Method Article

Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

DOI:

10.3791/62547

⸱

June 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ekstrakcję lotnych związków organicznych z próbki biologicznej za pomocą metody ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżniowo, chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas przy użyciu szyny Entech Sample Preparation Rail, oraz analizę danych. Opisano również hodowlę próbek biologicznych i sondowanie izotopów stabilnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lotne związki organiczne (LZO) z próbek biologicznych mają nieznane pochodzenie. LZO mogą pochodzić od gospodarza lub różnych organizmów z jego społeczności mikrobiologicznej. Aby rozwikłać temat pochodzenia mikrobiologicznych LZO, przeprowadzono analizę lotnej przestrzeni nad powierzchnią mono- i kokultur bakteryjnych Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii, a także sondowanie stabilnych izotopów w próbkach biologicznych kału, śliny, ścieków i plwociny. Mono- i kokultury wykorzystano do identyfikacji produkcji substancji lotnych z poszczególnych gatunków bakterii lub w połączeniu z sondowaniem stabilnych izotopów w celu zidentyfikowania aktywnego metabolizmu drobnoustrojów w próbkach biologicznych.

Ekstrakcja sorbentu wspomagana próżnią (VASE) została zastosowana do ekstrakcji LZO. VASE to łatwa w użyciu, komercjalizowana, bezrozpuszczalnikowa metoda ekstrakcji przestrzeni nad powierzchnią dla związków półlotnych i lotnych. Brak rozpuszczalników i warunki zbliżone do próżni stosowane podczas ekstrakcji sprawiają, że opracowanie metody jest stosunkowo łatwe i szybkie w porównaniu z innymi opcjami ekstrakcji, takimi jak tert-butylacja i mikroekstrakcja do fazy stałej. Opisany tutaj przepływ pracy został wykorzystany do identyfikacji określonych niestabilnych sygnatur z monokultur i kokultur. Co więcej, analiza sondowania stabilnymi izotopami próbek biologicznych związanych z ludźmi pozwoliła zidentyfikować LZO, które były produkowane powszechnie lub unikalnie. W artykule przedstawiono ogólny przebieg pracy i rozważania eksperymentalne dotyczące VASE w połączeniu z sondowaniem stabilnych izotopów żywych kultur drobnoustrojów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lotne związki organiczne (LZO) są bardzo obiecujące w wykrywaniu i identyfikacji bakterii, ponieważ są emitowane przez wszystkie organizmy, a różne mikroorganizmy mają unikalne sygnatury LZO. Cząsteczki lotne zostały wykorzystane jako nieinwazyjny pomiar do wykrywania różnych infekcji dróg oddechowych, w tym przewlekłej obturacyjnej choroby płuc1, gruźlicy2 w moczu3, oraz zapalenia płuc związanego z respiratorem4, oprócz odróżniania osób z mukowiscydozą (CF) od zdrowych osób z grupą kontrolną5,6. Sygnatury lotne zostały nawet wykorzystane do rozróżnienia specyficznych infekcji patogennych w mukowiscydozie (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa8,9 i S. aureus vs. P. aeruginosa10). Jednak ze względu na złożoność takich próbek biologicznych często trudno jest określić źródło określonych LZO.

Jedną ze strategii oddzielania profili lotnych od wielu infekujących mikroorganizmów jest przeprowadzenie analizy przestrzeni nad mikroorganizmami zarówno w monokulturze, jak i w kokulturze11. Analiza przestrzeni nad powierzchnią bada anality emitowane do "przestrzeni nad głową" nad próbką, a nie te osadzone w samej próbce. Metabolity drobnoustrojów są często charakteryzowane w monokulturach ze względu na trudności w określeniu pochodzenia metabolitów drobnoustrojów w złożonych próbkach klinicznych. Poprzez profilowanie substancji lotnych z monokultur bakteryjnych, rodzaje substancji lotnych wytwarzanych przez drobnoustroje in vitro mogą stanowić podstawę jego lotnego repertuaru. Łączenie kultur bakteryjnych, np. tworzenie kokultur i profilowanie wytwarzanych lotnych cząsteczek, może ujawnić interakcje lub wzajemne karmienie między bakteriami12.

Inną strategią identyfikacji mikrobiologicznego pochodzenia lotnych cząsteczek jest dostarczenie źródła składników odżywczych, które jest oznaczone stabilnym izotopem. Izotopy stabilne to naturalnie występujące, nieradioaktywne formy atomów o różnej liczbie neutronów. W strategii, która jest stosowana od wczesnych lat 30. XX wieku do śledzenia aktywnego metabolizmu u zwierząt13, mikroorganizm żywi się oznakowanym źródłem składników odżywczych i włącza stabilny izotop do swoich szlaków metabolicznych. Ostatnio stabilny izotop w postaci ciężkiej wody (D2O) został użyty do identyfikacji metabolicznie aktywnego S. aureus w klinicznej próbce plwociny CF14. W innym przykładzie, 13glukozy znakowanej C wykorzystano do zademonstrowania krzyżowego podawania metabolitów między klinicznymi izolatami mukowiscydozy P. aeruginosa i Rothia mucilaginosa12 .

Wraz z rozwojem technik spektrometrii mas, metody wykrywania lotnych sygnałów przeniosły się z obserwacji jakościowych na bardziej ilościowe pomiary. Dzięki zastosowaniu chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) przetwarzanie próbek biologicznych stało się dostępne dla większości warunków laboratoryjnych lub klinicznych. Wiele metod badania lotnych cząsteczek zostało wykorzystanych do profilowania próbek, takich jak żywność, kultury bakterii i inne próbki biologiczne oraz powietrze i woda w celu wykrycia zanieczyszczeń. Jednak kilka popularnych metod pobierania próbek lotnych o wysokiej przepustowości wymaga rozpuszczalnika i nie jest przeprowadzanych z korzyściami zapewnianymi przez ekstrakcję próżniową. Ponadto do analizy często wymagane są większe objętości lub ilości (większe niż 0,5 ml) pobranych materiałów15,16,17,18,19, chociaż jest to specyficzne dla podłoża i wymaga optymalizacji dla każdego typu próbki i metody.

Tutaj ekstrakcja sorbentu wspomagana próżnią (VASE), a następnie desorpcja termiczna na GC-MS została wykorzystana do zbadania lotnych profili mono- i kokultur bakteryjnych oraz identyfikacji aktywnie wytwarzanych substancji lotnych za pomocą sondowania stabilnych izotopów z ludzkich kału, śliny, ścieków i próbek plwociny (Rysunek 1). Przy ograniczonej ilości próbek, LZO wyekstrahowano już z 15 μl plwociny. Eksperymenty z sondowaniem izotopów na próbkach ludzkich wymagały dodania stabilnego źródła izotopów, takiego jak glukoza 13C, i pożywki w celu kultywowania wzrostu społeczności drobnoustrojów. Aktywna produkcja substancji lotnych została zidentyfikowana jako cięższa cząsteczka przez GC-MS. Ekstrakcja cząsteczek lotnych w próżni statycznej umożliwiła wykrycie cząsteczek lotnych ze zwiększoną czułością20,21,22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uwagi dotyczące analizy Headspace Sorbent Pen (HSP) i próbki

UWAGA: HSP zawierający sorbent Tenax TA został wybrany do wychwytywania szerokiego zakresu substancji lotnych. Tenax ma mniejsze powinowactwo do wody w porównaniu z innymi sorbentami, co umożliwia zatrzymywanie większej ilości LZO z próbek o wyższej wilgotności. Tenax ma również niski poziom zanieczyszczeń i może być kondycjonowany do ponownego użycia. Wyboru sorbentu dokonano również z uwzględnieniem kolumny zainstalowanej w GC-MS (patrz tabela materiałów).

  1. Przeprowadzić kontrole ujemne poprzez ekstrakcję pożywek lub ślepych prób w takich samych warunkach, jak przy ekstrakcji próbki.
  2. Przeanalizować ślepą próbę HSP (wcześniej potwierdzono, że jest czysta i wolna od znaczącego tła) na GC-MS przed analizą wyekstrahowanych próbek. Uruchomić ślepe próby między typami próbek (np. trzy kontrpróby monokultury bakterii, ślepa próba, trzy kontrpróby kohodowli bakterii, ślepa próba itp.).
  3. Ogranicz używanie pachnących środków higieny osobistej lub spożywanie śmierdzących pokarmów przed ekstrakcją i analizą próbki. Najlepiej przygotować próbki w okapie bezpieczeństwa biologicznego, który nie był czyszczony alkoholem lub innymi lotnymi środkami czyszczącymi przez co najmniej 30 minut. Włącz przepływ powietrza w kapturze bezpieczeństwa biologicznego na 30-60 minut przed przygotowaniem próbki.
  4. Próbki należy przechowywać na lodzie, aby ograniczyć uwalnianie substancji lotnych podczas przygotowywania próbki.

2. Przygotowanie mono- i kokultur

  1. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego zaszczepić kultury A. baumannii, S. aureus i P. aeruginosa w pożywkach wzrostowych Todda Hewitta. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem 200 obr./min.
  2. Po całonocnej inkubacji należy przeprowadzić postępowanie z kulturą w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Rozcieńczyć każdą kulturę do gęstości optycznej 0,05 przy 500 nm.
  3. Wymieszać kokultury w równych częściach i odpipetować 200 μl pożywki kontrolnej, mono- lub kokultury do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny. Przygotować drugą płytkę do 48-godzinnej inkubacji.
  4. Pod koniec okresu inkubacji przygotować próbki do ekstrakcji w sekcji 4. Pipetować płynne kultury do probówek mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C, aby w razie potrzeby ekstrahować je później.

3. Sondowanie stabilnych izotopów w przygotowaniu próbek biologicznych

UWAGA: Próbki kału i śliny zostały pobrane od anonimowych dawców za zgodą University of California Irvine Institutional Review Board (HS# 2017-3867). Ścieki pochodziły z San Diego w Kalifornii. Próbki plwociny pobrano od osób z mukowiscydozą w ramach większego badania zatwierdzonego przez University of Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056).

  1. Wszystkie próbki biologiczne należy przygotować w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Aby przygotować próbki kału, dodaj 1 ml wody dejonizowanej do 100 mg kału w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj przez 3 minuty. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany.
      1. Do 15 μl mieszaniny kału i wody dodaj 485 μl pożywki Brain Heart Infusion (BHI) z 20 mM 13C glukozy lub BHI z 30% deuterem (D2O). Upewnij się, że końcowa objętość próbki wynosi 500 μl. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach technicznych.
    2. Aby przygotować próbki ścieków, należy dodać 500 μl ścieków do 500 μL BHI z 20 mM 13C glukozy lub BHI z 30% D2O, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany.
    3. Aby przygotować próbki śliny, dodać 50 μl śliny do 500 μl BHI z 20 mM 13C glukozy lub BHI z 30% D2O, aby uzyskać całkowitą objętość 550 μL. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany.
    4. Aby przygotować próbki plwociny w celu porównania substancji lotnych obecnych w próbce przed i po hodowli, należy przeprowadzić pierwszą ekstrakcję za pomocą 15 μl plwociny. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany. Przejść do sekcji 4 w celu ekstrakcji próbki i ekstrahować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C z mieszaniem 200 obr./min.
    5. Po zakończeniu pierwszej ekstrakcji niehodowlanych próbek plwociny należy zachować fiolki z plwociną. Dodać 500 μl BHI z 20 mM 13C glukozy do fiolek z plwociną z 3.5.1. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany.
  2. Przejść do sekcji 4 w celu ekstrakcji próbki.

4. Pobieranie próbek

  1. Umieść puste fiolki po analizie lotnych substancji organicznych (VOA) (20 ml) na zimnej płytce i umieść zimną płytkę na lodzie w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Włącz urządzenie do ekstrakcji wstrzykiwacza sorbentu 5600 (SPEU) i ustaw żądaną temperaturę zgodnie z wymaganiami dla każdej metody.
    UWAGA: W przypadku eksperymentów z sondowaniem izotopów stabilnych w temperaturze 37 °C osiągnięcie wartości zadanej może zająć do 15 minut. W przypadku eksperymentów z monokulturą i kokulturą w temperaturze 70 °C osiągnięcie wartości zadanej może zająć do 60 minut.
  3. Zebrać czyste WWO, które są równe liczbie przygotowanych próbek, w tym WWO dla pożywek lub kontroli próbek.
  4. W razie potrzeby oznacz fiolki VOA o pojemności 20 ml zgodnie z próbkami, powtórzeniami i identyfikatorami HSP. Użyj markera, który jest odporny na wodę, w przypadku gdy na zewnątrz fiolki tworzy się kondensacja podczas przebywania na lodzie.
  5. Wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego odkręć białą nakrętkę na fiolce, szybko odpipetuj próbkę do fiolki i załóż czarną nakrętkę, wkładkę pokrywki i HSP.
    UWAGA: Próbki nie powinny mieć kontaktu z HSP, a objętość próbki będzie zależeć od typu próbki.
  6. Umieścić fiolkę zawierającą próbkę i HSP z powrotem na zimnej płytce.
  7. Powtórzyć kroki 4.5 i 4.6 dla każdej próbki. Wykonaj te czynności dla każdej próbki, a nie dla wszystkich naraz, aby zapobiec podgrzaniu próbki, a tym samym przedwczesnemu uwalnianiu substancji lotnych.
  8. Po przygotowaniu wszystkich próbek w szklanych fiolkach należy wykonać następujące czynności na zewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego na stole. Włączyć pompę próżniową, umieścić fiolki pod ciśnieniem do 30 mmHg i usunąć źródło podciśnienia.
    UWAGA: Fiolki nie muszą znajdować się na zimnej tacy po zakończeniu aplikacji próżniowej.
  9. Dokładnie sprawdź ciśnienie po umieszczeniu wszystkich próbek pod próżnią za pomocą manometru. Jeśli fiolka jest nieszczelna, należy upewnić się, że nakrętka jest mocno dokręcona i że białe pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym HSP i wkładki wieczka są prawidłowo założone.
    UWAGA: Uszkodzone uszczelnienie może spowodować zmniejszenie wykrywalności substancji lotnych w porównaniu z fiolką pod próżnią.
  10. Umieścić fiolki w SPEU na optymalny czas i temperaturę z mieszaniem przy 200 obr./min. Ekstrahować kultury przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C. Ekstrahować eksperymenty sondowania stabilnymi izotopami z próbkami kału, ścieków, śliny i plwociny przez 18 godzin w temperaturze 37 °C.
  11. Umieścić zimną płytę w temperaturze -80 °C do użycia po zakończeniu okresu ekstrakcji.
  12. Po zakończeniu ekstrakcji umieścić próbki na zimnej płytce na 15 minut, aby wyciągnąć parę wodną z HSP i przestrzeni nad fiolką.
  13. Przenieś WWO do rękawów.
    UWAGA: Eksperyment można tutaj przerwać na okres do ~1 tygodnia w temperaturze pokojowej przed utratą bardziej lotnych związków z HSP.

5. Analiza próbek na chromatografii gazowej - spektrometr masowy (GC-MS)

  1. Użyj następujących ustawień GC-MS (patrz tabela materiałów): 35 °C z 5 minutami zatrzymania, 10 °C/min z krokiem do 170 °C i krokiem 15 °C/min do 230 °C ze stosunkiem podziału 20:1 i całkowitym czasem pracy 38 minut.
  2. Ustawić metodę desorpcji w następujący sposób: 2 min, podgrzewanie w temperaturze 70 °C; desorpcja w 2 minutach w temperaturze 260 °C; wypalanie w temperaturze 34 min w temperaturze 260 °C i po wypieku w temperaturze 2 min w temperaturze 70 °C.
  3. Ustaw sekwencję próbek i rozpocznij przebieg zgodnie z oprzyrządowaniem.
    1. Aby skonfigurować sekwencję w oprogramowaniu Entech, otwórz program. W opcjach po prawej stronie menu rozwijanego instrumentu wybierz 5800 | Sekwencja.
    2. Obserwuj tabelę sekwencji w oprogramowaniu Entech podobną do tej w oprogramowaniu GC-MS. Nazwij kolumnę Identyfikator próbki zgodnie z bieżącym numerem date_vial. Należy pamiętać, że nazwa jest analogiczna do nazwy w tabeli sekwencji GC-MS, a metoda 5800 określa szybkość narastania temperatury, czasy utrzymywania itp. (otwiera menu, w którym można wybrać metodę wygenerowaną w kroku 5.2).
    3. Należy pamiętać, że kolumny Tray (Taca) i Position (Pozycja) określają, dokąd uda się szyna przygotowania próbki (SPR), aby odebrać HSP.
      1. Zwróć uwagę na dwie tace z 30 plamkami każda po lewej stronie, ułożone jako sześć kolumn po pięć punktów każda. Pozycja tacy, która jest najbardziej wysunięta na lewo i najbliżej użytkownika (przód), to pozycja 1, podczas gdy skrajna prawa, najbardziej oddalona to pozycja 30.
      2. Zwróć uwagę, że te tace to HSP A lub B, gdzie HSP B to taca bliżej SPR (najbardziej wewnętrzna taca), a bezpośrednio za HSP B znajduje się HSP Blank. Umieść wyekstrahowane próbki na tacach i odpowiednio wybierz miejsce w sekwencji.
    4. Zapisz tabelę sekwencji, wybierz opcję Uruchom po lewej stronie, a następnie Rozpocznij od pustej wartości w desorberze, jeśli puste HSP znajduje się w desorberze (oznaczone przez HSP oznaczone żółtą etykietą).
  4. Należy pamiętać, że WWO będą obsługiwane przez SPR dla każdej próbki w sekwencji. Pozwól SPR się rozgrzać, a u góry ekranu pojawi się komunikat potwierdzający, czy puste miejsce znajduje się w desorberze. Kliknij Pomiń, aby potwierdzić, że pióro tam jest. Zezwól SPR na automatyczne uruchamianie wszystkich próbek, a sekwencja po stronie GC-MS automatycznie zapisze dane w oddzielnych plikach.

6. Analiza danych

  1. Dane filtrów jakościowych w oprogramowaniu GC-MS (Tabela materiałów).
    1. Przejrzyj każdy pik na chromatogramie i dodaj adnotacje do pików, które pasują do biblioteki National Institute of Standards & Technology (NIST) (lub z inną dostępną biblioteką).
    2. Dodać adnotowane piki chromatogramu do metody przetwarzania. Ustaw kryteria wyboru pików tak, aby obejmowały związki o prawdopodobieństwie większym niż 75%, i upewnij się, że wyrównanie każdego jonu identyfikującego związek leży w środku piku.
      1. Aby dodać szczyt do metody przetwarzania, wybierz opcję Kalibruj | Edycja złożona | Nazwa | wstaw związek w obszarze Zewnętrzny związek wzorcowy. Dodaj nazwę związku, czas retencji, Quant Signal Target Ion. Dodaj trzy największe szczyty. Aby zapisać, wybierz OK | Metoda | Zapisz.
    3. Po skonfigurowaniu metody procesu przejdź do opcji Quantitate | Obliczanie i wyświetlanie | Wynik ilościowy QEdit.
    4. Sprawdź każdy związek, aby upewnić się, że piki są zgodne z oczekiwanymi czasami retencji i znajdują się powyżej szumu tła.
    5. Po zakończeniu QEdit wybierz opcję Exit (Wyjdź | Tak, aby zapisać QEdits i powrócić do głównego chromatogramu. Wyeksportuj integracje obszaru, otwierając plik po lewej stronie. Wybierz opcję Kwantyfikuj | Wygeneruj raport.
    6. Aby wyeksportować pliki do użycia w DExSI, wybierz Plik | Eksport danych do formatu AIA | Utwórz nowy katalog i wybierz lokalizację dla pliku lub Użyj istniejącego katalogu.
    7. Obserwuj, jak otwiera się nowe okno, w którym można wybrać pliki do eksportu. Przenieś pliki na prawą stronę okna i kliknij Proces. Poczekaj od kilku sekund do kilku minut w zależności od liczby konwertowanych plików.
  2. Skoryguj obfitość izotopów w DExSI zgodnie z instrukcjami dla oprogramowania DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) i przeprowadź analizę za pomocą ulubionego oprogramowania lub programu (np. R). Skrypty używane do generowania liczb znajdują się pod adresem https://github.com/joannlp/VOC_SIP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mono- i kokultury S. aureus, P. aeruginosa i A. baumannii
Mono- i kokultury składały się z gatunków bakterii S. aureus, P. aeruginosa i A. baumannii. Są to powszechne oportunistyczne patogeny występujące w ludzkich ranach i przewlekłych infekcjach. Aby zidentyfikować lotne cząsteczki obecne w mono- i kokulturach, przeprowadzono krótką, 1-godzinną ekstrakcję w temperaturze ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zidentyfikować produkcję lotną w kulturach in vitro i próbkach związanych z człowiekiem, przeprowadzono analizę lotnych mono- i kokultur P. aeruginosa, S. aureus i A. baumanii oraz sondowanie stabilnych izotopów różnych próbek biologicznych. W analizie dla monokultur i kokultur substancje lotne wykryto poprzez przeprowadzenie krótkiej ekstrakcji przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C. Lotna analiza mono- i kokultur pozwoliła na zbadanie związków wytwarzanych zarówno przez poszczególne gatunki...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V. L. V i S. J. B. D. byli byłymi pracownikami Entech Instruments Inc., a K. W. jest członkiem Entech's University Program. J. P., J. K. i C. I. R. nie mają żadnych konfliktów interesów, o których mogliby się oświadczyć.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Heather Maughan i Lindzie M. Kalikin za staranną redakcję tego rękopisu. Prace te były wspierane przez NIH NHLBI (grant 5R01HL136647-04).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
13C glukozaSigma-Aldrich389374-1G
2-Stg Pompa membranowaEntech Instruments01-10-20030
Fiolki VOA 20 mlFisher Scientific5719110
24 mm Czarne nakrętki z otworem, bez przegrodyEntech Instruments01-39-76044Butrzymuje wkładkę wieczka na miejscu na fiolce
24-milimetrowa wkładka na fiolkę do wstrzykiwaczy sorbentowychEntech InstrumentsSP-L024Sumożliwia wstrzykiwaczom wykonanie uszczelnienia próżniowego na górze fiolki
5600 Jednostka do ekstrakcji pióra sorbentowego (SPEU)Entech Instruments5600-SPES5600 Jednostka do ekstrakcji pióra sorbentowego -120 VAC
96-dołkowe płytki testoweGenesee25-224
Infuzja mózgu i serca (BHI)Sigma-Aldrich53286-500G
ChemStation StofwareKolumna Agilent
DB-624Agilent122-1364E60 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm, grubość warstwy 1,40 mikrona, w GC-MS
Tlenek deuteruSigma-Aldrich151882-1L
Oprogramowanie DexsiDexsi (open source)
GC-MS (7890A GC i 5975C obojętny XL MSD z detektorem trójosiowym)Agilent7890A GC i 5975C obojętny XL MSD z trzema osiami detektor
Headspace Bundle HS-B01, 120VAEntech InstrumentsSP-HS-B01Elementy do uruchamiania ekstrakcji headspace zawarte w zestawie
Długopis sorbentowy Headspace (HSP) - blankEntech InstrumentsSP-HS-0
Długopis sorbentowy Headspace (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)Entech InstrumentsSP-HS-T3560
Probówki do mikrowirówek (2 mL)VWR53550-792
O-ringiEntech InstrumentsSP-OR-L024
Przygotowanie próbki RailEntech Instruments
Kondycjoner termiczny w piórze sorbentowymEntech Instruments3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) mediaSigmaT1438-500G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
  3. Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
  4. Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179(2015).
  5. Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
  6. Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
  7. Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
  8. Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87(2012).
  9. Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584(2014).
  10. Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826(2018).
  11. Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412(2015).
  12. Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151(2018).
  13. Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
  14. Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365(2018).
  15. Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
  16. Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184(2014).
  17. Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
  18. Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
  19. Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
  20. Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390(2020).
  21. Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
  22. Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
  23. Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12(2015).
  24. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060(2018).
  25. Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Volatile CompoundsVacuum Assisted Sorbent ExtractionStable Isotope ProbingHuman Biological SamplesVolatile Headspace AnalysisBacterial Mono CulturesCo Culture AnalysisGC MS AnalysisMetabolic Biomarker DiscoveryVolatile Metabolite Profiling

Related Articles