Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej

Podsumowanie

Nabłonek jelitowy zapewnia nie tylko wchłanianie składników odżywczych, ale także ochronę przed szkodliwymi substancjami. Najbardziej wierzchołkowo-nabłonkowe połączenie międzykomórkowe, czyli połączenie ścisłe, reguluje przepuszczalność substancji rozpuszczonej i jonów parakomórkowych. W tym miejscu opisano protokół przygotowania arkuszy błony śluzowej oraz oceny selektywności jonowej połączeń ścisłych techniką komory usingowej.

Streszczenie

Technika komory Ussing została po raz pierwszy wynaleziona przez duńskiego naukowca Hansa Ussinga w 1951 roku w celu zbadania transkomórkowego transportu sodu przez skórę żaby. Od tego czasu technika ta została zastosowana do wielu różnych tkanek w celu zbadania fizjologicznych parametrów transportu przez błony. Metoda komory Ussinga jest lepsza od innych metod, ponieważ można wykorzystać tkankę natywną, dzięki czemu ma ona większe zastosowanie do tego, co dzieje się in vivo. Jednak ze względu na to, że używana jest tkanka natywna, przepustowość jest niska, czas jest ograniczony, a przygotowanie tkanek wymaga umiejętności i szkolenia. Komory te zostały wykorzystane do badania specyficznych białek transportowych w różnych tkankach, zrozumienia patofizjologii chorób, takich jak mukowiscydoza, badania transportu i wychwytu leków, a zwłaszcza przyczyniły się do zrozumienia transportu składników odżywczych w jelicie. Biorąc pod uwagę cały proces transportu nabłonkowego tkanki, ważne są nie tylko szlaki transnabłonkowe, ale także szlaki parakomórkowe. Połączenia ścisłe są kluczowym wyznacznikiem specyficznej dla tkanek przepuszczalności parakomórkowej w jelicie. W tym artykule technika komory Ussinga zostanie wykorzystana do oceny parakomórkowej przepuszczalności jonów poprzez pomiar przeznabłonkowego przewodnictwa i potencjałów rozcieńczenia.

Wprowadzenie

Metoda komory Ussing została po raz pierwszy opracowana przez duńskiego naukowca Hansa Ussinga. Ussing po raz pierwszy użył go do pomiaru prądu zwarciowego transportu sodu przez skórę żaby po tym, jak zaobserwowano, że NaCl może być transportowany przez skórę przy stromym gradiencie stężeń¹. Jego system składał się ze skóry żaby umieszczonej między dwiema komorami z dostępem po obu stronach skóry. Każda komora zawierała roztwór Ringera, który był cyrkulowany i napowietrzany. Dwa wąskie mostki agarowe umieszczone w pobliżu skóry i połączone z nasyconymi elektrodami KCl-kalomelowymi mierzyły różnicę potencjałów odczytywaną przez wzmacniacz. Druga para mostków pierścieniowych agaru znajdowała się na przeciwległym końcu każdej komory, połączona ze zlewkami z nasyconym KCl nasyconym AgCl w celu przyłożenia siły elektromotorycznej dostarczanej przez baterię. Dzielnik potencjału został użyty do regulacji napięcia w taki sposób, aby różnica potencjałów w poprzek powłoki pozostała zerowa, tworząc w ten sposób warunki zwarciowe. Podłączono również mikroamperomierz do odczytu prądu przepływającego przez powłokę (patrz rysunek w ref.¹ dla oryginalnego projektu komory).

W ciągu ostatnich 70 lat, technika ta była stosowana do wielu różnych tkanek, szczególnie tkanki jelitowej, do badania transportu składników odżywczych i jonów. Na przykład, mechanizm biegunki wywołanej został zbadany poprzez zamontowanie jelita krętego królika w tych komorach i stwierdzono, że biegunka wywołana toksyną jest wywoływana przez cAMP². Ponadto komory te wykorzystano również do zbadania mechanizmu leżącego u podstaw transportu glukozy przez kotransporter Na⁺-glukozy 1 (SGLT1)³. Nasze laboratorium koncentruje się na transporcie transkomórkowym i parakomórkowym w komórkach nabłonka jelitowego. Stosując metodę komory Usinga, transport peptydów oceniano u myszy z nokautem Claudin 15, które mają upośledzony parakomórkowy transport sodu, używając komór Ussinga do pomiaru wchłaniania niehydrolizowanego dipeptydu glicylosarkozyny. Stwierdzono, że homeostaza luminalnego Na⁺ jest ważna dla transportu peptydów sprzężonych z protonami⁴. Ponadto komory te wykorzystano również do zbadania wydzielania anionów w mysim jelicie ślepym w odpowiedzi na podśluzówkową aktywację receptora 1 aktywowanego proteinazą przez proteazę serynową trypsin⁵.

Komory Ussingowe są ostatnio używane do oceny ścieżek parakomórkowych w tkance nabłonkowej. Szlaki parakomórkowe są regulowane przez ścisłe połączenia, które są kompleksami białek, które tworzą się w punkcie, w którym spotykają się dwie lub więcej komórek⁶. Funkcja bariery i selektywność jonowa (czy aniony lub kationy są selektywnie zdolne do przechodzenia przez ścisłe połączenie) są określane przez obecność białek z rodziny klaudyny; Niektóre z nich działają jako bariery (klaudyna 3 i 7), pory anionowe (kludyna 10a) lub pory kationowe (klaudyna 2, 10b i 15)7. Do oceny szlaku parakomórkowego zastosowano inne metody, takie jak zgłębnik FITC w jamie ustnej w połączeniu ze stężeniem FITC w osoczu krwi⁸, lub EDTA-Cr⁹; Techniki te mają jednak niższą rozdzielczość i nie mogą ocenić selektywności jonowej ani określonego odcinka odcinka przewodu pokarmowego. Komory Ussing mogą być jednak wykorzystywane do oceny potencjału rozcieńczania jonów docelowych, a tym samym do określania selektywności jonowej połączeń ścisłych. Na przykład w przypadku NaCl selektywność połączeń ścisłych dla Na⁺ i Cl^- można obliczyć, rozcieńczając jedną stronę błony (zwykle stronę błony śluzowej) i mierząc zmianę różnicy potencjału przeznabłonkowego. Względną przepuszczalność Na⁺ i Cl^- można oszacować za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza¹⁰, a selektywność ciasnego połączenia można oszacować za pomocą równania Kimizuka-Koketsu¹¹. Komory te mają zatem tę zaletę, że mierzą parametry elektrofizjologiczne tkanek i w efekcie dostarczają więcej informacji o przechodzeniu jonów przez złącza ścisłe niż inne metody o niższej rozdzielczości.

Metoda komory Ussinga nie ogranicza się tylko do przewodu pokarmowego, chociaż jest szeroko stosowana w badaniach dotyczących jelit, ma również wiele innych zastosowań. Na przykład, komory te były używane do badania mukowiscydozy, a w szczególności transbłonowego regulatora przewodnictwa (CFTR) kanału chlorkowego mukowiscydozy (CFTR)¹². Mukowiscydoza jest spowodowana mutacją w CFTR¹³, która powoduje upośledzenie wydzielania chlorków i transportu płynów przez komórki nabłonka oddechowego, co skutkuje grubszą, bardziej suchą warstwą śluzu¹⁴. Badanie nabłonka dróg oddechowych CFTR zostało przeprowadzone za pomocą tych komór, aby nie tylko zrozumieć chorobę, ale także odkryć sposoby leczenia choroby. Na przykład u pacjentów z rzadkimi mutacjami powodującymi mukowiscydozę analiza komórek nabłonka oddechowego pacjenta została wykorzystana do przetestowania terapii, takich jak Orkambi i koterapia wzmacniacza¹⁵.

Komory użytkowe były również wykorzystywane do badania dróg dostarczania leków, takich jak ludzka biopsja tkanek do badania absorpcji leku i farmakokinetyki¹⁶. Wychwyt jelitowy nie jest jedyną drogą dostarczania leków. Komory te były również wykorzystywane do badania donosowych systemów dostarczania leków¹⁷. Przeprowadzono również badania nad podawaniem leków za pomocą komór Ussinga dla oka. W rogówce królika przeprowadzono badania przepuszczalności i wychwytu z użyciem leku Labrasol, który ma na celu zwiększenie wchłaniania leków przez tkanki¹⁸. W innym badaniu badano wpływ chlorku benzylalkoniowego na przeztwardówkowe dostarczanie leków w klasie królika sclera19.

Metoda komory Ussing jest użyteczna, ponieważ można użyć natywnej tkanki. W związku z tym jest lepszy od modeli in vitro, takich jak linie komórkowe Caco-2. Jednak technika ta wymaga umiejętności i czasu na przygotowanie próbek, więc nie nadaje się do zastosowań o dużej przepustowości. Właściwości elektrofizjologiczne monowarstw komórkowych można badać za pomocą wkładek do hodowli komórkowych w tych komorach. Ostatnie odkrycia pozwoliły na hodowlę organoidów, które są mini-organami wyhodowanymi w kulturze z pozyskania komórek macierzystych nabłonka lub śródbłonka²⁰. Kulturą organoidów można manipulować tak, aby rosła w monowarstwie, co umożliwia montowanie organoidów w komorze Ussinga²¹. Można badać organoidy różnych tkanek nabłonka i śródbłonka, zmniejszając liczbę wymaganych zwierząt, ponieważ hodowla organoidów może być utrzymywana przez długi czas. Zwiększy to również przepustowość, ponieważ nie będzie konieczne czasochłonne i pracochłonne rozwarstwianie tkanek oraz etapy przygotowania. W przyszłości badania w komorze Ussing będą nadal bardzo przydatne w badaniu transportu tkanek i będą szczególnie ważne w dziedzinie medycyny spersonalizowanej.

Poniższy protokół demonstruje zastosowanie metody komory Ussinga do oceny permselektywności i funkcji barierowej połączeń ścisłych w jelicie cienkim myszy z nokautem Claudin 15 (Cldn15^-/-) i kontroli typu dzikiego (WT) poprzez pomiar potencjału rozcieńczania NaCl. Połączenia ścisłe (TJ) powstają w miejscu, w którym dwie lub więcej komórek spotyka się w tkance nabłonkowej i śródbłonka. Uważa się, że dwukomórkowe połączenia ścisłe (bTJ), w szczególności białka z rodziny klaudyny znajdujące się w bTJ, determinują funkcję bariery i permselektywność TJ⁷. Myszy Cldn15^-/- mają mega jelito cienkie²² i zmniejszoną zdolność pobierania składników odżywczych z powodu utraty recyklingu jelitowego Na⁺, który następuje przez klaudinę 15^4,23,24. Myszy Cldn15^-/- mają upośledzoną homeostazę Na⁺, co czyni je interesującym modelem do badania permselektywności TJ. Poniższy protokół ocenia przepuszczalność TJ dla NaCl poprzez pomiar potencjału rozcieńczania NaCl (P_Na / P_Cl) w środkowym jelicie cienkim. Krótko mówiąc, zmiana różnicy potencjałów błony, która następuje przez rozcieńczenie jednej strony membrany (strona M lub strona S, obie są mierzone w poniższym protokole) można wykorzystać do obliczenia przepuszczalności Na⁺ (P_Na) i Cl^- (P_Cl), a potencjał rozcieńczenia (P_Na / P_Cl) pokaże, czy ścisłe połączenie ma selektywność kationową czy anionową.

Eksperymenty w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu dostosowanej komory Ussing (Rysunek 1A), która składa się z dwóch połówek, pomiędzy którymi preparacja jelitowa jest zamontowana pionowo, wzmacniacz cęgowy napięcia, rejestrator elektryczny, elektrody, mostki solne, roztwór Ringera, bufor HEPES (150 mM NaCl), rozcieńczony bufor HEPES (75 mM NaCl), preparat jelitowy (szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów).

Protokół

Wszystkie zwierzęta użyte w tych eksperymentach były przechowywane w ośrodku opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie Shizuoka, a eksperymenty były prowadzone zgodnie z wytycznymi dla badań na zwierzętach określonymi przez Uniwersytet Shizuoka. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Shizuoka (Zezwolenia #205272 i #656-2303).

1. Przygotowanie elektrod NaCl

UWAGA: Elektrody używane w tych eksperymentach składają się ze skoncentrowanego NaCl lub KCl. Elektrody KCl/kalomelowe są kupowane w handlu. Przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że wszystkie elektrody są wypełnione do góry stężonym roztworem NaCl lub KCl.

1. Przygotuj małe szklane słoiki z plastikowymi pokrywkami (objętość 20 ml).
2. Wywierć dwa otwory w plastikowych pokrywkach, jeden na mostek solny NaCl (średnica 2.5 mm), a drugi na drut srebrny (średnica 1 mm; Rysunek 1C, elektroda NaCl).
3. Napełnij szklany słoik nasyconym roztworem NaCl (około 15 ml, aż do pełna).
4. Włóż srebrny drut (średnica 0.8 mm, długość 7 cm) do słoika, ale upewnij się, że część drutu na zewnątrz słoika można podłączyć za pomocą zacisków krokodylkowych (mały rozmiar) do amplifier system.
5. Gdy nie są używane, owiń elektrody i upewnij się, że otwory są zakryte parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu.

2. Przygotowanie mostów solnych

UWAGA: Przygotuj mostki solne co najmniej dzień przed eksperymentem, aby zapewnić odpowiedni czas na zastygnięcie. Mostki solne mogą być używane wielokrotnie, ale nie zaleca się stosowania po 2 miesiącach.

1. Mostki solne NaCl
   1. Przygotuj rurkę polietylenową #7 (średnica zewnętrzna 2,3 mm, średnica wewnętrzna 1,3 mm), igłę 19 G i strzykawkę typu lock, 200 ml roztworu 1 M NaCl, 2 g agaru, zamykany plastikowy pojemnik do przechowywania mostu solnego.
   2. Przygotuj odpowiednią liczbę mostków solnych, przycinając rurki do rozmiaru niezbędnego do ustawienia komory Ussing (każda komora wymaga dwóch mostków solnych).
   3. Przed wstrzyknięciem agaru uformuj rurki w kształcie litery U i umieść je w zlewce z ciepłą wodą (aby stworzyć łatwy kształt do tworzenia mostków solnych).
   4. Przygotować 200 ml 1 M NaCl, rozpuszczając 11.688 g NaCl w 200 ml w wodzie dejonizowanej.
   5. Podziel 1 M NaCl na porcje 100 ml: Zrób 100 ml 2% agaru w 1 M NaCl (wymieszaj 2 g agaru z NaCl, podgrzej w kuchence mikrofalowej do rozpuszczenia).
   6. Za pomocą igły 19 G i strzykawki blokującej napełnić strzykawkę 1 M roztworem NaCl/agar. Delikatnie zacznij usuwać roztwór kropla po kropli i robiąc to, włóż igłę do jednego końca probówki i napełniaj, aż mieszanina wypłynie z drugiej strony.
   7. Powoli wyjmować igłę, wciąż odciągając roztwór, i powtarzać tę czynność, aż zostaną wykonane wszystkie wymagane mostki solne. (Jeśli roztwór zastygnie w strzykawce lub igle, należy go krótko ogrzać w gorącej wodzie, aż roztwór będzie mógł być ponownie odciągnięty.)
   8. Sprawdź mostki solne, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków i przechowuj w pozostałym 1 M roztworze NaCl w zamykanym pojemniku.
2. Mosty solne KCl
   UWAGA: Do mostków agarowych KCl stosuje się cieńsze rurki, aby uniknąć wzrostu stężenia K⁺ w buforze, ponieważ końcówki mostków solnych mogą się rozpuścić, a K⁺ może przeciekać do buforu.
   1. Przygotuj rurkę polietylenową #3 (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm), strzykawkę 23 G z igłą i blokadą, 200 ml roztworu 1 M KCl, 2 g agaru, zamykany plastikowy pojemnik do przechowywania mostu solnego.
   2. Przygotuj odpowiednią liczbę mostków solnych, przycinając rurki do rozmiaru niezbędnego do ustawienia komory Ussing (każda komora wymaga dwóch mostków solnych).
   3. Przygotować 200 ml 1 M KCl, rozpuszczając 14,91 g KCl w 200 ml wody dejonizowanej.
   4. Podziel na dwie porcje po 100 ml: Przygotuj 100 ml 2% agaru w 1 M KCl (wymieszaj 2 g agaru z KCl, podgrzej w kuchence mikrofalowej do rozpuszczenia).
   5. Za pomocą igły 23 G i strzykawki blokującej wstrzyknąć do rurki 2% agar 1 M mieszaninę KCl (upewnić się, że probówki są całkowicie wypełnione i nie ma pęcherzyków) w taki sam sposób, jak w przypadku mostków solnych NaCl.
   6. Sprawdź mostki solne, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków i przechowuj w pozostałym 1 M roztworze KCl w zamykanym pojemniku.

3. Przygotowanie roztworu Ringera i buforu HEPES

UWAGA: W zależności od tkanki zamontowanej w komorze Usinga, składniki roztworu Ringera mogą się różnić. Przedstawione tutaj przepisy są specyficzne dla jelita cienkiego i grubego.

1. Roztwór Ringera należy przygotować w stanie świeżym w dniu doświadczenia, jak opisano w Tabeli 1.
2. Pęcherzykować roztwór 95% O₂/5% CO_{2 ,} aby dostarczyć O₂ do tkanki i pojemność buforową.

Roztwór Ringera (jelito cienkie)	Roztwór Ringera (jelito grube)
NaHCO3 – 21,0 mM	NaHCO3 – 21,0 mM
K2HPO4 – 2,4 mM	K2HPO4 – 2,4 mM
KH2PO4 – 0,6 mM	KH2PO4 – 0,6 mM
NaCl – 119,0 mM	NaCl – 119,0 mM
MgCl2 – 1,2 mM	MgCl2 – 1,2 mM
CaCl2 – 1,2 mM	CaCl2 – 1,2 mM
Indometacyna – 10 μM (zrobić 1 mM bulionu w 21 mM NaHCO3, dodać 10 ml bulionu na 1 l roztworu Ringera)	Indometacyna – 10 μM (zrobić 1 mM bulionu w 21 mM NaHCO3, dodać 10 ml bulionu na 1 l roztworu Ringera)
1 mM Glutaminy (0,146 g/l)	10 mM glukozy

Tabela 1: Przepis na roztwór Ringera. Aby przygotować roztwór Ringera, wymieszaj wszystkie składniki razem z wodą dejonizowaną. Roztwór Ringera najlepiej przygotować na świeżo przed eksperymentami. Przechowywać w lodówce lub na lodzie do czasu użycia. Przed użyciem gaz o zawartości 95% O₂/5% CO_{2 .}

3. Przygotować świeży bufor HEPES w dniu eksperymentu, jak opisano w Tabeli 2, mieszając składniki w wodzie dejonizowanej.
4. Nie należy dostosowywać do końcowej objętości buforu, dopóki nie nastąpi dostosowanie pH.
5. Podgrzej bufor HEPES do 37 °C i dostosuj pH do 7,4, powoli dodając krople 1 M roztworu Tris, mieszając.
6. Dostosuj do końcowej objętości, dodając odpowiednią ilość wody dejonizowanej.

Bufor HEPES	Rozcieńczający bufor HEPES
FILTR ELEKTROMAGNETYCZNY – 10 mM	FILTR ELEKTROMAGNETYCZNY – 10 mM
Glukoza – 10 mM (jelito grube)	Glukoza – 10 mM (jelito grube)
1 mM glutaminy (0,146 g/l) (Jelito cienkie)	1 mM glutaminy (0,146 g/l) (Jelito cienkie)
NaCl – 150 mM	NaCl – 75 mM + 150 mM mannitol (w celu dostosowania do różnic osmolalności)
MgCl2 – 1 mM	MgCl2 – 1 mM
CaCl2 – 2 mM	CaCl2 – 2 mM
Indometacyna – 10 μM (zrobić 1 mM bulionu w 21 mM NaHCO3, dodać 10 ml bulionu na 1 l roztworu Ringera)	Indometacyna – 10 μM (zrobić 1 mM bulionu w 21 mM NaHCO3, dodać 10 ml bulionu na 1 l roztworu Ringera)
Dostosuj do pH 7,40 (37°C) za pomocą 1 M Tris

Tabela 2: Receptura bufora HEPES. Aby uzyskać bufor HEPES i rozcieńczający bufor HEPES, rozpuść wszystkie składniki w wodzie dejonizowanej. Roztwory muszą być dostosowane do pH za pomocą 1 M roztworu Tris, więc nie dodawaj pełnej objętości wody (np. przygotowując 1 litr rozpuść wszystkie składniki w około 800 ml wody). Następnie podgrzać roztwór do 37 °C, dostosować pH do 7,4, a następnie dostosować końcową objętość.

4. Konfiguracja studzienki użytkowania

UWAGA: Komory Ussinga użyte w tym protokole to wykonane na zamówienie komory do ciągłej perfuzji. Aby ocenić funkcję bariery jelitowej myszy lub pobieranie składników odżywczych, zaleca się komory z otworem o średnicy 4 lub 5 mm²⁵ (Rysunek 1A-C).

1. Aby zredukować efekt krawędzi²⁶ i pomóc uszczelnić komory, przymocuj 4 lub 5 mm dziurkowaną folię parafinową (około 4 cm²) przed ustawieniem (Rysunek 1B).
2. Ustawienie w warunkach obwodu otwartego do pomiaru potencjału rozcieńczenia. Ustaw w bieżącym trybie cęgowym. Ustaw wyjście jako prąd i ustaw impuls prądu na ±20 μA.
3. W przypadku ustawiania w warunkach zwarciowych do pomiaru prądu zwarciowego i rezystancji przezśluzówkowej, należy ustawić w trybie cęgów napięciowych. Ustaw wyjście jako napięcie i ustaw impuls napięcia na ±5 mV.
4. Upewnij się, że w płaszczu wodnym krąży woda o temperaturze 37 °C.
5. Napełnij każdą komorę roztworem Ringera lub buforem HEPES (ilość zależy od zastosowanego systemu, stosowane tutaj komory wymagają 5 ml z każdej strony) i upewnij się, że nie ma wycieków.
6. Podłącz mostki solne i elektrody.
7. Upewnij się, że napięcie wynosi 0 i jest stabilne, prąd impulsowy, aby upewnić się, że mostki solne i elektrody są prawidłowo ustawione.
8. Odczekać, aby temperatura systemu i roztworu Ringera zrównoważyła się przez co najmniej 20 minut.
9. Po zrównoważeniu należy skorygować asymetryczną różnicę napięć między elektrodami KCl i skompensować opór płynu, zmieniając go na zero (sprawdź instrukcję systemu studzienek Ussinga używanego do określenia prawidłowego sposobu).

5. Wypreparowanie tkanki jelitowej

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach muszą być przeprowadzane zgodnie z przepisami ustalonymi przez kraj i uniwersytet.

1. Przed pobraniem tkanki jelitowej przygotuj świeży, lodowaty roztwór Ringera i bąbelkuj 95%_O2 i 5% CO₂ przez 15 minut (krok 3).
2. Znieczulenie myszy należy stosować zgodnie z wytycznymi regulującymi wykorzystanie zwierząt w badaniach. W tym eksperymencie myszy znieczulono 2%-3% izofluranem podawanym przez środek znieczulający. Sprawdź, czy znieczulenie jest prawidłowe, ściskając palce u nóg i upewniając się, że nie ma reakcji bólowej.
3. Wykonaj nacięcie w jamie brzusznej nożyczkami od miednicy do przepony; zlokalizuj żołądek i odetnij odźwiernikowy koniec żołądka.
4. Chwyć kleszczami część żołądkową przyczepioną do jelita cienkiego i delikatnie pociągnij jelito cienkie, jednocześnie odcinając przyczepy krezkowe. Uważaj, aby w żaden sposób nie przeciąć ani nie uszkodzić tkanki jelitowej.
5. Kontynuuj preparowanie jelita aż do odbytu. W celu całkowitego usunięcia jelita grubego przetnij kości miednicy, aby odsłonić dystalną część jelita grubego i ostrożnie usuń resztę jelita, odcinając przyczepy.
6. Zmierz długość jelita i podziel na wybrane segmenty. W tym eksperymencie podziel jelito cienkie na trzy segmenty i użyj środkowego segmentu.
7. Umieść żądane segmenty w lodowatym, bąbelkowym roztworze Ringera, a następnie otwórz każdy segment wzdłużnie, przecinając wzdłuż przyczepów krezkowych. Odetnij tłuszcz i tkankę łączną.
8. Włóż segmenty z powrotem do lodowatego roztworu Ringera i dokładnie umyj (nawet w lodowatym roztworze natlenienie nabłonka światła jest ważne dla utrzymania funkcji nabłonka).

6. Zdejmowanie warstwy mięśniowej i przygotowanie arkusza jelitowego

UWAGA: Usunięcie surowicy (warstwy mięśniowej) jest ważne dla badań transportu z wykorzystaniem jelita. Jeśli surowiczość pozostanie, tkanka jelitowa może podlegać losowym skurczom mięśni, które zniekształcą dane elektrofizjologiczne, a transport może zostać zahamowany. Nieoczyszczona tkanka szybko ulega zniszczeniu po zamontowaniu w komorach Ussing, ponieważ surowiczość stanowi istotną barierę dyfuzyjną dla substratu i tlenu. W niektórych szczególnych przypadkach może być konieczne zachowanie warstwy mięśniowej, więc decyzja należy do badacza i projektu eksperymentu. Arkusze jelitowe można przygotować na dwa sposoby, w zależności od tego, która warstwa zostanie usunięta (Rysunek 2). Do tego eksperymentu wymagane są preparaty błony śluzowej i podśluzówkowej (Rysunek 2, 2 panel).

1. Przygotuj płytki preparacyjne (średnica 10 cm) pokryte gumą silikonową, szpilki (małe igły do akupunktury), 5 mm perforowaną bibułę filtracyjną i kwadraty parafilmowe (2 cm x 2 cm; mogą nie być konieczne w przypadku innych systemów).
2. Wlej świeży, lodowaty, bąbelkowy roztwór Ringera do płytki preparacyjnej (tyle, aby pokryć tkankę, około 2-3 ml).
3. Pod mikroskopem stereoskopowym przypiąć końce tkanki jelitowej (błoną śluzową do dołu).
4. Za pomocą cienkich kleszczy tępo odetnij warstwę mięśniową od leżącej pod nią błony śluzowej.
5. Uważaj, aby nie rozerwać ani nie wprowadzić żadnych w tkance.
6. Po usunięciu warstwy mięśniowej wytnij kawałek wystarczająco duży, aby uzyskać otwór o średnicy 5 mm. Podczas przygotowywania jelita cienkiego usunięcie warstwy mięśniowo-surowiczej powinno być wykonane w ciągu 10 minut, ponieważ natlenienie światła jest w tych warunkach trudne.
7. Zwilż 5 mm dziurkowaną bibułę filtracyjną pod kątem kwadratowym w roztworze Ringera i umieść na niej tkankę jelitową stroną śluzówkową do dołu, ponieważ preparaty podśluzówkowe samoistnie owijają się stroną śluzówkową na zewnątrz.
8. Upewnij się, że otwór jest całkowicie zakryty przez tkankę jelitową i nie ma zmarszczek. Użyj czarnej tablicy pod preparatem, aby sprawdzić, czy otwór jest całkowicie zakryty.
9. Powtórz tę procedurę dla wymaganej liczby preparatów błony śluzowej (w tym eksperymencie wymagane są dwa preparaty: jeden preparat zostanie użyty do pomiaru potencjału rozcieńczenia, a drugi zostanie użyty do pomiaru podstawowych parametrów elektrycznych).

7. Montaż preparatów jelitowych w komorach Ussing

UWAGA: Konfiguracja będzie zależała od typu używanego systemu komory Ussing i systemu nagrywania.

1. Odessać roztwór Ringera/bufor HEPES z komory Ussing.
2. Zdemontuj komorę Ussing i połóż bibułę filtracyjną preparatem jelitowym środkiem śluzówkowym do dołu na komorze po stronie błony śluzowej i wyreguluj tak, aby okienko komory zrównało się z otworem bibuły filtracyjnej (Rysunek 1A, czarne oznaczenie wokół okna komory jest przydatne do wyrównania preparatów).
3. Ostrożnie umieść boczną komorę surowiczej na bocznej komorze błony śluzowej i szczelnie zamknij, ale upewnij się, że arkusz jelitowy nie poruszył się podczas połączenia.
4. Szybko napełnij obie komory roztworem Ringera lub buforem HEPES i umieść bulgoczące różdżki (roztwór Ringera: 95% O₂/5% CO₂; Bufor HEPES: 100% O₂) na przeciwległym końcu komór, z dala od membrany (bulgotanie zbyt blisko preparatu mogłoby mieć wpływ na pomiary).
5. Podłącz ponownie mostki solne i sprawdź, czy napięcie jest stabilne i czy prąd impulsowy jest w porządku (Rysunek 1C).
6. Powtórz tę czynność dla każdego preparatu jelitowego.
7. Pozwól systemowi osiągnąć równowagę przez około 15 minut. W przypadku korzystania z systemu rejestracyjnego, przed rozpoczęciem eksperymentów poczekaj, aby różnica przewodności i potencjału_{I sc}/membrana ustabilizowała się.

8. Eksperyment z potencjałem rozcieńczenia (warunki otwartego obiegu)

1. Umyć obie strony komory, odsysając bufor HEPES i dodając po 5 ml świeżego, wstępnie podgrzanego buforu HEPES z każdej strony.
2. Włącz system nagrywania. Ustaw zakres na 250 mV, (zastosowany tutaj system wzmacnia napięcie wyjściowe 10x), ustaw pozycje znaczników i ustaw system nagrywania na miarę.
3. Przełącz systemy studzienek Ussing w tryb zacisku i rozpocznij pomiar. Po ustabilizowaniu się potencjału błony (~15-20 min) można rozpocząć ocenę.
4. Odessać bufor HEPES od strony błony śluzowej i szybko zastąpić 5 ml podgrzanego buforu HEPES do rozcieńczania zawierającego 75 mM NaCl.
5. Gdy potencjał błonowy osiągnie szczyt (5-10 min), usuń bufor rozcieńczający ze strony "śluzowej" i zastąp buforem HEPES.
6. W razie potrzeby powtórzyć krok 3 dla strony surowiczej, dodając rozcieńczony bufor HEPES po stronie surowiczej.
7. Aby upewnić się, że tkanka jest żywotna, dodaj aktywator cyklazy adenylanowej Forskolina (końcowe stężenie 10 μM) po stronie surowiczej.
8. Gdy różnica potencjałów błony osiągnie szczyt i zacznie spadać, eksperyment jest zakończony
.

9. Pomiar przeznabłonkowej przesączkowej przewodności elektrycznej i linii bazowej I_sc (warunki zwarciowe)

1. Umyj obie strony komory, odsysając roztwór Ringera i dodając po 5 ml świeżego bąbelkowego roztworu Ringera z każdej strony.
2. Włącz system nagrywania. Ustaw zakres na 2,5 V (zastosowany tutaj system wzmacnia napięcie wyjściowe 10x), ustaw pozycje znaczników i ustaw system nagrywania na miarę.
3. Przełączyć systemy komór Ussing w tryb clamp i rozpocząć pomiar; po ustabilizowaniu się I_sc i przewodności (~15-20 min) można uzyskać pomiary podstawowe.
4. Aby upewnić się, że tkanka jest żywotna, dodaj aktywator cyklazy adenylanowej Forskolina (końcowe stężenie 10 μM) po stronie surowiczej.
5. Gdy różnica potencjałów błony osiągnie szczyt i zacznie spadać, eksperyment jest zakończony.

10. Analizowanie wyników

1. W warunkach obwodu otwartego oblicz przewodność przezśluzówkową na podstawie zmiany napięcia w odpowiedzi na impulsy prądu zgodnie z prawem Ohma. Wyznacz równoważny prąd zwarciowy (I_sc) od napięcia i przewodności przezśluzówkowej, stosując prawo Ohma.
2. Użyj potencjału rozcieńczenia NaCl do obliczenia względnej selektywności jonowej (P_Na/P_Cl) za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza¹⁰.
3. Oszacuj bezwzględną selektywność ścisłego połączenia dla każdego jonu za pomocą równania Kimizuka-Koketsu¹¹.
4. Oblicz P_Na/P_Cl za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza na podstawie potencjałów rozcieńczenia i określ przepuszczalności bezwzględne P_Na i P_Cl z równania Kimizuka-Koketsu zgodnie z opisem Yu i wsp.¹⁰ w następujący sposób:
   
   
   
   
   gdzie, V: potencjał rozcieńczania (mV); α: Wskaźnik aktywności. Obliczona aktywność NaCl w buforze HEPES podzielona przez obliczoną aktywność NaCl w rozcieńczającym buforze HEPES (dla tego eksperymentu obliczono ją jako 1,8966); e: Stała matematyczna, 2,71828; GM: Przewodność przezśluzówkowa (mS/cm²); F: stała Faradaya (96 485,3329 C/mol); R: stała gazowa (8,314 J/mol K); T: Temperatura (310.15 K)

Wyniki

Wyniki przedstawione w tym artykule są wynikami, które były częścią większego projektu, który został zakończony (zobacz ref.^4,23,24).

Transepitelialna przewodność elektryczna jelita cienkiego jest zmniejszona u myszy Cldn15^-/-.
Początkowa przewodność przezśluzówkowa (w warunkach zwarcia) środkowego odcinka jel...

Dyskusja

W tym eksperymencie wykorzystano komory Ussinga do pomiaru podstawowych parametrów elektrycznych i potencjału rozcieńczania NaCl w jelicie cienkim myszy Cldn15^-/- i WT. Bardzo ważne jest, aby podczas wykonywania doświadczeń w komorze Ussinga sprawdzić, czy preparat membranowy użyty w eksperymentach jest opłacalny. Zwykle odbywa się to poprzez dodanie glukozy lub aktywatora cyklazy adenylanowej forskoliny i sprawdzenie, czy występuje odpowiedni wzrost I_sc (100-300 μA /^cm2...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#3 rurki polietylenowe	Hibiki		średnica zewnętrzna 1,0 mm; średnica wewnętrzna 0,5 mm
#7 rurki polietylenowe	Hibiki		średnica zewnętrzna 2,3 mm; średnica wewnętrzna 1,3 mm
Strzykawka blokująca 10 ml	Terumo	SS-10LZ	Strzykawki blokujące są niezbędne, aby zapobiec przemieszczaniu się igły podczas napełniania
igły 19 g	Terumo	NN-1938R	Zachowaj ostrożność podczas pracy z igłami i wyrzuć do pojemnika na ostre
Igła 23 g	Terumo	NN-2332R	Zachowaj ostrożność podczas pracy z igłami i wyrzuć do pojemnika na ostre przedmioty
Dziurkacz 5 mm	NA	NA	Służy do przebijania otworów w bibule filtracyjnej i parafilmie
igły do akupunktury	Seirin	NS	Używany jako szpilki preparacyjne do przypinania tkanki do płytki rozwarstwiającej
Agar	Fujifilm Wako	010-15815
Zaciski krokodylkowe	NA	NA	Łączy elektrodę ze wzmacniaczem
CaCl2	Fujifilm Wako	038-00445
D(-)-mannitol	Fujifilm Wako	133-00845	Służy do korygowania różnicy osmolalności w rozcieńczeniu Bufor HEPES
D(+)-Glukoza	Fujifilm Wako	049-31165
		do preparacji	Będziesz potrzebować, nożyczki i zakrzywione kleszcze
Płytki			Użyliśmy 10 cm płytek do hodowli komórkowych i pokrytych gumą silikonową
DMSO	Sigma	472301-500ML	Do robienia zapasu forskoliny
Rejestrator elektryczny	TOA Electronics	PRR-5041	Inne równoważne rejestratory elektryczne są dostępne na rynku
Nabłonkowy wzmacniacz cęgowy	Nihon Kohden CEZ9100		Inne równoważne wzmacniacze są dostępne komercyjnie
bibuła filtracyjna, pocięta na kwadraty		NA NA	Dziurkowany dziurkaczem 5 mm, służy do przytrzymywania preparatu jelitowego
drobne kleszcze	Fast Gene	FG-B50476	Do rozwarstwienia warstwy mięśniowej
Forskolin	Alomone Labs	F-500	Zrób 10 mM zapasów w DMSO, końcowe stężenie wyniesie 10 i mikro; M
HEPES	Sigma	H4034-1KG
Indometacyna	Sigma	I7338-5G	Zrób 1 mM zapas w 21 mM NaHCO3, końcowe stężenie wynosi 10 &mikro; M
K2HPO4	Fujifilm Wako	164-04295
KCl	Fujifilm Wako	163-03545
KCl/elektroda kalomelowa	Asch Japan Co.	SCE-100
KH2PO4	Kanto chemical	32379-00
L(+)-Glutamina	Fujifilm Wako	074-00522
MgCl2	Fujifilm Wako	135-00165
Gaz mieszany (95% O2/5% CO2)	Shizuoka Oxygen Company		Służy do bulgotania roztworu Ringera i komór podczas korzystania z roztworu Ringera
NaCl	Fujifilm Wako	191-01665
Elektroda NaCl	NA		NA Ręcznie robione elektrody, które wymagają skoncentrowanego NaCl i drutu srebrnego
NaHCO3	Fujifilm Wako	191-01305
O2 Gas	Shizuoka Oxygen Company		Służy do komór bąbelkowania podczas korzystania z parafilmu buforowego HEPES
	Bemis	PM-996	Służy do uszczelniania komór Ussing
pH-metr	DKK-TOA Corp	HM-305	Bufor HEPES należy dostosować do pH 7,4 przy 37 & stopniach; C
Elektroda pH-TOA	Corp	GST-5311C
guma silikonowa	Shinetsu Chemical	KE-12	Służy do wypełniania płytek rozwarstwiających
srebrny drut			Służy do produkcji elektrod NaCl
Małe słoiki z plastikowymi pokrywkami		NA NA Służy	do elektrod NaCl
stereoskop	Zeiss	Stemi 305	Mikroskop stereoskopowy pozwala zobaczyć głębię, dzięki czemu można łatwiej wypreparować tkankę
Tris (podstawa Trizma)	Sigma	T1503-1KG	Przygotuj roztwór 1M do regulacji pH HEPES
Komory uspensowe	Sanki Kagaku Kougei		Komory te są wykonywanymi na zamówienie komorami z ciągłą perfuzją o średnicy okna 5 mm
Pompa wodna i system grzewczy	Tokyo Rikakikai Co., Ltd.	Zobacz materiał NTT-110