Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Podsumowanie

Metoda hodowli narządów typu Trowella została wykorzystana do rozwikłania skomplikowanych sieci sygnałowych, które regulują rozwój zębów, a ostatnio do badania regulacji związanych z komórkami macierzystymi stale rosnącego siekacza myszy. Fluorescencyjne modele zwierzęce i metody obrazowania na żywo ułatwiają dogłębną analizę komórek macierzystych zębów i ich specyficznego mikrośrodowiska niszowego.

Streszczenie

Rozwój, funkcja i regeneracja organów zależą od komórek macierzystych, które znajdują się w odrębnych przestrzeniach anatomicznych zwanych niszami komórek macierzystych. Stale rosnący siekacz myszy stanowi doskonały model do badania komórek macierzystych specyficznych dla tkanki. Komórki macierzyste siekacza specyficzne dla tkanki nabłonkowej znajdują się na bliższym końcu zęba w niszy zwanej pętlą szyjną. Zapewniają ciągły napływ komórek, aby zrównoważyć ciągłe ścieranie samoostrzącej się końcówki zęba. Przedstawiono szczegółowy protokół izolacji i hodowli bliższego końca siekacza myszy, w którym znajdują się komórki macierzyste i ich nisza. Jest to zmodyfikowany protokół hodowli narządów typu Trowella, który umożliwia hodowlę in vitro fragmentów tkanek (eksplantatów), a także grubych plastrów tkanek na granicy faz ciecz/powietrze na filtrze wspartym na metalowej siatce. Opisany tutaj protokół hodowli narządów umożliwia manipulacje tkankami, które nie są możliwe do wykonania in vivo, a w połączeniu z użyciem reportera fluorescencyjnego stanowi platformę do identyfikacji i śledzenia dyskretnych populacji komórek w żywych tkankach w czasie, w tym w komórkach macierzystych. W tym systemie można testować różne cząsteczki regulatorowe i związki farmakologiczne pod kątem ich wpływu na komórki macierzyste i ich nisze. Ostatecznie dostarcza to cennego narzędzia do badania regulacji i utrzymania komórek macierzystych.

Wprowadzenie

Siekacze myszy rosną nieprzerwanie dzięki zachowaniu przez całe życie komórek macierzystych (SC), które wspierają nieustanną produkcję składników zębów. Należą do nich między innymi nabłonkowe SC, które generują ameloblasty wytwarzające szkliwo, oraz mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które generują odontoblasty wytwarzające zębinę, między innymi¹. Nabłonkowe SC w stale rosnących siekaczach zostały początkowo zidentyfikowane jako komórki zachowujące etykietę^2,3 i od tego czasu wykazano, że wyrażają wiele dobrze znanych genów macierzystych, w tym Sox2⁴. Komórki te mają cechy wspólne z nabłonkowymi SC w innych narządach i znajdują się w niszy SC zwanej pętlą szyjną znajdującej się po wargowej stronie siekacza. Wnęka jest dynamiczną jednostką składającą się z komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej, które kontrolują aktywność SC⁵. Badania nad śledzeniem linii wykazały, że nabłonkowe SC Sox2+ mogą regenerować cały przedział nabłonkowy zęba i że mają kluczowe znaczenie dla tworzenia zębów sukcesyjnych^6,7. MSCs z potencjałem naprawczym lub regeneracyjnym zębiny są w dużej mierze rekrutowane z zewnątrz narządu przez naczynia krwionośne i nerwy^8,9,10,11, zapewniając zatem odpowiedni model do badania rekrutacji, migracji i zakwaterowania populacji MSC.

Badanie SCs in vivo nie zawsze jest wykonalne, ponieważ wiele manipulacji genetycznych i/lub farmakologicznych może wpływać na homeostazę narządów i/lub mieć śmiertelne konsekwencje. W związku z tym hodowla narządów stanowi doskonałe narzędzie do badania regulacji SC i ich nisz in vitro. System hodowli narządów, który wykorzystuje metalową siatkę, został początkowo opracowany przez Trowell¹² do badania rozwoju narządów i został następnie zmodyfikowany przez Saxen¹³ do badania sygnałów indukcyjnych w rozwoju nerek. Od tego czasu ta metoda in vitro, polegająca na hodowli całego narządu lub jego części, jest z powodzeniem stosowana w różnych dziedzinach. W dziedzinie rozwoju zębów metoda ta jest szeroko stosowana do badania interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych, które rządzą rozwojem zębów¹⁴ i tworzeniem zębów sukcesyjnych¹⁵. Prace laboratorium Thesleff wykazały przydatność tego systemu do czasowej analizy wzrostu i morfogenezy zębów, do analizy wpływu różnych cząsteczek i czynników wzrostu na wzrost zębów oraz do poklatkowego obrazowania na żywo rozwoju zębów^16,17. Ostatnio metoda ta została wykorzystana do zbadania regulacji SC siekaczy i ich niszy^18,19, co jest szczegółowo opisane tutaj.

Protokół

Ten protokół obejmuje wykorzystanie zwierząt, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisje Etyczne ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami oraz Obiekt dla Zwierząt na Uniwersytecie w Helsinkach.

1. Przygotowanie naczynia do hodowli organów

1. Wszystkie procedury należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym. Oczyść powierzchnie robocze 70% etanolem i używaj autoklawowanych szklanych narzędzi i roztworów. Sterylizuj nożyczki i inny metalowy sprzęt w sterylizatorze z kulkami szklanymi.
2. Przygotuj filtry normalnie przechowywane w 70% etanolu, myjąc je trzy razy w 1x PBS, aby usunąć etanol (Rysunek 1). Pokrój filtry na prostokątne kawałki (3 x 3-5 x 5 mm).
   UWAGA: Umyte kawałki filtra można przechowywać przez kilka dni w 1x PBS w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować pożywkę hodowlaną (1:1 DMEM:F12 uzupełniony 1% [v/v] 200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy w 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml kwasu askorbinowego i 0,2% [v/v] penicyliny [10 000 j.m./ml] i streptomycyny [10,000 μg/ml]). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Umieść metalowe siatki o średnicy 30 mm (z otworami o średnicy 1-2 mm, które umożliwiają obrazowanie tkanek) na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Dodaj wystarczającą ilość mediów, aby dotrzeć do powierzchni siatki bez wytwarzania pęcherzyków powietrza. Przygotowane naczynie hodowlane należy wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C, aż tkanka zostanie wyizolowana i będzie gotowa do hodowli (w standardowym inkubatorze o zawartości 5%_CO2 i wilgotności 90%-95%).

2. Rozwarstwienie siekacza i izolacja bliższego końca

1. Uśmiercaj zwierzęta zgodnie z zatwierdzonym protokołem opieki nad zwierzętami.
2. Odetnij głowę myszy i przeprowadź sekcję żuchwy. Aby to zrobić, najpierw usuń skórę, aby odsłonić żuchwę i przetnij mięśnie żwaczy, aby oddzielić ją od szczęki i reszty głowy.
3. Po odizolowaniu żuchwy usuń język i jak najwięcej tkanki miękkiej.
4. Zbierz wszystkie żuchwy i trzymaj je na szalce Petriego zawierającej PBS na lodzie, ponieważ zwiększa to żywotność tkanek.
5. Przenieść jedną żuchwę na szklaną szalkę Petriego i użyć jednorazowych igieł podskórnych o sile 20/26 G do wypreparowania siekacza pod mikroskopem stereoskopowym. Podziel żuchwę w linii środkowej, przecinając spojenie. Oczyść tkankę miękką i mięśniową z powierzchni kości, aby uzyskać lepszą wizualizację.
   UWAGA: Szklana szalka Petriego jest niezbędna, ponieważ nie stępi to igieł.
6. Żuchwy uzyskane od zwierząt w wieku poniżej 10 dni są bardziej miękkie i kruche, dlatego należy używać jednorazowych igieł podskórnych 20/26 G, aby otworzyć każdą połowę żuchwy wzdłużnie, aby odsłonić ząb siekacza. W przypadku myszy starszych niż 10 dni użyj pęsety, aby chwycić żuchwę i złamać kość, aby odsłonić ząb.
7. Delikatnie odłącz siekacz od otaczającej kości i odetnij bliższy koniec, w którym znajduje się pętla szyjna.
8. Odetnij bliższy koniec i usuń zmineralizowane szkliwo i macierz zębiny.
9. Zebrane proksymalne końce należy przechowywać w PBS firmy Dulbecco na lodzie, aż będą gotowe do hodowli.

3. Kultura

1. Ostrożnie umieść prostokąt filtra na górze siatki we wstępnie podgrzanym naczyniu hodowlanym.
2. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby prawidłowo zorientować kawałki tkanki.
3. Umieścić w standardowym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i wilgotnością 90%-95%.
4. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień i zastępuj świeżą, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Monitoruj wzrost tkanek i rób codzienne zdjęcia za pomocą kamery dołączonej do mikroskopu stereoskopowego.

4. Dodawanie rozpuszczalnych czynników do kultury

1. Uzupełnij pożywkę hodowlaną o rozpuszczalne czynniki i cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania, aby zbadać ich wpływ na regulację SCs.
   UWAGA: Protokół podawania dowolnej cząsteczki (czynniki wzrostu, cząsteczki sygnałowe, przeciwciała blokujące, związki farmakologiczne, takie jak inhibitory lub aktywatory, wektory itp.) zależy od jej okresu półtrwania i rozpuszczalności. Parametry te określają również odpowiednią kontrolę, która ma być zastosowana.

5. Analizy molekularne i histologiczne

1. Usuń pożywkę hodowlaną.
2. Ostrożnie dodaj lodowaty metanol do tkanek, aby zapobiec oderwaniu się od filtrów.
3. Pozostaw metanol na 5 minut.
4. Przenieść filtry przenoszące eksplantaty tkanek do probówek do pobierania próbek.
5. Utrwalić eksplantaty w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 10-24 godziny w temperaturze 4 °C.
6. Postępuj zgodnie z ustalonymi protokołami przetwarzania histologicznego (parafina, mrożone itp.) lub barwienia immunologicznego.

6. Kultura plastrów tkanek

UWAGA: Istnieje kilka odmian tego protokołu, które są równie skuteczne i są kwestią osobistego wyboru, w zależności od szybkości i umiejętności użytkownika. Odnoszą się one do buforu używanego do zbierania i utrzymywania żywotności tkanek. W tym celu można zastosować bufor Krebsa, PBS uzupełniony 2% glukozą i antybiotykami lub PBS. W przypadku stosowania buforu Krebsa, należy go przygotować 1 dzień wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C.

1. Przed eksperymentem należy przygotować 4%-5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, rozpuszczając 2-2,5 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 ml wrzącej 2% glukozy/PBS, po czym roztwór należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.
2. Ustaw wibratom, przemyj 70% etanolem i napełnij lodowatym 2% glukozą/PBS uzupełnionym antybiotykami (100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny).
3. Wypreparuj proksymalne końce siekacza i zbierz je w lodowatym 2% glukozie/PBS uzupełnionym antybiotykami.
4. Umieść jeden proksymalny koniec siekacza w formie zawierającej 4%-5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw kawałek w pożądanym kierunku i pozostaw na lodzie, aby agaroza stwardniała.
5. Przytnij stwardniały blok agarozy i umieść go w wibratomie. Pokrój grube plastry (150-300 μm).
6. Zbierz plastry na szalce Petriego zawierającej lodowato 2% glukozy/PBS uzupełnionej antybiotykami.
7. Za pomocą szpatułki przenieś grube plastry na prostokąt filtra umieszczony na wstępnie podgrzanej siatce przygotowanej jak w sekcji 1.3.
8. Inkubuj grube plastry w inkubatorze i kontynuuj obrazowanie (Rysunek 2).

Wyniki

Nabłonkowe komórki macierzyste (SC) znajdują się w niszy zwanej pętlą szyjną, która jest zlokalizowana w proksymalnej części siekacza (Rycina 3A). Pętle szyjne są morfologicznie odrębnymi strukturami złożonymi z wewnętrznego i zewnętrznego nabłonka emaliowego, które otaczają siateczkę gwieździstą, stanowiącą rdzeń z luźno rozmieszczonych komórek nabłonkowych (Rycina 3B,C). W każdym siekaczu znajdują się dwie pętle szyjne (Ry...

Dyskusja

Hodowla narządów in vitro jest szeroko stosowana do badania potencjału indukcyjnego i interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych, które rządzą wzrostem i morfogenezą narządów. Laboratorium Thesleff zademonstrowało, w jaki sposób można zaadaptować modyfikację Saxéna hodowli narządów typu Trowella i wykorzystać ją do badania rozwoju zębów¹⁴. Powtarzalne warunki i postęp w dziedzinie reporterów fluorescencyjnych sprawiły, że jest to przydatna metoda monitorowania morfogenezy zębów i odrębnych pop...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plastikowe strzykawki
Jednorazowe igły podskórne o rozmiarze 20/26	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Nożyczki	FST	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS Ameryka Południowa (CE)	LifeTechn.	10270106	podzielić na porcje, przechowywać w temperaturze -20° C
Sterylizator z kulkami szklanymi, Steri 250 Second-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm średnicy	MerckMillipore	VCTP02500	Przechowywać w 70% etanolu w temperaturze pokojowej.
Kwas L-askobinowy	Sigma	A4544-25g	rozcieńczony 100 mg / ml w MilliQ, filtr stryrylowany i podzielony na 20μ l alikwoty, przechowywać w ciemności, -20° C
Agaroza niskotopliwa	TopVision	R0801
Siatki metalowe			Dostępne na rynku lub wykonane samodzielnie z siatki ze stali nierdzewnej (odporne na korozję, rozmiar oczek 0,7 mm). Wytnij krążek o średnicy około 30 mm i zegnij krawędzie, aby uzyskać 3 mm wysokości. Użyj gwoździ do zrobienia otworów.
Mikro kleszcze	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich
Penicylina-Streptomycyna (10 000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
szalki Petriego, szkło sodowo-wapniowe	DWK Nauki Przyrodnicze	9170442
Petridish 35 mm, z odpowietrznikiem	Duran	237554008
Petridish 90 mm, bez odpowietrznika klasyczne	Thermo Fisher	101RT/C
Małe nożyczki

1 ml