Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62498

⸱

20 maja 2021

 ,  ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM UMR S1255, EFS Grand-EST, 2UMR-S1113 –IRFAC, Université de Strasbourg

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Streszczenie

Megakariocyty szpiku kostnego to duże poliploidalne komórki, które zapewniają produkcję płytek krwi. Powstają z hematopoetycznych komórek macierzystych poprzez megakariopoezę. Końcowe etapy tego procesu są złożone i klasycznie obejmują bipotencjalne progenitory megakariocytów-erytrocytów (MEP) i unipotencjalne progenitory megakariocytów (MKp). Populacje te poprzedzają powstawanie megakariocytów w dobrej wierze, a ich izolacja i charakterystyka mogą pozwolić na solidną i bezstronną analizę powstawania megakariocytów. W protokole tym szczegółowo przedstawiono procedurę pobierania komórek krwiotwórczych ze szpiku kostnego myszy, wzbogacanie krwiotwórczych komórek progenitorowych poprzez zubożenie magnetyczne i wreszcie strategię sortowania komórek, która daje wysoce oczyszczone populacje MEP i MKp. Najpierw pobiera się komórki szpiku kostnego z kości udowej, piszczelowej, a także grzebienia biodrowego, kości zawierającej dużą liczbę krwiotwórczych komórek progenitorowych. Stosowanie kości grzebienia biodrowego drastycznie zwiększa całkowitą liczbę komórek uzyskanych na mysz, a tym samym przyczynia się do bardziej etycznego wykorzystywania zwierząt. Zubożenie linii magnetycznej zostało zoptymalizowane przy użyciu kulek magnetycznych o długości fali 450 nm, co pozwoliło na bardzo wydajne sortowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Wreszcie, w protokole przedstawiono strategię znakowania i bramkowania do sortowania dwóch wysoce oczyszczonych populacji progenitorów megakariocytów: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9 dim) i MKp (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9jasny). Technika ta jest łatwa do wdrożenia i zapewnia wystarczającą ilość materiału komórkowego do przeprowadzenia i) charakterystyki molekularnej w celu głębszej wiedzy na temat ich tożsamości i biologii, ii) testów różnicowania in vitro, które zapewnią lepsze zrozumienie mechanizmów dojrzewania megakariocytów, lub iii) modeli interakcji in vitro z ich mikrośrodowiskiem.

Wprowadzenie

Płytki krwi są wytwarzane przez megakariocyty. Te duże komórki poliploidalne znajdują się w szpiku kostnym i podobnie jak w przypadku wszystkich komórek krwi, pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)1. Klasyczny szlak produkcji megakariocytów w szpiku kostnym wywodzi się z HSC i obejmuje generowanie różnych komórek progenitorowych, które stopniowo ograniczają swój potencjał różnicowania2. Pierwszym protoplastą podpisującym zobowiązanie do linii megakariocytarnej jest Megakariocyt-Erythrocyte Progenitor (MEP), bipotencjalny protoplasta zdolny do wytwarzania zarówno komórek erytroidalnych, jak i megakariocytów3,4,5. Następnie MEP wytwarza unipotencjalny prekursor / prekursor (MKp), który różnicuje się w dojrzały megakariocyt zdolny do wytwarzania płytek krwi. Mechanizmy związane z powstawaniem tych progenitorów, a także ich różnicowaniem i dojrzewaniem do megakariocytów są złożone i tylko częściowo poznane. Ponadto niejednorodność populacji MEP pod względem potencjału różnicowania i wewnętrzny poziom zaangażowania tych komórek są nadal niejasne. Aby rozszyfrować te procesy, konieczne jest uzyskanie (lub dostęp do) oczyszczonych populacji MEP i MKp do precyzyjnych analiz molekularnych i jednokomórkowych.

Kilka badań wykazało szczególne kombinacje markerów powierzchni komórek do identyfikacji przodków związanych z linią megakariocytów u myszy6,7,8. Na ich podstawie opracowano metodę pozwalającą na oczyszczanie MEP i MKp z myszy. Metoda ta została zoptymalizowana w celu uzyskania komórek w odpowiedniej liczbie i jakości dla dużej liczby testów. Mając na uwadze względy etyczne i w celu zminimalizowania liczby zwierząt biorących udział w eksperymentach, poprosiliśmy o pobranie szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej, a także z grzebienia biodrowego. Kość ta zawiera dużą częstotliwość i liczbę krwiotwórczych komórek progenitorowych i w większości przypadków ulega uszkodzeniu podczas długiego pobierania kości. Przedstawiona jest tutaj szczegółowa metoda niezawodnego zbierania tej kości.

Drugim kryterium optymalizacji jest produkcja wysoce oczyszczonych populacji komórek. Sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) jest metodą z wyboru w celu uzyskania oczyszczonych populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Jednak niskie plony osiąga się, gdy populacja komórek będących przedmiotem zainteresowania jest bardzo rzadka. W związku z tym konieczne są procedury wzbogacania. W protokole tym zdecydowano się na procedurę selekcji negatywnej przy użyciu kulek magnetycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Eksperymentów na Zwierzętach CREMEAS Uniwersytetu w Strasburgu (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Numer zezwolenia: E67-482-10).

1. Pobieranie kości myszy

  1. Uśmierć zwierzę zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    UWAGA: Dane przedstawione w niniejszym opracowaniu uzyskano od myszy C57Bl/6 w wieku od 8 do 12 tygodni. Liczba uzyskanych komórek oraz częstość występowania cytowanych populacji mogą różnić się w zależności od wieku i szczepu myszy.
  2. Spryskaj ciało 70% etanolem.
  3. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie skóry o długości 0,5-1 cm prostopadle do kręgosłupa i odrze skórę z całego ciała. Odsuń skórę z dolnej części ciała i usuń ją.
  4. Połóż zwierzę na podkładce do sekcji, brzuchem do dołu. Zlokalizuj kości miednicy, przesuwając palcami wzdłuż odsłoniętego kręgosłupa od góry do dołu. Aby zlokalizować grzebień biodrowy, zidentyfikuj niewielkie uwypuklenie w odcinku lędźwiowym w pobliżu kończyn tylnych (przednio-górny obszar kości miednicy). Rysunek 1A,B przedstawia schemat anatomiczny myszy.

Schemat anatomii szkieletu myszy z opisanymi kośćmi miednicy, kością udową i piszczelową do celów edukacyjnych.
Rycina 1: Anatomia myszy. (A) RTG myszy przedstawiające kości kończyn dolnych. Należy zwrócić uwagę na przestrzeń między kością miednicy a kręgosłupem (żółta strzałka), w którą należy wsunąć nożyczki, aby prawidłowo oddzielić kończyny dolne od tułowia myszy (żółta linia przerywana). (B) Schematyczne przedstawienie wybranych kości bogatych w szpik kostny. Kości miednicy zaznaczono na czerwono, kości udowe na fioletowo, a kości piszczelowe na zielono. (C) Schematyczne przedstawienie kości miednicy myszy. Kość biodrowa odpowiada części kości miednicy bogatej w szpik i jest wyróżniona na czerwono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Umieść nożyczki równolegle do kręgosłupa, przytrzymując je przy kręgach i blisko wybrzuszenia grzebienia biodrowego. Przystąp do rozcięcia mięśni wzdłuż kręgosłupa nad kością miednicy, przesuwając nożyczki wzdłuż kręgów aż do ogona.
    UWAGA: To pierwsze cięcie mięśni można wykonać również za pomocą ostrza skalpela.
  2. Umieść nożyczki równolegle do kręgosłupa i rozetnij tkanki między kręgami a grzebieniem biodrowym, zgodnie z żółtą linią przerywaną na Rysunku 1A. Pamiętaj, aby pozostać jak najbliżej kręgów. Dotnij pozostałe mięśnie, aby oddzielić kończynę od ciała.
    UWAGA: Opór powinien być niewielki lub w ogóle go nie być.
  3. Powtórz czynność po drugiej stronie, aby oddzielić drugą kończynę.
  4. Przenieś kończyny na czystą powierzchnię, a resztę ciała zutylizuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  5. Odsłoń kości miednicy, kości udowe i piszczelowe, usuwając pęsetą i skalpelami jak najwięcej otaczających tkanek.
  6. Przystąp do ostrożnego zwichnięcia głowy kości udowej z kości miednicy, trzymając dystalny koniec kości udowej pęsetą i delikatnie rozcinając skalpelami mięśnie wokół stawu. Poruszaj kośćmi, aby ułatwić zwichnięcie.
  7. Zeskrob pozostałe mięśnie z kości miednicy i wykonaj skalpelem nacięcie w środku jamki, w której znajdowała się głowa kości udowej. Kość biodrowa zostaje zachowana, ponieważ jest bogata w progenitorów hematopoetycznych, natomiast trójkątna, bardzo cienka część kości zostaje odrzucona, jak pokazano na Rysunku 1C.
  8. Usuń pozostałe tkanki wokół kości biodrowej skalpelem i umieść oczyszczoną kość w sterylnym PBS uzupełnionym o 2% Newborn Calf Serum (PBS-2%NBCS).
  9. Za pomocą nożyczek odetnij stopę od nogi na wysokości kostki.
  10. Przytrzymaj dolną część kości piszczelowej pęsetą i zeskrob mięśnie w kierunku kolana. Usuń kości strzałkowe i przetnij skalpelem plateau kości piszczelowej. Umieść kość piszczelową w sterylnym PBS-2%NBCS.
  11. Usuń pozostałe tkanki wokół kości udowej za pomocą skalpeli.
  12. Przytrzymaj górną część kości udowej pęsetą; ustaw ostrze skalpela u podstawy rzepki. Przyłóż siłę w kierunku rzepki równolegle do kości udowej, aż do oddzielenia rzepki. Umieść kość udową w sterylnym PBS-2%NBCS. Usunięcie rzepki zapewnia swobodny dostęp do wprowadzenia igły do płukania szpiku.

2. Magnetyczne usuwanie komórek lineage-dodatnich

  1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść kości do sterylnej szalki Petriego wypełnionej sterylnym PBS-2%NBCS.
  2. Za pomocą skalpela odciąć głowy kości udowych.
  3. Napełnić strzykawkę 1 mL sterylnym PBS-2%NBCS i przymocować do wylotu igłę 21 G.
  4. Napełnić polipropylenową probówkę 5 mL ilością 2 mL sterylnego PBS-2%NBCS.
  5. Przytrzymać kość udową pęsetą; ostrożnie wprowadzić igłę w zagłębienie powstałe po usunięciu rzepki. Podczas wprowadzania obracać igłę, aby zapobiec jej zapchaniu. Upewnić się, że igła została całkowicie wprowadzona do kości aż do ścięcia.
  6. Przenieść kość wraz z igłą do probówki zawierającej 2 mL PBS-2%NBCS. Wypłukiwać kość, tłocząc i zasysając PBS-2%NBCS ze strzykawki, aż zostanie ona oczyszczona.
  7. Wyjąć igłę z kości udowej i wprowadzić ją w otwór po przeciwnej stronie, w miejscu, gdzie znajdowała się głowa kości udowej. Ponownie tłoczyć i zasysać bufor, a następnie zutylizować kość.
  8. W przypadku grzebieni biodrowych i kości piszczelowych przytrzymać kość pęsetą; ostrożnie wprowadzić igłę z otwartej strony. Podczas wprowadzania obracać igłę, aby zapobiec jej zapchaniu. Upewnić się, że igła została całkowicie wprowadzona do kości aż do ścięcia. Przenieść kość wraz z igłą do probówki zawierającej 2 mL PBS-2%NBCS. Wypłukiwać kość, tłocząc i zasysając PBS-2%NBCS ze strzykawki, aż zostanie ona oczyszczona. Zutylizować kości.
    UWAGA: Kości z maksymalnie trzech myszy można wypłukać do jednej probówki. Połączyć zawiesiny komórkowe.
  9. Przepuścić połączoną zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40 µm umieszczone na sterylnej polistyrenowej probówce 5 mL.
  10. Przejść do zliczania komórek.
    UWAGA: Zliczanie komórek można przeprowadzić za pomocą dowolnego hemocytometru, stosując błękit trypanu do oceny żywotności, lub za pomocą dowolnego automatycznego licznika komórek. Jedna mysz dostarcza zazwyczaj 105 ± 7 x 106 komórek.
  11. Odbrać 100 µL zawiesiny komórkowej jako całkowity szpik kostny (Total Bone Marrow), dodać 500 µL PBS-2%NBCS i przechowywać w lodzie do procedury barwienia.
  12. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę przy 400 x g przez 5 min w 4 °C i usunąć nadsącz.
    UWAGA: Erytrocyty można zlizować, resuspendując osad w świeżo przygotowanym roztworze lizującym (Lysis Solution, 1/10th w dH2O). Inkubować przez 5 min, aż zawiesina stanie się przejrzysta i jasnoczerwona, a następnie dodać 10 objętości sterylnego PBS. Przejść do przemycia komórek w PBS-2%NBCS poprzez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w 4 °C. Należy zachować ostrożność podczas usuwania nadsączu, ponieważ osad komórkowy jest bardzo luźny. Przeprowadzić drugie przemycie w PBS-2%NBCS przez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w 4 °C i przejść do kroku 2.13.
  13. Resuspendować osad komórkowy w świeżo przygotowanym koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych w stosunku 100 µL na 1 x 107 komórek. Inkubować w lodzie przez 30-45 min.
PrzeciwciałoRozcieńczenie
Gr-1-biotin1:500
B220-biotin1:500
Mac-1-biotin1:500
CD3-biotin1:500
CD4-biotin1:500
CD5-biotin1:500
CD8-biotin1:500
TER119-biotin1:1000
CD127-biotin1:500

Tabela 1.

  1. Odbierz 10 µL zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki polistyrenowej o pojemności 5 mL oznaczonej jako Lin-Pos Fraction. Dodaj 90 µL PBS-2%NBCS i przechowuj na lodzie do czasu przeprowadzenia procedury barwienia.
  2. Przeprowadź dwukrotne przemycie komórek sterylnym PBS-2%NBCS poprzez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że ostatnie przemycie zostanie wykonane w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 5 mL.
  3. Podczas etapów przemywania przygotuj kuleczki do magnetycznego usuwania.
    1. Resuspenduj kuleczki w fiolce, intensywnie mieszając w vortexie przez 30 s.
    2. Przenieś objętość kuleczek odpowiadającą dwóm kuleczkom na jedną komórkę docelową do probówki polipropylenowej o pojemności 5 mL.
    3. Przemyj kuleczki dwukrotnie roztworem PBS-2%NBCS, umieszczając probówkę na magnesie i usuwając bufor myjący za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura.
    4. Resuspenduj kuleczki w 500 µL sterylnego PBS-2NBCS%.
  4. Resuspenduj osad oznakowanych komórek w 250 µL zawiesiny kuleczek i mieszaj delikatnie przez 5 min na lodzie. Dodaj 2 mL sterylnego PBS-2%NBCS i wymieszaj delikatnie. Nie potrząsaj probówką.
  5. Umieść probówkę na magnesie na 2 min.
  6. Zbierz frakcję niemagnetyczną za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura i dodaj ją do pozostałych 250 µL kuleczek magnetycznych. Zamknij probówkę paraflem.
  7. Umieść probówkę na rotatorze do probówek na 20 min w temperaturze 4 °C.
  8. Dodaj 2 mL sterylnego PBS-2%NBCS i wymieszaj delikatnie. Nie potrząsaj probówką.
  9. Umieść probówkę w magnesie na 2 min.
  10. Zbierz frakcję niemagnetyczną do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 5 mL oznaczonej jako Lin-Neg Fraction za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura.
  11. Zwiruj komórki przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad, a następnie usuń nadsącz.
  12. Resuspenduj komórki niemagnetyczne w 500 µL sterylnego PBS-2%NBCS.
  13. Przejdź do zliczenia komórek.
    UWAGA: Jedna mysz dostarcza zazwyczaj 3,9 ± 1,1 x 106 komórek. Typowe barwienie linii przed i po usuwaniu przedstawiono na Rysunku 2B.

3. Sortowanie komórek progenitorowych megakariocytów metodą cytometrii przepływowej

  1. Pobrać probówki oznakowane jako Total Bone Marrow, Lin-Pos Fraction oraz Lin-Neg Fraction.
  2. Zawartość probówki Total Bone Marrow rozdzielić w równych częściach do sześciu sterylnych polistyrenowych probówek o pojemności 5 mL. Probówki ponumerować od 1 do 6.
  3. Probówkę Lin-Pos Fraction oznakować numerem 7.
  4. Zawartość probówki Lin-Neg Fraction rozdzielić w następujący sposób:
    1. Przenieść 50 µL do sterylnej polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL zawierającej 250 µL sterylnego PBS-2%NBCS. Następnie zawartość tę rozdzielić w równych częściach do 3 sterylnych polistyrenowych probówek o pojemności 5 mL. Probówki te ponumerować od 8 do 10.
    2. Pozostałe 450 µL zawiesiny komórkowej Lin-Neg Fraction stanowi zawartość probówki numer 11.
  5. Do probówek dodać przeciwciała zgodnie z opisem w Tabeli 2.
ProbówkaEtykietaKoktajl przeciwciał
Całkowity szpik kostny
1Kontrola niebarwiona
2Kontrola barwiona pojedynczoCD45-FITC (1/200)
3Kontrola barwiona pojedynczoCD45-PE (1/200)
4Kontrola barwiona pojedynczoTER119-APC (1/200)
5Kontrola barwiona pojedynczoCD45-PECy7 (1/200)
6Kontrola barwiona pojedynczoCD45-APC-Cy7 biotyna (1/200)
Frakcja Lin-Pos
7Kontrola barwiona pojedynczoKontrola barwiona pojedynczo. Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)
Frakcja Lin-Neg
8Kontrola FMO FITC c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)
9Kontrola FMO PECD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)
10Kontrola FMO PECy7CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)
11Probówka pozytywna do sortowaniaCD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)

Tabela 2.

  1. Inkubować na lodzie przez 30-45 min w ciemności.
  2. Przemyć komórki sterylnym PBS-2%NBCS poprzez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w 4 °C.
  3. Resuspender osady komórkowe w następujący sposób.
    1. W przypadku probótek od 1 do 10, resuspender osad w 300 µL sterylnego PBS-2%NBCS uzupełnionego o 7AAD (stężenie końcowe 2,5 µg/mL) (PBS-7AAD).
      OSTROŻNIE: 7AAD jest interkalatorem DNA, dlatego należy z nim obchodzić się w odpowiednich środkach ochrony osobistej (rękawice).
    2. W przypadku probótki 11, resuspender osad w sterylnym PBS-7AAD przy maksymalnym stężeniu 5 x 106 komórek na mL i minimalnej objętości 1 mL.
  4. Przygotować dwie polipropylenowe probótki do zbierania, oznaczone jako MEP i MKp, zawierające 2 mL PBS-2%NBCS.
    UWAGA: Alternatywnie komórki można zbierać do pożywki hodowlanej lub buforu do lizy komórek, w zależności od dalszego zastosowania posortowanych komórek. Nie zaleca się stosowania probótek polistyrenowych ze względu na możliwe zakłócenia naładowanych kropli zawierających interesujące nas komórki.
  5. Przechowywać wszystkie probótki na lodzie w ciemności.
  6. Przejść do konfiguracji sortera komórkowego.
    1. Użyć probótek 1-7 do ustawienia napięcia i kompensacji, probótek 7-10 do wyznaczenia bramek sortowania dla interesujących populacji komórek oraz probótki 11 do sortowania komórek.
  7. Pierwsze kroki strategii bramkowania mają na celu wykluczenie dubletów i martwych komórek z analizy, jak opisano na Rysunku 3. Zidentyfikować pojedyncze żywe komórki i wyświetlić wykres kropkowy SSC-vs Lin-APC-Cy7, aby potwierdzić wydajność usuwania komórek linii (lineage depletion). Z komórek Lin- ustawia się bramkę w celu wyboru komórek pozytywnych dla c-kit oraz negatywnych lub słabo pozytywnych (dim) dla Sca-1 i CD16/32. Wykres kropkowy ekspresji CD9 vs CD150 dla wybranych komórek pozwala na identyfikację czterech populacji.
    UWAGA: Komórki MEP i MKp są obie pozytywne dla CD150. Można zdefiniować trzy poziomy ekspresji CD9 (neg, dim i high). MKp wykazują wysoki poziom CD9, a MEP wykazują CD9 na pośrednim poziomie intensywności fluorescencji. Populacja MEP odpowiada Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9dim, a populacja MKp odpowiada Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9bright. Rozróżnienie między populacjami CD9 high i CD9 dim dla komórek pozytywnych dla CD150 jest ustalane na podstawie maksymalnego poziomu ekspresji CD9 w populacji negatywnej dla CD150. Jedna mysz dostarcza zazwyczaj 5,3 ± 0,6 x 103 MKp i 27,2 ± 2,4 x 103 MEP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analizę fenotypową komórek zidentyfikowanych jako MEP i MKp przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki znakowano przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją przeciwko CD41a i CD42c, które są klasycznymi markerami linii megakariocytowej i płytkowej. Oba markery były ekspresjonowane przez komórki populacji MKp, podczas gdy w populacji MEP nie wykryto ich jeszcze na powierzchni komórek (Rysunek 4Ai,4Aii). Poliploidia jest cechą charakterystyczną megakariocytów. Pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda opisana w niniejszej pracy pozwala na ekstrakcję i oczyszczanie mysich MEP i MKp. Ważnym parametrem w optymalizacji protokołu było uzyskanie wystarczającej liczby komórek, które byłyby kompatybilne z większością testów molekularnych i komórkowych. Ogólna praktyka pobierania kości myszy w celu ekstrakcji komórek krwiotwórczych zwykle polega na pobieraniu zarówno kości udowych, jak i piszczelowych każdej myszy. Kość miednicy, kolejne źródło materiału krwiotwórczego, jest więc często pomijana. Powodem, dla którego ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Monique Freund, Catherine Ziessel i Ketty za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) oraz przez Grant ANR-17-CE14-0001-01 dla Henri.de la. Salle.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły o rozmiarze 21 BDMicrolance301155
7AADSigma-AldrichA9400
Przeciwciało Gr-1-biotynaeBioscience13-5931-85Przeciwciało zubożenia magnetycznego
B220-biotynaeBioscience13-0452-85Przeciwciało zubożenia magnetycznego
Mac-1-biotynaeBioscience13-0112-85Magnetyczne zubożenie
Przeciwciało CD3e-biotynaeBioscience13-0031-85Zubożenie magnetyczne
Przeciwciało CD4-biotynaeBioscience13-9766-82Zubożenie magnetyczne
Przeciwciało CD5-biotynaeBioscience13-0051-85Przeciwciało zubożenia magnetycznego
CD8a-biotynaeBioscience13-0081-85Przeciwciało zubożenia magnetycznego
TER119-biotynaeBioscience13-5921-85Przeciwciało zubożenia magnetycznego
CD127-biotynaeBioscience13-1271-85Przeciwciało zubożenia magnetycznego
CD45-FITCeBioscience11-0451-85Przeciwciało do sortowania komórek
CD45-PEeBioscience12-0451-83Przeciwciało do sortowania komórek
TER119-APCeBioscience17-5921-83Sortowanie komórek
Przeciwciało CD45-PECy7eBioscience25-0451-82Przeciwciało do sortowania komórek
CD45-biotynaeBioscience13-0451-85Przeciwciało do sortowania komórek
CD9-FITCeBioscience11-0091-82Przeciwciało do sortowania komórek
  c-kit-APCeBioscience17-1171-83Przeciwciało do sortowania komórek
Sca-1-PEeBioscience12-5981-83Przeciwciało do sortowania komórek
CD16/32-PEeBioscience12-0161-83Przeciwciało do sortowania komórek
CD150-PECy7eBioscience25-1502-82Pożywka hodowlana do sortowania komórek
StemSpan-SFEMTechnologie komórek macierzystych#09650
Podkładka preparcyjnaFisher Scientific10452395
DPBSLife Technologies14190-094
EtanolvWR Chemicals83813.360
KleszczeEuronexiaP-120-AS
Szklana pipeta pasteuraDutscher42011
Magnes :  DynaMag-5Thermo Fisher Scientific12303D
Koraliki magnetyczne: Dynabeads Owce Anti-Rat IgGThermo Fisher Scientific11035
Megacult Technologie komórek macierzystych#04970
MethoCult SF M3436Technologie komórek macierzystych#03436
Surowica dla noworodkówDutscher50750-500
Liza czerwonych krwinek rozwiązanieBD Bioscience555899
SkalpeleFisher Scientific12308009
NożyczkiEuronexiaC-165-ASB
Sterylne strzykawki 1 mlBD Bioscience303172
Sterylne probówki 15 mlSarstedt62.554.502
Sterylne probówki polipropylenowe 5 mlFalcon352063
Sterylne probówki polistyrenowe 5 mlFalcon352054
Sterylne probówki z 70&mikro; m nasadka sitka do komórekFalcon352235
Sterylna szalka PetriegoFalcon353003
Streptawidyna-APC-Cy7BD Nauki biologiczne554063Sortowanie komórek
Rolka rurowaBenchmark ScientificR3005

Bibliografia

  1. Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
  3. Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
  4. Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
  5. Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
  6. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  7. Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
  8. Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
  9. Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
  10. Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
  11. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
  12. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  13. Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14(2014).
  14. Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions.
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results.
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Izolacja szpiku kostnegodeplekcja magnetycznacytometria przep yewowasortowanie kom rekprogenitorzy hematopoetyczniprogenitorzy megakariocytowo erytrocytarnir nicowanie in vitromarker CD41formowanie p ytek krwi
Izolacja progenitorów megakariocytów myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.