Badanie epitranskryptomów m6A i m5C po infekcji wirusowej: przykład z HIV

Summary

Rola modyfikacji RNA w infekcjach wirusowych dopiero zaczyna być badana i może uwypuklić nowe mechanizmy interakcji wirus-gospodarz. W tej pracy przedstawiamy proces badania modyfikacji RNA m⁶A i m⁵C w kontekście infekcji wirusowych.

Abstract

Rola modyfikacji RNA w procesach biologicznych była przedmiotem coraz większej liczby badań w ciągu ostatnich kilku lat i jest obecnie znana jako epitranskryptomika. Na cząsteczkach mRNA opisano m.in. modyfikacje RNA N6-metyloadenozyny (^m6A) i 5-metylocytozyny (^m5C), które mogą odgrywać rolę w modulowaniu procesów komórkowych. Epitranskryptomika jest zatem nową warstwą regulacji, którą należy wziąć pod uwagę oprócz analiz transkryptomicznych, ponieważ może być również zmieniana lub modulowana przez ekspozycję na dowolny czynnik chemiczny lub biologiczny, w tym infekcje wirusowe.

Tutaj prezentujemy przepływ pracy, który pozwala na analizę wspólnego komórkowego i wirusowego krajobrazu epitranskryptomicznego znaczników m⁶A i m⁵C jednocześnie, w komórkach zakażonych lub nie ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV). Po izolacji i fragmentacji mRNA z komórek zakażonych wirusem HIV i niezakażonych, zastosowaliśmy dwie różne procedury: MeRIP-Seq, technikę opartą na immunoprecypitacji RNA, w celu wzbogacenia o fragmenty RNA zawierające znacznik m⁶A oraz BS-Seq, technikę opartą na konwersji wodorosiarczynu, w celu identyfikacji znaku m⁵C w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Po wychwyceniu specyficznym dla metylacji biblioteki RNA są przygotowywane do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Opracowaliśmy również dedykowany potok bioinformatyczny w celu identyfikacji transkryptów metylowanych różnicowo (DM) niezależnie od ich podstawowego profilu ekspresji.

Ogólnie rzecz biorąc, metodologia pozwala na jednoczesną eksplorację wielu znaczników epitranskryptomicznych i dostarcza atlas transkryptów DM w przypadku infekcji wirusowej lub innych zaburzeń komórkowych. Podejście to stwarza nowe możliwości identyfikacji nowych graczy i nowych mechanizmów odpowiedzi komórek, takich jak czynniki komórkowe promujące lub ograniczające replikację wirusa.

Introduction

Od dawna wiadomo, że cząsteczki RNA mogą być modyfikowane, a do tej pory opisano ponad 150 modyfikacji potranskrypcyjnych¹. Polegają one na dodawaniu grup chemicznych, głównie grup metylowych, do praktycznie dowolnej pozycji pierścieni pirymidynowych i purynowych cząsteczek RNA². Wykazano już, że takie modyfikacje potranskrypcyjne są wysoce wzbogacone w transferowy RNA (tRNA) i rybosomalny RNA (rRNA), a ostatnio opisano je również w cząsteczkach mRNA.

Rozwój nowych technologii, takich jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), oraz produkcja specyficznych przeciwciał rozpoznających określone modyfikacje chemiczne pozwoliły, po raz pierwszy, na zbadanie lokalizacji i częstotliwości specyficznych modyfikacji chemicznych na poziomie całego transkryptomu. Postępy te doprowadziły do lepszego zrozumienia modyfikacji RNA i mapowania kilku modyfikacji cząsteczek mRNA^3,4.

Podczas gdy epigenetyka bada rolę modyfikacji DNA i histonów w regulacji transkryptomu, epitranskryptomika w podobny sposób skupia się na modyfikacjach RNA i ich roli. Badanie modyfikacji epitranskryptomicznych stwarza nowe możliwości zwrócenia uwagi na nowe mechanizmy regulacji, które mogą dostrajać różne procesy komórkowe (tj. splicing RNA, eksport, stabilność i translację)⁵. Nie było więc wielkim zaskoczeniem, że ostatnie badania ujawniły wiele modyfikacji epitranskryptomicznych po infekcji wirusowej zarówno w komórkowych, jak i wirusowych RNAs⁶. Wirusy przebadane do tej pory obejmują zarówno wirusy DNA, jak i RNA; wśród nich HIV można uznać za pionierski przykład. Podsumowując, odkrycie metylacji RNA w kontekście infekcji wirusowych może pozwolić na zbadanie jeszcze nieopisanych mechanizmów ekspresji lub replikacji wirusa, dostarczając w ten sposób nowych narzędzi i celów do ich kontrolowania⁷.

W dziedzinie epitranskryptomiki HIV, modyfikacje transkryptów wirusowych były szeroko badane i wykazały, że obecność tej modyfikacji była korzystna dla replikacji wirusa8^,9^,10,11,12,13. Do tej pory można stosować różne techniki wykrywania znaczników epitranskryptomicznych na poziomie całego transkryptomu. Najczęściej stosowane techniki identyfikacji m⁶A opierają się na technikach wytrącania immunologicznego, takich jak MeRIP-Seq i miCLIP. Podczas gdy MeRIP-Seq opiera się na fragmentacji RNA w celu wychwycenia fragmentów zawierających metylowane reszty, miCLIP opiera się na generowaniu mutacji sygnatury specyficznych dla przeciwciała α-m⁶A po sieciowaniu UV RNA-przeciwciało, umożliwiając w ten sposób bardziej precyzyjne mapowanie.

Wykrycie modyfikacji m⁵C może być osiągnięte albo za pomocą technologii opartych na przeciwciałach, podobnych do detekcji m⁶A (m⁵C RIP), albo przez konwersję bisulfitu, albo przez AZA-IP lub przez miCLIP. Zarówno Aza-IP, jak i m⁵C miCLIP wykorzystują specyficzną metylotransferazę jako przynętę do celowania w RNA podczas przechodzenia metylacji RNA. W Aza-IP komórki docelowe są wystawione na działanie 5-azacytydyny, co powoduje losowe wprowadzenie miejsc analogu 5-azacytydyny cytydyny do powstającego RNA. W miCLIP metylotransferaza NSun2 jest genetycznie modyfikowana tak, aby zawierała mutację C271A^14,15.

W tej pracy skupiamy się na podwójnej charakterystyce modyfikacji m⁶A i m⁵C w zakażonych komórkach, używając HIV jako modelu. Po optymalizacji metodologicznej opracowaliśmy przepływ pracy, który łączy immunoprecypitację metylowanego RNA (MeRIP) i konwersję wodorosiarczynu RNA (BS), umożliwiając jednoczesną eksplorację znaczników epitranskryptomicznych m⁶A i m⁵C na poziomie całego transkryptomu, zarówno w kontekście komórkowym, jak i wirusowym. Ten przepływ pracy można zaimplementować na komórkowych ekstraktach RNA, a także na RNA wyizolowanym z cząstek wirusa.

Podejście do immunoprecypitacji metylowanego RNA (MeRIP)¹⁶ pozwalające na badanie m⁶A na poziomie transkryptomu jest dobrze ugruntowane, a tablica przeciwciał specyficznych dla m6A jest dostępna na rynku¹⁷. Metoda ta polega na selektywnym wychwytywaniu fragmentów RNA zawierających m⁶A przy użyciu przeciwciała swoistego dla m⁶A. Dwie główne wady tej techniki to (i) ograniczona rozdzielczość, która w dużym stopniu zależy od wielkości fragmentów RNA, a tym samym zapewnia przybliżoną lokalizację i region zawierający metylowaną resztę, oraz (ii) dużą ilość materiału potrzebnego do przeprowadzenia analizy. W poniższym zoptymalizowanym protokole ustandaryzowaliśmy rozmiar fragmentu do około 150 nt i zmniejszyliśmy ilość materiału wyjściowego z 10 μg RNA wyselekcjonowanego przez poli-A, co jest obecnie zalecaną ilością materiału wyjściowego, do zaledwie 1 μg RNA wyselekcjonowanego przez poli-A. Zmaksymalizowaliśmy również wydajność odzyskiwania fragmentów RNA m⁶A związanych ze specyficznymi przeciwciałami za pomocą elucji metodą konkurencji z peptydem m⁶A zamiast bardziej konwencjonalnych i mniej specyficznych metod elucji przy użyciu technik opartych na fenolu lub proteinazie K. Głównym ograniczeniem tego testu opartego na RIP pozostaje jednak nieoptymalna rozdzielczość, która nie pozwala na identyfikację precyzyjnego zmodyfikowanego nukleotydu A.

Analiza znaku C m⁵C może być obecnie przeprowadzona przy użyciu dwóch różnych podejść: metody opartej na RIP z przeciwciałami specyficznymi dla m⁵C i konwersją wodorosiarczynu RNA. Ponieważ RIP oferuje tylko ograniczoną rozdzielczość identyfikacji metylowanej pozostałości, zastosowaliśmy konwersję wodorosiarczynu, która może zapewnić rozdzielczość pojedynczego nukleotydu. Narażenie RNA na wodorosiarczyn (BS) prowadzi do deaminacji cytozyny, przekształcając w ten sposób resztę cytozyny w uracyl. Tak więc podczas reakcji konwersji wodorosiarczynu RNA każda niemetylowana cytozyna jest deaminowana i przekształcana w uracyl, podczas gdy obecność grupy metylowej w pozycji 5 cytozyny ma działanie ochronne, zapobiegając deaminacji wywołanej przez BS i zachowując resztę cytozyny. Podejście oparte na BS pozwala na wykrycie nukleotydu zmodyfikowanego m⁵C w rozdzielczości pojedynczej zasady oraz na ocenę częstotliwości metylacji każdego transkryptu, zapewniając wgląd w dynamikę modyfikacji m⁵C¹⁸. Główne ograniczenie tej techniki polega jednak na fałszywie dodatnim odsetku metylowanych pozostałości. Rzeczywiście, konwersja BS jest skuteczna w przypadku jednoniciowego RNA z dostępnymi resztami C. Jednak obecność ścisłej struktury drugorzędowej RNA może maskować pozycję N5C i utrudniać konwersję BS, co skutkuje niemetylowanymi resztami C, które nie są przekształcane w reszty U, a tym samym fałszywie dodatnimi. Aby obejść ten problem i zminimalizować odsetek wyników fałszywie dodatnich, zastosowaliśmy 3 rundy cykli denaturacji i konwersji wodorosiarczynu¹⁹. Wprowadziliśmy również 2 kontrole w próbkach, aby umożliwić oszacowanie wydajności konwersji wodorosiarczynu: zwiększyliśmy kontrolę sekwencjonowania ERCC (niemetylowane standaryzowane i dostępne na rynku sekwencje)²⁰, a także RNA zubożone w poli-A, aby ocenić współczynnik konwersji wodorosiarczynu z jednej strony, a z drugiej strony zweryfikować za pomocą RT-PCR obecność znanego i dobrze zachowanego miejsca metylacji, C4447, z drugiej strony na rybosomalnym RNA 28S²¹.

W dziedzinie wirusologii, połączenie tych dwóch metod badań epitranskryptomicznych z sekwencjonowaniem nowej generacji i dokładną analizą bioinformatyczną pozwala na dogłębne badanie dynamiki m⁶A i m⁵C (tj. modyfikacji RNA, zmian czasowych, które mogą wystąpić po infekcji wirusowej i mogą odkryć szereg nowych terapeutycznie istotnych celów do użytku klinicznego).

Protocol

1. Przygotowanie komórek

UWAGA: W zależności od typu komórki i jej zawartości RNA, początkowa liczba komórek może się różnić.

1. Mieć wystarczającą ilość komórek, aby uzyskać od 200 do 500 μg całkowitego RNA lub 5-7 μg RNA wyselekcjonowanego przez poli-A. Na przykład komórki 50 x 10⁶ SupT1 powinny dać około 500 μg całkowitego RNA po ekstrakcji odczynnikami na bazie fenolu, a zatem jest to wymagane dla każdego badanego stanu.
2. Przygotuj wymaganą liczbę komórek zgodnie z planem eksperymentalnym, a tym samym zgodnie z liczbą badanych warunków (infekcja, punkty czasowe, leczenie). Jeśli eksperyment ma na celu uzyskanie komórek niezakażonych i komórek zakażonych wirusem HIV w ciągu 24 godzin po zakażeniu, potrzeba w sumie 100 x 10⁶ komórek, połowa w stanie niezakażonym i połowa w stanie zakażonym.

2. Ekstrakcja RNA

1. Z komórek: ekstrakcja RNA za pomocą fenolu-chloroformu
   1. Dla każdego warunku zebrać komórki (np. 50 x 10⁶) przez odwirowanie i odrzucić supernatant.
   2. Dodać 5 ml odczynnika na bazie fenolu do każdej^{6-komórkowej} osadki o wymiarach 50 x 10 i wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół.
   3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowitą lizę. Lizowane komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub przetwarzane bezpośrednio.
      UWAGA: W razie potrzeby komórki można również podzielić na porcje 10 x 10⁶ komórek na probówkę w probówkach o pojemności 1,5 ml i poddać lizie w 1 ml odczynnika na bazie fenolu w celu wygodniejszego przechowywania.
   4. Dodać 1 ml chloroformu i wymieszać przez odwrócenie.
   5. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
   6. Wirować przez 15 minut przy 2.000 x g i 4 °C.
   7. Odpipetować fazę wodną (faza górna) i przenieść do nowej probówki. Zakończ przenoszenie fazy wodnej, ustawiając probówkę pod kątem 45° i ostrożnie odpipetując roztwór.
      UWAGA: Ilość fazy wodnej może się różnić w zależności od próbki, ale powinna być zbliżona do ilości chloroformu dodanego do próbki (tj. 1 ml). Nie przenoś żadnej warstwy interfazowej ani organicznej! Zastosowanie lamp z blokadą fazową lub roztrząsaczem faz może ułatwić ten proces.
   8. Dodać 0,5 ml izopropanolu o jakości cząsteczkowej 100% do fazy wodnej.
   9. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -80 °C, aby umożliwić wytrącenie RNA.
   10. Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C w celu osadzenia wytrąconego RNA.
   11. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad RNA w 1 ml 75% etanolu klasy biologii molekularnej. Wiruj krótko.
   12. Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   13. Suszyć pelety na powietrzu przez 15 minut.
   14. Zawiesić osad w 20 μl wody wolnej od RNaz i przenieść do nowej probówki.
   15. Umyj pustą probówkę dodatkowymi 20 μl wody, aby zmaksymalizować odzysk RNA, i połącz z pierwszymi 20 μl objętości.
   16. Określ ilościowo całkowite RNA za pomocą spektrofotometru i oceń jakość RNA za pomocą analizatora fragmentów.
2. Z cząstek wirusowych: ekstrakcja RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA opartego na kolumnie
   UWAGA: Ekstrakcja RNA z cząstek wirusa za pomocą odczynnika na bazie fenolu skutkuje niską jakością wirusowego RNA i bibliotekami o niższej jakości. W związku z tym należy preferować ekstrakcję RNA opartą na kolumnach. Zestawy do ekstrakcji RNA wykorzystujące nośnik RNA do elucji i odzyskiwania RNA nie są odpowiednie do tej procedury i należy ich unikać. Ponieważ RNA HIV jest poli-adenylowane, bezpośrednia ekstrakcja RNA bez dalszej izolacji mRNA jest wystarczająca, aby wejść do rurociągów MeRIP-Seq i BS-Seq. Zwykle 1-2 ml supernatantu wirusowego z powszechnie zakażonych komórek powinno zapewnić wystarczającą ilość RNA do wykonania całego przepływu pracy.
   1. Przygotować bufor, dodając 150 μl beta-merkaptoetanolu do 30 ml buforu do lizy. Rozpuść Viral Wash Buffer, dodając 96 ml 100% etanolu.
   2. Zbierz supernatanty zawierające wirusy i odwiruj w celu osadzenia szczątków komórek, aby zminimalizować zanieczyszczenie komórkowym RNA.
   3. Przenieść 1 ml supernatantu wirusa do probówki o pojemności 15 ml.
   4. Dodaj 3 ml wirusowego buforu RNA do 1 ml próbki wirusa i wymieszaj przez wirowanie.
   5. Przenieść 700 μl próbki do kolumny, umieścić w probówce zbiorczej.
   6. Wirować przez 2 minuty przy 13 000 x g w temperaturze pokojowej.
   7. Odrzuć przepływ.
   8. Powtarzaj 3 poprzednie kroki, aż cała próbka zostanie przetworzona, a tym samym całe RNA zostanie wychwycone na kolumnie matrycowej na bazie krzemionki.
   9. Dodać 500 μl buforu do płukania wirusów do kolumny.
   10. Wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ.
   11. Dodać 200 μl buforu do płukania wirusów do kolumny.
   12. Wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ.
   13. Umieść kolumnę w pustej probówce zbiorczej.
   14. Wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej, aby dodatkowo usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia buforem do płukania.
   15. Ostrożnie przenieść kolumnę do probówki o pojemności 1,5 ml.
   16. Dodaj 20 μl wody wolnej od DNaz/RNaz bezpośrednio do środka matrycy kolumny i odwiruj przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
   17. Dodaj dodatkowe 10 μl wody wolnej od DNaz/RNaz bezpośrednio do środka matrycy kolumny i ponownie odwiruj przez 30 sekund.
   18. Określ ilościowo całkowite RNA za pomocą spektrofotometru i oceń jakość RNA za pomocą analizatora fragmentów.
       UWAGA: Ekstrakcję RNA można przeprowadzić dowolną metodą, jeśli jakość pobranego RNA jest wysoka, z numerem integralności/jakości RNA > 9. Całkowite RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.

3. Izolacja mRNA metodą selekcji poli-A za pomocą Oligo(dT)₂₅

UWAGA: Ze względu na obecność wysoce metylowanego rybosomalnego RNA w ekstraktach komórkowych, zdecydowanie zaleca się izolowanie poli-A RNA albo przez zubożenie rRNA, albo preferencyjnie przez selekcję dodatnią poli-A. Ten krok jest opcjonalny i powinien być wykonywany tylko dla próbek komórkowego RNA, aby uzyskać wyniki sekwencjonowania w wyższej rozdzielczości. Jeśli analizujesz metylację niepoli-adenylowanych wirusowych RNA, faworyzuj raczej zubożenie rRNA niż selekcję poli-A lub ostatecznie przeprowadź analizę całkowitego RNA.

1. Przygotowanie ściegu do wychwytywania poly-A
   1. Zawiesić fiolkę z kulkami magnetycznymi Oligo(dT)₂₅, wirując przez >30 s.
   2. Przenieś 200 μl kulek magnetycznych do probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotuj liczbę probówek z kulkami magnetycznymi zgodnie z całkowitą ilością próbek RNA do przetworzenia.
      UWAGA: Jedna probówka z 200 μl roztworu podstawowego Dynabead odpowiada 1 mg kulek i może pomieścić próbkę 75 μg całkowitego RNA.
   3. Umieść probówki na magnesie na 1 minutę i wyrzuć supernatant. Wyjmij rurki z magnesu.
   4. Dodać 1 ml buforu wiążącego (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 2 mM EDTA) i zawiesić ponownie przez wirowanie. Umieść probówki na magnesie na 1 minutę i wyrzuć supernatant. Wyjmij rurki z magnesu. Powtórzyć.
   5. Ponownie zawiesić umyte kulki magnetyczne w 100 μl buforu wiążącego.
2. Przygotowanie całkowitego RNA
   1. Rozcieńczyć całkowite RNA w końcowym stężeniu 0,75 μg/μl wodą wolną od RNaz, co odpowiada 75 μg/100 μL.
      UWAGA: Jeśli RNA ma niższe stężenie, postępuj zgodnie z opisem poniżej bez modyfikowania objętości.
   2. Podwielokrotnić całkowitą ilość RNA w wielu probówkach, dozując 100 μl próbki RNA na probówkę.
   3. Dodać 100 μl buforu wiążącego do każdej próbki RNA.
   4. Podgrzewać całkowite RNA do temperatury 65 °C przez 2 minuty, aby rozbić struktury drugorzędowe.
   5. Umieść natychmiast na lodzie, aż będziesz gotowy do przejścia do następnego kroku.
      UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od liczby próbek do przetworzenia, ale nie powinien przekraczać 1 godziny, aby uniknąć degradacji RNA.
3. Wybór Poly-A
   1. Do każdej probówki RNA (od kroku 3.2) dodaj 100 μl przemytych kulek magnetycznych (od kroku 3.1).
   2. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie pozostawić na obracającym się kole w temperaturze pokojowej na 15 minut.
   3. Otwórz wszystkie probówki, umieść je na magnesie na 1 minutę i ostrożnie usuń cały supernatant.
   4. Odzyskać supernatant w nowej probówce i odłożyć na bok do drugiej rundy wychwytywania RNA (krok 3.3.14), w celu poprawy ostatecznego odzysku poli-A.
   5. Wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 200 μl buforu myjącego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA). Wymieszać ostrożnie pipetując 4 do 5 razy.
   6. Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę i wyrzuć supernatant.
   7. Powtórz krok prania raz (powtórz kroki 3.3.5 i 3.3.6).
   8. Dodaj 20 μl lodowatego 10 mM Tris-HCl, aby wymyć poli-A RNA z kulek.
   9. Inkubować w temperaturze 80 °C przez 2 minuty.
   10. Umieść probówkę na magnesie i szybko przenieś supernatant zawierający poli-A RNA do nowej probówki wolnej od RNaz. Umieść rurkę na lodzie.
   11. Powtórzyć etap elucji (kroki 3.3.8-3.3.10) w celu zwiększenia wydajności.
   12. Umyj te same koraliki raz za pomocą 200 μl bufora do mycia. Wymieszać ostrożnie pipetując 4 do 5 razy.
   13. Umieść na magnesie na 1 minutę i wyrzuć bufor do mycia.
   14. Dodać przepływ z etapu 3.3.4 do kulek i powtórzyć procedurę od wiązania do elucji (kroki 3.3.2 do 3.3.10). Na razie trzymaj eluaty RNA w oddzielnych probówkach.
       UWAGA: Opcjonalnie, ponownie zachować supernatant odpowiadający krokowi 3.3.4 w nowej probówce, ponieważ może on być używany jako kontrola. Pod koniec procedury należy oczyścić i zagęścić RNA przez wytrącanie etanolu lub wybraną metodę opartą na kolumnie (tj. oczyszczanie i koncentrator RNA). Próbka ta odpowiada próbce RNA zubożonej w poli-A i może być stosowana jako kontrola konwersji wodorosiarczynu (etap 8.2.2).
   15. Oznaczyć ilościowo wymyty RNA za pomocą spektrofotometru i zachować podwielokrotność 2 μl w celu dalszej oceny jakości RNA za pomocą analizatora fragmentów.
       UWAGA: RNA Poly-A może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.

4. Przepływ pracy RNA

1. Podziel próbki komórkowego poli-A RNA (mRNA) i wirusowego RNA na 2 podwielokrotności, przeznaczone dla odpowiedniego potoku analizy epitranskryptomicznej:
   (i) 5 μg komórkowego mRNA lub 1 μg wirusowego RNA dla MeRIP-Seq i kontroli wejściowej (przejdź do kroków od 5 do 7 i kroku 9).
   (ii) 1 μg komórkowego mRNA lub 500 ng wirusowego RNA dla BS-Seq (przejdź do kroków 8 i 9).

5. Fragmentacja RNA

UWAGA: Fragmentacja RNA jest przeprowadzana za pomocą odczynnika do fragmentacji RNA i jest przeznaczona dla MeRIP-Seq i kontrolnych próbek RNA. Jest to bardzo ważny krok, który wymaga starannej optymalizacji w celu uzyskania fragmentów o wielkości 100-200 nt.

1. Podziel całkowitą objętość mRNA na 0,2 ml probówki PCR z 18 μl mRNA/probówkę.
   UWAGA: Pracuj szybko. Nie pracuj z więcej niż 8 próbkami jednocześnie, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Skalowanie woluminu w górę nie gwarantuje powtarzalnego i jednolitego rozdrobnienia.
2. Rozgrzej termocykler w temperaturze 70 °C.
3. Dodać 2 μl odczynnika do rozdrabniania na brzeg każdej probówki do PCR.
4. Zamknij probówkę i odwiruj w dół (tak, aby odczynnik wszedł w kontakt z RNA w tym samym czasie dla 8 probówek).
5. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 70 °C w nagrzanym termocyklerze.
6. Jak tylko inkubacja się zakończy, dodaj szybko 2 μl roztworu Stop do każdej probówki.
7. Zakręć i pozostaw na lodzie, aż będziesz gotowy do przejścia do następnego kroku.
   UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od liczby próbek do przetworzenia, ale nie powinien przekraczać 1 godziny, aby uniknąć degradacji RNA.
8. Powtórzyć procedurę dla wszystkich próbek (jeżeli jest więcej niż 8 podwielokrotności).
9. Połącz probówki razem i przystąp do oczyszczania RNA za pomocą zestawu do czyszczenia i koncentratora RNA (krok 6) lub dowolnego niestandardowego zestawu opartego na kolumnie, aby pozbyć się i odzyskać czyste rozdrobnione RNA w wodzie.

6. Oczyszczanie RNA

UWAGA: Ten krok może być przeprowadzony przez wytrącanie etanolu lub za pomocą dowolnej metody oczyszczania i zagęszczania RNA opartej na kolumnach (np. RNA Clean and Concentrator).

1. Eluować lub ponownie zawiesić oczyszczony RNA w całkowitej objętości 50-75 μl wody wolnej od DNazy/RNaz.
   UWAGA: Jeśli stosowana jest metoda oparta na kolumnach, zdecydowanie zaleca się dwie rundy elucji, aby zapewnić maksymalne odzysk.
2. Określ ilościowo oczyszczone pofragmentowane mRNA za pomocą spektrofotometru i oceń jakość RNA za pomocą analizatora fragmentów.
3. Zachowaj 100 ng pofragmentowanego mRNA jako kontrolę wejściową do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania (przejdź do kroku 9). Pozostałe pofragmentowane mRNA (minimum 2,5 μg) można wykorzystać do MeRIP (przejdź do kroku 7.2).

7. MeRIP

UWAGA: Minimum 2,5 μg rozdrobnionego mRNA jest wymagane dla każdej immunoprecypitacji (IP), albo przy użyciu specyficznego przeciwciała anty-m⁶A (warunek testowy), albo przy użyciu przeciwciała anty-IgG (kontrola negatywna).

1. Przygotowanie kulek magnetycznych do immunoprecypitacji
   1. Dla każdej próbki przygotuj 4 ml 1x buforu IP w nowej stożkowej probówce, rozcieńczając 800 μl buforu mRNA IP 5x (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630 i woda wolna od nukleaz) z 3,2 ml wody wolnej od nukleaz.
      UWAGA: Potrzebne są co najmniej 2 reakcje (jeden test i jedna kontrola IgG).
   2. Umieść rurkę na lodzie.
   3. Oznaczyć odpowiednią liczbę probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml dla liczby pożądanych reakcji IP:
      n probówek (test) na przeciwciało anty-m6A.
      n probówek (kontrola ujemna) dla normalnej mysiej IgG.
   4. Ponownie zawieś kulki magnetyczne (np. Magna ChIP Protein A/G ) przez odwrócenie i wirowanie. Nie powinny być widoczne żadne kępy koralików.
   5. Dla każdej zaplanowanej reakcji przenieść 25 μl kulek magnetycznych do probówki mikrowirówkowej.
   6. Dodać dziesięć razy więcej bufora 1x IP (z kroku 7.1.1) w stosunku do pierwotnej objętości użytych kulek (tj. 250 μl 1x bufora IP na 25 μl kulek magnetycznych).
   7. Wymieszać kulki, delikatnie pipetując kilkakrotnie w górę i w dół, aby całkowicie się zawiesić.
   8. Umieść rurkę na separatorze magnetycznym na 1 minutę.
   9. Usuń i wyrzuć supernatant, uważając, aby nie zassać żadnych kulek magnetycznych. Wyjmij rurkę z magnesu.
   10. Powtórzyć etap prania (kroki od 7.1.6 do 7.1.9).
   11. Ponownie zawiesić koraliki w 100 μl 1x bufora IP na 25 μl pierwotnej objętości kulek magnetycznych.
   12. Dodać 5 μl przeciwciała (1 μg/μl) na 25 μl pierwotnej objętości kulek magnetycznych.
       n probówek (test) z przeciwciałem anty-m6A (klon 17-3-4-1) [1 μg/μL].
       n probówek (kontrola ujemna) z normalną mysią IgG (1 μg/μL).
   13. Inkubować na obracającym się kole przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić koniugację przeciwciał z kulkami magnetycznymi.
   14. Umieścić probówkę na separatorze magnetycznym na 1 minutę. Wyrzucić supernatant. Wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś mieszaninę przeciwciała i kulki w 100 μl 1x bufor IP.
2. Immunoprecypitacja RNA (RIP)
   1. Przygotować 500 μl mieszaniny reakcyjnej RIP na każdą próbkę mRNA o wielkości 2,5 μg w następujący sposób: 2,5 μg w 100 μl rozdrobnionego RNA (z kroku 6.12); 295 μl wody wolnej od nukleaz; 5 μl inhibitora RNazy 40 U/μL; i 100 μl buforu 5x IP.
   2. Dodać 500 μl mieszaniny reakcyjnej RIP do każdej mieszaniny przeciwciało-kulka (~100 μl z kroku 7.1.14). Wymieszać delikatnie pipetując kilka razy, aby całkowicie zawiesić kulki. Ułóż na lodzie.
   3. Inkubować wszystkie probówki RIP na obracającym się kole przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
   4. Odwiruj krótko reakcje MeRIP, aby odwirować kropelki cieczy z boków nasadki i probówki. Umieść probówki na separatorze magnetycznym na 1 minutę.
   5. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej, uważając, aby nie naruszyć kulek magnetycznych .
      UWAGA: Przepływ może być zachowany jako kontrola w celu sprawdzenia wydajności procesora RIP (przejdź do kroku 7.3.9).
   6. Wyjmij rurki z magnesu. Umyj kulki, dodając 500 μl zimnego bufora 1x IP. Wymieszaj kulki, delikatnie pipetując kilka razy, aby całkowicie zawiesić kulki.
   7. Umieść probówki na separatorze magnetycznym na 1 minutę i wyrzuć supernatant.
   8. Powtórzyć procedurę prania (kroki 7.2.6-7.2.7) dwukrotnie, co daje w sumie 3 prania.
   9. Umieść probówki na lodzie i natychmiast przystąp do elucji.
3. Elucji
   1. Przygotować roztwór 20^{mM 6}A, rozpuszczając 10 mg soli sodowej N6-metyloadenozyny, 5′-monofosforanu (^m6A) w 1,3 ml wody wolnej od nukleaz. Przygotować 150 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Dla każdej próbki (badanie i kontrole): Przygotować 225 μl buforu elucyjnego, mieszając następujące składniki: 45 μl 5x buforu IP, 75 μl 20 mM⁶A, 3,5 μl 40U/μL inhibitora RNazy i 101,5 μl wody wolnej od nukleaz.
   3. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (z kroku 7.3.2) do kulek (z kroku 7.2.9). Wymieszać, delikatnie pipetując kilka razy, aby całkowicie zawiesić kulki.
   4. Inkubować wszystkie probówki przez 1 godzinę, wytrząsając w sposób ciągły na bujaku w temperaturze 4 °C.
   5. Krótko odwirować reakcje RIP, aby odwirować kropelki cieczy z boków nasadki i probówki. Umieść probówki na separatorze magnetycznym na 1 minutę.
   6. Przenieść supernatant zawierający eluowane fragmenty RNA do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Uważaj, aby nie zasysać koralików, ponieważ zwiększy to hałas w tle.
   7. Powtórzyć etapy elucji (7.3.3-7.3.6), ponownie dodając 100 μl buforu elucyjnego, inkubując przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i zbierając eluat po rozdzieleniu magnetycznym.
   8. Połączyć wszystkie eluaty z tej samej próbki (całkowita objętość elucji powinna wynosić 200 μl).
   9. Oczyścić wymyty RNA i jego przepływ (opcjonalnie, od kroku 7.2.5) przez wytrącanie etanolu lub wybraną metodę opartą na kolumnie (tj. RNA Clean and Concentrator).
   10. Oceń ilość i jakość RNA w próbkach przepływowych i eluowanych za pomocą analizatora fragmentów przy użyciu zestawu do wykrywania o wysokiej czułości. Jeśli jakość RNA jest zadowalająca, przystąp do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (krok 9).
       UWAGA: Ilość RNA pobranego przez MeRIP jest bardzo niska i bezwzględnie wymaga zestawów do wykrywania o wysokiej czułości, aby zapewnić kwantyfikację. Jeśli żaden bioanalizator nie jest dostępny, można przejść na ślepo do przygotowania biblioteki.

8. Konwersja wodorosiarczynu RNA

1. Kontrola i przygotowanie odczynnika
   1. Kontrola skoków mieszanki ERCC: Dodaj mieszankę ERCC zgodnie z instrukcjami producenta, który zaleca dodanie 0,5 μl nierozcieńczonej mieszanki ERCC do 500 ng mRNA. Ta kontrola może pomóc w ocenie wydajności konwersji wodorosiarczynu.
   2. Spike Poly-A-zubożone RNA (z kroku 3.3.14) w stosunku 1/1000 (tj. 500 pg poli-A-zubożonego RNA na 500 ng mRNA). Próbka ta jest wzbogacona w rybosomalny RNA i dlatego powinna zawierać 28S rRNA, pozytywną kontrolę konwersji wodorosiarczynu.
      UWAGA: Całkowite RNA może być również używane jako kontrola pozytywna zamiast RNA zubożonego w poli-A.
   3. Przeprowadź konwersję wodorosiarczynu za pomocą zestawu do metylacji RNA (np. Zymo EZ).
   4. Bufor do płukania RNA: Przed użyciem dodaj 48 ml 100% etanolu (lub 52 ml 95% etanolu) do 12 ml koncentratu buforu do płukania RNA.
2. Konwersja wodorosiarczynu
   UWAGA: Konwersję wodorosiarczynu przeprowadzono za pomocą dostępnego na rynku zestawu do konwersji wodorosiarczynu RNA zgodnie z procedurą producenta opisaną poniżej.
   1. W probówkach PCR o pojemności 0,2 ml dodaj 1000 ng mRNA (lub od 300 do 1000 ng). Dodaj kontrole skokowe: 1 μl mieszanki ERCC (krok 8.1.1) i 1000 pg RNA zubożonego w poli-A (krok 8.1.2). Pełna objętość do 20 μl z wodą wolną od DNaz/RNaz.
   2. Dodać 130 μl odczynnika do konwersji RNA do każdej próbki 20 μl RNA.
   3. Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół.
   4. Odkręć na chwilę, aby upewnić się, że w nasadce lub bokach rurki nie ma kropel.
   5. Umieścić probówki PCR w termocyklerze i wykonać następujące czynności: denaturacja w temperaturze 70 °C przez 5 minut; konwersja w temperaturze 54 °C przez 45 minut; powtórzyć etapy denaturacji i konwersji, w sumie przez 3 cykle; a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
      UWAGA: Trzy cykle denaturacji i konwersji wodorosiarczynu zapewniają całkowitą konwersję próbki w kierunku wodorosiarczynu. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub przetwarzane bezpośrednio.
   6. Kontynuować odsiarczanie w kolumnie. Umieść kolumnę w pustej probówce zbiorczej i dodaj do niej 250 μl buforu wiążącego RNA.
   7. Załaduj próbkę (~150 μl z kroku 8.2.5) do kolumny zawierającej bufor wiążący RNA i wymieszaj, pipetując w górę iw dół.
   8. Dodać 400 μl 95-100% etanolu do mieszaniny buforu wiążącego próbkę i RNA w kolumnie. Zamknij nakrętkę i natychmiast wymieszaj, kilkakrotnie odwracając kolumnę.
   9. Wirować z pełną prędkością (≥ 10 000 x g) przez 30 s. Wyrzucić przepływ.
   10. Dodać 200 μl buforu płuczącego RNA do kolumny i wirować z pełną prędkością przez 30 s.
   11. Dodać 200 μl buforu odsulfonacyjnego RNA do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji wirować na pełnych obrotach przez 30 s. Odrzuć przepływ.
   12. Dodać 400 μl buforu płuczącego RNA do kolumny i wirować z pełną prędkością przez 30 s. Powtórzyć etap płukania z dodatkowymi 400 μl buforu płuczącego RNA. Odrzuć przepływ.
   13. Odwirować kolumnę w opróżnionej probówce zbiorczej z pełną prędkością przez 2 minuty. Przenieść kolumnę do probówki wolnej od RNaz.
   14. Dodać ≥ 10 μl wody wolnej od DNaz/RNaz bezpośrednio do matrycy kolumny i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wirować z pełną prędkością przez 30 s.
       UWAGA: Zazwyczaj eluujemy w objętości 20 μL. Uwolniony RNA może być zużyty natychmiast lub przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy. W przypadku długotrwałego przechowywania przechowywać w temperaturze -80 °C.
   15. Pobrać 2,5 μl do oceny jakości i ilości RNA za pomocą analizatora fragmentów, a następnie przejść do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (krok 9).
   16. Weź 4 μl przekształconego RNA w celu kontroli wydajności konwersji wodorosiarczynu (krok 8.3).
3. Kontrola konwersji wodorosiarczynu przez RT-PCR
   UWAGA: Ten krok zapewnia, że konwersja wodorosiarczynu zakończyła się pomyślnie przed przystąpieniem do sekwencjonowania. Rybosomalny RNA 28S z Homo sapiens zostanie wykorzystany jako kontrola pozytywna do analizy metylacji RNA, ponieważ reszta C w pozycji 4447 (akces GenBank # NR_003287) została opisana jako w 100% metylowana.
   Sekwencje podkładowe:
   Podkład H 28SF: 5'-GGGGTTTTAYGATTTTTTTTTTTTTGGG-3'
   Podkład H 28SR: 5'-CCAACTCACRTTCCCTATTAATAAATAAAC-3'
   1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną odwrotnej transkrypcji (RT) przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności. Rozmrozić elementy zestawu na lodzie i przygotować główną mieszankę RT na lodzie w następujący sposób:
      4 μl RNA przekształconego w wodorosiarczyn (z kroku 8.2.14):
      2 μl buforu 10xRT
      0,8 μL 25x dNTP Mix [100 mM]
      2 μL 10 losowych starterów RT
      1 μl odwrotnej transkryptazy MultiScribe
      1 μl inhibitora RNazy
      9,2 μl H₂O
      wolne od nukleaz UWAGA: Każda reakcja RT powinna zawierać 20 μl końcowej objętości w 0,2 ml probówkach PCR.
   2. Umieścić probówki w termocyklerze z następującym programem RT: 25 °C przez 10 min; 37 °C przez 120 min; 85 °C przez 5 min; następnie w 4 °C na czas nieokreślony.
   3. Przygotuj reakcję PCR, aby amplifikować specyficznie 28S rRNA za pomocą enzymu korygującego PCR. Rozmrozić elementy zestawu na lodzie, delikatnie odwirować i krótko odwirować. Przygotować mieszankę wzorcową PCR na lodzie lub na lodowatym metalowym uchwycie na płytkę w następujący sposób:
      0,6 μl 10 μM H 28SF startera
      0,6 μl 10 μM H 28SF startera
      6,5 μl matrycy cDNA
      22,5 μl głównej mieszanki polimerazy DNA
      UWAGA: Każda reakcja PCR powinna zawierać 20 μl końcowej objętości w 0,2 ml probówek PCR.
   4. Umieścić probówki w termocyklerze z następującym programem PCR: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 minut; 45 cykli denaturacji (95 °C przez 15 s), wyżarzanie (57 °C przez 30 s) i wydłużenie (72 °C przez 15 s), końcowe wydłużenie w temperaturze 72°C przez 10 minut, a następnie utrzymywanie w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   5. Przeprowadź 10 μl reakcji na 2% żelu agarozowym. Przewidywana wielkość pasma to 130 - 200 pz.
4. Sekwencjonowanie produktów PCR
   1. Oczyść produkty PCR wybraną metodą kolumnową w celu usunięcia enzymów i reszt dNTP oraz eluuj amplifikowane DNA w co najmniej 20 μl wody wolnej od DNazy/RNaz.
   2. Oznacz ilościowo oczyszczone DNA za pomocą spektrofotometru.
   3. Reakcja sekwencjonowania
      1. Użyć 40 ng produktu PCR/reakcji sekwencjonowania.
      2. Sekwencjonuj w obu kierunkach za pomocą spłonek H 28SF i H 28SR.
      3. Dopasuj sekwencje do znanej nieprzekształconej sekwencji (28S rybosomalny N5 (RNA28SN5). Sprawdzić, czy w miejscu C4447 nie ma pozostałości C, a w innych miejscach nie ma pozostałości T.

9. Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

1. Przygotuj biblioteki do sekwencjonowania za pomocą zestawów mRNA (np. Illumina TruSeq Stranded), uruchamiając protokół na etapie Elute-Prime-Fragment i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Jednak w przypadku wejściowych próbek RNA-Seq i MeRIP-Seq należy inkubować próbki w temperaturze 80 °C przez 2 minuty, aby tylko je zagruntować, ale nie dalej rozdrobnić.
2. Przeprowadź sekwencjonowanie za pomocą platform Illumina. Reakcje sekwencjonowania można przeprowadzać zgodnie z preferencjami i projektem eksperymentalnym, pojedynczymi lub sparowanymi końcami, o długości co najmniej 100 nt.

10. Analizy bioinformatyczne

1. m⁶A Przetwarzanie danych
   1. Uruchom FASTQC²⁴, aby ocenić jakość odczytu w m⁶A i wprowadzić pliki FASTQ z sekwencjonowania.
   2. Uruchom Atropos²⁵, aby przyciąć sekwencje końcowe i adapterowe niskiej jakości z odczytów. Ustaw następujące parametry podczas uruchamiania Atropos.
      1. Usuń następujące sekwencje adapterów: AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTCCCCGATCT.
      2. Użyj następującego odcięcia jakości Phred: 5, do przycinania końcówek niskiej jakości, zgodnie z zaleceniami producenta (https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html).
      3. Użyj następującej minimalnej długości odczytu po przycięciu: 25 par zasad.
   3. Scal ludzki genom GRh38 i odniesienie do HIV [Integrated linear pNL4-3Env-GFP] w formacie FASTA.
   4. Indeksuj scalone odniesienie za pomocą HISAT2²⁶.
   5. Uruchom HISAT2 na przyciętych odczytach, aby wyrównać do indeksowanego odwołania. Użyj domyślnych parametrów HISAT.
   6. Sortuj i indeksuj wyrównane odczyty za pomocą SAMtools²⁷.
   7. Uruchom SAMtools stat i Qualimap 2^28, aby sprawdzić jakość sekwencjonowanych bibliotek po wyrównaniu.
   8. Opcjonalnie zbierz i podsumuj miary jakości z poprzedniego kroku za pomocą multiQC²⁹.
   9. Genom HIV ma homologiczne sekwencje 634 pz w 5' LTR i 3' LTR: Dopasuj odczyty wielomapowania z 5' LTR do odpowiedniego regionu 3' LTR za pomocą SAMtools.
   10. Aby zidentyfikować piki m⁶A, uruchom oprogramowanie do wywoływania szczytów MACS2³⁰ (v 2.1.2). Starannie dobieraj parametry pracy MACS2, aby zapewnić prawidłowe działanie danych RNA-Seq, ponieważ poziom ekspresji genów może mieć wpływ na wywoływanie pików, a krótkie eksony mogą być błędnie nazywane pikami. W związku z tym sygnał wejściowy musi zostać odjęty od sygnału m⁶A, bez wygładzania rutynowo stosowanego przez MACS2 do danych opartych na DNA. Zastosuj następujące parametry do podkomendy "callpeak" z MACS2:
       -keep-dup auto (kontroluje zachowanie MACS2 w stosunku do zduplikowanych odczytów, 'auto' pozwala MACS obliczyć maksymalną liczbę odczytów w dokładnie tym samym miejscu na podstawie rozkładu dwumianowego przy użyciu 1e-5 jako odcięcia wartości p)
       -g 2.7e9 (wielkość ludzkiego genomu w BP)
       -q 0,01 (minimalna granica FDR do wywołania znaczących szczytów)
       -nomodel (aby pominąć budowanie modelu przesuwania, który jest dostosowany do eksperymentów ChIP-Seq)
       -slocal 0
       -llocal 0 (ustawienie tego i poprzedniego parametru na 0 pozwala MACS2 na bezpośrednie odejmowanie, bez wygładzania, odczyty wejściowe z m⁶A odczytuje)
       -extsize 100 (średnia długość fragmentów w bp)
       -B
   11. Uruchom podkomendę wywołania piku różnicowego MACS2, 'bdgdiff', aby porównać próbki zakażone i niezainfekowane. 'bdgdiff' przyjmuje jako dane wejściowe pliki bedGraph wygenerowane przez 'callpeak' w poprzednim kroku. Dla każdego punktu czasowego uruchom porównanie próbek zakażonych i niezakażonych za pomocą "bdgdiff", odejmując odpowiedni sygnał wejściowy od sygnału m⁶A i podając dodatkowe parametry: -g 60 -l 120.
2. m⁵C Przetwarzanie danych
   1. Uruchom Cutadapt³¹, aby przyciąć sekwencje adapterów z nieprzetworzonych odczytów, z następującymi parametrami:
      adapter "AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC"
      -minimalna-długość=25.
   2. Odwrotne uzupełnienie przyciętych odczytów przy użyciu seqkit³², ponieważ protokół sekwencjonowania generuje odczyty z odwrotnej nici.
   3. Uruchom FastQC, aby sprawdzić jakość odczytu.
   4. Scal ludzki genom GRh38 i odniesienie do HIV [Integrated linear pNL4-3Env-GFP] w formacie FISTA.
   5. Indeksuj scalone odniesienie z aplikacją meRanGh z pakietu meRanTK class³³.
   6. Wyrównaj z meRanGh z następującymi parametrami:
      -UN umożliwiające zapisywanie niezmapowanych odczytów do plików wyjściowych
      -MM umożliwiające zapis odczytów z wieloma mapami do pliku wyjściowego
      -bg dla danych wyjściowych w bedGraph
      -mbgc 10 Filtruj raportowane regiony według zasięgu (co najmniej 10 odczytów pokrycia)
   7. Genom HIV ma homologiczne sekwencje 634 pz w 5' LTR i 3' LTR: dopasuj odczyty multimapowania z 5' LTR do odpowiedniego regionu 3' LTR za pomocą SAMtools.
   8. Uruchom wywołanie metylacji za pomocą narzędzia meRanCall, dostarczonego przez meRanTK, z następującymi parametrami:
      -rl = 126, długość odczytu
      -ei = 0,1, przedział błędu dla obliczenia wartości p szybkości metylacji
      -cr = 0,99, oczekiwana konwersja
   9. Uruchom estimateSizeFactors.pl narzędziowy MeRanTK, aby oszacować współczynniki wielkości każdej próbki. Współczynniki wielkości zostaną użyte jako parametry w następnym kroku.
   10. Uruchom MeRanCompare w celu przeprowadzenia różnicowej analizy metylacji osób niezakażonych i zakażonych w punktach czasowych 12, 24 i 36 godzin. Stosowane są następujące parametry: wartość istotności 0,01 jako minimalny próg raportowania i współczynniki wielkości z poprzedniego kroku.

Results

Ten przepływ pracy okazał się przydatny do zbadania roli metylacji m⁶A i m⁵C w kontekście zakażenia wirusem HIV. W tym celu użyliśmy modelu linii limfocytów T CD4+ (SupT1), które albo zarażamy wirusem HIV, albo pozostawiamy nieleczone. Rozpoczęliśmy przepływ pracy od 50 milionów komórek na warunek i uzyskaliśmy średnio 500 μg całkowitego RNA o liczbie jakości RNA 10 (Rysunek 1A-B). Po selekcji poli-A uzyskaliśmy od 10 do 12 μg mRNA na warunek (co stanowi około 2% całkowitego RNA) (Figura 1B). W tym momencie użyliśmy 5 μg RNA wyselekcjonowanego poli-A dla rurociągu MeRIP-Seq i 1 μg dla potoku BS-Seq. Ponieważ RNA wirusa HIV jest poliadenylowane, nie są wymagane żadne dalsze działania, a procedury MeRIP-Seq i BS-Seq mogą być stosowane bezpośrednio.

Rysunek 1: Przygotowanie RNA do dalszych zastosowań. A) Przepływ pracy przedstawiający przygotowanie i dystrybucję RNA dla jednoczesnych rurociągów MeRIP-Seq i BS-Seq. Każdy wypełniony sześciokątny kształt reprezentuje typ modyfikacji RNA, taki jak m⁶A (zielony) lub m⁵C (różowy). Wskazane są ilości materiału RNA potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu. B) Reprezentatywne wyniki przedstawiające oczekiwane profile dystrybucji RNA (wielkość i ilość) po całkowitej ekstrakcji RNA (górny panel) i selekcji poli-A (dolny panel). Próbki załadowano do analizatora fragmentów za pomocą standardowego zestawu czułości w celu oceny jakości RNA przed przystąpieniem do określonych procedur MeRIP-Seq i BS-Seq. RQN: numer jakości RNA; nt: nukleotydy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rurociąg MeRIP-Seq to technika oparta na immunoprecypitacji RNA, która pozwala na badanie modyfikacji m⁶A wzdłuż cząsteczek RNA. W tym celu RNA jest najpierw fragmentowany, a następnie inkubowany z przeciwciałami specyficznymi dla m⁶A sprzężonymi z kulkami magnetycznymi w celu immunoprecypitacji i wychwytywania. Fragmenty RNA wzbogacone w MeRIP i nietknięta (wejściowa) frakcja są następnie sekwencjonowane i porównywane w celu zidentyfikowania regionów RNA zmodyfikowanych m⁶A, a tym samym m⁶A-metylowanych transkryptów (Figura 2A). Rozdzielczość tej techniki opiera się na wydajności fragmentacji RNA. Rzeczywiście, krótsze fragmenty pozwalają na bardziej precyzyjną lokalizację reszty m⁶A. W tym przypadku wyselekcjonowane przez komórki poli-A RNA i wirusowe RNA poddano fragmentacji jonowej z buforem fragmentacji RNA przez 15 minut w końcowej objętości 20 μl w celu uzyskania fragmentów RNA 100-150 nt. Zaczynając od 5 μg mRNA, odzyskaliśmy 4,5 μg rozdrobnionego RNA, co odpowiada wskaźnikowi odzysku wynoszącemu 90% (Rysunek 2B). Użyliśmy 100 ng rozdrobnionego, oczyszczonego RNA jako kontroli wejściowej, poddanej bezpośrednio przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu. Pozostałe RNA (~4,4 μg) przetworzono zgodnie z potokiem MeRIP-Seq, który rozpoczyna się od inkubacji rozdrobnionego RNA z kulkami związanymi albo z przeciwciałami specyficznymi dla anty-m⁶A, albo z przeciwciałami anty-IgG jako kontrolą. m⁶A specyficzny RIP (MeRIP) 2,5 μg rozdrobnionego RNA pozwolił na pobranie około 15 ng materiału wzbogaconego m⁶A, który został poddany przygotowaniu bibliotecznemu i sekwencjonowaniu (Rysunek 2B). RIP z kontrolą anty-IgG, zgodnie z oczekiwaniami, nie dostarczył wystarczającej ilości RNA, aby umożliwić dalszą analizę (Figura 2B).

Rysunek 2: Potok MeRIP-Seq. A) Schematyczne przedstawienie przepływu pracy MeRIP-Seq i kontroli wejść. Po selekcji poli-A próbki rozdrobniono na kawałki o długości 120-150 nt i albo bezpośrednio poddano sekwencjonowaniu (100 ng, kontrola wejściowa), albo użyto do immunoprecypitacji RNA (2,5 μg, RIP) z przeciwciałem specyficznym anty-m⁶A lub przeciwciałem anty-IgG jako kontrolą ujemną przed sekwencjonowaniem. B) Reprezentatywne wyniki pokazujące oczekiwane profile dystrybucji RNA (wielkość i ilość) po fragmentacji (górny panel) i RIP (dolne panele, MeRIP: po lewej, kontrola IgG: po prawej). Próbki załadowano do analizatora fragmentów w celu oceny jakości i stężenia RNA przed dalszym przetwarzaniem w celu przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Analizę fragmentarycznego RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu do standardowej czułości RNA, podczas gdy immunoprecypitowane RNA użyto zestawu o wysokiej czułości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Potok BS-Seq pozwala na eksplorację modyfikacji m⁵C RNA w rozdzielczości nukleotydowej i prowadzi do identyfikacji m⁵C-metylowanych transkryptów. Po konwersji wodorosiarczynu niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, podczas gdy metylowane cytozyny pozostają niezmienione (Rysunek 3A). Ze względu na trudne warunki procedury konwersji wodorosiarczynu (tj. wysoka temperatura i niskie pH), przekształcone mRNA są wysoce zdegradowane (Rysunek 3B), jednak nie przeszkadza to w przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu. Konwersja wodorosiarczynu jest wydajna tylko w przypadku jednoniciowego RNA i dlatego może być potencjalnie utrudniona przez drugorzędowe struktury dwuniciowego RNA. Aby ocenić efektywność konwersji C-U, wprowadziliśmy dwie kontrole. Jako kontrolę pozytywną wykorzystaliśmy wcześniej opisaną obecność silnie metylowanej cytozyny w pozycji C4447 28S rRNA²³. Po amplifikacji i sekwencjonowaniu RT-PCR fragmentu o długości 200 pz otaczającego miejsce metylacji można było zaobserwować, że wszystkie cytozyny zostały pomyślnie przekształcone w uracyle, pojawiając się tym samym jako tymidyny w sekwencji DNA, z wyjątkiem cytozyny w pozycji 4447, która pozostała niezmieniona. Jako kontrolę współczynnika konwersji wodorosiarczynu wykorzystaliśmy dostępne na rynku syntetyczne sekwencje RNA ERCC. Mieszanina ta składa się z puli znanych, niemetylowanych i poli-adenylowanych sekwencji RNA, o różnych strukturach i długościach drugorzędowych. Po przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu skupiliśmy się na tych sekwencjach ERCC, aby obliczyć współczynnik konwersji, który można przeprowadzić, zliczając liczbę przekształconych C wśród całkowitych reszt C we wszystkich sekwencjach ERCC i w każdej próbce. Uzyskaliśmy współczynnik konwersji na poziomie 99,5%, potwierdzając skuteczność i sukces reakcji konwersji wodorosiarczynu (Rysunek 3D).

Rysunek 3: Potok BS-Seq. A) Schematyczne przedstawienie przepływu pracy BS-Seq. Po selekcji poli-A próbki są poddawane działaniu wodorosiarczynu, co powoduje konwersję C do U (w wyniku deaminacji) dla niemetylowanych reszt C. W przeciwieństwie do tego, metylowane reszty C (m⁵C) nie są dotknięte obróbką wodorosiarczynową i pozostają niezmienione. B) Reprezentatywny wynik profilu dystrybucji RNA przekształconego w wodorosiarczyn (wielkość i ilość) po analizie na analizatorze fragmentów z zestawem o standardowej czułości. C) Elektroferogram przedstawiający reprezentatywny wynik sekwencjonowania amplikonu RT-PCR regionu otaczającego 100% metylowany C w pozycji 4447 w 28S rRNA (zaznaczony na niebiesko). W przeciwieństwie do tego, reszty C sekwencji referencyjnej zostały zidentyfikowane jako reszty T w sekwencji amplikonowej ze względu na powodzenie konwersji wodorosiarczynu. D) Ocena współczynnika konwersji C-U poprzez analizę sekwencji skokowych ERCC w komórkach zakażonych wirusem HIV i niezakażonych. Średni współczynnik konwersji wynosi 99,5%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

M⁶próbek wzbogaconych w A, próbki przekształcone w wodorosiarczyn i kontrole wejściowe są dalej przetwarzane w celu przygotowania biblioteki, sekwencjonowania i analizy bioinformatycznej (Rysunek 4). Zgodnie z projektem eksperymentu i poruszonymi kwestiami biologicznymi, można zastosować wiele analiz bioinformatycznych. Jako dowód zasadniczy pokazujemy tutaj reprezentatywne wyniki z jednego potencjalnego zastosowania (tj. różnicowej analizy metylacji), które koncentruje się na identyfikacji różnicowo metylowanych transkryptów indukowanych po zakażeniu wirusem HIV. Krótko mówiąc, zbadaliśmy poziom metylacji transkryptów m⁶A lub m⁵C, niezależnie od poziomu ekspresji genów, zarówno w komórkach niezakażonych, jak i zakażonych wirusem HIV, w celu lepszego zrozumienia roli metylacji RNA podczas cyklu życia wirusa. Po normalizacji ekspresji genów stwierdziliśmy, że transkrypt ZNF469 był różnie metylowany m⁶A w zależności od statusu infekcji, w rzeczywistości ten transkrypt nie był metylowany w niezakażonych komórkach, podczas gdy wykazywał kilka metylowanych pików po zakażeniu HIV (Figura 5A). Podobna różnicowa analiza metylacji na m⁵C wykazała, że transkrypt PHLPP1 zawierał kilka metylowanych reszt, które mają tendencję do częstszego metylowania w stanie HIV (Figura 5B). W tym kontekście obie analizy sugerują, że zakażenie wirusem HIV wpływa na epitranskryptom komórkowy.

Rysunek 4: Schematyczne przedstawienie bioinformatycznego przepływu pracy do analizy danych m⁶A i m⁵C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykład różnie metylowanych transkryptów po infekcji. A) Reprezentatywny wynik wykazujący metylację m⁶A transkryptu ZNF459 w komórkach zakażonych wirusem HIV (kolor zielony) i niezakażonych (szarych). Intensywność piku (po odjęciu wyrażenia wejściowego) jest pokazana na osi y i pozycji w chromosomie wzdłuż osi x. Różnicowa analiza metylacji ujawnia, że transkrypt ZFN469 ulega hipermetylacji po zakażeniu wirusem HIV. B) Reprezentatywny wynik metylowanego genu m⁵C w komórkach zakażonych wirusem HIV (górna linia) i niezakażonych (dolna linia). Wysokość każdego słupka reprezentuje liczbę odczytów na nukleotyd i umożliwia ocenę pokrycia. Każda reszta C jest reprezentowana na czerwono, a proporcja metylowanego C jest reprezentowana na niebiesko. Dokładna szybkość metylacji (%) jest podawana powyżej każdej reszty C. Strzałki wskazują statystycznie istotne różnicowo metylowane C. Próbki wizualizowano za pomocą przeglądarki IGV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Rola modyfikacji RNA w infekcji wirusowej jest nadal w dużej mierze nieznana. Lepsze zrozumienie roli modyfikacji epitranskryptomicznych w kontekście infekcji wirusowej może przyczynić się do poszukiwania nowych celów leczenia przeciwwirusowego.

W tej pracy zapewniamy kompletny przepływ pracy, który umożliwia badanie epitranskryptomów m⁶A i m⁵C zakażonych komórek. W zależności od kwestii biologicznej zalecamy użycie RNA wyselekcjonowanego przez poli-A jako materiału wyjściowego. Chociaż jest to opcjonalne, ponieważ rurociąg może być używany z całkowitym RNA, ważne jest, aby pamiętać, że rRNA, jak również małe RNA, są wysoce zmodyfikowane i zawierają znaczną liczbę metylowanych reszt. Może to skutkować obniżeniem jakości i ilości istotnych danych sekwencjonowania.

Jeśli jednak badanie koncentruje się na niepoli-adenylowanym RNA, etap ekstrakcji RNA powinien być dostosowany, aby uniknąć odrzucenia małego RNA (w przypadku ekstrakcji RNA na podstawie kolumny) i uprzywilejować techniki dezubożenia rybosomów, a nie selekcję poli-A do wejścia do rurociągu.

W celu zapewnienia wysokiej jakości RNA, prawidłowej fragmentacji oraz odpowiedniej jakości RNA wzbogaconego w m⁶A i przetworzonego BS do przygotowania biblioteki, zdecydowanie zalecamy użycie analizatora fragmentów lub bioanalizatora. Jednak ten sprzęt nie zawsze jest dostępny. Alternatywnie, jakość RNA, mRNA i wielkość rozdrobnionego RNA można również ocenić za pomocą wizualizacji na żelu agarozowym. Alternatywnie, przygotowanie biblioteki można przeprowadzić bez wcześniejszej oceny ilości RNA.

Użyliśmy techniki MeRIP-Seq¹⁶ opartej na przeciwciałach, aby zbadać epitranskryptomiczny krajobraz m⁶A. Technika ta opiera się na immunoprecypitacji RNA i jest skuteczna; Jednak niektóre kroki wymagają starannej optymalizacji i mogą być krytyczne. Chociaż opisano metylację^m6A zachodzącą głównie w sekwencji konsensusu RRA*CH, motyw ten jest bardzo częsty wzdłuż cząsteczek mRNA i nie pozwala na precyzyjną identyfikację miejsca metylacji. Dlatego tak ważne jest osiągnięcie powtarzalnej i spójnej fragmentacji RNA, generującej małe fragmenty RNA, w celu poprawy rozdzielczości opartej na RIP. W tym protokole zalecamy zoptymalizowaną procedurę, zapewniającą powtarzalne i spójne wyniki w naszych warunkach eksperymentalnych; Jednak ten etap fragmentacji może wymagać dalszej optymalizacji zgodnie z określonymi przykładowymi funkcjami.

Niedawno opisano nową technikę pozwalającą na bezpośrednie sekwencjonowanie m⁶A. Opiera się na wykorzystaniu specyficznych wariantów odwrotnej transkryptazy, które wykazują unikalne sygnatury RT w odpowiedzi na napotkanie modyfikacji RNA m⁶A²⁴. Technologia ta, po starannej optymalizacji, może obejść główne ograniczenie stojące przed MeRIP-Seq (zmniejszenie ilości materiału wyjściowego i umożliwienie wyższej rozdzielczości). Aby zbadać modyfikację m⁵C, zdecydowaliśmy się użyć techniki konwersji wodorosiarczynu w celu wykrycia z rozdzielczością nukleotydową zmodyfikowanych reszt C. W celu zmniejszenia odsetka wyników fałszywie dodatnich ze względu na obecność struktur drugorzędowych RNA, przeprowadziliśmy 3 cykle denaturacji/konwersji wodorosiarczynu i dalej kontrolowaliśmy wydajność współczynnika konwersji wodorosiarczynu dzięki zastosowaniu kontroli ERCC z impulsami skokowymi. Jednym z ograniczeń związanych z tą techniką jest to, że konwersja wodorosiarczynu jest bardzo ostra, a trzy cykle denaturacji/konwersji wodorosiarczynu mogą zdegradować część RNA, a tym samym zmniejszyć rozdzielczość. Jednak w naszym otoczeniu zdecydowaliśmy się zadowolić potencjalnie nieco niższą rozdzielczością, aby zwiększyć jakość zestawu danych.

Dzięki tym optymalizacjom i kontrolom byliśmy w stanie zapewnić niezawodny i solidny przepływ pracy, który można wykorzystać do zbadania krajobrazu epitranskryptomicznego i jego zmian w kontekście infekcji wirusowych, interakcji gospodarz-patogen lub jakiejkolwiek ekspozycji na określone terapie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx SuperMix	Invitrogen	12344-040
Przeciwciało anty-m6A _Clone 17-3-4-1	Millipore	MABE1006
Chloroform	Merck	67-66-3
ERCC	Invitrogen	4456740
EZ	Zymo Research	EZR5001
Zestaw RNA - Zestaw HS RNA	Agilent	DNF-472-0500
Zestaw analizatora fragmentów RNA - Zestaw RNA	Agilent	DNF-471-0500
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności	Applied Biosystem	4368814
Illumina TruSeq Nici mRNA	Illumina	20020594
Kulki magnetyczne Mieszanka A/G	Merck	16-663
N6-metyloadenozyna, sól sodowa 5′-monofosforanu (m6A)	Sigma Aldrich	M2780-10MG
Normalna mysia IgG	Merk	12371
Oligo(dT)25	Life Technologies	61005,
PCRapace		Stratec 1020220300
Szybki zestaw wirusowy RNA	Zymo Research	1034
RNA Czystość & Koncentrator	Zymo Research	R1015
Odczynnik do fragmentacji RNA	Ambion	AM8740
Inhibitor RNazy	Ambion	AM2684
	Trizol TRIzol	Odczynnik 15596026