Nabłonek jelitowy zapewnia nie tylko wchłanianie składników odżywczych, ale także ochronę przed szkodliwymi substancjami. Najbardziej wierzchołkowo-nabłonkowe połączenie międzykomórkowe, czyli połączenie ścisłe, reguluje przepuszczalność substancji rozpuszczonej i jonów parakomórkowych. W tym miejscu opisano protokół przygotowania arkuszy błony śluzowej oraz oceny selektywności jonowej połączeń ścisłych techniką komory usingowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technika komory Ussing została po raz pierwszy wynaleziona przez duńskiego naukowca Hansa Ussinga w 1951 roku w celu zbadania transkomórkowego transportu sodu przez skórę żaby. Od tego czasu technika ta została zastosowana do wielu różnych tkanek w celu zbadania fizjologicznych parametrów transportu przez błony. Metoda komory Ussinga jest lepsza od innych metod, ponieważ można wykorzystać tkankę natywną, dzięki czemu ma ona większe zastosowanie do tego, co dzieje się in vivo. Jednak ze względu na to, że używana jest tkanka natywna, przepustowość jest niska, czas jest ograniczony, a przygotowanie tkanek wymaga umiejętności i szkolenia. Komory te zostały wykorzystane do badania specyficznych białek transportowych w różnych tkankach, zrozumienia patofizjologii chorób, takich jak mukowiscydoza, badania transportu i wychwytu leków, a zwłaszcza przyczyniły się do zrozumienia transportu składników odżywczych w jelicie. Biorąc pod uwagę cały proces transportu nabłonkowego tkanki, ważne są nie tylko szlaki transnabłonkowe, ale także szlaki parakomórkowe. Połączenia ścisłe są kluczowym wyznacznikiem specyficznej dla tkanek przepuszczalności parakomórkowej w jelicie. W tym artykule technika komory Ussinga zostanie wykorzystana do oceny parakomórkowej przepuszczalności jonów poprzez pomiar przeznabłonkowego przewodnictwa i potencjałów rozcieńczenia.
Wprowadzenie
Metoda komory Ussing została po raz pierwszy opracowana przez duńskiego naukowca Hansa Ussinga. Ussing po raz pierwszy użył go do pomiaru prądu zwarciowego transportu sodu przez skórę żaby po tym, jak zaobserwowano, że NaCl może być transportowany przez skórę przy stromym gradiencie stężeń1. Jego system składał się ze skóry żaby umieszczonej między dwiema komorami z dostępem po obu stronach skóry. Każda komora zawierała roztwór Ringera, który był cyrkulowany i napowietrzany. Dwa wąskie mostki agarowe umieszczone w pobliżu skóry i połączone z nasyconymi elektrodami KCl-kalomelowymi mierzyły różnicę potencjałów odczytywaną przez wzmacniacz. Druga para mostków pierścieniowych agaru znajdowała się na przeciwległym końcu każdej komory, połączona ze zlewkami z nasyconym KCl nasyconym AgCl w celu przyłożenia siły elektromotorycznej dostarczanej przez baterię. Dzielnik potencjału został użyty do regulacji napięcia w taki sposób, aby różnica potencjałów w poprzek powłoki pozostała zerowa, tworząc w ten sposób warunki zwarciowe. Podłączono również mikroamperomierz do odczytu prądu przepływającego przez powłokę (patrz rysunek w ref.1 dla oryginalnego projektu komory).
W ciągu ostatnich 70 lat, technika ta była stosowana do wielu różnych tkanek, szczególnie tkanki jelitowej, do badania transportu składników odżywczych i jonów. Na przykład, mechanizm biegunki wywołanej został zbadany poprzez zamontowanie jelita krętego królika w tych komorach i stwierdzono, że biegunka wywołana toksyną jest wywoływana przez cAMP2. Ponadto komory te wykorzystano również do zbadania mechanizmu leżącego u podstaw transportu glukozy przez kotransporter Na+-glukozy 1 (SGLT1)3. Nasze laboratorium koncentruje się na transporcie transkomórkowym i parakomórkowym w komórkach nabłonka jelitowego. Stosując metodę komory Usinga, transport peptydów oceniano u myszy z nokautem Claudin 15, które mają upośledzony parakomórkowy transport sodu, używając komór Ussinga do pomiaru wchłaniania niehydrolizowanego dipeptydu glicylosarkozyny. Stwierdzono, że homeostaza luminalnego Na+ jest ważna dla transportu peptydów sprzężonych z protonami4. Ponadto komory te wykorzystano również do zbadania wydzielania anionów w mysim jelicie ślepym w odpowiedzi na podśluzówkową aktywację receptora 1 aktywowanego proteinazą przez proteazę serynową trypsin5.
Komory Ussingowe są ostatnio używane do oceny ścieżek parakomórkowych w tkance nabłonkowej. Szlaki parakomórkowe są regulowane przez ścisłe połączenia, które są kompleksami białek, które tworzą się w punkcie, w którym spotykają się dwie lub więcej komórek6. Funkcja bariery i selektywność jonowa (czy aniony lub kationy są selektywnie zdolne do przechodzenia przez ścisłe połączenie) są określane przez obecność białek z rodziny klaudyny; Niektóre z nich działają jako bariery (klaudyna 3 i 7), pory anionowe (kludyna 10a) lub pory kationowe (klaudyna 2, 10b i 15)7. Do oceny szlaku parakomórkowego zastosowano inne metody, takie jak zgłębnik FITC w jamie ustnej w połączeniu ze stężeniem FITC w osoczu krwi8, lub EDTA-Cr9; Techniki te mają jednak niższą rozdzielczość i nie mogą ocenić selektywności jonowej ani określonego odcinka odcinka przewodu pokarmowego. Komory Ussing mogą być jednak wykorzystywane do oceny potencjału rozcieńczania jonów docelowych, a tym samym do określania selektywności jonowej połączeń ścisłych. Na przykład w przypadku NaCl selektywność połączeń ścisłych dla Na+ i Cl- można obliczyć, rozcieńczając jedną stronę błony (zwykle stronę błony śluzowej) i mierząc zmianę różnicy potencjału przeznabłonkowego. Względną przepuszczalność Na+ i Cl- można oszacować za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza10, a selektywność ciasnego połączenia można oszacować za pomocą równania Kimizuka-Koketsu11. Komory te mają zatem tę zaletę, że mierzą parametry elektrofizjologiczne tkanek i w efekcie dostarczają więcej informacji o przechodzeniu jonów przez złącza ścisłe niż inne metody o niższej rozdzielczości.
Metoda komory Ussinga nie ogranicza się tylko do przewodu pokarmowego, chociaż jest szeroko stosowana w badaniach dotyczących jelit, ma również wiele innych zastosowań. Na przykład, komory te były używane do badania mukowiscydozy, a w szczególności transbłonowego regulatora przewodnictwa (CFTR) kanału chlorkowego mukowiscydozy (CFTR)12. Mukowiscydoza jest spowodowana mutacją w CFTR13, która powoduje upośledzenie wydzielania chlorków i transportu płynów przez komórki nabłonka oddechowego, co skutkuje grubszą, bardziej suchą warstwą śluzu14. Badanie nabłonka dróg oddechowych CFTR zostało przeprowadzone za pomocą tych komór, aby nie tylko zrozumieć chorobę, ale także odkryć sposoby leczenia choroby. Na przykład u pacjentów z rzadkimi mutacjami powodującymi mukowiscydozę analiza komórek nabłonka oddechowego pacjenta została wykorzystana do przetestowania terapii, takich jak Orkambi i koterapia wzmacniacza15.
Komory użytkowe były również wykorzystywane do badania dróg dostarczania leków, takich jak ludzka biopsja tkanek do badania absorpcji leku i farmakokinetyki16. Wychwyt jelitowy nie jest jedyną drogą dostarczania leków. Komory te były również wykorzystywane do badania donosowych systemów dostarczania leków17. Przeprowadzono również badania nad podawaniem leków za pomocą komór Ussinga dla oka. W rogówce królika przeprowadzono badania przepuszczalności i wychwytu z użyciem leku Labrasol, który ma na celu zwiększenie wchłaniania leków przez tkanki18. W innym badaniu badano wpływ chlorku benzylalkoniowego na przeztwardówkowe dostarczanie leków w klasie królika sclera19.
Metoda komory Ussing jest użyteczna, ponieważ można użyć natywnej tkanki. W związku z tym jest lepszy od modeli in vitro, takich jak linie komórkowe Caco-2. Jednak technika ta wymaga umiejętności i czasu na przygotowanie próbek, więc nie nadaje się do zastosowań o dużej przepustowości. Właściwości elektrofizjologiczne monowarstw komórkowych można badać za pomocą wkładek do hodowli komórkowych w tych komorach. Ostatnie odkrycia pozwoliły na hodowlę organoidów, które są mini-organami wyhodowanymi w kulturze z pozyskania komórek macierzystych nabłonka lub śródbłonka20. Kulturą organoidów można manipulować tak, aby rosła w monowarstwie, co umożliwia montowanie organoidów w komorze Ussinga21. Można badać organoidy różnych tkanek nabłonka i śródbłonka, zmniejszając liczbę wymaganych zwierząt, ponieważ hodowla organoidów może być utrzymywana przez długi czas. Zwiększy to również przepustowość, ponieważ nie będzie konieczne czasochłonne i pracochłonne rozwarstwianie tkanek oraz etapy przygotowania. W przyszłości badania w komorze Ussing będą nadal bardzo przydatne w badaniu transportu tkanek i będą szczególnie ważne w dziedzinie medycyny spersonalizowanej.
Poniższy protokół demonstruje zastosowanie metody komory Ussinga do oceny permselektywności i funkcji barierowej połączeń ścisłych w jelicie cienkim myszy z nokautem Claudin 15 (Cldn15-/-) i kontroli typu dzikiego (WT) poprzez pomiar potencjału rozcieńczania NaCl. Połączenia ścisłe (TJ) powstają w miejscu, w którym dwie lub więcej komórek spotyka się w tkance nabłonkowej i śródbłonka. Uważa się, że dwukomórkowe połączenia ścisłe (bTJ), w szczególności białka z rodziny klaudyny znajdujące się w bTJ, determinują funkcję bariery i permselektywność TJ7. Myszy Cldn15-/- mają mega jelito cienkie22 i zmniejszoną zdolność pobierania składników odżywczych z powodu utraty recyklingu jelitowego Na+, który następuje przez klaudinę 154,23,24. Myszy Cldn15-/- mają upośledzoną homeostazę Na+, co czyni je interesującym modelem do badania permselektywności TJ. Poniższy protokół ocenia przepuszczalność TJ dla NaCl poprzez pomiar potencjału rozcieńczania NaCl (PNa / PCl) w środkowym jelicie cienkim. Krótko mówiąc, zmiana różnicy potencjałów błony, która następuje przez rozcieńczenie jednej strony membrany (strona M lub strona S, obie są mierzone w poniższym protokole) można wykorzystać do obliczenia przepuszczalności Na+ (PNa) i Cl- (PCl), a potencjał rozcieńczenia (PNa / PCl) pokaże, czy ścisłe połączenie ma selektywność kationową czy anionową.
Eksperymenty w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu dostosowanej komory Ussing (Rysunek 1A), która składa się z dwóch połówek, pomiędzy którymi preparacja jelitowa jest zamontowana pionowo, wzmacniacz cęgowy napięcia, rejestrator elektryczny, elektrody, mostki solne, roztwór Ringera, bufor HEPES (150 mM NaCl), rozcieńczony bufor HEPES (75 mM NaCl), preparat jelitowy (szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tych eksperymentach były utrzymywane w ośrodku opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie w Shizuoka, a badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi badań na zwierzętach ustalonymi przez Uniwersytet w Shizuoka. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Shizuoka (pozwolenia nr 205272 i nr 656-2303).
1. Przygotowanie elektrod NaCl
UWAGA: Elektrody użyte w tych eksperymentach zawierają stężony NaCl lub KCl. Elektrody KCl/kalomelowe są kupowane komercyjnie. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy upewnić się, że wszystkie elektrody są wypełnione do pełna stężonym roztworem NaCl lub KCl.
- Przygotować małe szklane słoiczki z plastikowymi zakrętkami (pojemność 20 mL).
- W plastikowych zakrętkach wywiercić dwa otwory: jeden na mostek solny NaCl (średnica 2,5 mm) oraz drugi na srebrny drut (średnica 1 mm; Rycina 1C, elektroda NaCl).
- Napełnić szklany słoiczek nasyconym roztworem NaCl (około 15 mL, aż do pełna).
- Włożyć srebrny drut (średnica 0,8 mm, długość 7 cm) do słoiczka, dbając o to, aby odcinek drutu znajdujący się na zewnątrz słoiczka mógł zostać połączony za pomocą klipsów krokodylkowych (małych) z systemem wzmacniacza.
- Gdy elektrody nie są używane, owinąć je parafilmem, upewniając się, że otwory są zakryte, aby zapobiec wysychaniu.
2. Przygotowanie mostków solnych
UWAGA: Mostki solne należy przygotować co najmniej jeden dzień przed eksperymentem, aby zapewnić odpowiedni czas na stężenie. Mostki solne mogą być używane wielokrotnie, jednak nie zaleca się ich stosowania po 2 miesiącach.
- Mostki solne NaCl
- Przygotować rurkę polietylenową nr 7 (średnica zewnętrzna 2.3 mm, średnica wewnętrzna 1.3 mm), igłę 19 G i strzykawkę z blokadą, 200 mL 1 M roztworu NaCl, 2 g agaru oraz szczelny plastikowy pojemnik do przechowywania mostków solnych.
- Przygotować odpowiednią liczbę mostków solnych, przycinając rurki do rozmiaru wymaganego dla zestawu komory Ussinga (każda komora wymaga dwóch mostków solnych).
- Przed wstrzyknięciem agaru uformować z rurek kształt litery U i umieścić je w zlewce z ciepłą wodą (aby ułatwić nadanie kształtu podczas przygotowywania mostków solnych).
- Przygotować 200 mL 1 M NaCl, rozpuszczając 11.688 g NaCl w 200 mL wody dejonizowanej.
- Podzielić 1 M NaCl na porcje po 100 mL: przygotować 100 mL 2% agaru w 1 M NaCl (wymieszać 2 g agaru z NaCl, podgrzać w mikrofalówce do rozpuszczenia).
- Używając igły 19 G i strzykawki z blokadą, napełnić strzykawkę roztworem 1 M NaCl/agar. Powoli zacząć wypychać roztwór kropla po kropli, wstawiając jednocześnie igłę do jednego końca rurki i napełniając ją, aż mieszanina wypłynie z drugiej strony.
- Powoli wycofywać igłę, wciąż wypychając roztwór, i powtarzać czynność, aż zostaną wykonane wszystkie wymagane mostki solne. (Jeśli roztwór stężeje w strzykawce lub igle, krótko podgrzać go w gorącej wodzie, aż roztwór znów będzie można wypchnąć).
- Sprawdzić mostki solne, aby upewnić się, że nie ma w nich pęcherzyków powietrza, i przechowywać w pozostałym roztworze 1 M NaCl w szczelnym pojemniku.
- Mostki solne KCl
UWAGA: W przypadku agarowych mostków KCl stosuje się cieńsze rurki, aby uniknąć wzrostu stężenia K+ w buforze, ponieważ końcówki mostka solnego mogą się rozpuszczać, a K+ może wyciekać do buforu.- Przygotować rurkę polietylenową nr 3 (średnica zewnętrzna 1.0 mm, średnica wewnętrzna 0.5 mm), igłę 23 G i strzykawkę z blokadą, 200 mL 1 M roztworu KCl, 2 g agaru oraz szczelny plastikowy pojemnik do przechowywania mostków solnych.
- Przygotować odpowiednią liczbę mostków solnych, przycinając rurki do rozmiaru wymaganego dla zestawu komory Ussinga (każda komora wymaga dwóch mostków solnych).
- Przygotować 200 mL 1 M KCl, rozpuszczając 14.91 g KCl w 200 mL wody dejonizowanej.
- Podzielić na dwie porcje po 100 mL: przygotować 100 mL 2% agaru w 1 M KCl (wymieszać 2 g agaru z KCl, podgrzać w mikrofalówce do rozpuszczenia).
- Używając igły 23 G i strzykawki z blokadą, wstrzyknąć do rurek mieszaninę 2% agaru i 1 M KCl (upewnić się, że rurki są całkowicie wypełnione i nie ma w nich pęcherzyków powietrza) w ten sam sposób, co w przypadku mostków solnych NaCl.
- Sprawdzić mostki solne, aby upewnić się, że nie ma w nich pęcherzyków powietrza, i przechowywać w pozostałym roztworze 1 M KCl w szczelnym pojemniku.
3. Przygotowanie roztworu Ringera i buforu HEPES
UWAGA: W zależności od tkanki umieszczonej w komorze Ussinga, skład roztworu Ringera może się różnić. Przedstawione tutaj receptury są przeznaczone specjalnie dla jelita cienkiego i grubego.
- Przygotować świeży roztwór Ringera w dniu przeprowadzania eksperymentów, zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Napowietrzyć roztwór mieszanką 95% O2/5% CO2, aby zapewnić tkance dopływ O2 oraz odpowiednią pojemność buforową.
| roztwór Ringera (jelito cienkie) | roztwór Ringera (jelito grube) |
| NaHCO33 – 21,0 mM | NaHCO33 – 21,0 mM |
| K2HPO4 – 2,4 mM | K2HPO (wysoka rozdzielczość optyczna)4 – 2,4 mM |
| KH2PO4 – 0,6 mM | KH2PO4 – 0,6 mM |
| NaCl – 119,0 mM | NaCl – 119,0 mM |
| MgCl₂2 – 1,2 mM | MgCl₂2 – 1,2 mM |
| CaCl22 – 1,2 mM | CaCl₂2 – 1,2 mM |
| Indometacyna – 10 µM (Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1 mM w 21 mM NaHCO3)3, dodać 10 ml roztworu zapasu na 1 l roztworu Ringera) | Indometacyna – 10 µM (Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1 mM w 21 mM NaHCO3)3, dodać 10 mL roztworu zapasowego na 1 L roztworu Ringera) |
| 1 mM glutaminy (0,146 g/L) | 10 mM glukozy |
Tabela 1: Skład roztworu Ringera.Aby przygotować roztwór Ringera, należy zmieszać wszystkie składniki z wodą dejonizowaną. Roztwór Ringera najlepiej przygotować świeżo przed rozpoczęciem eksperymentów. Przechowywać w lodówce lub w lodzie do momentu użycia. Przed użyciem napowietrzyć mieszaniną 95% O2/5% CO2.
- Przygotować świeży bufor HEPES w dniu eksperymentu zgodnie z opisem w Tabeli 2, mieszając składniki w wodzie dejonizowanej.
- Nie dopełniać do końcowej objętości buforu przed regulacją pH.
- Podgrzać bufor HEPES do 37 °C i dostosować pH do 7.4, powoli dodając krople 1 M roztworu Tris podczas mieszania.
- Dopełnić do końcowej objętości, dodając odpowiednią ilość wody dejonizowanej.
| Bufor HEPES | Bufor HEPES do rozcieńczania |
| HEPES – 10 mM | HEPES – 10 mM |
| Glukoza – 10 mM (Jelito grube) | Glukoza – 10 mM (Jelito grube) |
| 1 mM glutaminy (0,146 g/l) (jelito cienkie) | 1 mM glutaminy (0,146 g/L) (jelito cienkie) |
| NaCl – 150 mM | NaCl – 75 mM + 150 mM mannitolu (w celu wyrównania różnic w osmolalności) |
| MgCl₂2 – 1 mM | MgCl22 – 1 mM |
| CaCl22 – 2 mM | CaCl₂2 – 2 mM |
| Indometacyna – 10 µM (Przygotować roztwór zapasowy 1 mM w 21 mM NaHCO3)3, dodać 10 ml roztworu zapasu na 1 l roztworu Ringera) | Indometacyna – 10 µM (Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 1 mM w 21 mM NaHCO3)3, dodać 10 ml roztworu zapasowego na 1 l roztworu Ringera) |
| Dostosować do pH 7,40 (37°C) przy użyciu 1 M Tris | |
Tabela 2: Skład buforu HEPES. Aby przygotować bufor HEPES oraz jego rozcieńczenie, należy rozpuścić wszystkie składniki w wodzie dejonizowanej. pH roztworów musi zostać skorygowane za pomocą 1 M roztworu Tris, dlatego nie należy dodawać pełnej objętości wody (np. przygotowując 1 L, należy rozpuścić wszystkie składniki w około 800 mL wody). Następnie roztwór należy podgrzać do 37 °C, ustawić pH na 7,4, a następnie dopełnić do końcowej objętości.
4. Konfiguracja komory Ussinga
UWAGA: Komory Ussinga użyte w tym protokole to specjalnie wykonane komory do ciągłej perfuzji. Aby ocenić funkcję bariery jelitowej lub wchłanianie składników odżywczych u myszy, zaleca się stosowanie komór z otworem o średnicy 4 lub 5 mm25 (Rysunek 1A-C).
- Aby zredukować efekt brzegowy26 i pomóc w uszczelnieniu komór, przed rozpoczęciem procedury przymocuj wyciętą dziurkaczem (otwór 4 lub 5 mm) folię parafinową (o powierzchni około 4 cm2) (Ryc. 1B).
- W celu pomiaru potencjału rozcieńczenia ustaw układ w warunkach obwodu otwartego. Wybierz tryb clamp prądowy (current clamp). Ustaw wyjście na prąd, a impuls prądowy na ±20 µA.
- W przypadku konfiguracji w warunkach zwarcia do pomiaru prądu zwarcia oraz oporności transmukozalnej, wybierz tryb clamp napięciowy (voltage clamp). Ustaw wyjście na napięcie, a impuls napięciowy na ±5 mV.
- Upewnij się, że w płaszczu wodnym krąży woda o temperaturze 37 °C.
- Napełnij każdą komorę roztworem Ringera lub buforem HEPES (ilość zależy od stosowanego systemu; w przypadku użytych tutaj komór wymagane jest 5 mL na każdą stronę) i upewnij się, że nie ma wycieków.
- Podłącz mostki solne i elektrody.
- Upewnij się, że napięcie wynosi 0 i jest stabilne; podaj impuls prądowy, aby sprawdzić, czy mostki solne i elektrody zostały prawidłowo zamontowane.
- Pozostaw układ i roztwór Ringera do wyrównania temperatury przez co najmniej 20 min.
- Po wyrównaniu temperatury skoryguj asymetryczną różnicę napięć między elektrodami KCl i skompensuj oporność cieczy, ustawiając ją na zero (sprawdź instrukcję obsługi konkretnego systemu komory Ussinga, aby ustalić prawidłową procedurę).
5. Disekcja tkanki jelitowej
UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach muszą być przeprowadzane zgodnie z przepisami obowiązującymi w danym kraju oraz na uniwersytecie.
- Przed pobraniem tkanki jelitowej przygotować świeży, lodowaty roztwór Ringera i napowietrzać go mieszaniną 95% O2 i 5% CO2 przez 15 min (krok 3).
- Znieczulić myszy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach. W tym eksperymencie myszy znieczulono izofluranem w stężeniu 2%-3% za pomocą aparatury do znieczulania. Prawidłowość znieczulenia należy sprawdzić poprzez uciśnięcie palców stopy i upewnienie się, że nie występuje reakcja bólowa.
- Nożyczkami wykonać nacięcie brzucha od miednicy do przepony; zlokalizować żołądek i przeciąć go na końcu odźwiernika.
- Chwycić pęsetą część żołądka przylegającą do jelita cienkiego i delikatnie wyciągać jelito cienkie, odcinając jednocześnie przyczepy krezkowe. Należy uważać, aby w żaden sposób nie przeciąć ani nie uszkodzić tkanki jelitowej.
- Kontynuować dysekcję jelita aż do odbytu. Aby całkowicie usunąć jelito grube, należy przeciąć kości miednicy, aby odsłonić dystalną część jelita grubego, a następnie ostrożnie usunąć resztę jelita, odcinając przyczepy.
- Zmierzyć długość jelita i podzielić je na pożądane segmenty. W tym eksperymencie jelito cienkie podzielono na trzy segmenty i wykorzystano segment środkowy.
- Umieścić wybrane segmenty w lodowatym, napowietrzanym roztworze Ringera; następnie otworzyć każdy segment wzdłużnie, przecinając go wzdłuż przyczepów krezkowych. Usunąć nadmiar tłuszczu i tkanki łącznej.
- Przenieść segmenty z powrotem do lodowatego roztworu Ringera i dokładnie wypłukać (nawet w lodowatym roztworze natlenianie nabłonka światła jelita jest istotne dla utrzymania jego funkcji).
6. Usunięcie warstwy mięśniowej i przygotowanie płata jelita
UWAGA: Usunięcie błony surowiczej (warstwy mięśniowej) jest istotne w badaniach transportu z wykorzystaniem jelita. Jeśli błona surowicza pozostanie, tkanka jelitowa może być narażona na przypadkowe skurcze mięśni, co zniekształci dane elektrofizjologiczne i może zahamować transport. Tkanka nieoczyszczona szybko ulega degradacji po umieszczeniu w komorach Ussinga, ponieważ błona surowicza stanowi znaczącą barierę dyfuzyjną dla substratu i tlenu. W niektórych szczególnych przypadkach konieczne może być pozostawienie warstwy mięśniowej, więc decyzja zależy od badacza i planu eksperymentu. Płaty jelitowe można przygotować na dwa sposoby, w zależności od tego, która warstwa zostanie usunięta (Rysunek 2). W tym eksperymencie wymagane są preparaty błony śluzowej i błony podśluzowej (Rysunek 2, 2nd panel).
- Przygotować płytki sekcyjne (10 cm średnicy) pokryte gumą silikonową, piny (małe igły do akupunktury), wycięte w okręgu o średnicy 5 mm kawałki papieru filtracyjnego oraz kwadraty z parafilmu (2 cm x 2 cm; mogą nie być niezbędne w przypadku innych układów).
- Wlać do płytki sekcyjnej świeży, lodowaty, napowietrzony roztwór Ringera (w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki, około 2-3 mL).
- Pod stereomikroskopem przypiąć końce tkanki jelita (stroną śluzówkową do dołu).
- Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie oddzielić warstwę mięśniową od leżącej pod nią błony śluzowej.
- Należy uważać, aby nie przerwać tkanki ani nie wprowadzić do niej żadnych otworów.
- Po usunięciu warstwy mięśniowej wyciąć fragment wystarczająco duży, aby przykryć otwór o średnicy 5 mm. Podczas przygotowywania jelita cienkiego usunięcie warstwy surowiczo-mięśniowej powinno zostać wykonane w ciągu 10 min, ponieważ w tych warunkach utlenowanie światła jelita jest utrudnione.
- Zmoczyć wycięty w okręgu o średnicy 5 mm kawałek papieru filtracyjnego w roztworze Ringera i położyć na nim tkankę jelita stroną śluzówkową do dołu, ponieważ preparaty podśluzówkowe samoistnie zwijają się stroną śluzówkową na zewnątrz.
- Upewnić się, że otwór jest całkowicie przykryty tkanką jelita i nie występują żadne zmarszczki. Pod preparatem należy umieścić czarną płytkę, aby sprawdzić, czy otwór jest w pełni zakryty.
- Powtórzyć tę procedurę dla wymaganej liczby preparatów śluzówki (w tym doświadczeniu wymagane są dwa preparaty: jeden zostanie wykorzystany do pomiaru potencjału rozcieńczenia, a drugi do pomiaru bazowych parametrów elektrycznych).
7. Montowanie preparatów jelitowych w komorach Ussinga
UWAGA: Konfiguracja zależy od rodzaju zastosowanego systemu komory Ussinga oraz systemu rejestracji.
- Odssać roztwór Ringera/bufor HEPES z komory Ussinga.
- Rozmontować komorę Ussinga i położyć papier filtracyjny z preparatem jelitowym stroną śluzową do dołu na komorze strony śluzowej, a następnie dopasować tak, aby okno komory pokrywało się z otworem w papierze filtracyjnym (Rysunek 1A; czarne oznaczenie wokół okna komory ułatwia wyrównanie preparatów).
- Ostrożnie nałożyć komorę strony surowiczej na komorę strony śluzowej i szczelnie zamknąć, upewniając się, że płat jelita nie przesunął się podczas łączenia.
- Szybko napełnić obie komory roztworem Ringera lub buforem HEPES i umieścić dysze napowietrzające (roztwór Ringera: 95% O2/5% CO2; bufor HEPES: 100% O2) po przeciwnej stronie komór, z dala od błony (napowietrzanie zbyt blisko preparatu może wpłynąć na pomiary).
- Ponownie podłączyć mostki solne i sprawdzić, czy napięcie jest stabilne oraz podać prąd impulsowy, aby upewnić się, że połączenia są prawidłowe (Rysunek 1C).
- Powtórzyć czynność dla każdego preparatu jelitowego.
- Pozostawić układ do equilibracji na około 15 min. W przypadku korzystania z systemu rejestracji, pozwolić na stabilizację przewodnictwa i Isc/różnicy potencjałów błonowych przed rozpoczęciem eksperymentów.
8. Eksperyment potencjału rozcieńczenia (warunki obwodu otwartego)
- Przepłucz obie strony komory, odsysając bufor HEPES i dodając 5 mL świeżego, uprzednio ogrzanego buforu HEPES na każdą stronę.
- Włącz system rejestrujący. Ustaw zakres na 250 mV (użyty tutaj system wzmacnia napięcie wyjściowe 10-krotnie), ustaw pozycje markerów i przełącz system rejestrujący w tryb pomiaru.
- Przełącz systemy komory Ussinga w tryb clamp i rozpocznij pomiary. Po ustabilizowaniu się potencjału błonowego (~15-20 min) można rozpocząć ocenę.
- Odsyj bufor HEPES ze strony śluzowej i szybko zastąp go 5 mL ogrzanego rozcieńczonego buforu HEPES zawierającego 75 mM NaCl.
- Gdy potencjał błonowy osiągnie wartość maksymalną (5-10 min), usuń bufor rozcieńczający ze strony śluzowej i zastąp go buforem HEPES.
- W razie potrzeby powtórz krok 3 dla strony surowiczej, dodając rozcieńczony bufor HEPES po stronie surowiczej.
- Aby upewnić się, że tkanka jest żywotna, dodaj do strony surowiczej forskolinę, aktywator cyklazy adenylanowej (stężenie końcowe 10 µM).
- Eksperyment kończy się w momencie, gdy różnica potencjałów błonowych osiągnie szczyt i zacznie spadać.
9. Pomiar transepithelialnego przewodnictwa elektrycznego i bazowego Isc (w warunkach zwarcia)
- Przemyj obie strony komory, odsysając roztwór Ringera i dodając 5 mL świeżego, napowietrzonego roztworu Ringera na każdą stronę.
- Włącz system rejestrujący. Ustaw zakres na 2.5 V (system użyty w tej procedurze wzmacnia napięcie wyjściowe 10-krotnie), ustaw pozycje znaczników i przełącz system rejestrujący w tryb pomiaru.
- Przełącz systemy komory Ussinga w tryb clamp i rozpocznij pomiary; po ustabilizowaniu się wartości Isc oraz przewodnictwa (~15-20 min) można uzyskać pomiary bazowe.
- Aby upewnić się, że tkanka jest żywotna, dodaj do strony surowiczej aktywator cyklazy adenylanowej, forskolinę (stężenie końcowe 10 µM).
- Eksperyment kończy się w momencie, gdy różnica potencjałów błonowych osiągnie szczyt i zacznie spadać.
10. Analiza wyników
- W warunkach otwartego obwodu obliczyć przewodnictwo transmukozalne na podstawie zmiany napięcia w odpowiedzi na impulsy prądowe, zgodnie z prawem Ohma. Wyznaczyć równoważny prąd zwarcia (Isc) z napięcia transmukozalnego i przewodnictwa, stosując prawo Ohma.
- Wykorzystać potencjał rozcieńczenia NaCl do obliczenia względnej selektywności jonowej (PNa/PCl) za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza10.
- Oszacować absolutną selektywność połączeń ścisłych dla każdego jonu, korzystając z równania Kimizuki-Koketsu11.
- Obliczyć PNa/PCl za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza z potencjałów rozcieńczenia oraz wyznaczyć absolutne przepuszczalności PNa i PCl z równania Kimizuki-Koketsu, zgodnie z opisem Yu i wsp.10, w następujący sposób:
gdzie, V: potencjał rozcieńczenia (mV); α: stosunek aktywności. Obliczona aktywność NaCl w buforze HEPES podzielona przez obliczoną aktywność NaCl w rozcieńczonym buforze HEPES (dla tego doświadczenia obliczono ją jako 1,8966); e: stała matematyczna, 2,71828; GM: przewodnictwo transmukozalne (mS/cm2); F: stała Faradaya (96,485.3329 C/mol); R: stała gazowa (8,314 J/mol K); T: temperatura (310,15 K)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki przedstawione w niniejszej pracy stanowią część większego, zakończonego już projektu (patrz ref.4,23,24).
Przewodnictwo elektryczne transepitelialne jelita cienkiego jest zmniejszone u myszy Cldn15-/-.
Bazowe przewodnictwo transmukozalne (w warunkach zwarcia) środkowego segmentu jelita cienkiego u myszy ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym eksperymencie wykorzystano komory Ussinga do pomiaru podstawowych parametrów elektrycznych i potencjału rozcieńczania NaCl w jelicie cienkim myszy Cldn15-/- i WT. Bardzo ważne jest, aby podczas wykonywania doświadczeń w komorze Ussinga sprawdzić, czy preparat membranowy użyty w eksperymentach jest opłacalny. Zwykle odbywa się to poprzez dodanie glukozy lub aktywatora cyklazy adenylanowej forskoliny i sprawdzenie, czy występuje odpowiedni wzrost Isc (100-300 μA /cm2...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia potencjalnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca jest obsługiwana przez 17K00860 (do HH) i 19K20152 (do NI). WH pragnie podziękować Fundacji Stypendialnej Otsuka Toshimi za wsparcie finansowe w latach 2018-2021.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #3 rurki polietylenowe | Hibiki | średnica zewnętrzna 1,0 mm; średnica wewnętrzna 0,5 mm | |
| #7 rurki polietylenowe | Hibiki | średnica zewnętrzna 2,3 mm; średnica wewnętrzna 1,3 mm | |
| Strzykawka blokująca 10 ml | Terumo | SS-10LZ | Strzykawki blokujące są niezbędne, aby zapobiec przemieszczaniu się igły podczas napełniania |
| igły 19 g | Terumo | NN-1938R | Zachowaj ostrożność podczas pracy z igłami i wyrzuć do pojemnika na ostre |
| Igła 23 g | Terumo | NN-2332R | Zachowaj ostrożność podczas pracy z igłami i wyrzuć do pojemnika na ostre przedmioty |
| Dziurkacz 5 mm | NA | NA | Służy do przebijania otworów w bibule filtracyjnej i parafilmie |
| igły do akupunktury | Seirin | NS | Używany jako szpilki preparacyjne do przypinania tkanki do płytki rozwarstwiającej |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Zaciski krokodylkowe | NA | NA | Łączy elektrodę ze wzmacniaczem |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | Służy do korygowania różnicy osmolalności w rozcieńczeniu Bufor HEPES |
| D(+)-Glukoza | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| do preparacji | Będziesz potrzebować, nożyczki i zakrzywione kleszcze | ||
| Płytki | Użyliśmy 10 cm płytek do hodowli komórkowych i pokrytych gumą silikonową | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | Do robienia zapasu forskoliny |
| Rejestrator elektryczny | TOA Electronics | PRR-5041 | Inne równoważne rejestratory elektryczne są dostępne na rynku |
| Nabłonkowy wzmacniacz cęgowy | Nihon Kohden CEZ9100 | Inne równoważne wzmacniacze są dostępne komercyjnie | |
| bibuła filtracyjna, pocięta na kwadraty | NA NA | Dziurkowany dziurkaczem 5 mm, służy do przytrzymywania preparatu jelitowego | |
| drobne kleszcze | Fast Gene | FG-B50476 | Do rozwarstwienia warstwy mięśniowej |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Zrób 10 mM zapasów w DMSO, końcowe stężenie wyniesie 10 i mikro; M |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indometacyna | Sigma | I7338-5G | Zrób 1 mM zapas w 21 mM NaHCO3, końcowe stężenie wynosi 10 &mikro; M |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/elektroda kalomelowa | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamina | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Gaz mieszany (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Służy do bulgotania roztworu Ringera i komór podczas korzystania z roztworu Ringera | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| Elektroda NaCl | NA | NA Ręcznie robione elektrody, które wymagają skoncentrowanego NaCl i drutu srebrnego | |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Służy do komór bąbelkowania podczas korzystania z parafilmu buforowego HEPES | |
| Bemis | PM-996 | Służy do uszczelniania komór Ussing | |
| pH-metr | DKK-TOA Corp | HM-305 | Bufor HEPES należy dostosować do pH 7,4 przy 37 & stopniach; C |
| Elektroda pH-TOA | Corp | GST-5311C | |
| guma silikonowa | Shinetsu Chemical | KE-12 | Służy do wypełniania płytek rozwarstwiających |
| srebrny drut | Służy do produkcji elektrod NaCl | ||
| Małe słoiki z plastikowymi pokrywkami | NA NA Służy | do elektrod NaCl | |
| stereoskop | Zeiss | Stemi 305 | Mikroskop stereoskopowy pozwala zobaczyć głębię, dzięki czemu można łatwiej wypreparować tkankę |
| Tris (podstawa Trizma) | Sigma | T1503-1KG | Przygotuj roztwór 1M do regulacji pH HEPES |
| Komory uspensowe | Sanki Kagaku Kougei | Komory te są wykonywanymi na zamówienie komorami z ciągłą perfuzją o średnicy okna 5 mm | |
| Pompa wodna i system grzewczy | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | Zobacz materiał NTT-110 |
Bibliografia
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3', 5'-AMP. American Journal of Physiology - Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology - Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907(2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032(2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, John Wiley & Sons, Inc. 1-19 (2017).
- Östh, K. The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery - Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , Uppsala University. Dissertation thesis (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703(2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376(2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
