Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62438

⸱

12 lutego 2022

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Experimental Teratology, Ministry of Education, Institute of Molecular Medicine and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Stem Cell and Regenerative Medicine Research Center, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2The Research Center of Stem Cell and Regenerative Medicine, Shandong University Cheeloo Medical College, School of Basic Medical Sciences, Shandong University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Długoterminowy system hodowli organoidów 3D ex vitro został stworzony z mysich hepatocytów. Organoidy te mogą być pasażowane i manipulowane genetycznie przez infekcję lentiwirusem o konstrukcji shRNA/ektopowej, transfekcję siRNA i inżynierię CRISPR-Cas9.

Streszczenie

Wątroba jest największym organem u ssaków. Odgrywa ważną rolę w magazynowaniu glukozy, wydzielaniu białek, metabolizmie i detoksykacji. Jako wykonawca większości funkcji wątroby, pierwotne hepatocyty mają ograniczoną zdolność proliferacji. Wymaga to opracowania modeli ekspansji hepatocytów ex vivo do badań fizjologicznych i patologicznych wątroby. Tutaj wyizolowaliśmy mysie hepatocyty za pomocą dwóch etapów perfuzji kolagenazy i ustaliliśmy hodowlę organoidów 3D jako "mini-wątrobę", aby podsumować interakcje komórka-komórka i funkcje fizyczne. Organoidy składają się z heterogenicznych populacji komórek, w tym komórek progenitorowych i dojrzałych hepatocytów. Szczegółowo przedstawiamy proces izolacji i hodowli mysich hepatocytów lub hepatocytów płodowych w celu utworzenia organoidów w ciągu 2-3 tygodni i pokazujemy, jak je przechodzić, mechanicznie pipetując w górę iw dół. Ponadto przedstawimy również, jak trawić organoidy do pojedynczych komórek w celu zakażenia lentiwirusem o budowie shRNA/ektopowej, transfekcji siRNA i inżynierii CRISPR-Cas9. Organoidy mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych leków, modelowania chorób i podstawowych badań wątroby poprzez modelowanie biologii i patobiologii wątroby.

Wprowadzenie

Organoidy to samoorganizujące się, trójwymiarowe (3D) klastry in vitro, które zawierają samoodnawiające się komórki macierzyste i komórki zróżnicowane wieloliniowo1,2. Organoidy wielu narządów zostały utworzone z pluripotencjalnych lub dorosłych komórek macierzystych przez dobrze zdefiniowane czynniki niszowe, w tym jelita, mózg, okrężnicę, nerki, wątrobę, trzustkę, tarczycę, żołądek, skórę i płuca3,4,5,6,7. Organoidy podsumowują funkcje fizyczne komórek, naśladując ich rozwój (wywodzący się z embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) lub homeostazy/regeneracji (pochodzących z dorosłych komórek macierzystych, ASC), co otwiera nowe możliwości w badaniach i terapii chorób8,9.

Jako największy organ u ssaków, wątroba jest głównie odpowiedzialna za magazynowanie, metabolizm i detoksykację. Dwa rodzaje komórek nabłonkowych, hepatocyty i cholangiocyty, budują podstawową jednostkę zrazika wątroby. Hepatocyty są odpowiedzialne za 70-80% funkcji wątroby10. Chociaż wątroba ma niezwykłą zdolność regeneracji, szybka utrata cech hepatocytów następuje podczas tradycyjnej hodowli jednowarstwowej przez rozregulowaną polaryzację komórek i dedyferencjację, co zwiększa potrzebę badaczy i klinicystów do budowania modeli wątroby "wypełniających luki" w naczyniu. Jednak do niedawna modele ekspansji ex vivo z pierwotnych hepatocytów nie były dobrze ugruntowane11,12,13,14,15. Organoidy wątroby można ustalić z embrionalnych/indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, konwersji fibroblastów w komórki podobne do hepatocytów i komórek pochodzących z tkanki. Rozwój organoidów wątrobowych przyspiesza stosowanie modelu in vitro do badań przesiewowych leków i testów toksyczności wątroby16,17.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół tworzenia organoidów wątrobowych z mysich pierwotnych hepatocytów. Korzystając z tego protokołu, stworzyliśmy system hodowli in vitro organoidów hepatocytów z dwiema perfuzjami kolagenazy. Te organoidy mogą być pasażowane w celu długotrwałej ekspansji przez wiele miesięcy. Ich funkcja fizjologiczna jest wysoce zgodna z hepatocytami. Ponadto podajemy również szczegółowy opis, jak wykonywać manipulacje genetyczne, takie jak infekcja lentiwirusem, transdukcja siRNA i inżynieria CRISPR-Cas9 przy użyciu organoidów. Rozmnażanie organoidów hepatocytów rzuciło światło na możliwość wykorzystania organoidów do zrozumienia biologii wątroby i opracowania spersonalizowanych i translacyjnych podejść medycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Podstawowych Nauk Medycznych na Uniwersytecie Shandong i zostały przeprowadzone zgodnie z Licencją zgodnie z wytycznymi i przepisami Home Office (Nie. ECSBMSSDU2019-2-079).

UWAGA: Ten protokół jest głównie używany do hodowli organoidów 3D z izolowanych pierwotnych hepatocytów.

1. Założenie hodowli organoidów mysich hepatocytów

UWAGA: Macierz zewnątrzkomórkowa, taka jak Matrigel lub BME, jest używana jako macierz podstawowa do hodowli organoidów. Przechowywać macierz zewnątrzkomórkową w temperaturze -20 °C i wstępnie rozmrozić ją w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Podczas eksperymentów utrzymuj macierz zewnątrzkomórkową na lodzie. Medium myjącym jest Advanced DMEM/F12 uzupełnione o GlutaMAX, HEPES i penicylinę/streptomycynę. Do hodowli organoidów stosuje się standardowy inkubator (37 °C, wilgotna atmosfera, 5% CO2 ).

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Przygotuj narzędzia potrzebne do eksperymentu: poduszkę pod mysz, sterylne narzędzia chirurgiczne, takie jak pęseta, nożyczki, rurki i pompę o natężeniu przepływu 2-10 ml/min.
    2. Przygotować odczynniki, w tym bufor perfuzyjny, bufor do wytrawiania i uczynić je sterylnymi w celu izolacji hepatocytów. Dodać świeżą kolagenazę typu IV (0,10 mg/ml) i CaCl2 (0,50 M) i wstępnie ogrzać bufor w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    3. Przygotować pożywkę warunkową do produkcji R-spondyny 1 oraz wszystkich zapasów substancji chemicznych i czynników wzrostu zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Unikaj częstego zamrażania i rozmrażania pożywki warunkowej i wywarów. Przygotuj pożywkę hodowlaną na świeżo i zużyj ją w ciągu jednego miesiąca. Ma to kluczowe znaczenie dla wydajności formowania organoidów.
  2. Izolacja hepatocytów myszy metodą perfuzji i trawienia wątroby
    UWAGA: Samce lub samice myszy w wieku od 12 tygodni do 6 miesięcy wykorzystano do hodowli organoidów. Nie stwierdzono żadnych oczywistych różnic w wydajności tworzenia organoidów w porównaniu z wiekiem myszy dawcy w tym zakresie.
    1. Poddaj mysz eutanazji metodą zatwierdzoną etycznie.
    2. Przymocuj mysz do poduszki myszy i oczyść sierść i skórę brzucha 70% alkoholem. Odsłoń brzuch i unieś wątrobę ponad resztę ciała. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić wątrobę.
    3. Napełnij rurkę dołączoną do pompy buforem perfuzyjnym. Wykonaj nacięcie żyły wrotnej (około 1/3 średnicy żyły) i ostrożnie umieść w niej cewnik. Podnieś narządy trawienne, aby pomóc we włożeniu kaniuli. Krawat z linią chirurgiczną jest opcjonalny, aby uniknąć wysunięcia się i pęknięcia.
    4. Uruchom pompę i wykonaj perfuzję z natężeniem przepływu 5-7 ml/min z buforem perfuzyjnym. Jeśli wątroba natychmiast zblednie, przetnij żyłę główną dolną, aby bufor perfuzyjny mógł przepływać przez całą wątrobę i wyprowadzić krew.
    5. Gdy odpływ stanie się czysty, wyjmij kaniulę. Zajmuje to około 5-10 minut.
    6. Zmienić bufor perfuzyjny na wstępnie podgrzany bufor do wytrawiania z szybkością 5 ml/min. Nie należy przerywać pompy, dopóki wątroba nie stanie się miękka i nie puchnie. Usuń cewnik, gdy wątroba przestanie puchnąć.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zachować odpowiedni czas trawienia, aby uniknąć nadmiernego trawienia i uzyskać pojedyncze komórki wątroby.
    7. Odetnij wątrobę i umieść ją na talerzu o średnicy 100 mm wypełnionym 15 ml zimnego środka do mycia. Przetnij więzadła małymi nożyczkami. Rozerwij wątrobę na kawałki za pomocą końcówek pipet lub kleszczy.
    8. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby uwolnić komórki, aż bufor zostanie nasycony komórkami (12-15 razy). Wlać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml przez filtry 70 μm.
    9. Wirować przez 1-3 minuty w temperaturze 50 x g i temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant. Opcjonalnie należy ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki płuczącej lub ponownie zawiesić komórki bezpośrednio za pomocą pożywki hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemacytometru.
    10. Odróżnij żywe lub martwe komórki za pomocą licznika komórek po barwieniu barwnikiem żywych komórek.
      UWAGA: Hepatocyty najlepiej oczyszczać za pomocą zimnego 40% Percollu. Po tym kroku żywotne hepatocyty znajdą się na dnie probówek.
  3. Hodowla i pasaż organoidów
    1. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić hepatocyty mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywki hodowlanej w stosunku 3:1,
      UWAGA: Zaleca się 10 000-20 000 komórek w mieszaninie 50-60 μl na dołek dla płytki 24-dołkowej. Ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać mieszaninę na lodzie przez cały proces. W tym stężeniu może powstać 200-500 organoidów.
    2. Dodaj kroplę komórki/mieszaniny na płytkę z małymi kropelkami, aby zapobiec łączeniu się kropel. Inkubować płytkę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5-10 minut, a następnie wyjmować płytkę na 20-25 minut, aż macierz zewnątrzkomórkowa stanie się twarda.
    3. Dodać pożywkę hodowlaną (500 μl na studzienkę dla płytki 24-dołkowej) do studzienek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w celu hodowli organoidów. Zmieniaj podłoże co 3-4 dni. Obserwuj organoidy, aż osiągną wystarczająco duże rozmiary, aby można je było przejść.
      UWAGA: Średnica około 400-500 μm jest odpowiednia do pasażu organoidów hepatocytów.
    4. Wyizoluj organoidy z macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą szczegółowego procesu poniżej. Trzymaj szklaną pipetę Pasteura w płomieniu, aby zwęzić jej otwór (o ~1/2). Mechanicznie pipetować w górę i w dół 5-10 razy, aby rozdzielić organoidy na mniejsze organoidy podczas pasażu.
      UWAGA: Podczas pasażowania należy przygotować wstępnie umyte końcówki i probówki do mikropipet z buforem do płukania końcówek, aby uniknąć utraty organoidów przyklejających się do probówek lub końcówek.

2. Manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

  1. Pojedyncze komórki z organoidów hepatocytów
    1. Do każdej studzienki dodać 500 μl pożywki do płukania na zimno/roztworu do odzyskiwania komórek. Pipetować w górę i w dół, aby zniszczyć mieszaninę komórka/macierz zewnątrzkomórkowa za pomocą mikropipety, a następnie przenieść zawiesinę organoidów do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie. Opcjonalnie od czasu do czasu obracaj rurkę w górę i w dół, aby dokładnie rozmrozić mieszankę.
    2. Wirować przez 5 minut przy 500-800 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Dodaj 1 ml roztworu trypsyny do granulki i odpipetuj ją do wymieszania. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, a następnie zatrzymać trawienie, dodając 2x większą objętość pożywki myjącej.
    3. Wirować przez 5 minut w temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad z pożywką hodowlaną i policzyć komórki za pomocą hemacytometru.
  2. siRNA lub transfekcja plazmidowa
    UWAGA: Mniejsze organoidy o średnicy mniejszej niż 50 μm lub pojedyncze komórki z organoidów hepatocytów są transfekowane siRNA przy użyciu Lipofectaminy lub plazmidów przy użyciu odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Wymieszaj siRNA lub plazmidy z odczynnikiem do transfekcji. Dodać pojedyncze komórki z organoidów i mieszaninę lipofektaminy-RNA/lipo-plazmidu (np. RNAiMAX) do 1-2 dołków na płytce 24-dołkowej i wirować przez 1 godzinę w temperaturze 500 x g i temperaturze 32 °C. Po odwirowaniu inkubować płytkę w inkubatorze przez 4-5 godzin w temperaturze 37 °C.
    2. Zebrać komórki i nasiona w macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą pożywki hodowlanej o stężeniu 10 000 komórek na studzienkę. Zmień pożywkę na stan selekcji dwa dni po transfekcji. Oceń skuteczność tworzenia organoidów po 10 dniach.
  3. Zakażenie lentiwirusowe
    UWAGA: Małe organoidy o średnicy mniejszej niż 50 μm lub pojedyncze komórki z organoidów hepatocytów są zakażone lentiwirusem przy użyciu pożywki z odczynnikami do infekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Wymieszać 250 μl zawiesiny jednokomórkowej z organoidu i 250 μl cząstek wirusa w probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Mieszaninę należy rozlać na płytki i odwirowywać przez 1 godzinę w temperaturze 500 x g i temperaturze 32 °C. Inkubować przez 4-5 godzin w temperaturze 37 °C.
    3. Zbierz komórki i nasiona w macierzy zewnątrzkomórkowej z pożywką hodowlaną. Zmień pożywkę na stan selekcji dwa dni po transfekcji. Oceń skuteczność tworzenia organoidów po 10 dniach.
  4. Inżynieria genetyczna według CRISPR/Cas9
    UWAGA: Wideo z tego występu udostępniamy w materiałach dodatkowych. Pojedyncze komórki z organoidów zostały zakażone lentiwirusem lub transfekowane plazmidami przenoszącymi sgRNA i Cas9.
    1. Trawić pojedyncze komórki z hodowanych organoidów hepatocytów i pasaż zgodnie z powyższą metodą.
    2. Zakażone pojedyncze komórki sgRNA za pomocą pożywki Opti-MEM i odczynników infekcyjnych zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Wymieszaj 250 μl zawiesiny jednokomórkowej i 250 μl cząstek wirusa w probówce o pojemności 1,5 ml.
    4. Odwirować mieszaninę o objętości 500 μl przez 1 godzinę w temperaturze 500 x g i temperaturze 32 °C, a następnie inkubować przez 4-5 godzin w temperaturze 37 °C.
    5. Zebrać zawiesinę komórkową i nasiona w macierzy zewnątrzkomórkowej. Oceń skuteczność tworzenia organoidów po 10 dniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Organoidy hepatocytów od samicy myszy Alb-Cre; Rosa26-GFP (8 tygodni) obserwowano pięć dni po wysiewaniu (Rysunek 1A). Organoidy proliferują, wykazując dodatnie barwienie na Ki67 (Rysunek 1B). Ekspresję reprezentatywnych genów w organoidach hepatocytów, zakłóconą poprzez transfekcję siRNA lub infekcję lentiwirusem, badano za pomocą qRT-PCR i western blot. Wyniki przedstawiono na Rysunku 2A i 2B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdolność do hodowli dojrzałych hepatocytów przez długi czas ma fundamentalne znaczenie w badaniach podstawowych nauk o wątrobie, toksykologii leków i hepatotropowych zakażeń mikrobiologicznych gospodarza, takich jak malaria i wirusy zapalenia wątroby. Z dobrze zdefiniowaną niszą, protokół tutaj ustanawia system hodowli hepatocytów. Protokół ten napędza dojrzałe hepatocyty do ekspansji w hodowli 3D z niejednorodnością, która podsumowuje interakcję komórka-komórka, większość funkcji hepatocytów i modyfikacje genetyczne, um...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają żadnych konfliktów.

Podziękowania

Dziękujemy profesorowi Hansowi Cleversowi za uprzejme dostarczenie linii komórkowych do produkcji rekombinowanej R-spondyny1. Prace te były wspierane przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2019YFA0111400), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31970779) dla H.H. oraz Funduszy dla Młodzieży Interdyscyplinarnej i Innowacyjnej Grupy Badawczej Uniwersytetu Shandong (2020QNQT003) dla H.H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor perfuzyjny
3,50 g/L
GlukozaSangon BitechA100188-05009,00 g/L
KClSangon BitechA100395-05004,00 g/L
Na2HPO4· 12H2OSangon BitechA501727-05001,51 g/L
NaClSangon BitechA501218-000180,0 g/L
NaH2PO4· 2H2OSangon BitechA610404-05000,78 g/L
NaHCO3Sangon BitechA500873-05003,50 g/L
Fenol RedSangon BitechA100882-00250,06 g/L
Bufor trawienny
CaCl2SangonBitechA501330-00050,50 M
Kolagenaza IVSigmaC16390,10 mg / ml
HEPESSangon BitechC621110-001023,80 g / L
KClSangon BitechA100395-05004,00 g / L
Na2HPO4· 12H2OSangon BitechA501727-05001,51 g/L
NaClSangon BitechA501218-000180,0 g/L
NaH2PO4· 2H2OSangon BitechA610404-05000,78 g/L
NaHCO3Sangon BitechA500873-05003,50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal bydlęca surowicaGibco10091148przechowywana w temperaturze 4 & st.; C
DPBSGibcoC14190500BT0przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
GlutaMAXGibco35050-061100 X
HEPESGibco15630-080100 X
Penicylina/streptomycynaSangon Bitech  A600135-0025100 X
Culture Medium
A83-01Tocris2939Stężenie wyjściowe 500 &mikro; M, końcowe
stężenie 2 i mikro; M
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
B-27 suplement 50x, bez witaminy AGibco1704-04450 X
Chir 99021Tocris4423Stężenie zapasu 30 mM, końcowe
stężenie 3 &mikro; M
DMEM/F12Gibco11330032przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
Gastrin ITocris3006Stężenie zapasu 100 mM, stężenie końcowe
10 nM
GlutaMAXGibco35050-061100 X
HEPESGibco15630-080100 X
Matrigel martixBD356231przechowywany w temperaturze -20 ° C
N-acetylocysteinaSigma AldrichA9165Stężenie magazynowe 500 mM, stężenie końcowe
1 mM
NiktynamidSigma AldrichN0636Stężenie zapasowe 1 M, stężenie końcowe 3 mM
Penicylina/streptomycynaSangon Bitech  A600135-0025100 X
Rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-15Stężenie zapasowe 100 &mikro; g / ml, stężenie końcowe 50 ng / ml
Rekombinowany ludzki FGF10Peprotech100-26Stężenie zapasowe 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml
Rekombinowany ludzki HGFPeprotech100-39Stężenie zapasowe 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 25 ng/ml
Rekombinowany ludzki TGF-&alfa;Peprotech100-16AStężenie magazynowe 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml
Rekombinowany ludzki TNF-αOrigeneTP750007-1000Koncentracja zapasów 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml
Inhibitor kinazy Rho Y-27632Abmole BioscienceY-27632 dichlorowodorekStężenie podstawowe 10 mM, stężenie końcowe 10 &mikro;
kondycjonowana M Rspondin-1Stabilna linia komórkowa wytworzona w laboratorium Hu. Stężenie końcowe 15%.
Inne
0,22 &mikro; m filtrMilliporeSCGPT01RE
16 # rurka silikonowaLangerPump
24 dobrze, zawieszenieGreiner bio-oneGN662102-100EA
37 ° C Kąpiel
70 &mikro; m filtrBD352350
AccutasestemcellAT-104przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Anti-CTNNB1BD610154Mysz
Anti-GAPDHCST5174SKrólik
Anti-HDAC7Abcamab50212Mysz
Anti-KI67Abcamab15580Królik
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoESCOCCL-170B-8
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253przechowywany przy 4 & stopniach;
C Wirówka 5430eppendorf542700097
inkubator CO2ESCOAC2-4S1
DMSOSangon Bitech  A100231przechowywane w RT
EVOS FL Color Imaging SystemsInvitrogenAME4300
Hdac3 siRNAGuangzhou RiboBio Co., Ltd.siG2003180909192555przechowywany w temperaturze -20 ° C
Hdac7 lentiwirusShanghaiGenePharmaCo., LtdLV2020-2364przechowywany w temperaturze -80 stopni; C
Hitrans G AShanghai Genechem Co., Ltd.REVG004Zwiększona skuteczność infekcji wirusowych
Oprogramowanie Image Pro PlusMedia Cybernetics, Bethesda, MD, USAwersja 6.0
Odczynnik do transfekcji Lipofectamin RNAiMAXInvitrogen13778150Zwiększona skuteczność infekcji wirusowej
Barwnik z żywych komórekLunaF23001przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Wolnoobrotowa wirówka biurkowacence TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b UrządzenieLonza
Opti-MEMGibco31985070przechowywane w temperaturze 4 & C
Pipeta PasteuraSangon BitechF621006-0001
Pompa perystaltycznaLangerPumpBT100-2J
Membrana PVDFMiliporeIPVH00010Aktywuj metanolem
PX458Addgene48138przechowywany w temperaturze -80 ° C
Wirówka z chłodzeniemThermo Scientific HeraeusLabofuge 400
RSL3MCEHY-100218AStężenie zapasów 10 mM, stężenie końcowe 4 i mikro; M
Trypsin/EDTAGibico25200072przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
Wee1 siRNAGuangzhou RiboBio Co., Ltd.siG2003180909205971przechowywany w temperaturze -20 & Z
EGTA Sangon Bitech A600077-0100 Pożywka wodna

Bibliografia

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
  2. Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  5. Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
  8. Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
  9. Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  10. Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
  11. Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
  12. Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  13. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  14. Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
  15. Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
  16. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  17. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Hepatocyty mysiehodowla organoidówperfuzja wątrobytrawienie kolagenazązawiesina pojedynczych komórekinfekcja lentiwirusemtransfekcja siRNAinżynieria CRISPR-Cas9
Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.