Dynamika tworzenia propłytek świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy

Summary

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę eksplantacji szpiku kostnego, od przygotowania próbki do analizy mikroskopowej, aby ocenić zdolność megakariocytów, które zróżnicowały się w swoim środowisku fizjologicznym, do tworzenia propłytek.

Abstract

Ostatni etap megakariopoezy prowadzi do cytoplazmatycznych rozszerzeń dojrzałych megakariocytów, tak zwanych propłytków. Wiele odkryto na temat tworzenia propłytek krwi przy użyciu megakariocytów różnicowanych in vitro; Istnieje jednak coraz więcej dowodów na to, że konwencjonalne systemy hodowli nie odwzorowują wiernie procesu różnicowania/dojrzewania, który zachodzi w szpiku kostnym. W tym manuskrypcie prezentujemy metodę eksplantatu opisaną po raz pierwszy w 1956 roku przez Thiéry'ego i Bessisa w celu wizualizacji megakariocytów, które dojrzały w swoim naturalnym środowisku, omijając w ten sposób potencjalne artefakty i błędne interpretacje. Świeże szpiki kostne pobiera się przez płukanie kości udowych myszy, kroi się je na odcinki o przekroju 0,5 mm i umieszcza w komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C zawierającej bufor fizjologiczny. Megakariocyty stają się stopniowo widoczne na obrzeżach eksplantatu i są obserwowane do 6 godzin pod odwróconym mikroskopem sprzężonym z kamerą wideo. Z biegiem czasu megakariocyty zmieniają swój kształt, przy czym niektóre komórki mają formę kulistą, a inne rozwijają grube przedłużenia lub wydłużają wiele cienkich płytek z rozległymi rozgałęzieniami. Prowadzone są zarówno badania jakościowe, jak i ilościowe. Ta metoda ma tę zaletę, że jest prosta, powtarzalna i szybka, ponieważ obecne są liczne megakariocyty, a klasycznie połowa z nich tworzy propłytki w ciągu 6 godzin w porównaniu do 4 dni w przypadku megakariocytów hodowanych myszy. Oprócz badania zmutowanych myszy, ciekawym zastosowaniem tej metody jest prosta ocena czynników farmakologicznych w procesie wydłużania propłytek, bez ingerencji w proces różnicowania, który może zachodzić w kulturach.

Introduction

Technika eksplantacji szpiku kostnego została po raz pierwszy opracowana przez Thiéry'ego i Bessisa w 1956 roku, aby opisać tworzenie się rdzeni cytoplazmatycznych megakariocytów szczura jako początkowe zdarzenie w tworzeniu płytek krwi¹. Korzystając z kontrastu fazowego i technik kinematograficznych, autorzy ci scharakteryzowali transformację dojrzałych okrągłych megakariocytów w "podobne do kałamarnic" komórki małopłytkowe, z cytoplazmatycznymi przedłużeniami wykazującymi dynamiczne ruchy wydłużania i kurczenia się. Ramiona te stają się stopniowo cieńsze, aż staną się nitkowate z małymi obrzękami wzdłuż ramion i na końcach. Te typowe wydłużenia megakariocytów, uzyskane in vitro i w płynnych pożywkach, mają pewne podobieństwa do płytek krwi obserwowanych w utrwalonym szpiku kostnym, gdzie megakariocyty wystają długimi przedłużeniami przez ściany sinusoidy do krążenia krwi^2,3. Odkrycie i sklonowanie TPO w 1994 roku pozwoliło na różnicowanie megakariocytów w hodowli zdolnych do tworzenia rozszerzeń propłytkowych przypominających te opisane w eksplantatach szpiku kostnego^4,5,6. Jednak dojrzewanie megakariocytów jest znacznie mniej efektywne w warunkach hodowli, w szczególności rozległa sieć błon wewnętrznych megakariocytów dojrzałych w szpiku kostnym jest słabo rozwinięta w hodowanych megakariocytach, co utrudnia badania nad mechanizmami biogenezy płytek krwi^7,8.

Szczegółowo opisujemy tutaj model eksplantacji szpiku kostnego, oparty na Thiéry i Bessis, aby śledzić w czasie rzeczywistym tworzenie propłytek u mysich megakariocytów, które osiągnęły pełną dojrzałość w swoim naturalnym środowisku, omijając w ten sposób możliwe artefakty in vitro i błędne interpretacje. Wyniki uzyskane na dorosłych myszach typu dzikiego przedstawiono w celu zilustrowania zdolności megakariocytów do wydłużania propłytek, ich morfologii i złożoności propłytek. Wprowadzamy również strategię szybkiego ilościowego określania w celu walidacji jakości, aby zapewnić dokładność i solidność danych podczas procesu rejestracji megakariocytów. Przedstawiony tutaj protokół jest najnowszą wersją metody opublikowaną wcześniej jako rozdział książki⁹.

Protocol

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z europejskimi standardami 2010/63/UE oraz Komitetem CREMEAS ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu w Strasburgu (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotować odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 1.
   1. W przypadku Stock I należy rozpuścić każdy proszek osobno. Upewnij się, że osmolarność preparatu jest wyższa niż 295 mOsm/L. Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden rok.
   2. Do przygotowania buforu Tyrode'a przygotować roztwór zgodnie z opisem w tabeli 1, dostosować objętość do 100 ml wodą destylowaną i dodać 0,1 g bezwodnej sacharozy D (+). Dostosuj do pH 7,3 za pomocą 1 N HCl w razie potrzeby i osmolarności do 295 mOsm/L. Aby zapobiec rozwojowi bakterii, dodaj penicylinę G w końcowym stężeniu 10 U/ml i siarczan streptomycyny w końcowym stężeniu 0,29 mg/ml. Przefiltruj końcowy roztwór przez pory 0,22 μm.

2. Przygotowanie zestawu eksperymentalnego

1. W dniu eksperymentu należy ogrzać bufor Tyrode'a do temperatury 37 °C i włączyć komorę grzewczą mikroskopu, aby doprowadzić temperaturę do 37 °C.
2. Przygotuj wszystkie niezbędne narzędzia, takie jak minutnik, komory inkubacyjne, strzykawki 5 ml, 21 G, kleszcze, żyletka, pipety Pasteura, szkiełka podstawowe i probówka wirówkowa o pojemności 15 ml (Rysunek 1A).

3. Izolacja szpiku kostnego myszy

1. Eutanazja myszy C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni przez uduszenie CO₂ i zwichnięcie szyjki macicy. Powinno to być zrobione szybko przez kompetentną i wykwalifikowaną osobę.
2. Aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologicznego, przed usunięciem kości udowych namocz ciało myszy w 70% (v/v) etanolu. Do preparacji należy użyć narzędzi zdezynfekowanych w 70% etanolu. Zbierz dwie kości udowe i oczyść je, usuwając wszelkie przylegające tkanki. Po szybkim zanurzeniu w etanolu umieścić je w 15 ml probówce wirówkowej zawierającej 2 ml buforu Tyrode.
3. Odetnij nasady za pomocą ostrej żyletki i przepłucz szpik kostny za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wypełnionej 2 ml buforem Tyrdode. Aby to osiągnąć, wprowadź igłę 21 G do otworu kości udowej (po stronie kolana) i powoli naciskaj tłok, aby pobrać nienaruszony cylinder szpiku (Rysunek 1B, C). Sesja pobierania szpiku powinna być jak najkrótsza (poniżej 10 minut).

4. Cięcie szpiku kostnego i umieszczanie go w komorze inkubacyjnej

1. Za pomocą plastikowej pipety o pojemności 3 ml ostrożnie i delikatnie przenieś nienaruszony szpik kostny na szklane szkiełko. Ważne jest, aby próbki były pokryte buforem, aby zapobiec wysychaniu (Rysunek 1D).
   UWAGA: Unikaj przepływu rozpływowego, aby zminimalizować ścinania, które mogłyby dysocjować tkankę.
2. Pod mikroskopem stereoskopowym (10x) odetnij końce szpiku, które mogły zostać ściśnięte w czasie płukania. Następnie wytnij przekroje poprzeczne ostrą żyletką. Skrawki powinny być wystarczająco cienkie, aby umożliwić szczegółową obserwację, ale upewnij się, że megakariocyty nie zostaną uszkodzone przez kompresję (zwykle grubość około 0,5 mm) (Rysunek 1E,F).
   UWAGA: Sekcje wykonuje się ostrą żyletką i pod lupą, aby dostosować ich grubość do około 0,5 mm. Wybierane są tylko przekroje o jednolitej grubości. Procedura ta nie jest skomplikowana, ale jej standaryzacja wymaga pewnego doświadczenia.
3. Za pomocą plastikowej pipety zbierz 10 skrawków do probówki o pojemności 1 ml zawierającej bufor Tyrode'a (Rysunek 1G).
4. Ostrożnie przenieś sekcje do komory inkubacyjnej o średnicy 13 mm ( Rysunek 1H).
5. Odessać bufor i dostosować objętość do 30 μl buforu Tyrode'a uzupełnionego 5 % surowicą mysią.
   UWAGA: Na tym etapie można dodać środki farmakologiczne, aby ocenić ich wpływ na tworzenie propłytek.
6. Ustaw sekcje w pewnej odległości. Uszczelnić komorę samoprzylepną szkiełkiem nakrywkowym o wymiarze 22 x 55 mm. Nachyl szkiełko nakrywkowe podczas przyklejania, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza (Rysunek 1I).
7. Umieścić komorę w komorze grzewczej w temperaturze 37 °C. Od tego momentu uruchamiany jest chronometr (T= 0 h). Eksperyment trwa 6 godzin w temperaturze 37 °C (T= 6 h).

5. Obserwacja eksplantatów szpiku w czasie rzeczywistym

1. Użyj mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym (obiektyw 40x do powiększenia) sprzężonego z kamerą wideo, aby obserwować eksplantaty szpiku kostnego. Pozwól komórkom inkubować przez 30 minut przed rozpoczęciem obserwacji. Podczas obserwacji konieczne jest dostosowanie ostrości, ponieważ megakariocyty się poruszają.
   UWAGA: Możliwe są inne tryby obserwacji (np. DIC, fluorescencja przy użyciu myszy, których megakariocyty wyrażają endogenny marker fluorescencyjny), ale mikroskopia z kontrastem fazowym jest optymalna, aby wyraźnie uwidocznić długie i cienkie rozszerzenia megakariocytów, umożliwiając precyzyjną kwantyfikację. Po 30 minutach komórki szpiku stopniowo migrują na obrzeża eksplantatu, tworząc monowarstwę. Po 1 godzinie inkubacji megakariocyty można zidentyfikować po ich dużych rozmiarach i polizbulizowanych jądrach (Rysunek 1J,K). Po 3 godzinach inkubacji liczba megakariocytów wzrasta, a niektóre mają długie przedłużenia.
2. Twórz filmy, aby rejestrować transformację megakariocytów.

6. Kwantyfikacja megakariocytów wydłużających propłytki

1. Narysuj mapę, aby zlokalizować każdą sekcję w komorze inkubacyjnej (Rysunek 1K).
2. Po 1 godzinie zidentyfikuj widoczne megakariocyty (tj. gigantyczne polizbulowane komórki) na obrzeżach każdej sekcji i nanieś ich położenie na rysunek. Powtórz tę procedurę po 3 i 6 godzinach
   UWAGA: Na podstawie rysunku można łatwo zlokalizować każdy megakariocyt w czasie i przeanalizować ewolucję ich morfologii (np. rozmiar, deformację, wydłużenie propłytek itp.). Inną możliwością jest użycie specjalnego oprogramowania nawigacyjnego.

Results

Wyniki jakościowe. Na początku eksperymentu wszystkie komórki są zagęszczane w przekroju szpiku kostnego. Potrzeba 30 minut, aby komórki stały się wyraźnie widoczne na obrzeżach eksplantatów. Megakariocyty są wtedy rozpoznawalne po ich dużych rozmiarach, a ich ewolucję można następnie badać w czasie (rozmiar, kształt, dynamika, wydłużenie propłytek i uwalnianie płytek krwi) (Ryc. 2A). Małe megakariocyty mają średnicę od 20 do 30 μm, a ich jądra są polilobulowane, podczas gdy dojrzałe ...

Discussion

W tym artykule opisano prostą i tanią metodę in vitro do oceny skuteczności megakariocytów w przedłużaniu propłytek, które narosły w szpiku kostnym. Model eksplantatu szpiku kostnego dla myszy ma cztery główne zalety. Po pierwsze, nie są wymagane żadne zaawansowane umiejętności techniczne. Po drugie, czas potrzebny do uzyskania propłytek wydłużających megakariocyty jest dość krótki, tylko 6 godzin w przypadku metody eksplantacyjnej, w porównaniu do minimum 4 dni w przypadku konwencjonalnej metody hodowli rozpocz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strzykawki 5 ml Igły	Terumo	SS+05S1
o rozmiarze 21 BD	Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Komory inkubacyjne Coverwall	Mikroskopia elektronowa Sciences	70324-02	Głębokość: 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	Dostosowane pH do 7,5
Albumina surowicy ludzkiej	Leki zatwierdzone przez VIALEBEX	: n° 3400956446995	20% (200 mg / ml -100 mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Mikroskopia elektronowa	ze szkła nakrywkowego Micro Cover	72200-40	Mikroskop
	22 mm x 55 mmLeica Microsystems SA, Westlar, Niemcy	DMI8 - 514341	kamera mikroskopowa z obiektywem powietrznym
	Leica Microsystems SA, Westlar, Niemcy	K5 CMS GmbH -14401137	rozdzielczość obrazu: 4,2 megapiksela
Serum dla myszy	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4. H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μ g/ml streptomycyny i 29,2 mg/ml glutaminy
Żyletka	Mikroskopia elektronowa Nauki	72000
Sacharoza D (+)	Sigma	G8270