Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Podsumowanie

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Streszczenie

Metylotransferazy białkowe (PRMT) katalizują transfer grupy metylowej do reszt argininy białek substratowych. Rodzina PRMT składa się z dziewięciu członków, którzy mogą monometylować lub symetrycznie/asymetrycznie dimetylanować reszty argininy. Dostępnych jest kilka przeciwciał rozpoznających różne typy metylacji argininy różnych białek; dostarczając w ten sposób narzędzi do opracowywania testów biomarkerów aktywności PRMT. Testy oparte na przeciwciałach PRMT są trudne ze względu na nakładające się substraty i specyficzność przeciwciał opartych na motywach. Omówiono te zagadnienia oraz zestaw eksperymentalny do badania metylacji argininy wnoszonej przez poszczególne PRMT. Dzięki starannemu doborowi reprezentatywnych substratów, które są biomarkerami dla ośmiu z dziewięciu PRMT, zaprojektowano panel testów aktywności PRMT. W tym miejscu przedstawiono protokoły testów komórkowych ilościowo mierzących aktywność enzymatyczną poszczególnych członków rodziny PRMT w komórkach. Zaletą opisanych metod jest ich proste działanie w każdym laboratorium z możliwością hodowli komórkowej i fluorescencyjnego western blot. Specyficzność substratu i niezawodność wybranego przeciwciała zostały w pełni zwalidowane za pomocą podejść do knockdownu i nadekspresji. Oprócz szczegółowych wytycznych dotyczących oznaczania biomarkerów i przeciwciał przedstawiono również informacje na temat stosowania zbierania związków z narzędzi do wykrywania PRMT za pomocą inhibitora.

Wprowadzenie

Metylacja argininy jest ważną modyfikacją potranslacyjną, która reguluje interakcje białko-białko i białko-RNA, odgrywając tym samym ważną rolę w różnych procesach komórkowych, takich jak splicing pre-mRNA, uszkodzenie DNA, odpowiedź transkrypcyjna i transdukcja za pośrednictwem czynnika wzrostu1^,2. Arginina jest metylowana przez białkowe metylotransferazy argininy (PRMT), w wyniku czego powstaje monometylo arginina (Rme1), asymetryczna dimetyloarginina (Rme2a) lub symetryczna dimetyloarginina (Rme2s)³. W zależności od typu metylacji, PRMT dzieli się na trzy grupy: Typ I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 i 8), które katalizują dimetylację mono- i asymetryczną; typ II (PRMT5 i PRMT9), które katalizują dimetylację mono- i symetryczną; i Typ III (PRMT7), który może tylko monometylować argininę³.

Ze względu na rosnącą liczbę dostępnych na rynku przeciwciał specyficznych dla metylacji argininy, aktywność PRMT może być mierzona za pomocą western blot. Western blot oparty na fluorescencji jest techniką preferowaną w stosunku do detekcji chemiluminescencyjnej ze względu na większy zakres dynamiki i liniowość, wyższą czułość i możliwość multipleksowania⁴. Aby określić ilościowo poziomy metylacji białek, wymagana jest normalizacja sygnału metylacji do całkowitych poziomów białka. Wybierając przeciwciała dla białka całkowitego i metylowanego wyhodowanego u różnych gatunków gospodarzy (np. myszy i królika), można zastosować przeciwciała drugorzędowe znakowane różnymi fluoroforami i określić sygnał dla obu przeciwciał w tym samym paśmie próbki. Przeciwciała metylo-argininowe zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania monometylowanych, asymetrycznych lub symetrycznie dimetylowanych białek, w których metyloarginina występuje w określonym kontekście. Ponieważ większość motywów bogatych w glicynę i argininę metylanu PRMT w ich substratach⁵, wyniesiono kilka przeciwciał dla peptydów zawierających monometylowe lub asymetryczne, symetryczne powtórzenia dimetylo-argininy-glicyny, takie jak odpowiednio D5A12, ASYM24 lub ASYM25 i SYM11. Inne przeciwciała metylo-argininowe zostały wygenerowane przeciwko bibliotece peptydów zawierającej asymetryczną, symetryczną dimetylo- i monometyloargininę w powtarzalnym kontekście, ułatwiając wykrycie metylo-argininy w tych konkretnych kontekstach⁶. Rośnie również liczba przeciwciał, które rozpoznają specyficzny znacznik argininy na pojedynczym białku, co umożliwia selektywne wykrywanie metylacji, takich jak histon H4R3me2a lub BAF155-R1064me2a.

Istnieje kilka dostępnych na rynku inhibitorów PRMT, które mogą być używane jako narzędzia do testów komórkowych PRMT. Jednak, nie wszystkie z nich są dokładnie scharakteryzowane dla selektywności i efektów off-target, a niektóre powinny być stosowane z ostrożnością. Konsorcjum Structural Genomic Consortium, we współpracy z laboratoriami akademickimi i partnerami farmaceutycznymi, opracowało dobrze scharakteryzowane silne, selektywne i przepuszczalne dla komórek inhibitory PRMT (sondy chemiczne), które mogą być stosowane bez ograniczeń przez społeczność naukową. Informacje na temat tych inhibitorów można znaleźć na stronach https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics i https://www.chemicalprobes.org/. Sondy chemiczne to małocząsteczkowe inhibitory o IC in vitro ₅₀ lub K_d < 100 nM, ponad 30-krotnej selektywności w stosunku do białek z tej samej rodziny i znaczącej aktywności komórkowej przy 1 μM. Dodatkowo, każda sonda chemiczna ma bliski analog chemiczny, który jest nieaktywny wobec zamierzonego celu^{7,8,9,10,11,12}.

Celem tego protokołu jest pomiar aktywności komórkowej poszczególnych członków rodziny PRMT za pomocą metody fluorescencyjnej western blot. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe informacje na temat zwalidowanych biomarkerów testowych, przeciwciał i silnych inhibitorów aktywnych komórek, a także cenne strategie skutecznego wdrożenia testu.

Protokół

1. Hodowla i posiewanie komórek

UWAGA: Hoduj komórki za pomocą zalecanej pożywki i rutynowo testuj pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Jako przykłady wybrano komórki HEK293T, MCF7 i C2C12, ponieważ te linie komórkowe zostały z powodzeniem wykorzystane w testach PRMT.

1. Hodowla HEK293T, MCF7 i C2C12 w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną (100 U ^mL-1) i streptomycyną (100 μg mL⁻¹) w 10-centymetrowych naczyniach poddanych działaniu hodowli tkankowej (TC).
2. W przypadku testu PRMT8 hoduj indukowane przez PRMT1 komórki HEK293T knockdown w pożywce zawierającej doksycyklinę (2 μg/ml) przez 3 dni przed rozpoczęciem testu.
3. Aby pokryć komórki, wyjmij i wyrzuć nośnik z płytki.
4. Dodać 10 ml PBS (bez jonów Ca⁺² i Mg⁺²) do przepłukania komórek i wyrzucić roztwór.
5. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,25%), inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie wyrzucić roztwór. Inkubować, aż komórki staną się okrągłe i oderwać się od płytki. W razie potrzeby dotknij płytki, aby odłączyć komórki. W przypadku komórek trudnych do trypsynizacji, takich jak C2C12, inkubować płytkę przez 1-2 minuty w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Unikaj ekspozycji komórek na roztwór trypsyny przez dłuższy czas (>10 min), ponieważ zmniejszy to żywotność komórek.
6. Dodaj 1 ml podgrzanej pożywki do płytki i delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 3-5 ml pożywki.
7. Aby zmierzyć liczbę komórek, zmieszaj 10 μl komórek z 10 μl błękitu trypanowego i przenieś 10 μl do hemocytometru lub użyj dowolnej innej metody liczenia komórek.
8. Rozcieńczyć komórki do zalecanej gęstości komórek i umieścić 500 μl / basenik w 24-dołkowych płytkach TC (Tabela 1). W przypadku testów endogennych (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 i PRMT9) przejdź do kroku 3.1.

2. Transfekcja komórkowa

1. W przypadku testów egzogennych (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfekować HEK293T komórki zalecaną ilością DNA (Tabela 2). HEK293T ogniwa są łatwe do transfekcji, więc można użyć dowolnego odczynnika do transfekcji, zgodnie z instrukcją producenta.

3. Leczenie złożone

UWAGA: Nie przekraczaj 0,1% końcowego stężenia dimetylosulfotlenku (DMSO) w pożywkach hodowlanych. Utrzymuj to samo stężenie DMSO w każdym dołku. Selektywne inhibitory PRMT (sondy chemiczne) i ich blisko spokrewnione nieaktywne analogi można znaleźć w tabeli 3.

1. W przypadku testów endogennych (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 i PRMT9) usuń pożywkę z komórek i zastąp 500 μl pożywki ze związkiem lub samym DMSO (kontrola).
   UWAGA: Zwykle potrzeba 2 dni, aby zaobserwować ponad 80% spadek poziomu metylacji R.
2. W przypadku testów egzogennych (PRMT3, PRMT6, PRMT8) usunąć pożywkę 4 godziny po transfekcji, dodać 500 μl pożywki ze związkiem lub samym DMSO (kontrola) i inkubować przez 20-24 godziny.

4. Przygotowanie lizatu komórkowego

1. Usuń wszystkie pożywki ze studzienek, przemyj 100 μl PBS w celu usunięcia pozostałości pożywki i dodaj 60 μl buforu do lizy (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 10 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 12,5 U mL−1 benzonazy, kompletny koktajl inhibitorów proteazy wolny od EDTA) do każdej studzienki.
   1. Inkubować przez mniej niż 1 minutę w temperaturze pokojowej, kołysząc płytką w celu rozprowadzenia buforu do lizy na komórkach. Następnie dodać 3 μl 20% w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS) do końcowego stężenia 1% i wymieszać, delikatnie wstrząsając. Przenieś lizat do probówek do mikrowirówek i trzymaj go na lodzie.
      UWAGA: Przed użyciem dodaj świeżo benzonazę i koktajl inhibitorów białka. Dodatek benzonazy szybko hydrolizuje kwasy nukleinowe, co zmniejsza lepkość lizatu komórkowego.
2. Oznaczyć stężenie białka w próbkach za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA lub użyć innej metody, która toleruje 1% SDS w roztworze.
   1. Dodać 2 μl lizatu i wzorców białkowych (0, 1, 2, 4 i 8 μg/ml BSA w buforze do lizy) do studzienek 96-dołkowej przezroczystej płytki.
   2. Wymieszać odczynnik A z odczynnikiem B w stosunku 50:1 i dodać 200 μl do dołka. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i odczytać stopień absorpcji.
3. Dostosuj stężenie białka za pomocą buforu do lizy, aby było równe we wszystkich próbkach.
4. Dodać 20 μL 4x buforu ładującego do 60 μL lizatu komórkowego i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 min. Po denaturacji cieplnej lizaty mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

5. Analiza Western blot

1. Załaduj 5-20 μg całkowitego lizatu komórkowego do analizy białek histonowych i 20-100 μg dla innych białek do 4-12% żelu białkowego Bis-Tris.
2. Uruchom żel w buforze MOPS SDS (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) przez około 2 godziny przy 100 V lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dna żelu.
3. W przypadku wykonywania transferu na mokro zmontuj kanapkę transferową w lodowatym buforze transferowym Tris-Glycine (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% v/v metanolu i 0,05% w/v SDS).
   1. Umieść gąbki, bibułę filtracyjną, membranę PVDF i żel zgodnie z instrukcjami producenta. Aktywuj membranę PVDF poprzez nasączenie w metanolu i zrównoważenie żelu w buforze transferowym przez 30 s przed montażem.
      UWAGA: Używaj zalecanej membrany Western Blotting PVDF, ponieważ ma ona niską autofluorescencję i nadaje się do białek o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak histony (Tabela materiałów).
4. Przenieś białka z żelu do membrany PVDF w buforze transferowym Tris-Glycine pod napięciem 70 V przez 1,5 godziny na lodzie.
5. Zablokuj membranę na 30 minut w buforze blokującym (5% m/v mleka w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, PBS). Przepłukać buforem do przemywania (PBST: 0,1% v/v Tween-20 w PBS) i inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami w roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (5% BSA w PBST) przez noc w temperaturze 4 °C (Tabela 3).
   UWAGA: W celu dłuższego przechowywania przefiltruj roztwór BSA, dodaj 0,02% w/v azydku sodu i utrzymuj w temperaturze 4 °C.
6. Umyć membranę 3 x 5 min za pomocą PBST. Następnie inkubować z kozimi przeciwciałami przeciwko królikom (IR800) i osłom (IR680) w zalecanym buforze blokującym (tabela materiałów, tabela 3) przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przemywać 3 x 5 minut PBST.
7. Odczyt sygnału na fluorescencyjnym obrazie western blot przy długości fali 800 i 700 nm. Najlepiej używać przyrządu, który umożliwia wyraźne obrazowanie silnych i słabych pasm na jednym obrazie z wysoką czułością i zakresem dynamiki, wysokim stosunkiem sygnału do szumu, ostrzeżeniem o osiągnięciu nasycenia obrazu, a także multipleksowaniem dwóch barw fluorescencyjnych w tym samym paśmie próbki.
8. Określ intensywności pasma do analizy western blot za pomocą odpowiedniego oprogramowania do fluorescencyjnego obrazowania western.

Wyniki

Przykłady wyników western blot dla testów komórkowych poszczególnych PRMT są przedstawione poniżej. Szczegóły testów podsumowano również w tabeli 4.

Test PRMT1
PRMT1 jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do asymetrycznej dimetylacji histonu 4 argininy 3 (H4R3me2a) w komórkach¹³. Po utracie aktywności PRMT1 globalne poziomy Rme1 i Rme2s znacznie wzrastają¹³. Jak pokazano w Rysunek 1A i 1B, kilka przeciwciał może być używanych do monitorowania globalnych zmian w Rme1, Rme2a, Rme2s, a także H4R3me2a. Znaczny spadek globalnych poziomów Rme2a i H4R3me2a oraz wzrost Rme1 i Rme2s można zaobserwować po 3 dniach od knockdownu PRMT1 (Rysunek 1A, B). Linie komórkowe różnią się podstawowym sygnałem H4R3me2a, dlatego w celu ułatwienia monitorowania utraty aktywności PRMT1 można zastosować linie komórkowe, takie jak MCF7 o wysokich podstawowych poziomach metylacji (Rysunek 1C). Optymalny czas na zaobserwowanie efektu hamowania PRMT1, np. po leczeniu inhibitorem PRMT typu I MS023⁸, wynosi 2 dni (Rysunek 1D,1E). Dłuższe leczenie powoduje zmniejszenie żywotności i wzrostu komórek.

Test PRMT3
W teście komórkowym PRMT3 nie można było wykryć selektywnych białek biomarkerowych, których zmiany metylacji uległy zmianom w western blot po knockdown lub nadekspresji PRMT3. Wykazano, że PRMT3 asymetrycznie dimetyluje H4R3 in vitro¹⁴, jednak znak jest głównie zdeponowany przez PRMT1, dlatego zaprojektowano egzogenny test z nadekspresją PRMT3. Zgodnie z ustaleniami in vitro, nadekspresja PRMT3 typu dzikiego, ale nie jego mutanta katalitycznego (E338Q) doprowadziła do wzrostu poziomów H4R3me2a (Figura 2A). Użyto komórek HEK293T, ponieważ mają one niską podstawową metylację tego znaku (Rysunek 1C). Test został następnie zweryfikowany za pomocą selektywnego inhibitora PRMT3 SGC707⁷, który hamował asymetryczną metylację H4R3 zależną od PRMT3 (Figura 2B).

Test PRMT4
PRMT4 asymetrycznie dimetylanuje BAF155 przy argininie 1064¹⁵. Ponieważ przeciwciało wykrywające BAF165-R1064me2a jest dostępne na rynku, aktywność PRMT4 w komórkach można monitorować za pomocą western blot, wykrywając zmiany w poziomach znaczników R1064me2a. Utrata białka PRMT4 lub hamowanie aktywności katalitycznej za pomocą selektywnego inhibitora PRMT4, TP-064¹⁰, powoduje spadek poziomów BAF165-R1064me2a (Rysunek 3). 2-dniowa kuracja jest zwykle wystarczająca, aby usunąć większość sygnału metylacji.

Test PRMT5
PRMT5 jest odpowiedzialny za większość symetrycznej dimetylacji argininy białek. Wcześniej informowano, że różne białka kompleksu SMN, w tym SmBB', są substratami PRMT5¹⁶. Aktywność PRMT5 można monitorować, przyglądając się zmianom w globalnych poziomach symetrycznej dimetylacji argininy lub symetrycznej dimetylacji białek SmBB. Knockdown PRMT5, ale nie PRMT1, 3, 4, 6 i 7 powoduje spadek globalnych poziomów Rme2s (Rysunek 4A). W większości linii komórkowych traktowanie komórek selektywnymi inhibitorami PRMT5 LLY-283¹¹ i GSK591 przez 2-3 dni stłumiło większość sygnału SmBB'Rme2s (Figura 4B). Większość komórek jest wrażliwa na hamowanie PRMT5, co powoduje zmniejszenie proliferacji komórek i śmierć komórki przy przedłużonej ekspozycji na inhibitor

.

Test PRMT6
Doniesiono, że PRMT6 jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do asymetrycznej dimetylacji histonu H3 argininy 2 (H3R2me2a) w komórkach¹⁷. W HEK293T komórkach knockdown PRMT6 przez 3 dni nie był wystarczający do zaobserwowania znaczącego spadku poziomu H3R2me2a. Jednak nadekspresja dzikiego typu PRMT6, ale nie jego mutanta katalitycznego (V86K/D88A) zwiększa poziomy H3R2me2a, a także H3R8me2a i H4R3me2a (Figura 5A). Istnieje kilka inhibitorów, które hamują aktywność PRMT6 z różną siłą i selektywnością: selektywny, allosteryczny inhibitor PRMT6 SGC6870¹⁸, inhibitor PRMT typu I MS023⁸ i inhibitor PRMT4/6 MS049⁹. Wszystkie te czynniki hamowały H3R2 zależny od PRMT6 (Figura 5B), a także asymetryczną dimetylację H4R3 i H3R8 (dane nie pokazane).

Test PRMT7
PRMT7 monometylaty argininy 469 zarówno w konstytutywnych, jak i indukowalnych formach HSP70 (odpowiednio HSPA8 i HSPA1/6)¹². Chociaż nie ma dostępnych na rynku przeciwciał, które wykrywają poziomy HSP70-R469me1, znak można wykryć za pomocą przeciwciał pan-monometylowych. Utrata białka PRMT7 lub hamowanie aktywności katalitycznej za pomocą selektywnego inhibitora PRMT7, SGC302712, powoduje obniżenie poziomu HSP70-R469me1 (Figura 6A, B). SGC3027 jest przepuszczalnym dla komórek prolekiem, który w komórkach jest przekształcany przez reduktazy w selektywny inhibitor PRMT7 SGC8158, dlatego siła działania komórek może się różnić w zależności od linii komórkowych. Kilka linii komórek rakowych wykazuje ekspresję indukowalnych izoform HSP70 na wysokich poziomach, a metylacja może być trudna do wykrycia ze względu na nakładające się na siebie niespecyficzne pasmo pochodzenia jądrowego (Rysunek 6C). Dlatego do testu komórkowego PRMT7 zalecane są linie komórkowe, które wyrażają głównie HSPA8, takie jak C2C12, lub ponieważ HSP70 lokalizuje się głównie w cytoplazmie, należy określić poziomy HSP70-R469me1 we frakcji cytoplazmatycznej preferowanych linii komórkowych.

Test PRMT8
PRMT8 jest jedynym PRMT z tkankowo ograniczonym wzorcem ekspresji - w dużej mierze wyrażonym w brain¹⁹. Ma 80% podobieństwa sekwencji i ma podobne preferencje dotyczące podłoża jak PRMT1¹⁹. Różni się od PRMT1 głównie na N-końcu, gdzie mirystoylacja powoduje powiązanie PRMT8 z błoną plazmatyczną²⁰. Doniesiono, że PRMT8 wraz z PRMT1 metyluje białko wiążące RNA EWS²¹. Ponieważ aktywność PRMT8 jest niska w nieneuronalnych liniach komórkowych, a EWS może być również metylowany przez PRMT1, opracowano test, w którym PMRT8 ulega nadekspresji wraz z EWS w komórkach knockdown PRMT1. Ponieważ PRMT1 jest niezbędnym genem, a jego długotrwała utrata powoduje śmierć komórki, zastosowano indukowalny system, w którym PRMT1 jest powalany na 3 dni przed użyciem w teście PRMT8 (Figura 7A). Koekspresja dzikiego mutanta PRMT8, ale nie katalitycznie nieaktywnego mutanta (E185Q), wraz z EWS spowodowała wzrost poziomu asymetrycznej dimetylacji EWS (Figura 7B). Przetestowano kilka asymetrycznych przeciwciał dimetyloargininy, a metylację wykryto tylko za pomocą przeciwciała Asym25. Test został następnie zweryfikowany za pomocą selektywnej sondy chemicznej PRMT typu I, MS023⁸, która zmniejszyła zależną od PRMT8 asymetryczną dimetylację egzogennego EWS (Rysunek 7B). Chociaż MS023 jest bardzo silny w hamowaniu PRMT8 w testach in vitro, w komórkach wysokie stężenia MS023 są wymagane do zahamowania metylacji²¹.

Test PRMT9
Wykazano, że PRMT9 symetrycznie dimetylanuje SAP145 przy argininie 508²². Niestety, żadne komercyjnie dostępne przeciwciała nie są w stanie rozpoznać tego znaku. Do testu PRMT9 użyto przeciwciał, które zostały podarowane przez dr Yanzhong Yanga (Beckman Research Institute of City of Hope). W przypadku nadekspresji, zmutowany SAP145 typu dzikiego, ale nie R508K, jest metylowany przez PRMT9 (Figura 8A). Test został zaprojektowany do monitorowania poziomów endogennych SAP145-R508me2 i został zwalidowany za pomocą Związku X, prototypu inhibitora PRMT9 (prace w toku, jeszcze nieopublikowane), który silnie hamuje PRMT9 in vitro o potencji nanomolowej. Związek X obniżał poziomy SAP145-R508me2s w sposób zależny od dawki (Rysunek 8B).

Rysunek 1. Test komórkowy PRMT1. (A) knockdown PRMT1 powoduje zmniejszenie globalnej asymetrycznej dimetylacji argininy (Rme2a) i zwiększenie poziomów symetrycznej dimetytylacji argininy (Rme2s) i monometylacji (Rme1). Skuteczność knockdown PRMT1 przedstawiono w panelu B. (B) knockdown PRMT1 zmniejsza asymetryczną dimetylację histonu H4R3 (H4R3me2a). (C) Podstawowe poziomy H4R3me2a różnią się w różnych liniach komórkowych. (D) Inhibitor PRMT typu I MS023 obniża poziom H4R3me2a w sposób zależny od dawki. Komórki MCF7 traktowano MS023 przez 2 dni. (E) Wykres przedstawia nieliniowe dopasowanie intensywności sygnału H4R3me2a znormalizowane do całkowitego histonu H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Test komórkowy PRMT3. (A) Nadekspresja katalitycznego mutanta PRMT3 typu dzikiego (WT), ale nie E338Q, zwiększa poziom H4R3me2a w komórkach HEK293T. Komórki transfekowano PRMT3 znakowanym FLAG przez 24 godziny. (B) Selektywny inhibitor PRMT3, SGC707, zmniejsza ektopową asymetryczną demetylację H4R3 zależną od PRMT3 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Test komórkowy PRMT4. (A) knockdown PRMT4 powoduje zmniejszenie asymetrycznej dimetytylacji argininy BAF155-R1064 (HEK293T komórek). (B) Selektywny inhibitor PRMT4, TP-064, obniża poziomy BAF155-R1064Rme2a. HEK293T komórki traktowano związkiem przez 2 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Test komórkowy PRMT5. (A) knockdown PRMT5 powoduje spadek globalnych symetrycznych poziomów dimetylacji argininy (komórki MCF7). (B) Selektywne inhibitory PRMT5 GSK591 i LLY-283 zmniejszają symetryczną dimetylację argininy SmBB (kolor zielony), podczas gdy całkowity poziom SmBB pozostaje niezmieniony (kolor czerwony). Komórki MCF7 traktowano związkami przez 2 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Test komórkowy PRMT6. (A) Nadekspresja katalitycznego mutantu PRMT6 typu dzikiego (WT), ale nie V86K / D88A, zwiększa poziomy H4R3me2a, H3R2me2a i H3R8me2a w komórkach HEK293T. Komórki transfekowano PRMT6 znakowanym FLAG przez 24 godziny. (B) Selektywny inhibitor PRMT6 (SGC6870), inhibitor PRMT typu I (MS023) i inhibitor PRMT4/6 (MS049) obniżają poziomy H3R2me2a zależne od PRMT6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Test komórkowy PRMT7. (A) Nokaut PRMT7 powoduje zmniejszenie monometylacji HSP70-R469 (komórki HCT116). (B) Selektywne inhibitory PRMT7, SGC3027, zmniejszają monometylację HSP70-R469 w komórkach C2C12. Komórki traktowano związkiem przez 2 dni. (C) Wykrycie metylacji HSP70-R469 indukowalnego HSP70 (HSPA1/6) za pomocą przeciwciał pan-monometyloargininowych (Rme1) może być trudne ze względu na nakładające się na siebie niespecyficzne pasmo pochodzenia jądrowego. Zaleca się pomiar poziomu metylacji HSP70 we frakcji cytoplazmatycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Test komórkowy PRMT8. (A) Metylację PRMT8 EWS można wykryć, gdy aktywność PRMT1 jest hamowana przez knockdown. HEK293T komórki transdukowano indukowalnym wektorem knockdown PRMT1. Po 3 dniach leczenia doksycykliną poziom PRMT1 uległ drastycznemu obniżeniu. (B) Gdy PRMT1 zostaje powalony, egzogenny EWS jest asymetrycznie dimetylowany przez nadekspresję dzikiego typu PRMT8, ale nie katalitycznie zmutowanego (E185Q) PRMT8. Metylacja jest zmniejszona przez wysokie stężenie inhibitora PRMT typu I (MS023). HEK293T komórki KD PRMT1były współtransfekowane z oznaczonym FLAG PRMT8 dzikim lub katalitycznym mutantem i EWS znakowanym GFP i traktowane MS023 przez 20 godzin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Test komórkowy PRMT9. (A) Typ dziki, ale nie R508K, zmutowany SAP145 jest metylowany przez PRMT9. HEK293T komórki transfekowano SAP145 znakowanym GFP przez 1 dzień. (B) Prototypowy inhibitor PRMT9 (związek X) zmniejsza zależną od PRMT9 symetryczną dimetylację R508 SAP145 w sposób zależny od dawki. HEK293T komórki traktowano tym związkiem przez 2 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Filtr PRMT	Komórek	Gęstość na ml
Zobacz materiał PRMT1	Złącze MCF7	1 x 105
Zobacz materiał PRMT3	HEK293T	2 x 105
Zobacz materiał PRMT4	HEK293T	1 x 105
Zobacz materiał PRMT5	Złącze MCF7	1 x 105
Zobacz materiał PRMT6	HEK293T	2 x 105
Zobacz materiał PRMT7	Zobacz materiał C2C12	1 x 105
Zobacz materiał PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
Zobacz materiał PRMT9	HEK293T	2 x 105
*potraktuj komórki doksycykliną (2 μg/ml) 3 dni przed posiewem do testu PRMT8

Tabela 1. Typy i gęstości komórek zalecane do testów PRMT.

Filtr PRMT	μg DNA/24-dołkowe	Addgene #	Uwagi dodatkowe
PRMT3	0.5 FLAGA-PRMT3	164695
	lub 0,5 FLAG-PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 FLAGA-PRMT6	164697
	lub 0,5 FLAG-PRMT6 (V86K/D88A)	164698
PRMT8	0,05 EWS-GFP	164701
	0,45 FLAGA PRMT8	164699
	lub 0,45 PRMT8(E185Q)-FLAG	Numer katalogowy: 164700
PRMT9	0,05 SAP145-GFP	BRAK DANYCH	prezent od dr Yanzhong Yanga, Beckman Research Institute of City of Hope
	lub 0,05 SAP145-R508K-GFP
	0.45 pusty wektor

Tabela 2. Stężenie DNA zalecane do eksperymentu transfekcji.

powiedział: powiedział:

Filtr PRMT	przeciwciało	Sonda chemiczna (aktywność komórki IC50)	Kontrola ujemna
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT typ I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = odpowiednio 9, 56, 1000, 5000 nM)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-aktyna (1:500 )
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	FLAGA (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064ME2A (1:3000)	SKI-73 (IC50 = 540 nM)*	SKI-73N*
PRMT5	anty-SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	LLY-284
	Rme2s (#13222, 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870 (IC50 = 0,9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT typ I	MS094
	H3R2me2a ( 1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = odpowiednio 9, 56, 1000, 5000 nM)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (odpowiednio PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	FLAGA ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	HSP/HSC70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	FLAGA (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	SAP145-R508me2s - miły prezent od dr Yanzhong Yanga, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013)
Przeciwciała drugorzędowe	Kozioł przeciw królikom IgG-IR800 (1:5000)
	osioł anty-mysz IgG-IR680 (1:5000)
*- przeciwciało rozpoznaje HSPA8, HSPA1 i HSPA6 (testowane z nadekspresjami białek znakowanych GFP), *prolek – IC50 może różnić się między różnymi liniami komórkowymi

Tabela 3. Zalecane przeciwciała i związki z sondy chemicznej PRMT/narzędzia do kontroli negatywnej.

pkt.

Filtr PRMT

Biomarker

Odczyt testu

Walidacja testu

Zalecana linia komórkowa

Ref.

Zobacz materiał PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

poziomy H4R3me2a znormalizowane do całkowitego H4 globalne poziomy Rme1, Rme2a lub Rme2s znormalizowane do B-aktyny.

Knockdown PRMT1 obniżył podstawowe poziomy H4R3me2a i globalne Rme2a oraz zwiększył globalne poziomy Rme1 i Rme2s w komórkach (Rys.1A, B). Sonda chemiczna PRMT typu I MS023 obniżyła poziom H4R3me2a w sposób zależny od dawki (ryc. 1D).

Komórki różnią się podstawowym poziomem H4R3me2a (ryc. 1C). Komórki MCF7 mają wysokie podstawowe poziomy H4R3me2a, co sprawia, że są preferowane do testów monitorujących spadek aktywności PRMT1.

8

Zobacz materiał PRMT3

H4R3me2a

H4R3me2a poziomy metylacji spowodowane przez egzogenny mutant PRMT3 WT lub katalityczny mutant E338Q (tło) znormalizowany do całkowitego histonu H4

Nadekspresja dzikiego typu PRMT3, ale nie jego katalityczna mutacja (E338Q), zwiększyła H4R3me2a (ryc. 2A). Selektywny inhibitor PRMT3 SGC707 zmniejszył zależny od PRMT3 wzrost poziomów H4R3me2a (ryc. 2B)

HEK293T komórki mają niski podstawowy poziom H4R3me2a (ryc. 1C), co jest preferowane do monitorowania egzogennej aktywności PRMT3

7

Zobacz materiał PRMT4

BAF155-R1064me2a

Poziomy BAF155-R1064me2a znormalizowane do całkowitej BAF155

Knockdown PRMT4 zmniejszył asymetryczną dimetylację BAF155 (ryc. 3A). 2-dniowe leczenie selektywną sondą chemiczną PRMT4 (TP-064) zmniejszyło asymetryczną dimetylację BAF155 (ryc. 3B).

Dowolna linia komórkowa

10

Zobacz materiał PRMT5

SmBB'-Rme2s

poziomy SmBB'-Rme2s wykryte z przeciwciałami pan Rme2s (CST) znormalizowanymi do całkowitego SmBB'

Knockdown PRMT5 spowodował zmniejszenie symetrycznego poziomu dimetylacji SmBB (ryc. 4A). 2-dniowe leczenie selektywnymi sondami chemicznymi PRMT5, GSK591 i LLY285, obniżyło poziomy SmBB'-Rme2s (ryc. 4B).

Dowolna linia komórkowa

11

Zobacz materiał PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

Poziomy metylacji H4R3me2a, H3R2me2a lub H3R8me2a są zwiększane przez egzogenny PRMT6 WT oznaczony FLAG, ale nie katalityczny mutant V86K,D88A (tło) znormalizowany odpowiednio do całkowitego histonu H4 lub H3

Nadekspresja dzikiego typu PRMT6, ale nie jego katalityczna mutacja (V86K,D88A) zwiększyła poziomy H3R2me2a, H3R8me2a i H4R3me2a (ryc. 5A). Allosteryczny inhibitor PRMT6 (SGC6870), inhibitor PRMT typu I MS023, inhibitor PRMT4/6 MS049 zmniejszał zależny od PRMT6 wzrost poziomów H3R2me2a (ryc. 5B).

HEK293T komórki mają niskie podstawowe poziomy H4R3me2a, H3R2me2a i H3R8me2a, co jest preferowane do monitorowania egzogennej aktywności PRMT6

8,9

Zobacz materiał PRMT7

HSP70-R469me1

Poziomy metylacji HSP70-Rme1 znormalizowane do całkowitego HSP70

Nokaut lub knockdown PRMT7 zmniejszył monometylację HSP70 (ryc. 6A). 2-dniowe leczenie selektywną sondą chemiczną PRMT7 SGC3027 zmniejszoną monometylację HSP70 zależną od PRMT7 w sposób zależny od dawki (ryc. 6B).

C2C12, HT180 Kilka linii komórek nowotworowych wyraża indukowalną formę HSP70, której sygnał metylacji pokrywa się z niespecyficznym białkiem pochodzenia jądrowego (ryc. 6C). W takim przypadku zalecamy analizę poziomów metylacji HSP70 we frakcji cytoplazmatycznej.

12

Zobacz materiał PRMT8

EWS-Rme2a

Egzogenne poziomy metylacji EWS oznaczone GFP spowodowane przez egzogenny mutant katalityczny PRMT8 WT lub E185Q oznaczone FLAG (tło), znormalizowane do całkowitego sygnału GFP w komórkach PRMT1 KO.

Nadekspresja dzikiego typu PRMT8, ale nie katalityczna zmutowana metylowana ektopowa EWS E185Q tylko w komórkach PRMT1 KD (ryc. 7A). Sonda chemiczna PRMT typu I MS023 hamowała asymetryczną dimetylację egzogennego EWS przez PRMT8 (ryc. 8B).

HEK293T PRMT1 KD (indukowalny). Nokaut PRMT1 powoduje śmierć komórki, dlatego zalecamy stosowanie systemu indukowalnego.

8

Zobacz materiał PRMT9

SAP145-R508me2s

Symetryczna dimetylacja SAP145 zależna od PRMT9 przy R508 znormalizowana do SAP145

Utrata PRMT9, ale nie PRMT5, prowadzi do zmniejszenia symetrycznej dimetylacji SAP145. SAP145 WT oznaczony GFP, ale nie SAP145mut (R508K) został metylowany przez PRMT9 (ryc. 8A). 2-dniowa terapia Copound X, prototypowym inhibitorem PRMT9, obniżyła poziomy SAP145-R508me2s w sposób zależny od dawki (ryc. 8B).

Dowolna linia komórkowa

21

Tabela 4. Podsumowanie testów PRMT.

Dyskusja

W tym miejscu opisano szczegółowe protokoły testów komórkowych dla członków rodziny PRMT, które wykorzystują fluorescencyjne metody western blott. Wybrano unikalne substraty, dla których zmiany metylacji argininy mogą być łatwo wykryte po indywidualnej utracie PRMT lub hamowaniu katalitycznym i nie mogą być kompensowane przez innych członków rodziny. Niektóre białka są metylowane przez wiele PRMT^21,23, co sugeruje nakładanie się specyficzności substratowej, gdzie niektóre PRMT wnoszą tylko niewielką ilość znacznika komórkowego w danym substracie białkowym 24,25,26,27, na przykład zarówno PRMT8, jak i PRMT1 przyczyniają się do metylacji EWS. W związku z tym każdy test wymagał dokładnej walidacji substratów i przeciwciał z eksperymentami z knockdownem i/lub nadekspresją oraz dalszej walidacji za pomocą dobrze scharakteryzowanych selektywnych inhibitorów. Zidentyfikowano substraty specyficzne dla PRMT, dla których zmiany znacznika metylacji można było wykryć w ciągu 2-3 dni po utracie/zahamowaniu PRMT, aby uniknąć narastających skutków zmniejszonej żywotności i proliferacji komórek, które mogą pośrednio wpływać na poziomy znacznika metyloargininy. Chociaż udało się znaleźć unikalne podłoża dla PRMT1, 4, 5, 7 i 9; W przypadku PRMT3, 6 i 8 konieczne było zastosowanie podejścia opartego na wzmocnieniu funkcji. Kilka przeciwciał specyficznych dla argininy methyl zostało przetestowanych pod kątem różnych celów komórkowych, ale żadne z nich nie było w stanie wykryć znaczących zmian w ciągu 3 dni od knockdownu PRMT3 i PRMT6; W związku z tym opracowano testy biomarkerów przy użyciu enzymów ulegających ekspresji ektopowej wraz z katalitycznie nieaktywnymi mutantami, które posłużyły jako kontrola podstawowej metylacji substratów. PRMT8 jest bliskim homologiem PRMT1 i ma podobne preferencje dotyczące substratów. Ponieważ nie można było zidentyfikować selektywnego biomarkera PRMT8, opracowano test w komórkach knockdown PRMT1, w którym PRMT8 ulegał jednoczesnej ekspresji wraz z EWS. PRMT1 jest również głównym enzymem odpowiedzialnym za asymetryczną metylację H4R3, dlatego aby użyć H4R3me2a jako biomarkera do testów komórkowych PRMT3 i PRMT6, wybrano komórki o niskim podstawowym poziomie H4R3me2a, a jako kontrolę tła zastosowano katalitycznie nieaktywne mutanty. Chociaż preferowane są testy endogenne, testy egzogenne okazują się nieocenione w testowaniu siły komórkowej kilku selektywnych inhibitorów PRMT ^7,8,9. Wraz z rosnącą wiedzą na temat biologii PRMT spodziewamy się udoskonalić testy poprzez znalezienie bardziej specyficznych białek biomarkerowych dla PRMT3, PRMT6 i PRMT8.

Stosowanie zwalidowanych przeciwciał i odpowiednich kontroli ma kluczowe znaczenie dla wydajności testu PRMT. Wszystkie zalecane tutaj przeciwciała zostały dokładnie zwalidowane przez eksperymenty z knockdownem i nadekspresją, jednak różnice między partiami, zwłaszcza w przypadku przeciwciał poliklonalnych, mogą nadal wpływać na ich działanie. Dlatego tak ważne jest stosowanie metod genetycznych i sond chemicznych wraz z ich ściśle powiązanymi kontrolami ujemnymi w celu potwierdzenia wiarygodności testu. Dodatkowo, w przypadku testów PRMT, które wymagają nadekspresji białka, kluczowe znaczenie ma użycie katalitycznie nieaktywnych mutantów wraz z białkiem typu dzikiego w celu określenia podstawowych poziomów metylacji.

Ten zbiór testów ilościowych do profilowania aktywności PRMT w komórkach może być szeroko przydatny dla społeczności naukowej, ponieważ można go szybko i łatwo wdrożyć przy minimalnym sprzęcie i ograniczonej wiedzy technicznej, obejmując jedynie podstawowe techniki hodowli komórek i fluorescencyjnego western blotting. Zalecane przeciwciała i sondy chemiczne dla PRMT mogą być również wykorzystywane do testów profilowania białek opartych na aktywności (ABPP) w celu ustalenia przydatności danej sondy ABPP, monitorowania zaangażowania celu i oceny efektów poza celem przy użyciu konkurencyjnego formatu ABPP. Omówione tutaj podejścia do opracowywania testów można również ekstrapolować na inne rodziny enzymów, takie jak lizynotransferazy białkowe i acetylotransferazy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynia TC 10 cm	Greiner bio-one	664160
24-dołkowe płytki TC	Greiner bio-one	662160
4– 12% Bis-Tris Żele białkowe	ThermoFisher Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Membrana PVDF Amersham Hybond P	Millipore-Sigma	10600021
anty-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anty-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anty-B-aktyna	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
anty-BAF155	Santa Cruz Biotechnologies	sc-32763
anty-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anty-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anty-GFP	Clontech	632381
anty-H3	Abcam	ab10799
anty-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
anty-H3R8me2a	Rockland	600-401-I67
anty-H4	Abcam	ab174628
anty-H4R3me2a	Aktywny motyw	39705
anty-HSP/HSC70	Enzo	ADI-SPA-820
anty-PRMT1	Millipore-Sigma	07-404
anty-PRMT3	Abcam	ab191562
anty-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
anty-PRMT5	Abcam	ab109451
anty-PRMT6	Abcam	ab47244
anty-PRMT7	Abcam	ab179822
anty-Rme1	CST	8015
anty-Rme2a	CST	13522
anty-Rme2s	CST	13222
anty-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anty-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anty-SAP145-R508me2s uprzejmy			prezent od dr Yanzhong Yanga, Beckman Research Institute of City of Hope
anty-SmBB'	Santa Cruz Biotechnologies	sc-130670
benzonaza			WYPRODUKOWANO WE WŁASNYM
ZAKRESIE BSA	Millipore-Sigma	A7906
C2C12			prezent od dr Stephane'a Richarda, McGill University
cOmkompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy	Millipore-Sigma	11873580001
	DMEM Bisent	319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
osł anty-mysz IgG-IR680	Licor	926-68072
doksycyklina	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Żubel	80150
glicyna	Bioshop	GLN002.5
kozioł-anty-królik IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			prezent od dr Sama Benchimola, York
University Image Studio Software ver 5.2	Licor
Bufor ładowania: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22&handel;
bufora blokującego NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS ThermoFisher	Scientiffic	NP0001
Odyssey Blocking Buffer (rozcieńczony 4 x z PBST)	Licor	927-40000	Intercept (PBS) # 927-70001
System obrazowania Odyssey CLX	Numer modelu Licor	9140
PBS (hodowla tkankowa)	Żubr	311-010-CL
PBS (western blot)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™ Zestaw do oznaczania białek BCA	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
odtłuszczone mleko w proszku	Bioshop	SKI400.500
TC20 automatyczny licznik komórek	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0,25%)	Żubr	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
Tritton X-100	Bioshop	TRX506
trypan niebieski	GIBCO	15250-061
Tween-20	Bioshop	TWN510.500