Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62447

⸱

28 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Health Sciences, Columbia University Mailman School of Public Health, 2Department of Medicine, Naomi Berrie Diabetes Center, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazujemy, jak używać nowatorskiego instrumentu do analizy śledzenia nanocząstek, aby oszacować rozkład wielkości i całkowite stężenie cząstek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołokomórkowej i ludzkiego osocza.

Streszczenie

Fizjologiczne i patofizjologiczne role pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) stają się coraz bardziej rozpoznawalne, co sprawia, że pole EV jest szybko rozwijającym się obszarem badań. Istnieje wiele różnych metod izolacji pojazdów elektrycznych, z których każda ma odrębne zalety i wady, które wpływają na wydajność i czystość pojazdów elektrycznych. W związku z tym scharakteryzowanie przygotowania EV wyizolowanego z danego źródła za pomocą wybranej metody jest ważne dla interpretacji dalszych wyników i porównania wyników między laboratoriami. Istnieją różne metody określania wielkości i ilości EV, które mogą być zmieniane w zależności od stanu chorobowego lub w odpowiedzi na warunki zewnętrzne. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest jedną z najważniejszych technologii stosowanych do wysokoprzepustowej analizy poszczególnych pojazdów elektrycznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół kwantyfikacji i określania wielkości EV wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołogonadalnej i ludzkiego osocza przy użyciu przełomowej technologii NTA, stanowiącej duży postęp w tej dziedzinie. Wyniki pokazują, że metoda ta może dostarczyć powtarzalnych i ważnych danych dotyczących całkowitego stężenia cząstek i rozkładu wielkości dla pojazdów elektrycznych wyizolowanych z różnych źródeł przy użyciu różnych metod, co zostało potwierdzone za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Dostosowanie tego instrumentu do NTA zaspokoi potrzebę standaryzacji metod NTA w celu zwiększenia rygoru i odtwarzalności w badaniach nad pojazdami elektrycznymi.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to małe (0,03-2 µm) pęcherzyki otoczone błoną, wydzielane przez niemal wszystkie typy komórek1. W zależności od mechanizmu uwalniania i wielkości są one często nazywane „egzosomami”, „mikropęcherzykami” lub „ciałkami apoptotycznymi”2. Choć początkowo sądzono, że EVs stanowią jedynie sposób usuwania odpadów z komórki w celu utrzymania homeostazy3, obecnie wiadomo, że mogą one również uczestniczyć w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport materiału molekularnego – w tym DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipidów i białek4,5 – oraz że są ważnymi regulatorami prawidłowej fizjologii, jak również procesów patologicznych1,5,6,7,8.

Istnieje wiele różnych metod izolacji i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), które opisano w innych opracowaniach9,10,11,12. Zastosowany protokół izolacji, jak również źródło EV, mogą mieć ogromny wpływ na wydajność i czystość otrzymanych pęcherzyków. Nawet wirowanie różnicowe, długo uważane za „złoty standard” izolacji egzosomów, może charakteryzować się znaczną zmiennością, co wpływa na uzyskaną populację EV i analizy następcze13. W związku z tym różnorodność metodologii izolacji i oznaczania EV utrudnia porównywanie, reprodukowanie i interpretowanie wyników eksperymentów opisanych w literaturze14. Co więcej, wydzielanie EV może być regulowane przez warunki komórkowe lub różne czynniki zewnętrzne. Sugerowano, że EV odgrywają rolę w utrzymaniu homeostazy komórkowej, chroniąc komórki przed stresem wewnątrzkomórkowym15, ponieważ kilka badań wykazało, że stres komórkowy stymuluje sekrecję EV. Na przykład zwiększone wydzielanie EV raportowano po poddaniu komórek działaniu hipoksji, stresu retikulum endoplazmatycznego, stresu oksydacyjnego, stresu mechanicznego, ekstraktu z dymu papierosowego oraz zanieczyszczeń powietrza pyłami zawieszonymi16,17,18,19,20,21,22. Wykazano również, że wydzielanie EV ulega modyfikacjom in vivo; myszy poddane diecie wysokotłuszczowej lub szesnastogodzinnemu postowi wydzielały więcej EV pochodzących z adipocytów23. Aby zbadać, czy konkretna terapia lub warunki zmieniają wydzielanie EV, należy dokładnie określić liczbę pęcherzyków. Ocena rozkładu wielkości EV może również wskazywać na dominujące podkomórkowe pochodzenie EV (np. fuzja późnych endosomów/ciał wielopęcherzykowych z błoną plazmatyczną w przeciwieństwie do pączkowania błony plazmatycznej)24. Istnieje zatem potrzeba zastosowania wiarygodnych metod do dokładnego pomiaru całkowitego stężenia i rozkładu wielkości badanego preparatu EV.

Szybką i wysoce czułą metodą wizualizacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) w roztworze jest analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA). Szczegółowe wyjaśnienie zasad tej metody oraz porównanie z alternatywnymi metodami oceny wielkości i stężenia EVs zostało opisane wcześniej25,26,27,28. W skrócie, podczas pomiaru NTA, EVs są wizualizowane dzięki światłu rozproszonemu w momencie ich naświetlania wiązką lasera. Rozproszone światło jest skupiane przez mikroskop na kamerze, która rejestruje ruch cząsteczek. Oprogramowanie NTA śledzi przypadkowy ruch termiczny każdej cząsteczki, znany jako ruchy Browna, aby wyznaczyć współczynnik dyfuzji, który służy do obliczenia wielkości każdej cząsteczki przy użyciu równania Stokesa-Einsteina. NTA zostało po raz pierwszy zastosowane do pomiaru EVs w próbce biologicznej w 2011 roku25. Do niedawna istniały tylko dwie główne firmy oferujące komercyjne instrumenty NTA29, aż do wprowadzenia urządzenia ViewSizer 3000 (w dalszej części tekstu zwanego instrumentem do śledzenia cząsteczek), które wykorzystuje kombinację nowatorskich rozwiązań sprzętowych i programistycznych w celu przełamania istotnych ograniczeń innych technik NTA.

Przyrząd do śledzenia cząstek charakteryzuje nanocząstki w próbkach ciekłych poprzez analizę ich ruchu Browna oraz charakteryzuje większe cząstki o rozmiarach mikronowych poprzez analizę sedymentacji grawitacyjnej. Unikalny system optyczny tego przyrządu, obejmujący iluminację wielospektralną z trzema laserowymi źródłami światła (o długościach fal 450 nm, 520 nm i 635 nm), pozwala badaczom na jednoczesną analizę szerokiego zakresu rozmiarów cząstek (np. egzosomów, mikropęcherzyków). Schemat budowy przyrządu przedstawiono na Rysunku 1.

W niniejszej pracy demonstrujemy, jak przeprowadzić pomiary rozkładu wielkości i stężenia wyizolowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) myszy i ludzi przy użyciu nowoczesnego urządzenia do analizy śledzenia nanocząstek (NTA).

Schemat układu optycznego dla mikroskopii wielokolorowej z długościami fal 450-635 nm do przechwytywania obrazu.
Rysunek 1: System optyczny urządzenia do śledzenia cząstek. Urządzenie NTA oświetla cząstki za pomocą trzech laserów o następujących długościach fal: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Nagrywanie wideo rozproszonego światła z poszczególnych cząstek jest wykrywane i śledzone przez cyfrową kamerę wideo zorientowaną pod kątem 90° względem kuwety. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace z tymi próbkami były prowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) oraz Instytucjonalnej Rady Recenzenckiej (IRB). Schematyczny przegląd metody NTA przedstawiono na Ryc. 2.

Schemat analizy śledzenia nanocząstek; obejmuje konfigurację, pomiar, przetwarzanie danych i wyniki.
Rysunek 2: Przegląd metody NTA z wykorzystaniem urządzenia do śledzenia cząstek. Próbka zostaje przygotowana i wprowadzona do urządzenia. Otwierane jest oprogramowanie NTA, dostrajane są parametry rejestracji, a próbka zostaje ustawiona w ostrzeności. Następnie dane są rejestrowane, przetwarzane i wyświetlane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

1. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

UWAGA: Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) z tkanki tłuszczowej okołojajnikowej myszy zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opisaną procedurą23. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z osocza wyizolowano z 1 mL osocza ludzkiego, stosując następujący protokół:

  1. zebrać osocze i wirować przy 3,000 x g przez 15 min w celu usunięcia szczątków komórkowych. Przenieść nadsącz do nowej probówki.
    UWAGA: Jeśli nadal wykrywalne są dodatkowe szczątki, wirować nadsącz przez dodatkowe 10 min przy 12,000 x g i przenieść nadsącz do nowej probówki.
  2. Dodać 67 µL odczynnika do izolacji egzosomów na każde 250 µL osocza. Dobrze wymieszać poprzez odwracanie lub energiczne potrząsanie probówką.
  3. Inkubować w pozycji pionowej na lodzie przez 30 min.
  4. Wirować mieszaninę odczynnika do izolacji egzosomów i osocza przy 3,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Wirowanie można przeprowadzić w temperaturze pokojowej lub 4 °C z uzyskaniem podobnych wyników, jednak zaleca się 4 °C. Po wirowaniu pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) mogą pojawić się w postaci beżowego lub białego osadu na dnie probówki.
  5. Ostrożnie odessać nadsącz. Wirować krótko w celu ściągnięcia pozostałości roztworu do izolacji egzosomów i usunąć wszystkie ślady cieczy poprzez aspirację, dbając o to, aby nie zakłócić osadu z wytrąconymi EVs.
  6. Resuspendować osad w 200 µL Buforu B (dostarczonego przez producenta). Zmierzyć i zapisać stężenie białka w próbce (do kroku 2.8) przy użyciu spektrofotometru, fluorometru, testu Bradforda lub innej preferowanej metody.

2. Oczyszczanie wyizolowanych EV

  1. Do resuspensowanych EV należy dodać 200 µL Buforu A (dostarczonego przez producenta).
  2. Należy wyjąć kolumnę do oczyszczania (dostarczoną), poluzować nakrętkę i odłamać dolną zaślepkę. Kolumnę należy umieścić w probówce zbiorczej.
    UWAGA: Dolną zaślepkę należy zachować do kroków 2.7-2.9.
  3. Próbkę należy wirować przy 1 000 x g przez 30 s w celu usunięcia buforu do przechowywania.
  4. Należy odrzucić przelew i ponownie umieścić kolumnę w probówce zbiorczej.
  5. Aby wypłukać kolumnę, należy zdjąć nakrętkę, nanieść 500 µL Buforu B na żywicę i wirować przy 1 000 x g przez 30 s. Przelew należy odrzucić. Nakrętkę należy zachować do kroków 2.7-2.9.
  6. Kroki 2.4-2.5 należy powtórzyć jeszcze raz, aby wypłukać kolumnę.
  7. Dno kolumny należy zamknąć dolną zaślepką (z kroku 2.2). Na żywicę należy nanieść 100 µL Buforu B, aby przygotować ją do naniesienia próbki.
  8. Na żywicę należy nanieść całą zawartość z kroku 1.6 (lub objętość odpowiadającą 4 mg całkowitego białka). Na górze kolumny należy zakręcić nakrętkę.
  9. Mieszanie należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej na wytrząsarku rotacyjnej przez nie więcej niż 5 min.

3. Elucja próbki

  1. Poluźnij zakrętkę i zdejmij dolne zamknięcie, a następnie natychmiast przenieś zawartość do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL.
    UWAGA: Elucja próbki rozpocznie się natychmiast po zdjęciu dolnego zamknięcia. Przed rozpoczęciem upewnij się, że probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL są przygotowane do odebrania eluatu, aby zminimalizować stratę próbki.
  2. Wiruj przy 1,000 x g przez 30 s w celu otrzymania oczyszczonych EV. Kolumnę należy wyrzucić.

4. Przygotowanie próbek do analizy śledzenia nanocząstek

  1. Użyj materiału niepozostawiającego włókien, takiego jak ściereczka z mikrofibry, aby zakryć przestrzeń roboczą i zapobiec przedostawaniu się włókien do kuwet.
  2. W rękawiczkach umieść kuwetę w magnetycznym uchwycie do kuwet, a następnie włóż mieszadło magnetyczne do kuwety. Zawsze manipuluj kuwetami w rękawiczkach, aby zapobiec powstawaniu odcisków palców i smug na powierzchni kuwety.
  3. Za pomocą narzędzia z haczykiem umieść wkładkę w kuwecie, zgodnie z rysunkiem w Rysunku 3. Ważne jest zapamiętanie orientacji wkładki do późniejszego etapu (Krok 5.4).

Eksperyment fotoniki laserowej z układem kuwet; widoki A-B pokazujące ustawienie lasera do rejestracji obrazu kamerą.
Rysunek 3: Prawidłowa orientacja wkładki w kuwecie kwarcowej. „Wycięcie” wkładki powinno być widoczne z przodu kuwety. Wkładka powinna zostać umieszczona w urządzeniu przodem do kamery. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Za pomocą pipety powoli dodaj 400-500 µL rozcieńczalnika lub rozcieńczonej próbki w temperaturze pokojowej do kuwety przez otwór w wkładce. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać zawartość. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    1. Najpierw przygotuj kuwetę z wybranym rozcieńczalnikiem (próba ślepa), aby zmierzyć stężenie cząstek w rozcieńczalniku. Należy to zrobić przed pomiarem próbki, aby możliwe było skorygowanie tła stężenia próbki.
      UWAGA: Dobra próba ślepa (w tym przypadku roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanowo [PBS]) będzie miała stężenie <9 x 106 (w zależności od rozcieńczalnika) i wykaże od 1 do 10 cząstek na ekranie w widoku na żywo (Rysunek 4). Zaleca się, aby rzeczywiste stężenie cząstek w próbce było co najmniej 3-krotnie wyższe od stężenia tła.
    2. Opcjonalnie, przed rejestracją próbki, można nasycić kuwetę 400-500 µL rozcieńczalnika lub rozcieńczonej próbki przed pomiarem. Aby to zrobić, wprowadź 400-500 µL rozcieńczonej próbki do kuwety, wylej roztwór, a następnie dodaj kolejne 400-500 µL próbki do pomiaru. Może to pomóc w wypłukaniu zanieczyszczeń z wnętrza kuwety.

Obraz wzbudzenia optycznego, obraz pola gwiazd, badanie astronomiczne, obserwacja ciał niebieskich, analiza fotoniczna.
Rycina 4: Reprezentatywny widok strumienia na żywo rozcieńczalnika w odpowiednim zakresie stężeń dla próbki blankowej. Rozcieńczyć preparaty EV w filtrowanym (preferowane 0,02 µm lub 3 kDa) PBS. Dobra próbka blankowa powinna wykazywać ~1-10 cząsteczek na ekran w widoku na żywo, co daje stężenie w zakresie 105-106. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zakręć kuwetę i sprawdź, czy nie ma w niej pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby usuń pęcherzyki poprzez delikatne opukiwanie. Przetrzyj zewnętrzne ścianki kuwety ściereczką niepozostawiającą włókien.

5. Procedura uruchamiania urządzenia do śledzenia cząstek

  1. Włącz stację roboczą komputera oraz urządzenie, odczekaj kilka minut przed analizą pierwszej próbki i uruchom program, klikając ikonę oprogramowania. Gdy pojawi się prośba, kliknij NTA na ekranie, aby przeprowadzić analizę śledzenia nanocząsteczek (Nanoparticle Tracking Analysis). Zacznij od karty Recording i klikaj poszczególne karty oprogramowania (Record, Process, Plot), aby przełączać się między nimi w trakcie procedury. Najpierw zarejestruj próbkę (roztwór lub preparat EV), następnie przetwórz nagrania, a na koniec wykreśl wyniki.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie, aby uzupełnić wszystkie niezbędne informacje o próbce. Sprawdź, czy wszystkie wymagane pola zostały wypełnione prawidłowo, m.in.: nazwa próbki (Sample name), opis (Description), przygotowanie próbki (Sample preparation), czynnik rozcieńczenia [1000] (Dilution factor), temperatura docelowa (ustawiona na 22 °C) oraz rozcieńczalnik (Diluent): wybierz rozcieńczalnik z menu rozwijanego, używając PBS jako rozcieńczalnika dla EV. Wybranie PBS z menu rozwijanego automatycznie ustawi zasolenie na 9%. Informacje te są niezbędne do określenia lepkości dynamicznej cieczy.
    UWAGA: Osiągnięcie równowagi termicznej wewnątrz kuwety może potrwać do 3 min, nawet jeśli sonda wskazuje już pożądaną temperaturę (np. zielona kropka staje się stabilna). Odczyty próbek mogą znacznie się różnić, jeśli temperatura docelowa nie zostanie ustawiona, ponieważ różnice w temperaturze próbki mogą znacząco zmienić ruchy Browna cząsteczek.
  3. Otwórz pokrywę urządzenia i zdejmij ochronną nasadkę z miejsca, w którym zostanie umieszczona kuweta.
    OSTRZEŻENIE: Urządzenie do śledzenia cząsteczek jest certyfikowane jako produkt laserowy klasy 1 (21 CFR Ch. I part 1040), zawierający lasery, które mogą być niebezpieczne i mogą spowodować poważne obrażenia, takie jak oparzenia i/lub trwałe uszkodzenie wzroku. Aby zapobiec wypadkom lub obrażeniom, nie zdejmuj obudowy urządzenia poprzez odkręcanie śrub z boku. Należy pamiętać, że podczas pracy wiązki laserowe są całkowicie zamknięte, nie stanowiąc zagrożenia dla użytkowników. Ponadto w uchwycie na próbki urządzenia wbudowano magnetyczną blokadę bezpieczeństwa, która zapobiega działaniu laserów po zdjęciu nasadki uchwytu na próbki.
  4. Umieść kuwetę (z kroku 4.3) wewnątrz urządzenia w odpowiedniej orientacji (patrz Rysunek 5). Nałóż nasadkę na kuwetę i zamknij pokrywę urządzenia. Zawsze obsługuj urządzenie z założoną nasadką na uchwycie na próbki. Nie wyłączaj ani nie próbuj obejść funkcji blokady bezpieczeństwa.

Układ optyczny z laserem do spektroskopii absorpcji przejściowej na opisowym schemacie eksperymentalnym.
Rysunek 5: Prawidłowa orientacja kuwety w urządzeniu do śledzenia cząstek. Ścianka kuwety (z widocznym „wcieniem” wkładki) powinna być skierowana w stronę kamery. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Włącz kamerę, klikając strzałkę nad opcją Streaming.
  2. Kliknij strzałkę rozwijania, aby wyświetlić ustawienia Record. Ustaw wzmocnienie (Gain) oraz moc lasera na wartości odpowiednie dla danej aplikacji. Parametry zastosowane do NTA małych (100 nm) EV znajdują się w Tabeli 1 (oraz na Ryc. uzupełniającej 1).
    UWAGA: Te zaawansowane ustawienia, dostępne po kliknięciu strzałki rozwijania, mogą być chronione hasłem. Do nagrywania i przetwarzania rozcieńczalnika (próby ślepej) należy użyć tych samych ustawień, co w przypadku kolejnych próbek.
  3. Reguluj ostrość do momentu, aż cząstki będą odpowiednio wyostrzone. Ustawianie ostrości powinno odbywać się na stosunkowo małych cząstkach (Rycyna 6). Do kwantyfikacji małych EV (zgodnych z egzosomami) zaleca się następujące ustawienia nagrywania: częstotliwość klatek (Frame rate): 30 fps, czas ekspozycji (Exposure): 15 ms, czas mieszania (Stir time): 5 s, czas oczekiwania (Wait time): 3 s, moc lasera – Blue: 210 mW, Green: 12 mW, Red: 8 mW, liczba klatek w filmie (Frames per video): 300 frames oraz wzmocnienie (Gain): 30 dB.
    UWAGA: Użytkownik może zwiększyć powiększenie (Zoom) do 1x i/lub zwiększyć wzmocnienie (Gain), aby ułatwić ustawianie ostrości. Pamiętaj o przywróceniu tych parametrów do zalecanych wartości przed nagrywaniem filmów.

Obraz z mikroskopu porównujący różne etapy powstawania gwiazd; wzorce galaktyczne, obserwacje nieba.
Rycina 6: Reprezentatywne widoki z transmisji na żywo obrazujące ogniskowanie cząstek. (A) Przykład widoku z transmisji na żywo z cząstkami znajdującymi się poza ogniskową. Cząstki mają poświatę w postaci halo lub wydają się rozmyte. Należy dostosować ostrość. (B) Przykład widoku z transmisji na żywo z cząstkami znajdującymi się w odpowiedniej ogniskowej. Najmniejsze cząstki są ostre. Można rozpocząć rejestrację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przeprowadź wizualną kontrolę jakości, aby upewnić się, że próbka została odpowiednio rozcieńczona. Jeśli próbka jest zbyt stężona, wyjmij kuwetę z urządzenia i rozcieńczaj próbkę sekwencyjnie. Powtarzaj tę czynność do momentu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia przed przejściem do Kroku 6.
    ​UWAGA: Nie należy nadmiernie rozcieńczać próbki! Rozcieńczanie zawsze wykonuj sekwencyjnie. Idealna próbka blankowa powinna wykazywać na ekranie jedynie kilka cząstek (1-4), jak pokazano na Rysunku 4. W przypadku próbek EV prawidłowo rozcieńczona próbka powinna wykazywać na ekranie około 20-100 widocznych cząstek, bez efektu poświaty lub zmętnienia w tle (przykład na Rysunku 7). Powinno to skutkować optymalnym stężeniem cząstek w zakresie od 5 x 106 do 2 x 108 cząstek na mL (bez uwzględnienia współczynnika rozcieńczenia).

Mikroskopia fluorescencyjna pokazująca zmienną gęstość komórek; schematy A, B, C; analiza intensywności sygnału.
Rysunek 7: Reprezentatywne obrazy z transmisji na żywo przedstawiające różne rozcieńczenia cząstek. (A) Przykład obrazu z transmisji na żywo próbki o zbyt dużym stężeniu. Rejestracja próbki o zbyt dużym stężeniu doprowadzi do uzyskania niedokładnych wyników. (B) Przykład obrazu z transmisji na żywo próbki o prawidłowym rozcieńczeniu. Na ekranie widocznych jest 60-100 cząstek, a rejestracja pozwala uzyskać surowe stężenie rzędu 5 x 106- 2 x 108 particles/mL. (C) Przykład obrazu z transmisji na żywo próbki zbyt rozcieńczonej. W przypadku tak dużego rozcieńczenia próbki liczba śledzonych cząstek będzie niewystarczająca, co zmniejszy wielkość próby i w konsekwencji sprawi, że wyniki będą statystycznie nieprawidłowe. W takim przypadku zaleca się zwiększenie liczby zarejestrowanych filmów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Pozyskiwanie danych wideo

  1. (Opcjonalnie) Ustaw powiększenie na 0,5x, aby oszczędzać przepustowość i zapobiec utracie klatek.
  2. Rozpocznij nagrywanie filmów, klikając Record (zalecane parametry nagrywania znajdują się w Tabeli 1).
    UWAGA: Domyślnie urządzenie będzie mieszać próbkę przez 5 s, czekać 3 s, a następnie nagrywać przez 10 s przed powtórzeniem tego procesu. Typowy czas pomiaru dla 50 filmów wynosi ok. 15 min na nagrywanie i ok. 13 min na przetwarzanie.
  3. Nie dotykaj urządzenia podczas nagrywania filmów. Upewnij się, że powierzchnia stołu laboratoryjnego nie drga.
    UWAGA: Zaleca się ustawienie urządzenia na platformie lub stole antywibracyjnym, aby zminimalizować zakłócenia w postaci wibracji z pobliskiego sprzętu, które mogłyby zakłócić wyznaczanie ruchu nanocząstek. Unikaj używania wirówek, mieszalników vortex lub innych urządzeń generujących wibracje na tym samym stole, na którym znajduje się instrument do śledzenia cząstek. Wibracje są łatwo widoczne na ekranie jako wydłużenie zazwyczaj okrągłych cząstek. W przypadku narażenia na silne wibracje urządzenie może wymagać ponownego ustawienia elementów optycznych. Urządzenie nie zostało zaprojektowane do serwisowania ani kalibracji przez użytkownika; w celu konserwacji, serwisu i kalibracji należy skontaktować się z producentem.
  4. Zanotuj wszystkie nagrane filmy, na których widoczne są bardzo duże cząstki w postaci dużych, nieregularnych białych plam. Usuń te filmy z procesu przetwarzania w kroku 7.3.

7. Przetwarzanie pozyskanych danych

  1. Gdy pojawi się komunikat informujący o zarejestrowaniu filmów, kliknij OK, aby zakończyć nagrywanie. Następnie wybierz kartę Process.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać. Przetwarzanie pozyskanych danych można wznowić później, przechodząc bezpośrednio do karty Process po uruchomieniu oprogramowania instrumentu do śledzenia cząsteczek i wskazaniu katalogu, w którym zapisano nagrane filmy.
  2. Podczas analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) zaznacz pole Disable auto detection override i ustaw średnicę cechy (Feature Diameter) na 30. Kliknij Process. (Ustawienia przetwarzania znajdują się w Tabele 2, a widok przetwarzania na Ryc. uzupełniającej 2). Wyświetlony zostanie dynamiczny wykres rozkładu, umożliwiający użytkownikowi obserwację przetwarzania w czasie rzeczywistym.
    1. W przypadku egzosomów przetwarzanie należy przeprowadzić z progiem detekcji (Detection Threshold) ustawionym na domyślną wartość Polydisperse Sample. Dane należy przetwarzać z parametrem Detection Threshold Manual ustawionym na 0,8 zamiast standardowego progu 0,99 wyłącznie w przypadku roztworów z bardzo dużymi różnicami w rozmiarach cząsteczek.
  3. Jeśli na którychkolwiek filmach widoczne były wyraźnie bardzo duże cząsteczki (patrz Krok 6.4), przejdź do katalogu z nagranymi filmami i usuń problematyczny plik. Po edycji listy plików wideo zmień liczbę nagranych filmów w pozostałych prowadzonych przez użytkownika dziennikach.
  4. Po zakończeniu przetwarzania kliknij OK. Następnie wybierz kartę Plot. Dla EV wyświetl główny wykres (Main chart) jako LogBinSilica.
    ​UWAGA: W karcie Plot użytkownik może dostosować inne funkcje wykresu, takie jak zdefiniowanie zakresu osi x (średnica cząsteczek, nm), aby ustawić obszar całkowania dla generowanej ryciny.

8. Prezentacja i interpretacja wyników

  1. Aby utworzyć raport w formacie PDF, należy kliknąć przycisk Report. Pomiar został zakończony i można teraz przejrzeć wyniki.
    UWAGA: Należy pamiętać o wcześniejszym zarejestrowaniu i przetworzeniu próbki ślepej, aby możliwe było skorygowanie stężenia tła w kolejnych próbkach. Jeśli ten krok zostanie pominięty, próbkę ślepą można zarejestrować po próbkach, a stężenie cząstek w próbkach skorygować ręcznie.
  2. Należy przeanalizować raport PDF, który wyświetla średnią, medianę i modę rozmiaru, a także stężenie skorygowane o czynnik rozcieńczenia i pomniejszone o stężenie cząstek w rozcieńczalniku. Wyświetlana jest również szerokość rozkładu (odchylenie standardowe).
    ​UWAGA: Istnieje bardzo niewiele zastosowań, w których pojedyncza wartość jest odpowiednia i reprezentatywna. Dlatego zaleca się opisanie całego rozkładu wielkości i podanie szerokości rozkładu dla każdej analizowanej próbki (na przykład tak, jak pokazano w Table 3).
  3. Należy zapisać następujące ustawienia instrumentu wykorzystane do wygenerowania danych, które powinny zostać podane podczas raportowania wyników: rozcieńczalnik, moc każdego lasera [mW], czas ekspozycji [ms], wzmocnienie [dB], liczba klatek na sekundę [fps], liczba klatek w filmie, liczba zarejestrowanych filmów, ustawienie przetwarzania (np. LogBinSilica), zakres całkowania [min nm, max nm] (zaleca się ustawienie wartości min na 50 nm) oraz liczba śledzonych cząstek (zaleca się analizę co najmniej ~150 cząstek na film; zaleca się minimum 3 750 wszystkich śladów na próbkę, aby uniknąć sztucznych pików w rozkładzie wielkości cząstek i wygenerować statystycznie istotne dane).

9. Czyszczenie kuwet

  1. Ręcznie czyść kuwety pomiędzy próbkami. Najpierw opróżnij kuwetę.
    UWAGA: Próbka może zostać odzyskana z kuwety i zachowana lub usunięta.
  2. Gdy kuweta będzie pusta, wyczyść ją, płucząc 10-15 razy wodą dejonizowaną (DI). Następnie wypłucz 3 razy etanolem (70-100%). Podczas tej czynności upewnij się, że kuweta jest całkowicie wypełniona rozpuszczalnikiem.
  3. Osusz zewnętrzną stronę kuwety szmatką z mikrofibry niepozostawiającą włókien. Unikaj smug na powierzchniach. Wnętrze kuwety wysusz na powietrzu lub za pomocą sprężonego powietrza w puszce.
    UWAGA: Do przecierania powierzchni optycznych kuwety należy używać wyłącznie papieru do czyszczenia soczewek lub szmatki z mikrofibry niepozostawiającej włókien, ponieważ większość produktów papierowych zawiera drobne włókna drzewne, które mogą porysować lub uszkodzić powierzchnię kuwety.
  4. Przygotuj dwie szklane fiolki scyntylacyjne: jedną wypełnioną etanolem 70-100%, a drugą wodą DI. Wypłucz wkładki i mieszadła magnetyczne najpierw w etanolu (następnie w wodzie DI), umieszczając wkładkę/mieszadło w odpowiedniej fiolce scyntylacyjnej i energicznie nią potrząsając. Osusz wkładki i mieszadła za pomocą szmatek niepozostawiających włókien lub sprężonego powietrza w puszce.
    UWAGA: Kuwetę i wkładkę można również czyścić w kąpieli ultradźwiękowej. Aby to zrobić, upewnij się najpierw, że urządzenie ultradźwiękowe zawiera odpowiednią ilość wody (głębokość co najmniej 5 cm). Następnie umieść kuwetę i wkładkę w szklanym zlewce (50 mL lub większej), napełnij zlewkę alkoholem do tego samego poziomu co kąpiel wodna, umieść zlewkę w wodzie i włącz urządzenie. Prowadź sonikację przez maksymalnie 5 min jednorazowo, pozwalając maszynie odpocząć przez >5 min między każdym 5-minutowym cyklem, jeśli wymagany jest dłuższy czas czyszczenia.
  5. Po zakończeniu niezwłocznie schowaj wszystkie wyczyszczone i osuszone elementy do miejsca przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed niniejszą demonstracją przeprowadzono test kalibracji instrumentu w celu zapewnienia poprawności uzyskanych danych, mierząc rozkład wielkości standardowych kulek polistyrenowych. Przebadano rozkład wielkości kulek o średnicy 100 nm i 400 nm, korzystając z domyślnych parametrów rejestracji oraz ustawień przetwarzania zalecanych w niniejszym protokole (Rysunek 8).

Dla standardu kulek polistyrenowych 100 nm zmierzono stężenie 4,205 x 107 cząsteczek/m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy prezentujemy protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w celu jednoczesnego pomiaru rozkładu wielkości szerokiego zakresu rozmiarów cząstek oraz pomiaru całkowitego stężenia EV w próbce polidyspersyjnej. W badaniu tym jako źródło EV wykorzystano tkankę tłuszczową okołojadrową myszy oraz ludzką osocze. Niemniej jednak do analizy NTA można wykorzystać również EV wyizolowane z innych tkanek lub płynów biologicznych, takich jak surowica, mocz, ślina, mleko kobiece, p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy zadeklarowali, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Dziękujemy Jeffreyowi Bodycombowi, Ph.D. z HORIBA Instruments Incorporated za pomoc w kalibracji instrumentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X dPBSVWR02-0119-1000Do rozcieńczania próbek
100 nm standard kulkiThermo Scientific3100ADo testowania kalibracji ViewSizer 3000
standard koralików 400 nmThermo Scientific3400ADo testowania kalibracji ViewSizer 3000
Filtr odśrodkowyAmiconUFC901024Do filtrowania rozcieńczalnika PBS
Probówki zbiorcze, 2 mlQiagen19201Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza
Miotełka do kurzu sprężonego powietrzaDustOffDPSJB-12Do czyszczenia kuwet
Wkładka kuwetowaHORIBAScientific-Dostarczana przy zakupie przyrządu do kuwety ViewSizer 3000
HORIBAScientific-Dowyrównywania mieszadła magnetycznego podczas umieszczania wkładek wewnątrz kuwety; Dostarczane przy zakupie ViewSizer 3000
Woda dejonizowanaVWR02-0201-1000Do czyszczenia kuwet
Komputer stacjonarny z monitorem, klawiaturą, myszą i wszystkimi niezbędnymiDostarczany przez firmę Dellprzy zakupie ViewSizer 3000
Etanol (70-100%)Millipore Sigma-Doczyszczenia kuwet
ExoQuick ULTRASystem BiosciencesEQULTRA-20A-1Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza
Szklane fiolki scyntylacyjne z pokrywkamiThermo ScientificB780020Do czyszczenia kuwet
"Haczyk" NarzędzieExcelta-Dostarczaneprzy zakupie ViewSizer 3000
Niestrzępiąca się ściereczka z mikrofibryTexwipeTX629Do czyszczenia kuwet i pokrywania powierzchni roboczej
Probówki do mikrowirówek, 2 mlEppendorf22363344Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza
MieszadłoSp SciencewareF37119-0005
Suprasil Kuweta kwarcowa z nasadkąAgilent TechnologiesAG1000-0544Początkowo dostarczana z zakupem ViewSizer 3000
ViewSizer 3000HORIBA Naukowyinstrument do śledzenia nanocząstek

Bibliografia

  1. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  2. Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
  3. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).
  4. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  5. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  6. Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad. Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
  8. Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
  9. Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2, 1800021(2018).
  10. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
  11. Erdbrügger, U., Lannigan, J. Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).
  12. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).
  13. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).
  15. Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis. Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).
  16. Kanemoto, S., et al. Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).
  17. Benedikter, B. J., et al. Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants. Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).
  18. Saeed-Zidane, M., et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. PloS One. 12, 0187569(2017).
  19. Wang, K., et al. Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells. ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).
  20. King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 12, 421(2012).
  21. Bonzini, M., et al. Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects. Environment Research. 155, 228-234 (2017).
  22. Neri, T., et al. Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells. Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).
  23. Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363, 989-993 (2019).
  24. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
  25. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).
  26. Saveyn, H., et al. Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation. Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).
  27. Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).
  28. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).
  29. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016(2019).
  30. Varga, Z., et al. Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).
  31. Serrano-Pertierra, E., et al. Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification. Biomolecules. 10, (2020).
  32. Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies. Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).
  33. Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie EVst enie cz stekrozcie czenia seryjnetransmisyjna mikroskopia elektronowadynamiczne rozpraszanie wiat adetekcja impuls w rezystywnychczyszczenie kuwet
Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.