine at Mount Sinai (ISMMS) i jego Institutional Review Board (IRB) zapewniają etyczne prowadzenie badań i zgodność z przepisami federalnymi, stanowymi i instytucjonalnymi. W tym badaniu wszystkie wykorzystane próbki pośmiertne zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację, uzyskane za odpowiednią zgodą za pośrednictwem biorepozytorium i zostały zwolnione z oznaczenia "badania na ludziach" przez IRB ISMMS (HS#14-01007).

1. Przygotowanie bufora

UWAGA: Jeśli wykonujesz sekwencjonowanie RNA na dalszym etapie, dokładnie potraktuj wszystkie miejsca pracy i narzędzia roztworem do dekontaminacji RNazy, aby zapobiec degradacji mRNA.

  1. Przygotować bufor do lizy.
    1. W destylowanymH2Odo 50 ml rozpuścić: 5,47 g sacharozy (0,32 M wersja ostateczna), 250 μl 1 M CaCl2 (5 mM wersja ostateczna), 150 μl 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM wersja ostateczna), 10 μl 500 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,1 mM wersja ostateczna), 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM wersja ostateczna), 50 μl Triton X-100 (0,1% wersja ostateczna) i 17 μl 3 M ditiotreitolu (DTT, 1 mM wersja ostateczna, dodać świeżą) (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotować bufor sacharozy
    1. W destylowanymH2Odo 50 ml rozpuścić: 30,78 g sacharozy (1,8 M wersja ostateczna), 150 μl 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM wersja ostateczna), 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM wersja ostateczna), 17 μl 3 M DTT (1 mM wersja ostateczna, dodać świeżą).

2. Dysocjacja zamrożonej tkanki do zawiesiny pojedynczego jądra

  1. Dodaj 4 ml lodowatego buforu do lizy do 7 ml szklanego młynka do tkanek i trzymaj na lodzie. Wypreparuj około 200-400 mg świeżo mrożonej dorosłej kory człowieka, odbij około 50 razy i przenieś homogenat tkankowy do 12 ml ultrawirówki polipropylenowej.
  2. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml dodaj 6,5 ml lodowatego buforu sacharozy na dno probówki ultrawirówki, uważając, aby nie naruszyć warstwy między sacharozą a homogenatem tkankowym.
    UWAGA: W przypadku przetwarzania dodatkowych próbek należy ostrożnie zrównoważyć probówki wagowo, dodając dodatkowy bufor do lizy do lżejszej próbki. Precyzyjne wyważenie probówek ultrawirówek jest niezbędne, aby zapobiec uszkodzeniu wirnika i zapewnić obrót z odpowiednią prędkością.

3. Ultrawirowanie

  1. Ultraodwirować lizat przy 24 400 obr./min (101 814 × g) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant i zanieczyszczenia, nie naruszając osadu.
    UWAGA: Osad może nie być widoczny, jeśli zaczyna się od mniej niż 200 mg tkanki.
  2. Dodać 600 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (bezCa2+, Mg2+) do osadu jądrowego i inkubować na lodzie przez 10 minut przed ponownym zawieszeniem.
  3. Pipetować w górę i w dół 50 razy, aby ponownie zawiesić osad jądra na lodzie.
  4. Użyj hemocytometru, aby uwidocznić nienaruszone jądra pod mikroskopem i upewnić się, że stężenie resuspension przekracza 105 jąder / ml przed przejściem do następnego kroku (połącz 10 μl zawieszonych jąder z 10 μl błękitu trypanowego).

4. Inkubacja przeciwciał

  1. Aby oznaczyć immunologicznie próbkę dla FANS, dodaj 500 μl zawieszonej osadki próbki, 490 μl 1x PBS (Ca2+, Mg2+ free), 10 μL 10% BSA (0,1% final), 1 μL mysiego przeciwciała anty-NeuN sprzężonego z AF555 (NeuN-AF555, końcowe stężenie 1:1000) i 1 μL mysiego przeciwciała anty-PAX6 sprzężonego z allofikocyjaniną (PAX6-APC, 1:1000 stężenie końcowe).
    UWAGA: Można dodać alternatywne przeciwciała sprzężone z innymi fluoroforami (patrz dyskusja). W tym przypadku zastosowano mysi anty-OLIG2 skoniugowany z AF488 (stężenie 1:1000) z korzystnymi wynikami.
  2. Wykonaj kontrole 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolowe (DAPI) i jednokolorowe, aby ustawić parametry bramkowania, używając w razie potrzeby niewielkiej ilości próbki.
    1. Aby przeprowadzić kontrolę pojedynczego koloru AF555, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1x PBS (bez Ca2+, Mg2+), 10 μl 10% BSA (0,1% końcowy) i 1 μl przeciwciała NeuN-AF555 (stężenie 1:1000).
    2. Aby przeprowadzić jednokolorową kontrolę APC, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1X PBS (bez Ca2+, Mg2+), 10 μl 10% BSA (0,1% końcowy) i 1 μl przeciwciała PAX6-APC (stężenie 1:1000).
    3. Aby przeprowadzić kontrolę tylko DAPI, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1X PBS (bez Ca2+, Mg2+) i 10 μl 10% BSA (0,1% końcowy) (DAPI zostanie dodany później, patrz 4.4).
      UWAGA: Jeśli stosuje się więcej niż dwa przeciwciała, oprócz kontroli jednokolorowych zaleca się wykonanie kontroli fluorescencji minus jeden (FMO).
  3. Inkubować próbki i kontrole z rotacją w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  4. Dodaj DAPI w stosunku 1:1000 do wszystkich próbek i kontroli, a następnie kontynuuj sortowanie.

5. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS)

UWAGA: Zaleca się korzystanie z instytucjonalnego urządzenia do cytometrii przepływowej z pomocą przeszkolonego personelu, chyba że jest już biegły w technikach cytometrii przepływowej/sortowania.

  1. Brama, jak pokazano poniżej.
    1. Po pierwsze, dla każdej próbki, bramka przez rozproszenie do przodu (FSC-A) vs. rozproszenie boczne (SSC-A), aby uwzględnić cząstki w odpowiednim zakresie rozmiarów dla jąder, wykluczając w ten sposób czerwone krwinki i szczątki (Rysunek 1A).
      UWAGA: Bardzo czysty preparat jąder może odróżnić mniejsze skupisko odłamków od klastra jąder.
    2. Następnie, dla każdej próbki, bramka według FSC-A vs. FSC-W (lub FSC-A vs. FSC-H) i SSC-A vs. SSC-W (lub SSC-A vs. SSC-H), aby uwzględnić tylko jądra singletowe (Rysunek 1B).
    3. Następnie, i dla każdej próbki, bramka według DAPI, aby uwzględnić nienaruszone pojedyncze jądra (DAPI - wysoka bramkowana populacja), z wyłączeniem szczątków (DAPI-niska, po lewej stronie bramkowanej populacji) i dubletów (po prawej stronie bramkowanej populacji) (Rysunek 1C).
    4. Ustaw dalsze bramkowanie w oparciu o kontrolki fluorescencji, określone wizualnie jako odrębne klastry na wykresach FACS.
      1. Uruchom kontrolę tylko DAPI, aby określić barwienie tła populacji przy braku przeciwciał (Rysunek 1D i Rysunek 2A).
      2. Uruchom kontrolę tylko NeuN-AF555, aby określić granicę barwienia NeuN+ w kanale dla AF555 (Rysunek 2B).
      3. Uruchom kontrolę tylko PAX6-APC, aby określić punkt odcięcia dla barwienia PAX6+ w kanale APC (Rysunek 2C).
      4. Uruchom dodatkowe jednokolorowe kontrolki, jeśli używasz więcej przeciwciał ( Rysunek 2D,E).
        UWAGA: W przypadku stosowania więcej niż dwóch przeciwciał zaleca się kontrolę FMO w celu wizualizacji wszelkich zmian w populacjach.
    5. Po uruchomieniu wszystkich kontrolek narysuj bramki dla kolekcji NeuN+ i PAX6+ powyżej ustalonych progów.
      1. Bramka populacji NeuN+ w celu zebrania neuronów ( Rysunek 1E i Rysunek 2F).
      2. Bramka populacji PAX6+ z populacji NeuN- w celu zebrania astrocytów (Rysunek 1E,F i Rysunek 2F).
      3. Bramkowanie i zbieranie dodatkowych populacji glejowych (takich jak komórki progenitorowe oligodendrocytów, jak pokazano tutaj przez OLIG2+) z populacji NeuN-PAX6- (Rysunek 1F).
        UWAGA: W przypadku, gdy określenie odpowiednich punktów odcięcia bramkowania jest trudne za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej ze względu na niewyraźne populacje, pomocna może być modyfikacja liczby wizualizowanych zdarzeń (zwiększenie lub zmniejszenie liczby zdarzeń na wykresie FANS).
  2. Należy pobrać próbki w odpowiedni sposób w oparciu o zamierzoną dalszą analizę.

6. Zbiór populacji FANS do dalszych analiz molekularnych

  1. W przypadku sekwencjonowania masowego RNA należy pobrać 50 000-500 000 jąder w PBS (patrz również punkt 7.1).
    1. Dodać 2 ml roztworu sacharozy, 50 μl 1 M CaCl2 i 30 μl 1 M Mg(CH3COO)2 i wypełnić PBS do 10 ml.
    2. Odwrócić i inkubować na lodzie przez 15 minut, a następnie odwirować przy 900 × g przez 10-15 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odessać supernatant, ponownie zawiesić w 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA, odwirować, zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Alternatywnie, próbki należy zebrać bezpośrednio do 200 μl odczynnika do ekstrakcji RNA. Po sortowaniu dodać odczynnik do ekstrakcji RNA do 1 ml, zachowując stosunek odczynnika do posortowanej próbki 1:1. Wirować, zamrażać na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. W przypadku masowego oznaczania chromatyny dostępnej dla transpozazy za pomocą sekwencjonowania (sekwencjonowanie ATAC), należy zebrać 50 000-75 000 jąder w PBS w probówce mikrowirówkowej pokrytej 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Jądra należy zamrozić na suchym lodzie/-80 °C lub natychmiast użyć do przygotowania ATAC.
  3. W przypadku sekwencji sn RNA lub sekwencji ATAC należy zebrać jądra w 0,04% BSA w PBS (patrz również punkt 7.2).

7. Wskazówki dotyczące przygotowania biblioteki

  1. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania masowego jądrowego RNA
    1. Po zebraniu w odczynniku do ekstrakcji RNA należy przeprowadzić standardową ekstrakcję RNA fenol/chloroform, dodając fenol/chloroform i wytrącając RNA z górnej warstwy wodnej etanolem, a następnie wytrawiając DNazę na probówce (15 min).
    2. Przeprowadzić oczyszczanie RNA i skoncentrować w końcowej objętości 15 μl wody.
      UWAGA: Stosując tę metodę, reprezentatywne odzysk z 300 mg próbki dorosłej kory wynosi ~300 000 jąder NeuN+ (15-20 ng/μL całkowitego RNA po oczyszczeniu i zagęszczeniu) i ~250 000 jąder PAX6+ (10-12 ng/μL całkowitego RNA po oczyszczeniu i zagęszczeniu). Ta reprezentatywna wydajność może się znacznie różnić w zależności od jakości próbki, rygorystyczności bramkowania i odzysku RNA.
    3. Wykonaj ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) przed sekwencjonowaniem, aby potwierdzić wzbogacenie astrocytów w oparciu o wysoką różnicową ekspresję kanonicznych markerów astrocytów (GFAP, SOX9), dehydrogenazę 10-formylotetrahydrofolianu (ALDH1L1)) i wyczerpanie markerów neuronalnych i innych linii komórkowych (Rysunek 1G).
      UWAGA: Zebranie populacji podwójnie ujemnej (NeuN-PAX6-) pozwala na dokładniejszą, wielopoziomową analizę kontroli jakości qPCR pod kątem względnego wzbogacenia astrocytów (Rysunek 2H).
    4. Generuj biblioteki sekwencji RNA przy użyciu zestawu zalecanego dla niskich wartości liczby integralności RNA, zgodnie z oczekiwaniami dotyczącymi próbek pośmiertnych.
  2. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania pojedynczego jądra
    1. Wykonaj sekwencjonowanie sn za pomocą instytucjonalnego rdzenia sekwencjonowania.
    2. Do przetwarzania i sekwencjonowania opartego na nanofluidyce należy stosować zalecane stężenie 1 × 106 komórek/ml w co najmniej 60 μl 1x PBS + 0,04% BSA dla sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) i 3 × 106 komórek/ml w co najmniej 20 μL 1x PBS + 0,04% BSA dla jednojądrowego testu chromatyny dostępnej dla transpozazy przy użyciu sekwencjonowania (snATAC-seq).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jądra komórkowe pobrano z utrwalonej przez szybkie zamrażanie świeżej (nieutrwalonej chemicznie) tkanki nowokory neocortex temporalnego, z czasem pobrania po śmierci wynoszącym 12 h. Po dysocjacji tkanki do postaci zawiesiny jąder, próbki inkubowano z przeciwciałami przeciwko NeuN, PAX6 i OLIG2, a następnie sortowano zgodnie z bramkowaniem przedstawionym na Rysunku 1 i Rysunku 2. Jądra komórkowe wyizolowano z populacji posortowanych NeuN+, PAX6+NeuN- oraz OLIG2+...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Projekt eksperymentalny zgodny z nakreślonym protokołem powinien zostać sfinalizowany po rozważeniu kilku czynników biologicznych i technicznych. Wyjściowe próbki tkanek są świeżo mrożone, bez utrwalania, i korzystnie mają krótki odstęp między pośmiertnymi pobraniami, aby zmaksymalizować regenerację jąder. Bazując na doświadczeniu, PMI do 24 h pozwala na odpowiednią regenerację jąder; jednak PMI wynoszący 12 godzin lub mniej jest preferowany w celu optymalizacji odzyskiwania nienaruszonych jąder. Dodatkowe czynniki poza ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom z Patologii i Neurochirurgii w Icahn School of Medicine w Mount Sinai za pomoc w pozyskiwaniu niezidentyfikowanej tkanki mózgowej oraz ISMMS's Flow Cytometry CORE za fachowe porady. Badanie zostało częściowo sfinansowane przez NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (do NMT) i R61DA048207 (do S.A.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x PBS pH 7,2Invitrogen70013073
PRZECIWCIAŁO ANTY-NEUN KLON A60MiliporyMAB377A5MImysie anty-NeuN sprzężone ze związkiem fluorescencyjnym AF555 (wzbudzenie, 553 nm; emisja, 568 nm)
PRZECIWCIAŁO ANTY-OLIG2 KLON 211MiliporeMABN50A4MImysi anty-OLIG2 sprzężony ze związkiem fluorescencyjnym AF488 (wzbudzenie, 499 nm; emisja, 520 nm)
Bydło Albumina surowicyFisherBP9704-100
Komora zliczająca jasną linięHausser Scientific3110V
Bezwodny chlorek wapniaFisherC614-3
Sitka komórkowe, 40 i mikro; MSP Scienceware136800040
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)InvitrogenD1306
DL-DithiothreitolSigma43815-1G
Illumina, NexteraFC-121– 1030
DNAse IWorthingtonLS002139
Młynek do tkanekDounce Sortownik WHEATON357542
FACSBD BiosciencesBD FACSAria III
Tetrahydrat octanu magnezuFisherM13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTÓWNovusNBP234705J
RNA Clean & KoncentratorZymo ResearchR1013
RNaseZap RNase Decontamination SolutionInvitrogenAM9780
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input MammalianClontech Laboratories635005Czas fragmentacji 2,5 minuty, zgodnie z zaleceniami dla niskich wartości RIN RNA.
Sacharoza, z certyfikatem kryształowym, ACS, 500 mgFisherS5500
SW 41 Ti Rotor z łyżką wahadłowąBeckman Coulter331362
Tris-HCl, roztwór 1M, pH 8,0, klasa biologii molekularnej, UltrapureThermo ScientificJ22638AE
TritonX-100FisherBP151-500niejonowy środek powierzchniowo czynny w buforze do lizy
OdczynnikTRIzol LSInvitrogen10296028
Odczynnik TRIzolOdczynnik Invitrogen15596026do izolacji RNA
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Gibco15250061
UltrawirówkaBeckman Coulter Optima XE-100A94516
Ultrawirówki PP 9/16 X 3-1/2Beckman Coulter331372
UltraPure Woda destylowana ( Invitrogen10977023określany jako woda destylowana
Ultrapure EDTALife Technologies15576-028
Zestaw biblioteki DNA

Bibliografia

  1. Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
  2. Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42(2008).
  3. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  4. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914(2008).
  5. Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
  6. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  7. Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
  8. Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70(2015).
  9. Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
  10. Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
  11. Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
  12. Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
  13. Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
  14. Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
  15. Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja astrocytówkora mózgu człowiekasekwencjonanie RNA pojedynczych jąderprzeciwciało PAX6przeciwciało NeuNwzbogacanie frakcji astrocytówkomórki progenitorowe oligodendrocytówstrategia immunotagowaniaanaliza transkryptomu
Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.