Artykuł metodologiczny

Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

DOI:

10.3791/62534

⸱

22 kwietnia 2022

 ,  ,  , 
1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2Central Laboratory, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cotton Hybrid R & D Engineering Center (the Ministry of Education), College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, 4Hainan Institute of Zhejiang University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepienie pod celami i tagmentacją (CUT&Tag) to skuteczna strategia profilowania epigenomicznego chromatyny. Protokół ten przedstawia udoskonaloną strategię CUT&Tag do profilowania modyfikacji histonów w roślinach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulacja epigenomiczna na poziomie chromatycznym, w tym modyfikacje DNA i histonów, zachowania czynników transkrypcyjnych i niekodujących RNA z ich rekrutowanymi białkami, prowadzą do czasowej i przestrzennej kontroli ekspresji genów. Rozszczepienie pod celami i znakowaniem (CUT&Tag) to metoda wiązania enzymatycznego, w której specyficzne białko chromatyny jest najpierw rozpoznawane przez jego specyficzne przeciwciało, a następnie przeciwciało wiąże białko fuzyjne transpozazy A (pA-Tn5), które rozszczepia docelową chromatynę in situ poprzez aktywację jonów magnezu. W tym miejscu przedstawiamy nasz wcześniej opublikowany protokół CUT&Tag wykorzystujący nienaruszone jądra wyizolowane z allortetraploidalnych liści bawełny z modyfikacją. Ten protokół krok po kroku może być wykorzystany do badań epigenomicznych na roślinach. Ponadto przedstawiono istotne modyfikacje izolacji jąder roślinnych wraz z krytycznymi uwagami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miejsca związane z czynnikiem transkrypcyjnym DNA i otwarta chromatyna związana ze znacznikami modyfikacji histonów pełnią kluczowe funkcje funkcjonalne w regulacji ekspresji genów i są głównymi celami badań epigenetycznych1. Konwencjonalnie, test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem (ChIP-seq) był stosowany do identyfikacji całego genomu specyficznej modyfikacji histonów chromatyny lub celów DNA z określonymi białkami i jest szeroko stosowany w dziedzinie epigenetyki2. Technologia CUT&Tag (Cleavage under targets and tagmentation) została pierwotnie opracowana przez Henikoff Lab w celu wychwytywania fragmentów DNA związanych z białkiem w całym genomie5. W porównaniu do ChIP, CUT&Tag może generować biblioteki DNA o wysokiej rozdzielczości i wyjątkowo niskim tle przy użyciu niewielkiej liczby komórek za pomocą uproszczonej procedury3. Do tej pory metody analizy regionów chromatyny ze specyficznymi modyfikacjami histonów za pomocą CUT&Tag zostały ustalone w komórkach zwierzęcych4,5. W szczególności jednokomórkowy CUT&Tag (scCUT&Tag) został również z powodzeniem opracowany dla tkanek i komórek ludzkich6. Jednak ze względu na złożoność ściany komórkowej i metabolitów wtórnych, CUT&Tag jest nadal wyzwaniem technicznym dla tkanek roślinnych.

Poprzednio opisaliśmy protokół CUT&Tag wykorzystujący nienaruszone jądra wyizolowane z allotetraploidalnych liści bawełny4. Aby zademonstrować skuteczność izolacji jąder i wychwytywania DNA za pomocą tkanki roślinnej, przedstawiono procedurę profilowania. Główne etapy obejmują izolację nienaruszonych jąder, inkubację in situ z przeciwciałem do modyfikacji chromatyny, inkubację transpozazy, integrację adaptora i przygotowanie biblioteki DNA. Rozwiązywanie problemów koncentruje się na przygotowaniu biblioteki CUT&Tag do izolacji jąder roślinnych i kontroli jakości.

W tym badaniu prezentujemy udoskonaloną strategię CUT&Tag dla roślin. Nie tylko dostarczamy krok po kroku protokół profilowania H3K4me3 w liściach bawełny, ale także zapewniamy zoptymalizowaną metodologię izolacji jąder roślinnych, w tym strategię wyboru stężenia detergentu do prawidłowej lizy komórek oraz strategię filtrowania jąder. Szczegółowe kroki z krytycznymi komentarzami są również zawarte w tym zaktualizowanym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie transpozazy i roztworów podstawowych (Dzień 1)

UWAGA: W tej części, adaptery oligonukleotydowe są skompleksowane z transpozazą Tn5 w celu wytworzenia aktywnej transpozazy.

  1. Rozcieńczyć startery (starter A, starter B i primer C) do stężenia 100 μM przy użyciu buforu do wyżarzania (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (patrz Tabela 1 w celu uzyskania informacji o sekwencji starterów i Tabela 2 w celu uzyskania receptur roztworów roboczych). Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Ustaw następujące dwie reakcje w probówkach PCR: Reakcja 1 (adapter AB), 10 μL 100 μM startera A, 10 μL 100 μM startera B; Reakcja 2 (adapter AC), 10 μL 100 μM startera A, 10 μL 100 μM startera C.
  3. Wyżarzać adaptery w maszynie PCR za pomocą następującego programu: pokrywka termiczna (102 °C), 75 °C przez 15 min, 60 °C przez 10 min, 50 °C przez 10 min, 40 °C przez 10 min, 25 °C przez 30 min.
    UWAGA: Adaptery są częściowo dwuniciowymi cząsteczkami DNA (stężenie = 50 pmol/μL).
  4. W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml należy przeprowadzić następującą reakcję: 10 μl transpozazy pA-Tn5 (500 ng/μL lub 7,5 pmol/μL), 0,75 μl adaptera AB (50 pmol/μL), 0,75 μl adaptera AC (50 pmol/μL), 7 μL buforu sprzęgającego. Delikatnie pipetować 20x, aby dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej przez 1 godzinę. Końcowe stężenie transpozazy = 4 pmol/μL. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Stosunek molowy adaptera AB: adapter AC: transpozaza = 0,5:0,5:1.
  5. Przygotować roztwory podstawowe zgodnie z recepturami podanymi w Tabeli 2 i autoklawować lub przefiltrować roztwory podstawowe w celu sterylizacji.
  6. Autoklaw i sterylizuj nożyczki, bibułę filtracyjną, sito ze stali nierdzewnej, moździerz, tłuczki itp.

2. Izolacja jąder (Dzień 2)

  1. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Na każdy 1 g materiału wyjściowego (liście bawełny) przygotować 25 ml buforu do izolacji jądrowej A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 ml buforu do izolacji jądrowej B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 ml buforu do płukania jądrowego (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidyna, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%), 1 ml buforu przeciwciał (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidyna, 1 mg/ml BSA, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%, 0,05% w/v digitonina). Pozostaw probówki na lodzie do czasu użycia.
  2. Zmielić świeże liście (~1 g) w ciekłym azocie na drobny proszek i przenieść do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml schłodzonego buforu do izolacji jądrowej A.
  3. Delikatnie wymieszaj roztwór buforowy i inkubuj probówkę na lodzie przez 5 minut, delikatnie wstrząsając, aby równomiernie rozprowadzić materiał.
  4. Wirować przez 5 minut w temperaturze 500 rcf w temperaturze 4 °C, aby uformować osad komórkowy.
  5. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 20 ml schłodzonego buforu do izolacji jądrowej B uzupełnionego 0,5% Tritonem X-100. Delikatnie odwróć rurkę, aby całkowicie zawiesić granulkę.
    UWAGA: 20 ml bufor izolacji jądrowej B ma zastosowanie do 1 g materiału wyjściowego, a objętość tę można odpowiednio zwiększyć.
    1. Wykonać test pilotażowy w celu zbadania wpływu stężenia szeregowego Triton X-100 (np. 2 ml buforu do izolacji jądrowej B, każdy z 0,1%, 0,25%, 0,5% i 1% Triton X-100 na 100 mg rozdrobnionych tkanek). Na odpowiednie stężenie Triton X-100 wskazuje nagromadzenie białych/szarych jąder na dnie i ciemnozielony supernatant po lizie i odwirowaniu na niskiej prędkości (< 500 rcf przez 4 min).
  6. Przefiltruj powstały lizat komórkowy za pomocą kombinacji dwóch sit: sita o oczkach 500 na górze, aby usunąć większe resztki tkanki, i sita o oczkach 1000 na dole, aby zebrać jądra.
    UWAGA: Wybierz odpowiedni rozmiar oczek dla sit w zależności od wielkości jąder roślin.
  7. Użyj sterylnej bibuły filtracyjnej z tyłu sita, aby wchłonąć drobne resztki komórek w lizacie.
  8. Pozostałe jądra zawierające lizat przenieść z górnej strony sita o oczkach 1000 do czterech świeżych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
  9. Wirować przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C w celu zebrania jąder.
  10. Usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą końcówki pipety i przemyć osad buforem do przemywania jądrowego.
  11. Dodać 800 μl buforu do płukania jądrowego i delikatnie odwrócić probówki, aby ponownie zawiesić osad. Ponownie obracać rurkę przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C.
  12. Wykonaj w sumie 3 prania.
  13. (Opcjonalnie) Zobrazuj jądra pod mikroskopem w celu barwienia DAPI.
    1. Przenieść 100 μl zawiesiny jąder w buforze do płukania jądrowego z etapu 2.11. do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 900 μl buforu do przemywania jądrowego i 2 μl roztworu podstawowego DAPI (1 mg/ml), aby uzyskać końcowe stężenie robocze 2 μg/ml dla DAPI. Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Po barwieniu wirować przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C w celu zebrania jąder.
    3. Usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą końcówki pipety. Przemyć 3 razy 800 μl buforu do przemywania nuklearnego.
    4. Usunąć jak najwięcej supernatantu i ponownie zawiesić jądra za pomocą 100 μl buforu do płukania jądrowego.
    5. Zobrazuj jądra pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą kanału DAPI.
  14. Połącz jądra z dwóch probówek (~50 μl objętości jąder w każdej probówce o pojemności 1,5 ml). Wirować przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć jak najwięcej pozostałego buforu za pomocą końcówki do pipety.

3. Inkubacja przeciwciał

  1. Zawiesić każde 50 μl jąder w probówce o pojemności 1,5 ml z 1 ml buforu przeciwciał.
  2. Ustaw następujące reakcje w probówkach o pojemności 1,5 ml: dwie kontrpróby biologiczne grup kontrolnych IgG ze 150 μl jąder (~ 1 μg chromatyny) i 2 μl IgG (1 mg / ml) w każdej probówce, dwie kontrpróby biologiczne grup testowych H3K4me3 z 150 μl jąder i 2 μl przeciwciała anty-H3K4me3 (1 mg / ml) w każdej probówce.
  3. Delikatnie wymieszać roztwór i pozostawić probówki na poziomym wytrząsarce do hybrydyzacji przez noc w temperaturze 4 °C i 12 obr./min.
  4. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Przygotować świeże 50 ml buforu do przemywania immunoprecypitacji (IP) (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%, 0,05% w/v digitoniny) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Pozostaw probówkę na lodzie.
  5. Odwirowywać probówki przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć bufor przeciwciał z każdej probówki.
  6. Do każdej probówki dodać 800 μl buforu do płukania IP i delikatnie wymieszać. Pozostaw probówki na wytrząsarce poziomej na 5 minut w temperaturze pokojowej i 12 obr./min.
  7. Po umyciu odwirować probówki przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą końcówki do pipety.
    UWAGA: Aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń w osadzie jąder, należy pozostawić ~50-80 μL buforu z jądrami.
  8. Powtórz kroki 3.6.-3.7. jeszcze dwa razy.
  9. Po trzecim płukaniu wirować przez 2 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć pozostały bufor w jak największym stopniu.

4. Inkubacja transpozazy

  1. Przygotować świeży 1 ml buforu do inkubacji transpozazy (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%, 0,05% w/v digitoniny) mieszając 1 ml buforu do przemywania IP z 30 μl 5 M NaCl.
  2. Aby przygotować mieszaninę transpozazy Tn5 do inkubacji, należy dodać 1 μl transpozazy do każdych 150 μl buforu do inkubacji transpozazy.
    UWAGA: Najpierw przygotować mieszaninę roztworu transpozazy zgodnie z liczbą reakcji, a następnie dodać podwielokrotność 150 μl do każdej probówki.
  3. Zawiesić jądra w 150 μl roztworu transpozazy.
  4. Pozostaw probówki na wytrząsarce poziomej przy 12 obr./min przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej i mieszaj co 10-15 minut.
  5. Po inkubacji transpozazy odwirowywać probówki przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć bufor do inkubacji transpozazy z każdej probówki.
  6. Umyj probówki buforem do płukania IP. W tym celu dodaj 800 μl buforu do płukania IP do każdej probówki, delikatnie wymieszaj i pozostaw probówki na poziomym wytrząsarce z prędkością 12 obr./min na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Wirować przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety.
  8. Powtórz kroki 4.6.-4.7. jeszcze dwa razy.
  9. Po trzecim płukaniu wirować przez 2 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć pozostały bufor w jak największym stopniu.

5. Oznaczanie

  1. Świeżo przygotować 2 ml buforu znakującego (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% w/v digitoniny) mieszając 2 ml buforu do przemywania IP z 60 μl 5 M NaCl i 20 μL 1 M MgCl2.
  2. Zawiesić jądra za pomocą 300 μl buforu znakującego.
  3. Wymieszać roztwór i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu znakowania.
  4. Zatrzymaj znakowanie za pomocą 10 μL 0,5 M EDTA (stężenie końcowe ~15 mM) i 30 μL 10% SDS (stężenie końcowe 1%).

6. Ekstrakcja DNA i budowa biblioteki NGS

  1. Dodać 300 μl buforu do ekstrakcji DNA CTAB zgodnie z opisem7. Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 30 minut. Odwróć do mieszania co ~10 min.
  2. Do każdej probówki dodać 600 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1). Dokładnie wymieszaj.
  3. Wstępnie odwirować probówki z żelem z blokadą fazową przez 2 minuty w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C. Przenieść powyższy roztwór do probówek z żelem z blokadą fazy.
  4. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieść supernatant (~600 μL) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 600 μl chloroformu do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj.
  7. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C.
  8. Przenieść supernatant (~600 μL) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  9. Dodaj 12 μl 100% etanolu i 2 μl GlycoBlue Coprecipitant. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę.
  10. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C.
  11. Zdekantować supernatant. Przemyć osad DNA przy użyciu 75% (v/v) etanolu i odwirować przez 5 minut w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C.
  12. Zdekantować supernatant. Wysuszyć na powietrzu osad DNA i ponownie zawiesić DNA w 25 μl ddH2O.
  13. Ustaw reakcję PCR w następujący sposób. Aby uzyskać łącznie 50 μl reakcji, dodaj 24 μl DNA, 11 μl ddH2O, 10 μl buforu 5x TAE, 2 μl startera P5 (10 μM), 2 μl startera P7 (10 μM) i 1 μl enzymu TruePrep Amplify. Program PCR: 72 °C przez 3 min, 98 °C przez 30 s; następnie 14 cykli w temperaturze 98 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, a następnie 72 °C przez 5 min.
    UWAGA: Nie można pominąć pierwszych 72 °C przez 3 minuty w celu przedłużenia. Nadmierna amplifikacja biblioteki doprowadzi do wysokiego poziomu duplikatów PCR w NGS. Zacznij od 12-14 cykli PCR w reakcji PCR dla H3K4me3 przy użyciu ~1 μg chromatyny w każdej reakcji.
  14. Załaduj 2 μl produktów PCR na 1,5% żelu agarozowym do elektroforezy.
  15. Oczyść produkty PCR za pomocą komercyjnych kulek magnetycznych do oczyszczania DNA.
  16. Określ ilościowo bibliotekę za pomocą fluorometru i elektroforezy w żelu agarozowym.
    UWAGA: Efektywne stężenie biblioteki powinno wynosić >2 nM metodą qPCR, aby zapewnić dobrą jakość.
  17. Wykonuj sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) i analizę danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia przebieg pracy CUT&Tag. Rysunek 2 pokazuje barwienie DAPI nienaruszonych jąder. Celem etapu "izolacji jąder" było uzyskanie nienaruszonych jąder w ilości wystarczającej do późniejszej reakcji CUT&Tag. Rysunek 3 pokazuje elektroforezę w żelu agarozowym produktów PCR. Ujemna kontrola IgG jest wymagana równolegle podczas przygotowywania eksperymentu. W porównaniu z grupą kontrolną IgG, większość fragmentów DNA pobra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisaliśmy CUT&Tag, technologię generowania bibliotek DNA w wysokiej rozdzielczości i wyjątkowo niskim tle przy użyciu niewielkiej liczby komórek przy użyciu uproszczonej procedury w porównaniu z immunoprecypitacją chromatyny (ChIP). Nasz sukces w profilowaniu H3K4me3 w liściach bawełny sugeruje, że CUT&Tag, który po raz pierwszy został zaprojektowany dla komórek zwierzęcych, może być również stosowany do komórek roślinnych. Zarówno system buforowy Tris powszechnie stosowany w teście ChIP8...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy nie pozostają w konflikcie interesów z żadną firmą handlującą jednym z wyżej wymienionych produktów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana finansowo przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) oraz projekt JCIC-MCP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało
Anti-H3K4me3Millipore07-473
Normalne królicze IgGMillipore12-370
Chemikalia
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego BSA. Przechowywać w temperaturze -20° C
digitonina (~50% (TLC)Sigma-AldrichD141Przygotować 5% roztwór podstawowy digitoniny (200 mg digitoniny [~50% czystości] do 2 ml DMSO). Uwaga: Sterylizuj za pomocą filtra 0,22 mikrona. Przechowywać w temperaturze -20° Kwas
C-dimetylosulfotlenku (DMSO)
chloroform
etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Przygotować 0,5 M roztwór podstawowy EDTA (pH = 8,5). Uwaga: Przygotowanie 100 ml 0,5-M EDTA (pH = 8,5) wymaga około 2 g granulek wodorotlenku sodu (NaOH) w celu dostosowania pH
etanolu
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg / ml)InvitrogenAM9516
chlorek magnezu (MgCl2)Przygotować 1 M MgCl2 koktajl
inhibitora proteazyCalbiochem539133-1SET
chlorek potasu (KCl)Przygotować 1 M roztwór podstawowy KCl
fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1,v:v:v)
chlorek sodu (NaCl)Przygotować 5 M roztworu podstawowego NaCl
spermidynyPrzygotować 2 M roztwór podstawowy spermidyny, przechowywać w temperaturze -20&C.
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Przygotować10% roztwór podstawowy SDS. Uwaga: Nie sterylizować w autoklawie; sterylizować za pomocą filtra 0,22 mikrona
PodstawaZrobić 1 M Tris (pH = 8,0) roztwór podstawowy
Triton X-100Zrobić 20% roztwór podstawowy Triton X-100
enzym
nadpobudliwy transpozaza pG-Tn5/pA-Tn5 do CUT& EtykietkaVazymeS602/S603Sprawdź powinowactwo przeciwciał białka A lub białka G, które jest połączone z Tn5. Ogólnie rzecz biorąc, białka A i G mają szerokie powinowactwo do przeciwciał. Jednak białko A ma stosunkowo większe powinowactwo do przeciwciał króliczych, a białko G ma stosunkowo wyższe powinowactwo do przeciwciał myszy. Wybierz odpowiednie produkty transpozazy, które pasują do Twojego przeciwciała.
TruePrep Amplify EnzymeVazymeTD601
Sprzęt
WirówkaEppendorf5424R
PCRApplied BiosystemsABI9700
Wytrząsarka orbitalnaMIULABHS-25
NanoDrop One  spektrofotometrThermo ScientificND-JEDEN-W
w roztworze podstawowym Tris

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  3. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  4. Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120(2020).
  5. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  6. Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
  7. Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11(2007).
  9. Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).
  10. Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
  11. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

H3K4me3 ModificationCUT And TagChromatin ProfilingPlant EpigenomicsNuclei IsolationHistone ModificationTn5 TransposaseAntibody IncubationDNA FragmentationHigh Throughput Sequencing

Powiązane artykuły