Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62491

⸱

5 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Streszczenie

EMBL Grenoble prowadzi Laboratorium Krystalizacji o Wysokiej Przepustowości (HTX Lab), duży obiekt dla użytkowników oferujących usługi krystalograficzne o wysokiej przepustowości dla użytkowników na całym świecie. Laboratorium HTX kładzie duży nacisk na rozwój nowych metod w krystalografii makromolekularnej. Dzięki połączeniu wysokowydajnej platformy krystalizacji, technologii CrystalDirect do w pełni zautomatyzowanego montażu kryształów i kriochłodzenia oraz oprogramowania CRIMS opracowaliśmy w pełni zautomatyzowane rurociągi do krystalografii makromolekularnej, które mogą być zdalnie obsługiwane przez Internet. Obejmują one proces przetwarzania białka do struktury w celu określenia nowych struktur, proces szybkiej charakterystyki kompleksów białko-ligand w celu wsparcia chemii medycznej oraz zakrojony na szeroką skalę, zautomatyzowany proces przesiewowy fragmentów, umożliwiający ocenę bibliotek zawierających ponad 1000 fragmentów. W tym miejscu opisujemy, jak uzyskać dostęp do tych zasobów i jak z nich korzystać.

Wprowadzenie

Automatyzacja została wprowadzona na wszystkich etapach eksperymentalnego procesu krystalografii makromolekularnej, od krystalizacji po zbieranie i przetwarzanie danych dyfrakcyjnych1,2,3,4,5,6,7,8,9, w tym szereg technologii do przykładowego montażu10,11,12,13,14,15,16,17. To nie tylko przyspieszyło tempo, w jakim uzyskiwane są struktury krystalograficzne, ale także przyczyniło się do usprawnienia zastosowań, takich jak projektowanie leków sterowane strukturą18,19,20,21,22,23,24. W tym manuskrypcie opisujemy niektóre aspekty zautomatyzowanych rurociągów krystalograficznych dostępnych w laboratorium HTX w Grenoble, a także leżące u ich podstaw technologie.

Laboratorium HTX w EMBL Grenoble jest jednym z największych ośrodków akademickich zajmujących się badaniami przesiewowymi krystalizacji w Europie. Znajduje się on na terenie Europejskiego Kampusu Fotonów i Neutronów (EPN) wraz z Europejskim Ośrodkiem Promieniowania Synchrotronowego (ESRF), który wytwarza jedne z najbardziej błyskotliwych promieni rentgenowskich na świecie, oraz Institut Laue Langevin (ILL), który dostarcza wiązki neutronów o wysokim strumieniu. Od początku swojej działalności w 2003 roku laboratorium HTX świadczy usługi dla ponad 800 naukowców i przetwarza ponad 1000 próbek rocznie. Laboratorium HTX kładzie duży nacisk na rozwój nowych metod krystalografii makromolekularnej, w tym metod oceny próbek i kontroli jakości25,26 oraz technologii CrystalDirect, umożliwiającej w pełni zautomatyzowane montowanie i przetwarzanie kryształów15,16,17. Laboratorium HTX opracowało również System Zarządzania Informacją Krystalograficzną (CRIMS), internetowy laboratoryjny system informacyjny, który zapewnia zautomatyzowaną komunikację między urządzeniami do krystalizacji i gromadzenia danych synchrotronowych, umożliwiając nieprzerwany przepływ informacji w całym cyklu próbki, od czystego białka do danych dyfrakcyjnych. Dzięki połączeniu możliwości zakładu HTX, technologii CrystalDirect i oprogramowania CRIMS, opracowaliśmy w pełni zautomatyzowane rurociągi białko-struktura, integrujące badania przesiewowe krystalizacji, optymalizację kryształów, zautomatyzowane przetwarzanie kryształów i kriochłodzenie oraz gromadzenie danych rentgenowskich w wielu synchrotronach w jeden i ciągły przepływ pracy, który może być zdalnie obsługiwany za pomocą przeglądarki internetowej. Rurociągi te mogą być stosowane do szybkiego określania nowych struktur, charakteryzowania kompleksów białko-ligand oraz badań przesiewowych związków i fragmentów na dużą skalę za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Laboratorium HTX jest wyposażone w robota do krystalizacji bez objętości (w tym moduł LCP, który umożliwia krystalizację zarówno białek rozpuszczalnych, jak i błonowych), farmy kryształów (w temperaturze 5 °C i 20 °C), dwie zrobotyzowane stacje obsługi cieczy do przygotowania ekranów krystalizacji oraz dwa automatyczne kombajny do zbierania kryształów CrystalDirect o zdolności do produkcji i przechowywania do 400 zamrożonych próbek na cykl operacyjny. Naukowcy wysyłają swoje próbki do placówki ekspresowym kurierem, które są następnie przetwarzane przez dedykowanych techników w laboratorium HTX. Naukowcy mogą zdalnie projektować badania przesiewowe krystalizacji i eksperymenty optymalizacyjne za pośrednictwem interfejsu internetowego dostarczanego przez system CRIMS. Za pomocą tego interfejsu mogą wybierać spośród szerokiej gamy parametrów i protokołów eksperymentalnych dostępnych w placówce, aby dopasować je do konkretnych wymagań dotyczących próbek. Wyniki wraz ze wszystkimi parametrami eksperymentalnymi są udostępniane użytkownikom w czasie rzeczywistym za pośrednictwem CRIMS. Wszystkie otrzymane próbki są oznaczane za pomocą specjalnie opracowanej metody, która umożliwia oszacowanie prawdopodobieństwa krystalizacji próbki25,26,27. Na podstawie wyników tego testu formułowane są szczegółowe zalecenia dla użytkowników dotyczące optymalnej temperatury inkubacji i możliwych eksperymentów optymalizujących próbki. Po skonfigurowaniu eksperymentów krystalizacji naukowcy mogą ocenić wyniki, patrząc na obrazy krystalizacji zebrane w różnych punktach czasowych za pośrednictwem sieci. Po zidentyfikowaniu kryształów nadających się do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej, naukowcy mogą użyć dedykowanego interfejsu do ustalenia planu montażu kryształów, który zostanie następnie wykonany przez robota CrystalDirect.

Technologia CrystalDirect opiera się na użyciu zmodyfikowanej mikropłytki krystalizacyjnej dyfuzji parowej oraz wiązki laserowej do montażu i kriochłodzenia próbek kryształów w sposób zgodny z dyfrakcją, co pozwala wypełnić lukę w automatyzacji istniejącą między krystalizacją a zbieraniem danych15,16,17. Krótko mówiąc, kryształy są hodowane na zmodyfikowanej płytce dyfuzyjnej, mikropłytce CrystalDirect. Po pojawieniu się kryształów robot zbierający CrystalDirect automatycznie przykłada wiązkę laserową do wycięcia kawałka filmu zawierającego kryształ, przymocowuje go do standardowego kołka do zbierania danych dyfrakcyjnych i chłodzi w strumieniu azotu (patrz Zander i in. 2016 i https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Technologia ta ma szereg dodatkowych zalet w porównaniu z ręcznymi lub półautomatycznymi protokołami montażu kryształów. Na przykład rozmiar i kształt kryształów nie stanowi problemu, co sprawia, że równie łatwo jest zbierać duże kryształy lub mikrokryształy, często można uniknąć stosowania krioprotektorantów, ze względu na specjalny sposób, w jaki działa ta technologia (patrz odniesienie 17, Zander i wsp.), dzięki czemu analiza dyfrakcji rentgenowskiej jest znacznie prostsza. Wiązka laserowa może być również używana jako narzędzie chirurgiczne do wybierania najlepszych części próbki, gdy kryształy rosną na skupiskach lub wykazują na przykład wzrost epitaksjalny. Technologia CrystalDirect może być również wykorzystywana do zautomatyzowanych eksperymentów z namaczaniem17. Dostarczanie roztworów z małymi cząsteczkami lub innymi substancjami chemicznymi do kryształów. Tym samym umożliwia w pełni zautomatyzowane, wielkoskalowe przesiewanie związków i fragmentów. Po zebraniu i schłodzeniu kriogenicznym kryształów przez robota CrystalDirect są one przenoszone do krążków SPINE lub Unpuck, które są kompatybilne z większością synchronicznych linii badawczych krystalografii makromolekularnej na całym świecie. System może zebrać do 400 pinów (pojemność kriogenicznego magazynu Dewara) w sposób w pełni autonomiczny. CRIMS komunikuje się z robotem harwesterowym podczas procesu i zapewnia automatyczne śledzenie próbek kryształów (krążków i szpilek). Krążki są oznaczone zarówno kodami kreskowymi, jak i znacznikami RFID, aby ułatwić zarządzanie próbkami21,28.

CRIMS dostarcza interfejs programu aplikacyjnego (API) wspierający automatyczną komunikację z systemem ISPyB, wspierającym gromadzenie danych rentgenowskich, zarządzanie i przetwarzanie w wielu synchrotronach w Europie i na świecie29. Po zakończeniu automatycznego zbierania kryształów naukowcy mogą wybrać próbki kryształów (krążki) i utworzyć przesyłki próbek dla linii badawczych krystalografii makromolekularnej w ESRF (Grenoble, Francja)7,8,9 lub synchrotronach Petra III (Hamburg, Niemcy)18,19. CRIMS przesyła dane odpowiadające wybranym próbkom z linii badawczej do synchrotronowego systemu informacyjnego wraz z wcześniej wybranymi parametrami zbierania danych. Gdy próbki dotrą do wybranej linii synchrotronowej, zbieranie danych rentgenowskich odbywa się albo ręcznie, poprzez zdalną obsługę linii badawczej, albo w sposób w pełni zautomatyzowany (tj. na linii badawczej MASSIF-1 ESRF8 obsługiwanej przez wspólną EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Po zebraniu danych CRIMS automatycznie pobiera informacje o wynikach zbierania danych wraz ze wstępnymi wynikami przetwarzania danych przeprowadzonymi przez systemy przetwarzania danych synchrotronowych i prezentuje je naukowcowi za pomocą wygodnego interfejsu użytkownika.

Laboratorium HTX stosuje te zautomatyzowane potoki do obsługi trzech różnych zastosowań, szybkiego oznaczania nowych struktur, szybkiej charakterystyki kompleksów białko-ligand oraz badań przesiewowych związków i fragmentów na dużą skalę. Poniżej opisujemy, jak z nich korzystać i obsługiwać.

Protokół

UWAGA: Finansowany dostęp do tych rurociągów dla naukowców na całym świecie jest wspierany przez szereg programów finansowania. W chwili pisania tego manuskryptu wnioski o dostęp są przyjmowane za pośrednictwem programu iNEXT Discovery (https://inext-discovery.eu), europejskiej sieci placówek stymulujących translacyjną biologię strukturalną20 finansowanego przez program Horyzont 2020 Komisji Europejskiej lub INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Skontaktuj się z autorem korespondencyjnym, aby uzyskać aktualne warunki i trasy finansowanego dostępu w określonym czasie. Ten protokół opisuje działanie potoku białko-struktura i zawiera kroki wspólne dla wszystkich naszych potoków, podczas gdy specyfika dla pozostałych dwóch potoków została omówiona w następnej sekcji. Poniższe instrukcje odnoszą się do CRIMS V4.0.

1. Laboratorium Krystalizacji o Wysokiej Przepustowości

  1. Przed rozpoczęciem należy poprosić o rejestrację w laboratorium HTX za pośrednictwem systemu CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. Poświadczenia użytkownika zapewniają zdalny dostęp do wszystkich interfejsów projektowania i oceny eksperymentów.
    1. Zaloguj się do CRIMS za pomocą nawigatora internetowego (obsługiwane są przeglądarki Firefox, Chrome i Safari). Serwer WWW CRIM jest szyfrowany, aby uniemożliwić osobom trzecim dostęp do danych podczas ich przesyłania przez sieć. Po wejściu do CRIMS szereg menu po lewej stronie ekranu pomaga zarządzać próbkami i je tworzyć, żądać eksperymentów krystalizacji, zarządzać płytkami i wizualizować je itp. Seria filmów instruktażowych jest dostępna na stronie https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
      UWAGA: Użytkownicy wysyłający próbki kurierem muszą zarejestrować próbki i żądane eksperymenty krystalizacji za pośrednictwem CRIMS przed wysłaniem próbki, aby upewnić się, że mogą one zostać przetworzone niezwłocznie po przybyciu. Prosimy o przesłanie szczegółów przesyłki na adres htx@embl.fr.
  2. Zaloguj się do CRIMS (https://htxlab.embl.fr ) za pomocą przeglądarki internetowej i kliknij w menu Samples. Spowoduje to otwarcie interfejsu z narzędziami do zarządzania projektami i próbkami.
  3. Kliknij przycisk Nowy próbka i podaj wymagane informacje. CRIMS pozwala na organizowanie próbek w ramach różnych projektów, celów i konstrukcji. Przypisz próbkę do istniejących lub utwórz nowe w tym momencie.
  4. Po wprowadzeniu wymaganych informacji kliknij Zapisz i złóż żądanie. Wybierz protokół krystalizacji, ekrany krystalizacji, które mają być użyte, temperaturę inkubacji i żądaną datę eksperymentów.
    1. Użyj pól komentarza, aby podać wskazówki dotyczące próbek, które są ważne dla operatorów laboratoriów HTX. Można również wybrać niestandardowe ekrany (patrz poniżej). Po przesłaniu wniosku o krystalizację zostanie on zweryfikowany przez Zespół HTX Lab, a potwierdzenie o harmonogramie eksperymentów zostanie wysłane e-mailem. Upewnij się, że wybrane daty eksperymentu są zgodne z czasem wymaganym do wysyłki próbki.
  5. Gdy próbki dotrą do placówki, operatorzy w laboratorium HTX przeprowadzą eksperymenty zgodnie z żądaniem. Po skonfigurowaniu eksperymentów krystalizacji potwierdzenie zostanie wysłane e-mailem, a tace krystalizacyjne zostaną przesłane do automatycznych imagerów. CRIMS zapewnia dostęp do wszystkich parametrów eksperymentalnych i automatycznie śledzi nowe sesje obrazowania. Powiadomienia e-mail będą wysyłane automatycznie, gdy dostępne będą nowe obrazy. Eksperyment oceny jakości próbki oparty na termofluorze30 oparty na protokole opracowanym w placówce25,26 jest przeprowadzany z każdą próbką w tym momencie i będzie dostępny za pośrednictwem CRIMS.
  6. Obrazy z eksperymentów krystalizacji wraz z wynikami oceny jakości próbki będą dostępne w CRIMS wkrótce po ustawieniu tac do krystalizacji. Kliknij menu Thermofluor i przejdź do próbki, aby zobaczyć wyniki eksperymentu oceny jakości próbki.
    1. Kliknij menu Płyty, aby zobaczyć obrazy z płyt krystalizacyjnych. Przejdź do próbki i kliknij Widok, aby zobaczyć ostatnią sesję obrazowania, lub symbol + (rozwiń), aby wybrać inną sesję obrazowania. Szereg narzędzi pomaga w łatwym znajdowaniu próbek i poruszaniu się po nich. Na przykład kliknięcie pola projektu u góry ekranu filtruje próbki dla tego projektu, a funkcje wyszukiwania są dostępne dla większości kolumn tabeli.
  7. Użyj interfejsu plate View, aby pomóc w ocenie i ocenie wyników eksperymentów krystalizacji. Umożliwia na przykład nawigację po różnych dołkach płytek krystalizacyjnych, wybór typów obrazów (np. Vis, UV), wybór rozdzielczości obrazu lub zapis wyników. Interfejs ten zapewnia również wszystkie parametry eksperymentalne używane w eksperymentach krystalizacji, w tym skład roztworów krystalizacyjnych.
  8. Kliknij menu Udoskonalenie, aby zaprojektować ekrany optymalizacji kryształów w oparciu o podstawowe warunki trafienia zidentyfikowane podczas początkowego przesiewu. Podmenu Chemikalia i Roztwory podstawowe umożliwiają rejestrację i zarządzanie roztworami podstawowymi krystalizacji. Podmenu Ekrany zapewnia dostęp do interfejsu umożliwiającego zaprojektowanie własnej optymalizacji lub niestandardowych ekranów.
    1. Wybierz typ płyty, roztwory podstawowe lub konfiguracje gradientu, które najlepiej pasują do projektu eksperymentalnego. Możliwe jest poproszenie CRIMS o wyprowadzenie pliku bezpośrednio kompatybilnego z robotem Formulator (Formulatrix) w celu automatycznego pipetowania sitek do płytki lub wydrukowania dokumentu z objętościami do obsługi ręcznej.
  9. Wykonaj iteracje przez kroki 1.2-1.8, aby przeprowadzić eksperymenty z optymalizacją kryształów.
  10. Po zidentyfikowaniu kryształów nadających się do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej przejdź do interfejsu Widok płyty i wybierz obraz odpowiadający prawej kropli krystalizacji. Wstępnie zapisane wyniki pomogą Ci to łatwo zrobić.
    1. Kliknij opcję Zbieranie kryształów, aby zarejestrować plan automatycznego zbierania kryształów dla robota zbierającego kryształy CrystalDirect lub opcję Ręczne zbieranie, aby uzyskać tradycyjny ręczny montaż kryształów, jeśli używasz CRIMS w obiekcie, który nie jest wyposażony w CrystalDirect. Oba interfejsy poprowadzą użytkownika przez proces zbierania kryształów. CRIMS automatycznie zarejestruje i zapisze lokalizację zebranych kryształów w SPINE lub Unipucks21.
  11. Wybierz menu Crystal Manager w CRIMS. Kliknij podmenu Zebrane kryształy, aby sprawdzić zamrożone próbki. Podczas korzystania z kombajnu CrystalDirect prezentowane są obrazy procesu zbioru, w tym obrazy pinów z zebranymi kryształami.
  12. Wybierz menu Przesyłki, aby połączyć się z synchrotronami ESRF lub Petra III i utworzyć przesyłki próbek do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Kliknij przycisk Utwórz przesyłkę i wybierz synchrotron, którego chcesz użyć oraz numer bagażu (tutaj konieczne jest hasło do torby na synchrotronie). Kolejna seria interfejsów służy do wyboru pukców, które mają zostać uwzględnione w przesyłce. System umożliwia dostarczanie komentarzy w celu wsparcia zbierania danych i określania parametrów zbierania danych dla zautomatyzowanych linii badawczych, takich jak MASSIF-1.
  13. Jeśli zbieranie danych odbywa się w laboratorium ESRF lub Petra III HTX, operatorzy przeniosą próbki na linię badawczą, zbieranie danych na innych synchrotronach będzie odbywać się na własny koszt. Możliwe jest zbieranie danych poprzez podróż do synchrotronu, poprzez zdalną obsługę linii badawczej lub w MASSIF-1. W tym drugim przypadku proces zbierania danych jest w pełni zautomatyzowany. W synchrotronie specjalne interfejsy w ISPyB29 pozwalają użytkownikom odzyskać informacje wysłane przez CRIMS i powiązać z nimi krążki z próbkami, dzięki czemu wyniki zbierania danych są automatycznie śledzone. W opisanych tutaj eksperymentach zbieranie danych w synchrotronach było zazwyczaj przeprowadzane za pomocą oprogramowania MXcube31, podczas gdy przetwarzanie danych i udoskonalanie struktury było przeprowadzane za pomocą atuoPROC32, Staraninso33, BUSTER33, Pipedream32,33 i Coot35.
  14. Po przeprowadzeniu eksperymentów zbierania danych, CRIMS pobiera informacje podsumowujące wraz z wynikami wstępnego przetwarzania danych w synchrotronie z systemu ISPyB29. Przejdź do menu CRIMS Crystal Manager i kliknij podmenu Dane dyfrakcji kryształów. Dostępne są wszystkie informacje i metadane dotyczące zbierania danych dyfrakcyjnych. Możliwe jest również pobieranie przetworzonych danych z synchrotronu, a także surowych obrazów dyfrakcyjnych. Wyświetlanie wielu kolekcji danych lub wybieranie określonych zestawów danych. Narzędzia do zarządzania próbkami umożliwiają nawigację i wybieranie próbek dla konkretnych projektów constructs.
    UWAGA: Ten rurociąg zapewnia w pełni zautomatyzowaną pracę przez Internet od czystego białka do wyników dyfrakcji rentgenowskiej i może być obsługiwany z jedną lub wieloma próbkami w tym samym czasie. Można go zastosować do różnych kontekstów i typów projektów w biologii strukturalnej.

Wyniki

Opisany powyżej zautomatyzowany proces krystalograficzny został zastosowany w wielu wewnętrznych i zewnętrznych projektach, przynosząc znaczące sukcesy. Do najważniejszych osiągnięć należy projekt prowadzony przez Djinović-Carugo i współpracowników z Max Perutz Laboratories (Wiedeń), skupiający się na analizie strukturalnej i funkcjonalnej dipeptydylopeptydazy niezbędnej do wzrostu patogenu bakteryjnego. Szybka sekwencja cykli przesiewania krystalizacji, oceny dyfrakcji, optymalizacji kryształów i zbierania danych rentgenowskich (do 8 iteracji w tym projekcie) umożliwiła uzyskanie modeli strukturalnych dla trzech różnych stanów konformacyjnych białka w zaledwie kilka tygodni, co dostarczyło kluczowych informacji mechanistycznych na temat funkcji tej klasy białek36 (patrz Rysunek 1).

Kolejnym przykładem są badania Maciasa i współpracowników z Instytutu Badań Biomedycznych (IRB, Barcelona), którzy połączyli narzędzia bioinformatyczne i podejścia strukturalne w celu zidentyfikowania nowych motywów wiązania DNA dla czynników transkrypcyjnych SMAD3 i SMAD4 zaangażowanych w regulację losów komórek. Praca ta pozwoliła na uzyskanie 6 struktur o wysokiej rozdzielczości SMAD3 i SMAD4 w kompleksie z różnymi motywami wiązania DNA37,38, co ujawniło dotąd nieznaną zdolność tych czynników transkrypcyjnych do rozpoznawania i wiązania się z różnorodnym zestawem sekwencji DNA, co ma kluczowe znaczenie dla interpretacji ich funkcji w różnych kontekstach biologicznych. Technologie te zostały również zastosowane do wsparcia badań zastrzeżonych w ramach projektów projektowania leków realizowanych przez grupy badawcze w firmach farmaceutycznych i biotechnologicznych. Na przykład, dzięki szybkości zapewnianej przez te potoki przetwarzania danych, analiza strukturalna wielu kompleksów ligand-cel może zostać przeprowadzona w ciągu kilku dni, co jest niezwykle cenne dla wsparcia kolejnych rund optymalizacji chemii medycznej w kontekście opracowywania leków. W końcu zastosowaliśmy tę infrastrukturę również do wielkoskalowego screeningu fragmentów opartego na krystalografii rentgenowskiej39.

Schemat zautomatyzowanego procesu krystalograficznego; projekt eksperymentu, przesiewanie, optymalizacja, zbieranie danych.
Rycina 1: Zautomatyzowany proces krystalograficzny. Zintegrowane działanie laboratorium EMBL HTX, obejmujące technologię CrystalDirect oraz oprogramowanie CRIMS z linią wiązki MASSIF-1 w ESRF, a także zautomatyzowana komunikacja między oprogramowaniem CRIMS a ISPyB, umożliwiają wsparcie w pełni zautomatyzowanego, zdalnie sterowanego procesu prowadzącego od białka do struktury, integrującego przesiewanie i optymalizację krystalizacji, zautomatyzowany zbiór kryształów i chłodzenie kriogeniczne oraz zautomatyzowane zbieranie i przetwarzanie danych. Modele strukturalne odpowiadają trzem różnym stanom konformacyjnym proteazy z bakterii patogennej, zidentyfikowanej w rekordowym czasie dzięki zastosowaniu tego procesu36. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisane tutaj zautomatyzowane procesy krystalograficzne są dostępne dla naukowców na całym świecie w ramach różnych programów finansowania. Obecnie dostęp do eksperymentów krystalizacji i technologii CrystalDirect można uzyskać poprzez zgłoszenie do programu iNEXT Discovery i INSTRUCT-ERIC, natomiast dostęp do linii badawczych krystalografii makromolekularnej w ESRF jest wspierany przez program dostępu dla użytkowników ESRF. Takie podejście minimalizuje opóźnienie między wzrostem kryształów a pomiarem, przyspieszając postęp bardzo trudnych projektów, które wymagają dyfrakcyjnej optymalizacji warunków produkcji białek i krystalizacji oraz uwalnia naukowców od skomplikowanych operacji związanych z krystalizacją, obsługą kryształów i obsługą linii badawczej, dzięki czemu krystalografia jest bardziej dostępna dla grup niebędących ekspertami. Może być również stosowany do szybkiej eksploracji dodatków krystalizacyjnych, środków fazujących lub do badania przesiewowego związków poprzez eksperymenty z kokrystalizacją. Podczas gdy większość projektów krystalograficznych mogłaby potencjalnie skorzystać z tego podejścia, niektóre próbki mogą wymagać specjalnych protokołów, które nie podlegają automatyzacji lub przedstawionym tutaj rurociągom, na przykład te, które wymagają systemów mikroprzepływowych lub wysoce wyspecjalizowanych urządzeń do krystalizacji lub próbek, które są wyjątkowo labilne i nie tolerują transportu.

Technologia CrystalDirect umożliwia również automatyczne namaczanie kryształów17 w celu scharakteryzowania kompleksów małych cząsteczek-cel. W tym celu przed procesem zbioru za pomocą lasera tworzy się mały otwór, a na wierzch dodaje się kroplę roztworu zawierającego pożądane substancje chemiczne (tj. środki fazowe lub potencjalne ligandy), tak aby weszła w kontakt z roztworem krystalizacyjnym i dyfundowała do niego, ostatecznie docierając do kryształu. Roztwory chemiczne mogą być formułowane w wodzie, DMSO lub innych rozpuszczalnikach organicznych. Po pewnym czasie inkubacji kryształy można zebrać i przeanalizować za pomocą dyfrakcji, jak opisano powyżej. Podejście to zostało zastosowane do szybkiej charakterystyki kompleksów ligand-białko w kontekście projektowania leków opartych na strukturze, a także do badań przesiewowych na dużą skalę związków i fragmentów. W tym drugim przypadku można szybko przeanalizować biblioteki fragmentów zawierające od setek do ponad tysiąca fragmentów. Specyficzne interfejsy CRIMS, które nie zostały tutaj przedstawione, ułatwiają projektowanie i automatyczne śledzenie eksperymentów z moczeniem kryształów, podczas gdy integracja między oprogramowaniem CRIMS a pakietem oprogramowania Pipedream, opracowanym przez Global Phasing Ltd (Wielka Brytania), umożliwia automatyczne przetwarzanie danych, fazowanie, identyfikację ligandów i udoskonalanie struktury na setkach zestawów danych równolegle, usprawniając analizę i interpretację danych32,33. Na przykład, proces ten został niedawno zastosowany do identyfikacji fragmentów wiążących się zarówno z miejscem aktywnym, jak i kilkoma miejscami allosterycznymi syntazy pirofosforanu farnezylu Trypanosoma brucei , kluczowego enzymu pasożyta wywołującego ludzką trypanosomatozę afrykańską.

Przedstawione tu badania mogą przyczynić się do przyspieszenia tempa odkryć w biologii strukturalnej i sprawić, że krystalografia makromolekularna stanie się bardziej dostępna dla większej liczby grup badawczych. Ponadto, ułatwiając badania przesiewowe na dużą skalę związków i fragmentów, mogą one przyczynić się do wspierania badań translacyjnych i przyspieszenia procesu odkrywania leków, przyczyniając się do ułatwienia opracowywania lepszych i bezpieczniejszych leków przeciwko większej liczbie celów.

Oświadczenia

JAM jest współautorem patentu na system CrystalDirect

Podziękowania

Chcemy podziękować połączonej Grupie Biologii Strukturalnej EMBL-ESRF (JSBG) za wsparcie w korzystaniu i eksploatacji makromolekularnych linii badawczych ESRF. Jesteśmy wdzięczni Matthew Bowlerowi za wsparcie w zbieraniu danych na linii badawczej MASSIF-1 ESRF oraz Thomasowi Schneiderowi i zespołowi EMBL Hamburg za doskonałe wsparcie w zbieraniu danych na P14 synchrotronu PetraIII (DESY, Hamburg, Niemcy). Kombajn CrystalDirect został opracowany we współpracy z zespołem ds. oprzyrządowania w EMBL Grenoble. Projekt ten został dofinansowany ze środków programu Wspólnoty Europejskiej H2020 w ramach projektów iNEXT (grant nr 653706) i iNEXT Discovery (grant nr 871037) oraz regionu Owernia-Rodan-Alpy w ramach programu Booster.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kombajn CrystalDirectArinaxZautomatyzowany montaż kryształów i kriochłodzenie
CrystalDirect Płytka krystalizacyjnaMitegenSKU: M-XDIR-96-296-dołkowa mikropłytka do krystalizacji
Formulator 16FormulatrixDo automatycznego przygotowania sit krystalizacji
Robot do krystalizacji komarówSPT LabtechDo przygotowania eksperymentów krystalizacyjnych
Tecan Evo Stacja obsługi cieczyTecanDo przygotowania roztworów krystalizacyjnych
KrążkiMitegenSKU: M-SP-SC3-1Krążki kriogeniczne kompatybilne ze SPINE do automatycznych synchrotronowych wymienników próbek
UniPucksMitegenSKU: M-CP-111-021Uniwersalne krążki kriogeniczne do automatycznych synchrotronowych wymienników próbek
kręgosłupa

Bibliografia

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074(2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848(2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848(2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070(2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krystalizacja wysokoprzepustowakrystalografia makromolekularnatechnologia CrystalDirectscreening fragment wruroci g analizy struktur bia kowychpozyskiwanie kryszta wdyfrakcja rentgenowskaoprogramowanie CRIMSbiologia strukturalna
Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.