Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla megakariocytów w hydrożelu 3D na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i uwięzienia

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62511

⸱

26 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS

W tym artykule

Podsumowanie

Teraz uznaje się, że trójwymiarowe środowisko komórek może odgrywać ważną rolę w ich zachowaniu, dojrzewaniu i/lub różnicowaniu. Protokół ten opisuje trójwymiarowy model hodowli komórkowej przeznaczony do badania wpływu fizycznego zamknięcia i ograniczeń mechanicznych na megakariocyty.

Streszczenie

Środowisko 3D prowadzące zarówno do zamknięcia, jak i ograniczeń mechanicznych jest coraz częściej uznawane za ważny czynnik determinujący hodowlę behavior. 3D komórek, dlatego opracowano go, aby lepiej podejść do sytuacji in vivo. Megakariocyty różnicują się z hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w szpiku kostnym (BM). BM jest jedną z najmiększych tkanek ciała, ograniczoną wewnątrz kości. Ponieważ kość jest słabo rozciągliwa w skali komórkowej, megakariocyty są jednocześnie poddawane słabej sztywności i wysokiemu zamknięciu. Protokół ten przedstawia metodę odzyskiwania HSPC z ujemną linią myszy (Lin-) poprzez sortowanie immunomagnetyczne i różnicowanie ich w dojrzałe megakariocyty w pożywce 3D złożonej z metylocelulozy. Metyloceluloza nie reaguje na megakariocyty, a jej sztywność można dostosować do sztywności normalnego szpiku kostnego lub zwiększyć, aby naśladować patologiczny szpik zwłóknieniowy. Proces odzyskiwania megakariocytów do dalszych analiz komórkowych jest również szczegółowo opisany w protokole. Chociaż wydłużanie się płytek krwi jest zapobiegane w środowisku 3D, poniżej opisano, jak ponownie zawiesić megakariocyty w płynnym podłożu i określić ilościowo ich zdolność do wydłużania propłytek. Megakariocyty hodowane w hydrożelu 3D mają większą zdolność do tworzenia propłytek krwi w porównaniu z tymi hodowanymi w środowisku płynnym. Ta hodowla 3D pozwala i) różnicować progenitorów w kierunku megakariocytów osiągających wyższy stan dojrzewania, ii) podsumować fenotypy, które można zaobserwować in vivo, ale pozostają niezauważone w klasycznych kulturach płynnych, oraz iii) badać szlaki transdukcji indukowane przez mechaniczne sygnały dostarczane przez środowisko 3D.

Wprowadzenie

Komórki w ciele doświadczają złożonego mikrośrodowiska 3D i są poddawane wzajemnemu oddziaływaniu między chemicznymi i mechanofizycznymi sygnałami, w tym sztywnością tkanki i uwięzieniem przez sąsiednie komórki i otaczającą matrycę 1,2,3. Znaczenie sztywności i uwięzienia dla zachowania komórek zostało dostrzeżone dopiero w ostatnich dziesięcioleciach. W 2006 roku przełomowa praca Englera i in. 4 podkreśliła znaczenie środowiska mechanicznego dla różnicowania komórek. Autorzy wykazali, że zmienność sztywności substratów komórkowych skutkowała orientacją komórek macierzystych w kierunku różnych linii różnicowania. Od tego czasu wpływ sygnałów mechanicznych na los i zachowanie komórek staje się coraz bardziej znany i badany. Pomimo tego, że jest to jedna z najmiększych tkanek organizmu, szpik kostny ma organizację strukturalną 3D, która jest zamknięta wewnątrz kości. Sztywność szpiku, choć technicznie trudna do precyzyjnego zmierzenia, szacuje się na 15 do 300 Pa 5, 6. W zrębie komórki są ściśle ze sobą połączone. Ponadto większość z nich migruje w kierunku naczyń sinusoidalnych, aby dostać się do krążenia krwi. Warunki te stwarzają dodatkowe ograniczenia mechaniczne dla sąsiednich komórek, które muszą dostosować się do tych sił. Sygnały mechaniczne stanowią ważny parametr, którego wpływ na różnicowanie megakariocytów i tworzenie propłytek krwi został niedawno zbadany. Chociaż megakariocyty mogą różnicować się in vitro w tradycyjnej hodowli płynnej, nie osiągają stopnia dojrzałości obserwowanego in vivo, częściowo z powodu braku mechanicznych wskazówek ze środowiska 3D 7. Rosnące przodki osadzone w hydrożelu przynoszą mechaniczne wskazówki 3D, których brakuje w środowisku płynnym.

Hydrożele są szeroko stosowane od kilkudziesięciu lat w dziedzinie hematologii, zwłaszcza do hodowli komórek w testach tworzenia kolonii w celu ilościowego określenia komórek progenitorowych hematopoetycznych. Jednak takie hydrożele rzadko były używane do badania biologicznego wpływu środowiska mechanicznego 3D na dojrzewanie i różnicowanie komórek krwiotwórczych. W ciągu ostatnich kilku lat nasze laboratorium opracowało model hodowli 3D przy użyciu hydrożelu na bazie metylocelulozy 8. Ten niereaktywny żel fizyczny jest użytecznym narzędziem do naśladowania fizycznych ograniczeń natywnego środowiska megakariocytów. Otrzymuje się go z celulozy przez zastąpienie reszt hydroksylowych (-OH) grupami metoksydowymi (-OCH3). Zarówno stopień podstawienia metylu, jak i stężenie metylocelulozy decydują o sztywności hydrożelu po jego galaretowatości. Na etapie rozwoju tej techniki wykazano, że moduł Younga w zakresie od 30 do 60 Pa jest optymalną sztywnością żelu dla wzrostu megakariocytów 9.

Poniższy protokół opisuje metodę hodowli mysich megakariocytarnych progenitorów w hydrożelu metylocelulozowym 3D. Wcześniej wykazano, że w porównaniu ze standardową hodowlą płynną, ta hodowla hydrożelu zwiększa stopień poliploidyzacji megakariocytów, poprawia dojrzewanie i organizację wewnątrzkomórkową oraz zwiększa zdolność megakariocytów do wydłużania propłytek po ponownym zawieszeniu w płynnym podłożu 9. W niniejszym manuskrypcie szczegółowo opisano protokół izolacji komórek Lin szpiku kostnego myszy i ich osadzania w hydrożelu metylocelulozy do hodowli 3D, a także ilościowe określenie ich zdolności do wytwarzania propłytek i odzyskiwania komórek do dalszych analiz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie protokoły przedstawione w filmie zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z prawem europejskim i zaleceniami Komisji Rewizyjnej Etablissement Français du Sang (EFS). Pierwsza wersja tego protokołu została pierwotnie opublikowana w 2018 roku w Methods in Molecular Biology 8.

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schematyczny widok całego procesu. Proces ten obejmuje 1) rozwarstwienie kości, pobranie szpiku i mechaniczną izolację komórek szpiku, 2) sortowanie magnetyczne komórek lineage ujemnych (Lin-), 3) wysiew w płynnym lub hydrożelu metylocelulozowym oraz 4) ponowne zawieszenie megakariocytów wyhodowanych w żelu 3D w celu zbadania tworzenia się propłytek w płynnym podłożu.

1. Pobieranie kości od dorosłych myszy

UWAGA: W tej sekcji ważne jest, aby zminimalizować zanieczyszczenie mikrobiologiczne.

  1. Przygotuj probówkę o pojemności 15 ml do pobrania kości z modyfikowaną pożywką Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającą 1% całkowitej objętości mieszaniny antybiotyków penicylina, streptomycyna i glutamina (PSG) (penicylina 10000 j./ml, streptomycyna 100000 μg/ml i L-glutamina 29,2 mg/ml).
    UWAGA: Jeśli wszystkie użyte myszy mają ten sam genotyp, zbierz wszystkie kości w tej samej probówce zawierającej 1 ml DMEM - PSG 1% na liczbę myszy. Antybiotyki są ważne, aby zapobiec możliwemu namnażaniu się bakterii w czasie pobierania próbek kostnych.
  2. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml etanolem 70% do dezynfekcji kości i drugą do płukania narzędzi podczas zabiegu. Używaj wysterylizowanych narzędzi preparacyjnych.
  3. Znieczulić myszy za pomocą inhalacji izofluranu (4%) i szybko przejść do zwichnięcia szyjki macicy w celu eutanazji myszy. Szybko zanurz ciało w 70% etanolu, aby zdezynfekować i uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
  4. Szybko wypreparuj piszczele i kości udowe.
  5. Za pomocą skalpela odetnij nasady bocznego końca kostki w kierunku kości piszczelowej i po stronie biodra w kierunku kości udowej.
  6. Zanurz kości na jedną sekundę w 70% etanolu przed zanurzeniem ich w pożywce DMEM zawierającej 1% PSG.

2. Dysocjacja szpiku i izolacja komórek Lin-

UWAGA: Ta część protokołu jest wykonywana pod okapem z przepływem laminarnym. W przypadku jednej kultury wszystkie studzienki są częścią tego samego eksperymentu i nie mogą być uważane za niezależne repliki biologiczne. Komórki wszystkich myszy są łączone razem, aby zapewnić jednorodność wszystkich studzienek i móc je ze sobą porównać, eliminując możliwą zmienność międzyosobniczą. W przypadku niezależnych replik biologicznych hodowlę należy powtórzyć.

  1. Umieść kości na szalce Petriego i podnieś je dwukrotnie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia.
  2. Przygotuj DMEM - 1% PSG w probówce 50 ml.
    UWAGA: Zapewnij 2 ml DMEM - 1% PSG na myszy użyte w eksperymencie.
  3. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml wyposażoną w igłę o rozmiarze 21 z DMEM - 1% PSG.
  4. Trzymając kość kleszczami, wprowadź tylko skos igły na końcu po stronie kolana.
    UWAGA: Nasada po stronie kolana powinna pozostać nienaruszona po rozwarstwieniu, pozostawiając w jej środku niewielką jamę, przez którą należy wprowadzić igłę. Pozostała nasada utrzyma kość przyczepioną do igły podczas płukania. Uważaj, aby nie wprowadzić do kości więcej niż skos, ponieważ może to spowodować zgniecenie i uszkodzenie szpiku.
  5. Szybko nacisnąć tłok strzykawki, aby wypłukać szpik do probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Aby uniknąć rozprysków i ułatwić płukanie i uwalnianie szpiku, umieść wolny koniec kości na ściance rurki, zanurzony w DMEM - 1% PSG. W praktyce objętość od 500 μl do 1 ml jest na ogół wystarczająca do wydalenia szpiku z kości. Kiedy szpik zostanie całkowicie wydalony, kość staje się biała. W przypadku, gdy szpik nie został całkowicie wydalony z trzonu, co ocenia się na podstawie pozostałego czerwonego koloru, możliwe jest powtórzenie płukania świeżą pożywką.
  6. Powtórzyć kroki 2.4 i 2.5 dla wszystkich kości, w razie potrzeby napełniając strzykawkę o pojemności 5 ml DMEM - 1% PSG.
  7. Użyj tej samej strzykawki o pojemności 5 ml z igłą o rozmiarze 21, aby przenieść całkowitą objętość pożywki zawierającej przepłukany szpik do okrągłodennych probówek o pojemności 10 ml.
    UWAGA: Nie jest absolutnie konieczne przejście na okrągłodenną probówkę o pojemności 10 ml, ale ułatwia to przejście do następujących etapów dysocjacji. Nie wahaj się zmienić strzykawki i/lub igły, jeśli podejrzewa się ryzyko zanieczyszczenia.
  8. Przejdź do dysocjacji komórek poprzez zasysanie i wydalanie pożywki i komórek szpiku kolejno dwa razy przez igłę 21G, trzy razy przez igłę 23G i raz przez igłę 25G.
    UWAGA: Unikaj pęcherzyków powietrza, ponieważ może to być szkodliwe dla komórek.
  9. Przenieść zawiesinę do probówek o pojemności 15 ml.
  10. Zmierzyć liczbę komórek i sprawdzić ich żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory celi do ręcznego liczenia w obecności trypana niebieskiego, aby wykluczyć martwe komórki.
  11. Odwirować probówki o pojemności 15 ml przez 7 minut przy 300 x g. Używając pipety transferowej o pojemności 1 ml, ostrożnie odpipetować i wyrzucić supernatant.
  12. Wyizolować komórki macierzyste i progenitorowe przez ujemne sortowanie immunomagnetyczne przy użyciu zestawu do izolacji komórek krwiotwórczych myszy.
    UWAGA: Celem tego sortowania komórek jest pobranie komórek, które są ujemne dla wszystkich przeciwciał selekcyjnych (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4), a zatem wyeliminowanie komórek, które są już zaangażowane w linię różnicowania inną niż megakariocytowa.
  13. Postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu, ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżo przygotowanym podłożu M (PBS z 2% końcowej objętości płodowej surowicy bydlęcej (FBS), EDTA 1 mM) do stężenia 1 × 108 komórek/ml i rozprowadzić zawiesinę w okrągłodennych probówkach polistyrenowych o pojemności 5 ml do maksymalnej objętości 2 ml.
  14. Do probówek polistyrenowych należy dodać normalną surowicę szczura o stężeniu 50 μL/ml oraz mieszaninę przeciwciał biotynylowanych (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) o stężeniu 50 μl mieszanki na ml i homogenizować, delikatnie przesuwając probówki.
    UWAGA: Przeciwciała te będą wiązać się z komórkami już zaangażowanymi w szlak różnicowania, z wyjątkiem szlaku megakariocytarnego.
  15. Inkubować probówki na lodzie przez 15 minut.
  16. Dodać kulki magnetyczne pokryte streptawidyną o stężeniu 75 μl/ml i homogenizować, delikatnie przesuwając probówki.
  17. Ponownie inkubować na lodzie przez 10 minut.
  18. W razie potrzeby dostosować do końcowej objętości 2,5 ml na probówkę z pożywką M.
  19. Homogenizować zawiesinę, delikatnie przesuwając rurkę tuż przed umieszczeniem ich, bez nasadek, w magnesie i odczekaj trzy minuty.
    UWAGA: Komórki już zaangażowane w ścieżkę różnicowania i pokryte kulkami magnetycznymi zostaną zatrzymane na ściance rurki wewnątrz magnesu.
  20. Odwróć magnes i rurkę, aby przenieść zawartość probówki do nowej probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem.
    UWAGA: Nie wyjmuj rurki z magnesu w celu przeniesienia; Odbywa się to poprzez odwrócenie magnesu z rurką nadal w środku. Używaj jednostajnych ruchów i nie potrząsaj rurką.
  21. Wyrzuć początkową probówkę zawierającą niepożądane komórki znakowane magnetycznie i umieść nową, bez nakrętki, w magnesie na kolejne trzy minuty.
  22. Postępując jak w kroku 2.20, przenieś izolowane komórki Lin− do nowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Jeśli w poprzednich krokach użyto kilku probówek z polistyrenu o pojemności 5 ml, zbierz wszystkie komórki w tej samej probówce o pojemności 15 ml. Komórki odzyskane po sortowaniu komórek to krwiotwórcze komórki macierzyste i komórki progenitorowe. Obecność trombopoetyny (TPO), głównego fizjologicznego regulatora megakariopoezy 10, skieruje różnicowanie komórek w kierunku linii komórek megakariocytarnych.
  23. Zmierz liczbę komórek Lin− i żywotność, jak w kroku 2.10.
  24. Obliczyć wymaganą objętość zawiesiny komórek do odwirowania, aby mieć 1 x 106 żywych komórek x liczba studzienek, przy czym liczba studzienek to liczba studzienek do wysiewu na warunek.
  25. Przygotować jedną probówkę na kondycję z odpowiednią objętością zawiesiny komórek i odwirowywać przy 300 x g przez 7 minut.
  26. W przypadku hodowli płynnych należy odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym pożywce hodowlanej (DMEM, PSG 1% objętości końcowej, FBS 10% objętości końcowej, hirudyna 100 U/ml, TPO 50 ng/ml), aby osiągnąć końcowe stężenie 2 × 106 żywotnych komórek/ml (równe 1 × 106 komórek na 500 μl studzienki). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2. (= dzień 0 hodowli)
    UWAGA: Zobacz następny akapit dla kultur metylocelulozowych Na przykład, aby przygotować kompletną pożywkę hodowlaną dla jednego dołka, użyj 435 μl DMEM, 50 μL 100% FBS dla 10% final, 5 μL 100% PSG dla 1% final, 5 μL 10 000 U/ml dla 100 U/ml final i 5 μL 5 μl TPO dla 50 ng/mL final. Zazwyczaj stosuje się 4- lub 24-dołkowe płytki hodowlane, ponieważ ich średnica studzienki jest odpowiednia dla 500 μl potrzebnych na studzienkę.

3. Zanurzanie komórek w hydrożelu metylocelulozowym

UWAGA: Proszę zauważyć, że poniższy protokół opisuje metodę uzyskania pojedynczej studni z hydrożelową hodowlą komórkową, dostosowaną do liczby potrzebnych studzienek.

  1. Rozmrozić 1 ml podwielokrotności 3% roztworu podstawowego metylocelulozy w temperaturze pokojowej. Przygotować jedną oddzielną dodatkową porcję metylocelulozy do powlekania strzykawki.
    UWAGA: W stężeniu 3% metyloceluloza pozostaje ciekła w temperaturze pokojowej (20-25 °C).
  2. Strzykawkę typu Luer lock o pojemności 1 ml wyposażoną w igłę o rozmiarze 18 należy pokryć metylocelulozą, pobierając 1 ml metylocelulozy z dodatkowej porcji. Całkowicie usunąć metylocelulozę.
    UWAGA: Ten etap powlekania zapewnia, że objętość metylocelulozy zebranej w kroku 3.3 jest dokładna.
  3. Za pomocą tej samej strzykawki i igły, ale przy użyciu nowej porcji metylocelulozy, narysuj odpowiednią objętość metylocelulozy (Rysunek 2A).
    UWAGA: Aby osiągnąć końcowe stężenie 2% metylocelulozy w końcowej objętości 500 μL na studzienkę, wymagane jest 333 μL 3% metylocelulozy.
  4. Ostrożnie wyjąć igłę. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy przykręć złącze Luer lock do końca strzykawki (Rysunek 2B-C).
  5. Podłącz drugą, niepowlekaną, 1 ml strzykawkę Luer lock do złącza Luer lock, aby połączyć ze sobą dwie strzykawki (Rysunek 2D).
    UWAGA: Nie ma potrzeby powlekania tej drugiej strzykawki.
  6. Równomiernie rozprowadź objętość metylocelulozy między dwiema strzykawkami (Rysunek 2E) i odłóż je na bok do kroku 3.11.
  7. Przygotować zagęszczoną pożywkę hodowlaną DMEM w taki sposób, aby uzyskać w końcowej objętości metylocelulozy (etap 3.11) stężenie identyczne ze stężeniem płynnej pożywki hodowlanej dla każdego związku (PSG 1% objętości końcowej, FBS 10% objętości końcowej, hirudyna 100 U/ml, TPO 50 ng/ml).
    1. Przygotować 167 μl skoncentrowanej pożywki hodowlanej na końcowy basenik 1 × 106 komórek. Tę objętość pożywki oblicza się tak, aby uzyskać końcowe stężenie metylocelulozy wynoszące 2%. Całkowita objętość w studzience wyniesie 500 μl (167 μl zawiesiny komórek w zagęszczonej pożywce hodowlanej + 333 μl metylocelulozy), a wszystkie składniki będą miały stężenie identyczne jak w studzienkach cieczowych.
    2. Na przykład, aby przygotować kompletną pożywkę hodowlaną dla jednego dołka, użyj 102 μl DMEM, 50 μl 100% FBS dla 10% końcowej, 5 μL 100% PSG dla 1% końcowej, 5 μL 10 000 U/ml dla 100 U/ml końcowej i 5 μL 5 μl 5 μg/ml TPO dla 50 ng/ml końcowej. Daje objętość 167 μL użytą do ponownego zawieszenia komórek, a po dodaniu 333 μL metylocelulozy końcowa objętość wyniesie 500 μL.
  8. Po zakończeniu etapu wirowania 2.26 odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w zagęszczonej pożywce hodowlanej w stosunku 1 × 106 komórek na 167 μl.
  9. Wyjąć strzykawki i odłączyć jedną z nich od złącza.
  10. Odpipetować 167 μl zawiesiny komórek.
  11. Dodaj zawiesinę komórek bezpośrednio do złącza strzykawki (Rysunek 2F), uważając, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Podczas dodawania zawiesiny do komórek należy jednocześnie powoli pociągnąć tłok strzykawki, aby zwolnić trochę miejsca na zawiesinę komórek.
  12. Ostrożnie ponownie podłącz dwie strzykawki (Rysunek 2G), nie tracąc żadnej zawiesiny w gwincie.
    UWAGA: Przed ponownym podłączeniem należy naciągnąć tłok, aby pozostawić łącznik do połowy pusty i pozostawić wystarczająco dużo miejsca na podłączenie drugiej strzykawki bez przepełnienia zawiesiny.
  13. Powoli homogenizować pożywkę metylocelulozową z zawiesiną komórkową z dziesięcioma ruchami tłoka w przód iw tył między dwiema strzykawkami (Rysunek 2H).
  14. Pobrać całą objętość do jednej strzykawki i odłączyć obie strzykawki, pozostawiając łącznik na pustym.
  15. Opróżnij zawartość strzykawki do dołka na płytce 4-dołkowej (Rysunek 2I).
  16. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 (= dzień 0 hodowli).
    UWAGA: Możliwe jest przygotowanie dwóch studzienek metylocelulozowych za pomocą jednej pary strzykawek. Zwiększ o dwa objętość metylocelulozy i objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać 2 x 106 komórek. Po wykonaniu kroku 3.13. Rozprowadzić objętość równomiernie między dwiema strzykawkami, tak aby w każdej z nich znajdowało się 500 μl. Odłącz je i opróżnij ten bez złącza w studzience hodowlanej. Ponownie podłączyć strzykawki, aby przenieść objętość z tej, która utrzymywała złącze, do drugiej. Odłącz strzykawki, ta z 500 μl nie powinna mieć podłączonego łącznika, i wysiewaj komórki w drugiej studzience hodowlanej. 3% metyloceluloza jest kupowana jako roztwór podstawowy w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco firmy Iscove (IMDM), podczas gdy skoncentrowane komórki są zawieszone w DMEM. Początkowo przeprowadzono testy porównawcze, aby upewnić się, że ta mieszana pożywka nie miała wpływu na wynik eksperymentu, zwłaszcza w porównaniu z płynną kulturą w 100% DMEM.

4. Zawiesina komórek do analizy propłytek

krwi

UWAGA: Analiza zdolności do tworzenia propłytek musi być przeprowadzona w porównywalnych warunkach między megakariocytami hodowanymi w płynie i metylocelulozie. Fizyczne ograniczenia wywierane przez hydrożel metylocelulozowy hamują wydłużanie się propłytek. Dlatego komórki wyhodowane za pomocą metylocelulozy są ponownie zawieszane w świeżej płynnej pożywce w 3 dniu hodowli, aby umożliwić im wydłużenie propłytek. Hydrożel metylocelulozowy jest fizycznym hydrożelem, który można łatwo rozcieńczyć po dodaniu płynnego podłoża. Co ważne, aby uniknąć artefaktów związanych z ponownym zawieszaniem i wirowaniem, komórki w pożywce kontrolnej muszą być traktowane jednocześnie w taki sam sposób, jak komórki hodowane z metylocelulozy. Zapoznaj się ze schematycznym przedstawieniem eksperymentu (Rysunek 1).

  1. Przygotować 10 ml DMEM - 1% PSG podgrzanego w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 15 ml dla każdej studzienki do ponownego zawieszenia.
  2. Ostrożnie zawiesić komórki z każdej studzienki w 10 ml DMEM - 1% PSG.
    UWAGA: Delikatnie wykonaj kilka ruchów w górę iw dół, aby całkowicie rozcieńczyć metylocelulozę. W przypadku studzienek z cieczą upewnij się, że zebrałeś wszystkie komórki osadzone na dnie studzienki.
  3. Odwirować probówki przez 5 minut przy 300 × g.
  4. W międzyczasie należy przygotować kompletną pożywkę hodowlaną (DMEM, PSG 1% objętości końcowej, FBS 10% objętości końcowej, hirudyna 100 U/ml, TPO 50 ng/ml).
    UWAGA: Na tym etapie każda studzienka jest pobierana w celu rozcieńczenia o połowę, dlatego należy przygotować 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej na studzienkę.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hodowlanej dla każdej probówki.
  6. Ponownie wysiewać 500 μl zawiesiny komórek na basenik na płytce 4- lub 24-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2,
    UWAGA: Z jednego dołka początkowego uzyskaj 2 dołki do wizualizacji propłytek w dwóch egzemplarzach. Należy pamiętać, że ponieważ te duplikaty pochodzą z tej samej próbki, nie można ich uznać za niezależne powtórzenia.
  7. 24 godziny po ponownym wysiewaniu, w 4 dniu hodowli, losowo uzyskaj 10 obrazów na studzienkę, używając mikroskopii jasnego pola i obiektywu 20×.
    UWAGA: Komórki mają tendencję do grupowania się w środku dołka, upewnij się, że nie masz zbyt wielu komórek na polu, ponieważ może to utrudnić wizualizację propłytek i kwantyfikację. Upewnij się, że przechwyciłeś co najmniej 5 megakariocytów na pole.
  8. Policz całkowitą liczbę megakariocytów i megakariocytów wydłużających propłytki na każdym obrazie i oblicz odsetek megakariocytów wydłużających propłytki.
    UWAGA: Kwantyfikacja nie jest zautomatyzowana; Ręczne zliczanie komórek. Liczenie można ułatwić za pomocą wtyczki licznika komórek ImageJ, aby kliknąć komórki w celu oznaczenia ich podczas liczenia. 10 pól nabytych na studzienkę i studzienek w dwóch egzemplarzach reprezentuje około 150-300 megakariocytów na warunek.

5. Utrwalanie i pobieranie komórek do przyszłych analiz

UWAGA: Ten protokół używa utrwalaczy, które muszą być używane pod okapem oparowym, w sprzęcie ochronnym.

UWAGA: Celem jest utrzymanie nienaruszonych ograniczeń żelu nałożonych na komórki, dopóki nie zostaną one w pełni naprawione. Dlatego i niezależnie od zastosowanego utrwalacza, należy go dodać do studzienki na wierzchu metylocelulozy, nie naruszając żelu. Ten sam protokół stosuje się do kultur płynnych.

  1. Dodać objętość roztworu utrwalającego równą objętości wysiewu (500 μl w niniejszym protokole), na wierzch metylocelulozy, nie naruszając żelu. Odczekać odpowiedni czas w zależności od użytego utrwalacza (co najmniej 10 min).
    UWAGA: Dyfuzja utrwalająca w całym żelu powinna być bardzo szybka, co objawia się szybką zmianą koloru żelu (z różowego na żółto-pomarańczowy odcień). Paraformaldehyd (8% w DPBS, 500 μl na studzienkę) jest zwykle używany do znakowania immunologicznego, podczas gdy glutaraldhehyd (5% w buforze kakodylanowym, 500 μl na studzienkę) jest używany do analizy mikroskopii elektronowej.
  2. Za pomocą pipety P1000 delikatnie wykonaj kilka pipetowania w górę i w dół z utrwalaczem i żelem, aby równomiernie rozcieńczyć metylocelulozę.
  3. Za pomocą tej samej pipety i końcówki przenieś całą objętość z dołka do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml DPBS i homogenizuj.
  4. Odwirować mieszaninę o stężeniu 300 × g przez 7 min.
    UWAGA: Może być potrzebny drugi etap mycia w celu wyeliminowania całej metylocelulozy
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad megakariocytów w odpowiednim podłożu zgodnie z pożądaną analizą (znakowanie immunologiczne, cytometria przepływowa9, mikroskopia elektronowa ...) (w przypadku mikroskopii elektronowej patrz również metoda papierowa "Eksploracja in situ głównych etapów megakariopoezy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej" w tym wydaniu JoVE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dane uzyskane przy użyciu tego protokołu zostały pierwotnie opublikowane w czasopiśmie Blood w 2016 roku9.

Zgodnie z protokołem, komórki zasiano w medium płynnym lub w hydrożelu metylocelulozowym. Komórki w medium płynnym osiadły na dnie dołka, w kontakcie ze sztywną plastikową powierzchnią, a niekiedy także z innymi komórkami. W przeciwieństwie do nich, komórki zatopione w hydrożelu metylocelulozowym są rozmieszczone w żelu jednorodnie i są odizolowane od sąsiednich ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatniej dekadzie mechanobiologia budziła coraz większe zainteresowanie w wielu dziedzinach biologii. Obecnie powszechnie uznaje się, że środowisko mechaniczne otaczające komórki odgrywa rolę w ich zachowaniu, co podkreśla znaczenie badania, w jaki sposób megakariocyty wyczuwają i reagują na zewnątrzkomórkowe sygnały mechaniczne. Dokładne zmierzenie sztywności tkanki szpiku kostnego in situ11 jest trudne, zwłaszcza jeśli weźmiemy pod uwagę krwiotwórczy szpik czerwony, ponieważ znajduje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Fabienowi Pertuy i Alicii Aguilar, którzy początkowo opracowali tę technikę w laboratorium, a także Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg), którzy scharakteryzowali lepkosprężyste właściwości hydrożelu metylocelulozowego. Prace te były wspierane przez ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) oraz przez grant ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher jest stypendystką Fondation pour la Recherche Médicale (stypendium FRM nr FDT202012010422).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły o rozmiarze 18Sigma-Aldrich1001735825
Igły o rozmiarze 2123 mm BD Microlance301155
TerumoAN*2332R1
Neeldes o rozmiarze 25 NaczyniaBD Microlance300400
Thermo Scientific 144444
Strzykawki 5 mlTerumoSS+05S1
CytoclipsMicrom MicrotechF/CLIPSH
Cytofunnels wyposażone w karty filtracyjneMicrom MicrotechF/JC304
Wirówka cytospinowaThermo ScientificCytospin 4
DakopenDako
DMEM 1xGibco, Life Technologies41 966-029
DPBSLife Technologies14190-094Sterylne Dulbecco' s buforowane fosforanami sól fizjologiczna
Magnesy EasySepStem Cell Technologies18000
EasySep Zestaw do izolacji krwiotwórczych komórek progenitorowych myszyStem Cell Technologies19856Abiotynylowane przeciwciała (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7– 4) i kulki magnetyczne pokryte streptawidyną
EDTAInvitrogen15575-020
Surowica bydlęcapłodu Opieka zdrowotna Life ScienceSH30071.01
Strzykawki Luer lock 1 mlSigma-AldrichZ551546-100EAlub 309628 strzykawki od BD MEDICAL
Strzykawki Luer lock łącznikiFisher Scientific11891120
MC 3%R& Amp; Systemy DHSC001
Prowadnice powlekane polilizynąThermo ScientificJ2800AMNZ
PSG 100xGibco, Life Technologies1037-01610 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μ g/ml streptomycyny i 29,2 mg/ml glutaminy
Surowica szczuraStem Cell Technologies13551
Rekombinowana hirudynaTransgè nerHV2-Lys47
Rekombinowana ludzka trombopoetyna (rhTPO)Technologie komórek macierzystych282210 000 jednostek/ml
Okrągłe dno 10 ml probówki z tworzywa sztucznegoFalcon352054
Rurki
Igły o rozmiarze 4-dołkowe polistyrenowe o okrągłym dnie 5 ml

Bibliografia

  1. Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
  2. Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
  3. Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
  6. Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
  7. Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
  8. Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
  9. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
  10. Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
  11. Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
  12. Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
  13. Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
  14. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hydrożel 3Dhydrożel metylocelulozowyśrednia sztywnośćograniczanie przestrzeni komórekkomórki progenitorowe układu krwiotwórczegoformowanie propłytekcytometria przepływowamikroskopia elektronowa
Hodowla megakariocytów w hydrożelu 3D na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i uwięzienia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.