Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Summary

Pokazujemy, jak używać nowatorskiego instrumentu do analizy śledzenia nanocząstek, aby oszacować rozkład wielkości i całkowite stężenie cząstek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołokomórkowej i ludzkiego osocza.

Abstract

Fizjologiczne i patofizjologiczne role pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) stają się coraz bardziej rozpoznawalne, co sprawia, że pole EV jest szybko rozwijającym się obszarem badań. Istnieje wiele różnych metod izolacji pojazdów elektrycznych, z których każda ma odrębne zalety i wady, które wpływają na wydajność i czystość pojazdów elektrycznych. W związku z tym scharakteryzowanie przygotowania EV wyizolowanego z danego źródła za pomocą wybranej metody jest ważne dla interpretacji dalszych wyników i porównania wyników między laboratoriami. Istnieją różne metody określania wielkości i ilości EV, które mogą być zmieniane w zależności od stanu chorobowego lub w odpowiedzi na warunki zewnętrzne. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest jedną z najważniejszych technologii stosowanych do wysokoprzepustowej analizy poszczególnych pojazdów elektrycznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół kwantyfikacji i określania wielkości EV wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołogonadalnej i ludzkiego osocza przy użyciu przełomowej technologii NTA, stanowiącej duży postęp w tej dziedzinie. Wyniki pokazują, że metoda ta może dostarczyć powtarzalnych i ważnych danych dotyczących całkowitego stężenia cząstek i rozkładu wielkości dla pojazdów elektrycznych wyizolowanych z różnych źródeł przy użyciu różnych metod, co zostało potwierdzone za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Dostosowanie tego instrumentu do NTA zaspokoi potrzebę standaryzacji metod NTA w celu zwiększenia rygoru i odtwarzalności w badaniach nad pojazdami elektrycznymi.

Introduction

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to małe (0,03-2 μm) pęcherzyki błonowe wydzielane przez prawie wszystkie typy komórek¹. Często określa się je mianem "egzosomów", "mikropęcherzyków" lub "ciał apoptotycznych" w zależności od ich mechanizmu uwalniania i rozmiaru². Chociaż początkowo sądzono, że EV są po prostu sposobem na wyeliminowanie odpadów z komórki w celu utrzymania homeostazy³, teraz wiemy, że mogą one również uczestniczyć w komunikacji międzykomórkowej poprzez transfer materiału molekularnego - w tym DNA, RNA (mRNA, mikroRNA), lipidów i białek4^,5 - i że są ważnymi regulatorami normalnej fizjologii, jak również procesów patologicznych^1,5,6,7,8.

Istnieje wiele różnych metod izolowania i ilościowego oznaczania EVs, które zostały opisane gdzie indziej^9,10,11,12. Zastosowany protokół izolacji, a także źródło pojazdów elektrycznych mogą mieć duży wpływ na wydajność i czystość pojazdów elektrycznych. Nawet wirowanie różnicowe, od dawna uważane za "złoty standard" w izolacji egzosomów, może podlegać znacznej zmienności, co z kolei wpływa na uzyskaną populację EV i dalsze analizy¹³. W związku z tym różne metodologie izolacji i kwantyfikacji EV utrudniają porównywanie, odtwarzanie i interpretację wyników eksperymentów opisanych w literaturze¹⁴. Ponadto uwalnianie EV może być regulowane przez warunki komórkowe lub różne czynniki zewnętrzne. Sugeruje się, że EV odgrywają rolę w utrzymaniu homeostazy komórkowej poprzez ochronę komórek przed stresem wewnątrzkomórkowym¹⁵, ponieważ kilka badań wykazało, że stres komórkowy stymuluje wydzielanie EV. Na przykład po ekspozycji komórek na niedotlenienie, stres retikulum endoplazmatycznego, stres oksydacyjny, stres mechaniczny, ekstrakt dymu papierosowego i zanieczyszczenie powietrza cząstkami stałymi^{16,17,18,19,20,21,22}. Wykazano również, że uwalnianie EV jest modyfikowane in vivo; myszy poddane diecie wysokotłuszczowej lub poszczeniu przez szesnaście godzin uwalniały więcej adipocytów EVs²³. Aby zbadać, czy określone leczenie lub stan zmienia uwalnianie EV, należy dokładnie określić liczbę EV. Ocena rozkładu wielkości EV może również wskazywać na dominujące subkomórkowe pochodzenie EV (np. fuzja późnych endosomów/ciał wielopęcherzykowych z błoną plazmatyczną vs. pączkowanie błony plazmatycznej)²⁴. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na solidne metody dokładnego pomiaru całkowitego stężenia i rozkładu wielkości badanego preparatu EV.

Szybką i bardzo czułą metodą wizualizacji i charakterystyki EV w roztworze jest analiza śledzenia nanocząstek (NTA). Szczegółowe wyjaśnienie zasad stosowania tej metody oraz porównanie z alternatywnymi metodami oceny wielkości i stężenia EV zostało opisane wcześniej^25,26,27,28. Krótko mówiąc, podczas pomiaru NTA, EV są wizualizowane przez światło rozproszone, gdy są naświetlane wiązką laserową. Rozproszone światło jest skupiane przez mikroskop na kamerze, która rejestruje ruch cząstek. Oprogramowanie NTA śledzi losowy ruch termiczny każdej cząstki, znany jako ruch Browna, w celu określenia współczynnika dyfuzji, który jest używany do obliczania wielkości każdej cząstki za pomocą równania Stokesa-Einsteina. NTA został po raz pierwszy zastosowany do pomiaru EV w próbce biologicznej w 2011 roku²⁵. Do niedawna istniały tylko dwie główne firmy oferujące komercyjne instrumenty NTA²⁹, aż do wprowadzenia ViewSizer 3000 (zwanego dalej instrumentem do śledzenia cząstek), który wykorzystuje kombinację nowatorskich rozwiązań sprzętowych i programowych w celu pokonania znacznych ograniczeń innych technik NTA.

Przyrząd do śledzenia cząstek charakteryzuje nanocząstki w próbkach cieczy, analizując ich ruchy Browna i charakteryzuje większe mikronowe cząstki, analizując osiadanie grawitacyjne. Unikalny układ optyczny tego instrumentu, który obejmuje oświetlenie wielospektralne za pomocą trzech laserowych źródeł światła (przy 450 nm, 520 nm i 635 nm), pozwala naukowcom analizować jednocześnie szeroki zakres rozmiarów cząstek (np. egzosomy, mikropęcherzyki). Schemat konfiguracji przyrządu jest pokazany w Rysunek 1.

Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić pomiary rozkładu wielkości i stężenia cząstek izolowanych mysich i ludzkich EV za pomocą nowatorskiego instrumentu NTA.

Rysunek 1: System optyczny przyrządu do śledzenia cząstek. Instrument NTA oświetla cząstki za pomocą trzech laserów o następujących długościach fal: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Zapis wideo światła rozproszonego od pojedynczych cząstek jest wykrywany i śledzony przez cyfrową kamerę wideo ustawioną pod kątem 90° od kuwety. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

Wszystkie prace z tymi próbkami zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt oraz Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej. Schematyczny przegląd metody NTA jest przedstawiony w Rysunek 2.

Rysunek 2: Przegląd metody NTA z wykorzystaniem narzędzia do śledzenia cząstek. Próbka jest przygotowywana i wkładana do urządzenia. Oprogramowanie NTA jest otwierane, parametry nagrywania są dostosowywane, a próbka jest zogniskowana. Następnie dane są rejestrowane, przetwarzane i wyświetlane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

UWAGA: EV perygonad tkanki tłuszczowej myszy zostały wyizolowane zgodnie z wcześniejszym opisem²³. EVs w osoczu wyizolowano z 1 ml ludzkiego osocza przy użyciu następującego protokołu:

1. Zebrać osocze i odwirować przy 3,000 x g przez 15 minut, aby usunąć resztki komórkowe. Przenieść supernatant do nowej probówki.
   UWAGA: Jeśli dodatkowe zanieczyszczenia pozostają wykrywalne, odwirować supernatant przez dodatkowe 10 minut przy 12 000 x g i przenieść supernatant do nowej probówki.
2. Dodać 67 μl odczynnika do izolacji egzosomów na 250 μl osocza. Dobrze wymieszaj, odwracając lub przesuwając rurkę.
3. Inkubować na lodzie w pozycji pionowej przez 30 minut.
4. Odwirować mieszaninę odczynnika do izolacji egzosomów i osocza przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Wirowanie można przeprowadzić w temperaturze pokojowej lub 4 °C z podobnymi wynikami, ale preferowane jest 4 °C. Po odwirowaniu EV mogą pojawić się jako beżowe lub białe granulki na dnie probówki.
5. Ostrożnie odessać supernatant. Odkręć resztki roztworu izolacyjnego egzosomów i usuń wszelkie ślady płynu przez aspirację, bardzo uważając, aby nie naruszyć wytrąconych EV w granulkach.
6. Zawiesić osad w 200 μl buforu B (dostarczonego przez producenta). Zmierzyć i zapisać stężenie białka w próbce (dla kroku 2.8) za pomocą spektrofotometru, fluorometru, testu Bradforda lub innej preferowanej metody.

2. Oczyszczanie izolowanych EV

1. Dodaj 200 μl buforu A (dostarczonego przez producenta) do ponownie zawieszonych pojazdów elektrycznych.
2. Wyjmij kolumnę oczyszczającą (w zestawie), poluzuj nakrętkę i oderwij dolne zamknięcie. Umieść kolumnę w probówce zbiorczej.
   UWAGA: Zachowaj dolne zamknięcie dla kroków 2.7-2.9.
3. Wirować przy 1 000 x g przez 30 s w celu usunięcia bufora magazynującego.
4. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
5. Aby umyć kolumnę, zdejmij nakrętkę i nałóż 500 μl buforu B na wierzch żywicy i odwiruj przy 1 000 x g przez 30 s. Odrzuć przepływ. Zachowaj nasadkę na kroki 2.7-2.9.
6. Powtórz kroki 2.4-2.5 jeszcze raz, aby umyć kolumnę.
7. Zatkaj dolną część kolumny dolnym zamknięciem (od kroku 2.2). Nałóż 100 μl buforu B na wierzch żywicy, aby przygotować ją do obciążenia próbki.
8. Dodać całą zawartość z kroku 1.6 (lub do objętości odpowiadającej 4 mg białka ogółem) do żywicy. Umieść nakrętkę na górze kolumny.
9. Mieszaj w temperaturze pokojowej na obracającym się wytrząsarce nie dłużej niż 5 minut.

3. Elucja próbki

1. Poluzuj nakrętkę i zdejmij dolne zamknięcie, a następnie natychmiast przenieś do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
   UWAGA: Próbka zacznie się wymutowywać, gdy tylko dolne zamknięcie zostanie usunięte. Upewnij się, że probówki mikrowirówkowe o pojemności 2 ml są gotowe do przyjęcia eluatu, aby zminimalizować straty próbki.
2. Wirować przy 1,000 x g przez 30 s, aby uzyskać oczyszczone EV. Odrzuć kolumnę.

4. Przygotowanie próbki do analizy śledzenia nanocząstek

1. Użyj niestrzępiącego się materiału, takiego jak ściereczka z mikrofibry, aby przykryć miejsce pracy i zapobiec przedostawaniu się włókien do kuwet.
2. Zakładając rękawiczki, umieść kuwetę na magnetycznym przyrządzie do kuwety, a następnie umieść mieszadło w kuwecie. Zawsze obchodź się z kuwetami w rękawiczkach, aby zapobiec pojawianiu się odcisków palców i smug na powierzchni kuwety.
3. Użyj narzędzia do hakowania, aby umieścić wkładkę w kuwecie, jak pokazano na rysunku Rysunek 3. Ważne jest, aby zwrócić uwagę na orientację wkładki na później (krok 5.4).

Rysunek 3: Właściwa orientacja wkładki w kuwecie kwarcowej. "Wcięcie" wkładki powinno być widoczne z przodu kuwety. Należy go włożyć do instrumentu skierowanego w stronę aparatu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Za pomocą pipety powoli dodawać 400-500 μl rozcieńczalnika lub rozcieńczonej próbki w temperaturze pokojowej do kuwety przez otwór we wkładce. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.
   1. Najpierw przygotuj kuwetę wypełnioną wybranym rozcieńczalnikiem (ślepą próbą), aby zmierzyć stężenie cząstek rozcieńczalnika. Należy to zrobić przed pomiarem próbki, aby można było skorygować stężenie tła w próbce.
      UWAGA: Dobra ślepa próba (w tym przypadku sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS]) będzie miała stężenie <9 x 10⁶ (w zależności od rozcieńczalnika) i wyświetli 1-10 cząstek na ekran w podglądzie na żywo (Rysunek 4). Zaleca się, aby rzeczywiste stężenie cząstek w próbce było co najmniej 3 razy większe niż stężenie tła.
   2. Opcjonalnie, przed zarejestrowaniem próbki, przed pomiarem należy napełnić kuwetę 400-500 μl rozcieńczalnika lub rozcieńczonej próbki. W tym celu należy załadować 400-500 μl rozcieńczonej próbki do kuwety, wyrzucić roztwór, a następnie dodać 400-500 μl więcej próbki do pomiaru. Może to pomóc w wypłukaniu pozostałości w kuwecie.

Rysunek 4: Reprezentatywny widok na żywo rozcieńczalnika w odpowiednim zakresie stężeń ślepej próby. Rozcieńczone EV przygotowuje się w przefiltrowanym (preferowane 0,02 μm lub 3 kDa) PBS. Dobry ślepy strzał wyświetli ~1-10 cząstek na ekran w podglądzie na żywo, dając stężenie w zakresie 10^{5-10 6}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Zakręć kuwetę i sprawdź, czy nie ma bąbelków. W razie potrzeby wytrząśnij bąbelki. Użyj niestrzępiącej się szmatki, aby wytrzeć zewnętrzne powierzchnie kuwety.

5. Procedura uruchamiania przyrządu do śledzenia cząstek

1. Włącz komputer, stację roboczą i instrument, odczekaj kilka minut przed uruchomieniem pierwszej próbki i uruchom program, klikając ikonę oprogramowania. Po wyświetleniu monitu kliknij NTA na ekranie, aby przeprowadzić analizę śledzenia nanocząstek. Rozpocznij w zakładce Nagrywanie i klikaj różne zakładki oprogramowania (Nagrywanie, Proces, Wykres), aby przełączać się między nimi w całym protokole. Najpierw zarejestruj próbkę (rozcieńczalnik lub przygotowanie EV), następnie przetwórz nagrania, a na końcu nanieś wyniki.
2. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wypełnić wszystkie niezbędne informacje o próbce. Sprawdź, czy wszystkie niezbędne pola są wypełnione i dokładne, tj. Nazwa próbki, Opis, Przygotowanie próbki, Współczynnik rozcieńczenia [1000], Temperatura docelowa (ustawiona na 22 °C) i Rozcieńczalnik: Wybierz rozcieńczalnik z menu rozwijanego i użyj PBS jako rozcieńczalnika dla EV. Wybranie PBS z menu rozwijanego spowoduje automatyczne wypełnienie zasolenia do 9%. Informacje te są niezbędne do określenia lepkości dynamicznej cieczy.
   UWAGA: Zrównoważenie temperatury wewnątrz kuwety może potrwać do 3 minut, nawet jeśli sonda pokazuje już żądaną temperaturę (tj. zielona kropka staje się stabilna). Odczyty próbek mogą się znacznie różnić, jeśli temperatura docelowa nie jest ustawiona, ponieważ różnice temperatur próbki mogą znacznie zmienić ruchy Browna cząstek.
3. Otwórz pokrywę instrumentu i zdejmij osłonę ochronną w miejscu, w którym zostanie umieszczona kuweta.
   UWAGA: Przyrząd do śledzenia cząstek jest certyfikowany jako produkt laserowy klasy 1 (21 CFR Ch. I część 1040), zawierające lasery, które mogą być niebezpieczne i mogą spowodować poważne obrażenia, takie jak oparzenia i/lub trwałe uszkodzenie wzroku. Aby zapobiec wypadkowi lub obrażeniom, nie zdejmuj pokrywy instrumentu, odkręcając z boku. Należy pamiętać, że podczas pracy wiązki laserowe są całkowicie zamknięte, nie stanowiąc zagrożenia dla użytkowników. Ponadto w uchwycie próbki urządzenia wbudowana jest magnetyczna blokada bezpieczeństwa, która zapobiega działaniu laserów po zdjęciu nasadki uchwytu na próbkę.
4. Umieść kuwetę (od kroku 4.3) wewnątrz instrumentu we właściwej orientacji (patrz Rysunek 5). Załóż nasadkę na kuwetę i zamknij pokrywę instrumentu. Zawsze używaj przyrządu z nasadką założoną na uchwyt próbki. Nie wyłączaj ani nie próbuj obejść funkcji blokady bezpieczeństwa.

Rysunek 5: Właściwa orientacja kuwety w przyrządzie do śledzenia cząstek. Czoło kuwety (z widocznym "wycięciem" wkładki) powinno być skierowane w stronę aparatu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Włącz kamerę, klikając strzałkę nad opcją Przesyłanie strumieniowe.
6. Kliknij strzałkę w strzałkę w strzałkę, aby rozwinąć ustawienia nagrywania. Ustaw Wzmocnienie i Moc lasera na wartości odpowiednie dla danego zastosowania. Patrz tabela 1 (i rysunek uzupełniający 1), aby zapoznać się z parametrami stosowanymi dla NTA małych (100 nm) EVs.
   UWAGA: Te zaawansowane ustawienia, do których można uzyskać dostęp po kliknięciu strzałki w strzałkę w strzałkę, mogą być chronione hasłem. Do rejestrowania i przetwarzania rozcieńczalnika (próby ślepej) należy stosować te same ustawienia, które są stosowane do kolejnych próbek.
7. Dostosuj ostrość, aż cząsteczki zostaną odpowiednio zogniskowane. Ogniskowanie powinno być wykonywane na stosunkowo małych cząstkach (Rysunek 6). W przypadku kwantyfikacji małych EV (zgodnych z egzosomami) zalecane są następujące ustawienia nagrywania: Liczba klatek na sekundę: 30 kl./s, Ekspozycja: 15 ms, Czas mieszania: 5 s, Czas oczekiwania: 3 s, Moc lasera - niebieski: 210 mW, zielony: 12 mW, czerwony: 8 mW, klatki na wideo: 300 klatek i Wzmocnienie: 30 dB.
   UWAGA: Użytkownik może zwiększyć powiększenie do 1x i/lub zwiększyć wzmocnienie, aby pomóc w ustawieniu ostrości. Pamiętaj, aby ponownie ustawić te parametry na zalecane wartości przed nagraniem filmów.

Rysunek 6: Reprezentatywne widoki strumienia na żywo pokazujące skupienie cząstek. (A) Przykładowy widok strumienia na żywo cząstek, które nie są ostre. Cząsteczki mają halo przypominające poświatę lub wydają się rozmyte. Dostosuj ostrość. (B) Przykładowy widok na żywo cząstek w odpowiedniej ostrości. Najmniejsze cząsteczki są ostre. Rozpocznij nagrywanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Przeprowadzić wizualną kontrolę jakości, aby upewnić się, że próbka jest odpowiednio rozcieńczona. Jeśli próbka jest zbyt zagęszczona, wyjmij kuwetę z przyrządu i rozcieńcz próbkę sekwencyjnie. Powtarzać, aż próbka zostanie odpowiednio rozcieńczona, zanim przejdziesz do kroku 6.
   UWAGA: Nie należy nadmiernie rozcieńczać próbki! Zawsze rozcieńczaj sekwencyjnie. Idealny blank wyświetli tylko kilka cząstek na ekranie (1-4), jak pokazano na Rysunek 4. Jeśli chodzi o próbki EV, odpowiednio rozcieńczona próbka będzie miała około 20-100 cząstek widocznych na ekranie, bez świecących lub mętnych obrazów w tle (patrz Rysunek 7 jako przykład). Powinno to skutkować optymalnym stężeniem cząstek w zakresie od 5 x 10⁶ do 2 x 10⁸ cząstek na ml (bez uwzględnienia współczynnika rozcieńczenia).

Rysunek 7: Reprezentatywne widoki strumienia na żywo przedstawiające różne rozcieńczenia cząstek. (A) Przykładowy widok na żywo próbki, która jest zbyt skoncentrowana. Rejestrowanie próbki, która jest zbyt skoncentrowana, da niedokładne wyniki. (B) Przykładowy widok na żywo prawidłowo rozcieńczonej próbki. Na ekranie widocznych jest 60-100 cząstek, a zapis daje surowe stężenie 5 x 10^6-2 x 10⁸ cząstek/ml. (C) Przykładowy widok strumienia na żywo próbki, która jest zbyt rozcieńczona. Jeśli próbka jest tak rozcieńczona, nie będzie śledzona wystarczająca liczba cząstek, co zmniejszy wielkość próbki, a zatem wyniki będą statystycznie nieważne. W takim przypadku zaleca się zwiększenie liczby nagrywanych filmów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Akwizycja danych wideo

1. (Opcjonalnie) Ustaw powiększenie na 0,5x, aby zaoszczędzić przepustowość i zapobiec utracie klatek.
2. Rozpocznij nagrywanie filmów, klikając przycisk Nagraj (zalecane parametry nagrywania znajdują się w Tabeli 1).
   UWAGA: Domyślnie przyrząd będzie mieszał próbkę przez 5 sekund, odczeka 3 sekundy, a następnie będzie nagrywał przez 10 sekund przed powtórzeniem tego procesu. Typowy czas pomiaru dla 50 filmów to ~15 min na nagranie i ~13 min na przetworzenie.
3. Nie dotykaj instrumentu podczas nagrywania filmów. Upewnij się, że powierzchnia stołu laboratoryjnego nie wibruje.
   UWAGA: Zaleca się, aby przyrząd był ustawiony na platformie lub stole antywibracyjnym w celu zmniejszenia wszelkich zakłóceń wibracyjnych spowodowanych przez pobliski sprzęt, które będą zakłócać określanie ruchu nanocząstek. Unikaj używania wirówek, mieszalników wirowych lub innych urządzeń generujących potencjalne wibracje na tym samym stole, co przyrząd do śledzenia cząstek. Drgania są łatwo widoczne na ekranie jako wydłużenie zwykle okrągłych cząstek. W przypadku narażenia na silne wibracje przyrząd może wymagać ponownego wyrównania elementów optycznych. Przyrząd nie został zaprojektowany do serwisowania lub kalibracji przez klienta; Skontaktuj się z producentem w celu konserwacji, serwisu i kalibracji.
4. Zwróć uwagę na każdy nagrany film, który ma bardzo duże cząstki widoczne jako duże, nieregularne białe plamy. Usuń te filmy z przetwarzania w kroku 7.3.

7. Przetwarzanie pozyskanych danych

1. Gdy pojawi się monit informujący, że filmy zostały nagrane, kliknij OK, aby zakończyć nagrywanie. Następnie wybierz kartę Proces.
   UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym miejscu. Przetwarzanie pozyskanych danych można później wznowić, przechodząc bezpośrednio do zakładki Proces po otwarciu oprogramowania przyrządu do śledzenia cząstek i określeniu katalogu, w którym zapisywane są nagrane filmy.
2. Podczas analizowania EV zaznacz pole Wyłącz zastąpienie automatycznego wykrywania i ustaw Średnicę elementu na 30. Kliknij przycisk Proces. (Patrz Tabela 2 dla ustawień przetwarzania i Rysunek uzupełniający 2 dla wyświetlania przetwarzania). Zostanie wyświetlony wykres dystrybucji na żywo, dzięki czemu użytkownik będzie mógł zobaczyć przetwarzanie w czasie rzeczywistym.
   1. W przypadku egzosomów proces odbywa się z progiem wykrywania ustawionym na domyślną próbkę polidyspersyjną. Przetwarzaj dane z ręcznym progiem wykrywania ustawionym na 0,8 zamiast standardowego progu 0,99 tylko w przypadku roztworów o bardzo dużych różnicach w rozmiarach cząstek.
3. Jeśli w którymkolwiek filmie widoczne były zauważalnie bardzo duże cząstki (patrz krok 6.4), przejdź do katalogu nagranych filmów i usuń problematyczne wideo. Po edycji listy plików wideo zmień liczbę nagranych filmów w innych dziennikach prowadzonych przez użytkownika.
4. Po zakończeniu przetwarzania kliknij przycisk OK. Następnie wybierz kartę Działka. W przypadku pojazdów elektrycznych wyświetl wykres główny jako LogBinSilica.
   UWAGA: Tutaj, w zakładce Wykres, użytkownik może dostosować inne funkcje wykresu, takie jak zdefiniowanie zakresu osi x (średnica cząstek, nm), aby ustawić obszar całkowania dla utworzonej figury.

8. Wyświetlanie i interpretowanie wyników

1. Aby utworzyć raport w formacie PDF, kliknij przycisk Raport. Pomiar został zakończony, a wyniki można wyświetlić.
   UWAGA: Należy pamiętać, aby najpierw zarejestrować i przetworzyć ślepą próbę, aby można było skorygować stężenie tła w kolejnych próbkach. W przypadku pominięcia tego etapu, ślepa próba może zostać zarejestrowana po pobraniu próbek i ręcznej korekcie stężenia cząstek w próbce.
2. Zapoznaj się z raportem PDF, który wyświetla średnią, medianę i wielkość modu, a także stężenie dostosowane do współczynnika rozcieńczenia i skorygowane przez odjęcie stężenia cząstek rozcieńczalnika. Pokazana jest również szerokość rozkładu (odchylenie standardowe).
   UWAGA: Istnieje bardzo niewiele aplikacji, w których pojedyncza wartość jest odpowiednia i reprezentatywna. W związku z tym zaleca się opisanie całego rozkładu wielkości i podanie szerokości rozkładu dla każdej analizowanej próbki (jak pokazano na przykład w tabeli 3).
3. Zapisz następujące ustawienia przyrządu używane do generowania danych, które powinny być podane podczas raportowania wyników: Rozcieńczalnik, moc lasera każdego lasera [mW], Ekspozycja [ms], Wzmocnienie [dB], Liczba klatek na sekundę [fps], Liczba nagrań wideo, Ustawienia przetwarzania (np. LogBinSilica), Zakres integracji [min nm, max nm] (zalecane ustawienie min na 50 nm) i Liczba śledzonych cząstek (pożądane do analizy co najmniej ~150 cząstek na wideo; minimum 3,750 całkowitych ścieżek na próbkę Zaleca się unikanie sztucznych skoków w rozkładzie wielkości cząstek i generowanie danych istotnych statystycznie).

9. Czyszczenie kuwet

1. Wyczyść kuwety ręcznie między próbkami. Najpierw opróżnij kuwetę.
   UWAGA: Próbkę można odzyskać z kuwety i zachować lub wyrzucić.
2. Gdy kuweta jest puweta, wyczyść ją, płucząc ją 10-15 razy wodą dejonizowaną (DI). Następnie spłucz 3 razy etanolem (70-100%). Robiąc to, upewnij się, że całkowicie napełniłeś kuwetę rozpuszczalnikiem.
3. Osusz zewnętrzną część kuwety niestrzępiącą się ściereczką z mikrofibry. Unikaj smug na powierzchniach. Wysuszyć wnętrze kuwety na powietrzu lub wysuszyć za pomocą miotełki do kurzu pneumatycznego.
   UWAGA: Do wycierania powierzchni optycznych kuwety należy używać wyłącznie papieru do czyszczenia soczewek lub niestrzępiącej się ściereczki z mikrofibry, ponieważ większość produktów papierowych zawiera małe włókna drzewne, które mogą porysować lub uszkodzić powierzchnię kuwety.
4. Przygotuj dwie szklane fiolki scyntylacyjne: jedną wypełnioną 70-100% etanolem, a drugą wodą demineralizowaną. Najpierw wypłukać wkładki i mieszadła w etanolu (a następnie w wodzie detonowanej), umieszczając wkładkę/mieszadło w odpowiedniej fiolce scyntylacyjnej i energicznie potrząsając fiolką. Osusz wkładki i mieszadła za pomocą niestrzępiących się ściereczek lub miotełki do kurzu na sprężone powietrze.
   UWAGA: Kuwetę i wkładkę można również czyścić za pomocą sonikującej kąpieli wodnej. Aby to zrobić, najpierw upewnij się, że jednostka sonikująca zawiera wystarczającą ilość wody (co najmniej 5 cm głębokości). Następnie umieść kuwetę i włóż ją do szklanej zlewki (50 ml lub większej), napełnij zlewkę alkoholem do tego samego poziomu co łaźnia wodna, umieść zlewkę w wodzie i włącz zasilanie. Sonikuj maksymalnie przez 5 minut na raz, pozwalając maszynie odpocząć >5 minuty między każdą 5-minutową serią, jeśli wymagane są dłuższe czasy.
5. Po zakończeniu natychmiast odłóż wszystkie oczyszczone i wysuszone elementy do przechowywania.

Results

Przed tą demonstracją, najpierw przetestowano kalibrację przyrządu, aby zapewnić poprawność uzyskanych danych, mierząc rozkład rozmiarów wzorców koralików z polistyrenu. Przetestowaliśmy rozkład wielkości kulek 100 nm i 400 nm przy użyciu domyślnych parametrów zapisu i ustawień przetwarzania zalecanych w tym protokole (Rysunek 8).

Dla standardu kulek polistyrenowych 100 nm zmierzono stężenie 4,205 x 10⁷ cząstek/ml. Średnia wielkość (odchylenie standardowe...

Discussion

W tym miejscu demonstrujemy protokół dla NTA EV do jednoczesnego pomiaru rozkładu wielkości szerokiego zakresu rozmiarów cząstek i pomiaru całkowitego stężenia EV w próbce polidyspersyjnej. W tym badaniu jako źródło EV wykorzystano mysią perygonadalną tkankę tłuszczową i ludzkie osocze. Jednak EV wyizolowane z innych tkanek lub płynów biologicznych, takich jak surowica, mocz, ślina, mleko matki, płyn owodniowy i supernatant do hodowli komórkowych, mogą być również stosowane do NTA. Pomiary wzorców kulek polistyrenowych u...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X dPBS	VWR	02-0119-1000	Do rozcieńczania próbek
100 nm standard kulki	Thermo Scientific	3100A	Do testowania kalibracji ViewSizer 3000
standard koralików 400 nm	Thermo Scientific	3400A	Do testowania kalibracji ViewSizer 3000
Filtr odśrodkowy	Amicon	UFC901024	Do filtrowania rozcieńczalnika PBS
Probówki zbiorcze, 2 ml	Qiagen	19201	Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza
Miotełka do kurzu sprężonego powietrza	DustOff	DPSJB-12	Do czyszczenia kuwet
Wkładka kuwetowa	HORIBA		Scientific-Dostarczana przy zakupie przyrządu do kuwety ViewSizer 3000
	HORIBA	Scientific-Do	wyrównywania mieszadła magnetycznego podczas umieszczania wkładek wewnątrz kuwety; Dostarczane przy zakupie ViewSizer 3000
Woda dejonizowana	VWR	02-0201-1000	Do czyszczenia kuwet
Komputer stacjonarny z monitorem, klawiaturą, myszą i wszystkimi niezbędnymi	Dostarczany przez firmę Dell		przy zakupie ViewSizer 3000
Etanol (70-100%)	Millipore Sigma-Do		czyszczenia kuwet
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza
Szklane fiolki scyntylacyjne z pokrywkami	Thermo Scientific	B780020	Do czyszczenia kuwet
"Haczyk" Narzędzie	Excelta-Dostarczane		przy zakupie ViewSizer 3000
Niestrzępiąca się ściereczka z mikrofibry	Texwipe	TX629	Do czyszczenia kuwet i pokrywania powierzchni roboczej
Probówki do mikrowirówek, 2 ml	Eppendorf	22363344	Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza
Mieszadło	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Kuweta kwarcowa z nasadką	Agilent Technologies	AG1000-0544	Początkowo dostarczana z zakupem ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Naukowy		instrument do śledzenia nanocząstek