Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

Podsumowanie

Ten protokół opisuje ekstrakcję lotnych związków organicznych z próbki biologicznej za pomocą metody ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżniowo, chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas przy użyciu szyny Entech Sample Preparation Rail, oraz analizę danych. Opisano również hodowlę próbek biologicznych i sondowanie izotopów stabilnych.

Streszczenie

Lotne związki organiczne (LZO) z próbek biologicznych mają nieznane pochodzenie. LZO mogą pochodzić od gospodarza lub różnych organizmów z jego społeczności mikrobiologicznej. Aby rozwikłać temat pochodzenia mikrobiologicznych LZO, przeprowadzono analizę lotnej przestrzeni nad powierzchnią mono- i kokultur bakteryjnych Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii, a także sondowanie stabilnych izotopów w próbkach biologicznych kału, śliny, ścieków i plwociny. Mono- i kokultury wykorzystano do identyfikacji produkcji substancji lotnych z poszczególnych gatunków bakterii lub w połączeniu z sondowaniem stabilnych izotopów w celu zidentyfikowania aktywnego metabolizmu drobnoustrojów w próbkach biologicznych.

Ekstrakcja sorbentu wspomagana próżnią (VASE) została zastosowana do ekstrakcji LZO. VASE to łatwa w użyciu, komercjalizowana, bezrozpuszczalnikowa metoda ekstrakcji przestrzeni nad powierzchnią dla związków półlotnych i lotnych. Brak rozpuszczalników i warunki zbliżone do próżni stosowane podczas ekstrakcji sprawiają, że opracowanie metody jest stosunkowo łatwe i szybkie w porównaniu z innymi opcjami ekstrakcji, takimi jak tert-butylacja i mikroekstrakcja do fazy stałej. Opisany tutaj przepływ pracy został wykorzystany do identyfikacji określonych niestabilnych sygnatur z monokultur i kokultur. Co więcej, analiza sondowania stabilnymi izotopami próbek biologicznych związanych z ludźmi pozwoliła zidentyfikować LZO, które były produkowane powszechnie lub unikalnie. W artykule przedstawiono ogólny przebieg pracy i rozważania eksperymentalne dotyczące VASE w połączeniu z sondowaniem stabilnych izotopów żywych kultur drobnoustrojów.

Wprowadzenie

Lotne związki organiczne (LZO) są bardzo obiecujące w wykrywaniu i identyfikacji bakterii, ponieważ są emitowane przez wszystkie organizmy, a różne mikroorganizmy mają unikalne sygnatury LZO. Cząsteczki lotne zostały wykorzystane jako nieinwazyjny pomiar do wykrywania różnych infekcji dróg oddechowych, w tym przewlekłej obturacyjnej choroby płuc¹, gruźlicy² w moczu³, oraz zapalenia płuc związanego z respiratorem⁴, oprócz odróżniania osób z mukowiscydozą (CF) od zdrowych osób z grupą kontrolną5^,6. Sygnatury lotne zos....

Protokół

1. Uwagi dotyczące analizy Headspace Sorbent Pen (HSP) i próbki

UWAGA: HSP zawierający sorbent Tenax TA został wybrany do wychwytywania szerokiego zakresu substancji lotnych. Tenax ma mniejsze powinowactwo do wody w porównaniu z innymi sorbentami, co umożliwia zatrzymywanie większej ilości LZO z próbek o wyższej wilgotności. Tenax ma również niski poziom zanieczyszczeń i może być kondycjonowany do ponownego użycia. Wyboru sorbentu dokonano również z uwzględnieniem kolumny zainstalowanej w GC-MS (patrz tabela materiałów).

1. Przeprowadzić kontrole ujemne poprzez ekstrakcję pożywek lub ślepych prób w takich samych wa....

Wyniki

Mono- i kokultury S. aureus, P. aeruginosa i A. baumannii
Mono- i kokultury składały się z gatunków bakterii S. aureus, P. aeruginosa i A. baumannii. Są to powszechne oportunistyczne patogeny występujące w ludzkich ranach i przewlekłych infekcjach. Aby zidentyfikować lotne cząsteczki obecne w mono- i kokulturach, przeprowadzono krótką, 1-godzinną ekstrakcję w temperaturze .......

Dyskusja

Aby zidentyfikować produkcję lotną w kulturach in vitro i próbkach związanych z człowiekiem, przeprowadzono analizę lotnych mono- i kokultur P. aeruginosa, S. aureus i A. baumanii oraz sondowanie stabilnych izotopów różnych próbek biologicznych. W analizie dla monokultur i kokultur substancje lotne wykryto poprzez przeprowadzenie krótkiej ekstrakcji przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C. Lotna analiza mono- i kokultur pozwoliła na zbadanie związków wytwarzanych zarówno przez poszczególne gatunki.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
13C glukoza	Sigma-Aldrich	389374-1G
2-Stg Pompa membranowa	Entech Instruments	01-10-20030
Fiolki VOA 20 ml	Fisher Scientific	5719110
24 mm Czarne nakrętki z otworem, bez przegrody	Entech Instruments	01-39-76044B	utrzymuje wkładkę wieczka na miejscu na fiolce
24-milimetrowa wkładka na fiolkę do wstrzykiwaczy sorbentowych	Entech Instruments	SP-L024S	umożliwia wstrzykiwaczom wykonanie uszczelnienia próżniowego na górze fiolki
5600 Jednostka do ekstrakcji pióra sorbentowego (SPEU)	Entech Instruments	5600-SPES	5600 Jednostka do ekstrakcji pióra sorbentowego -120 VAC
96-dołkowe płytki testowe	Genesee	25-224
Infuzja mózgu i serca (BHI)	Sigma-Aldrich	53286-500G
ChemStation Stofware	Kolumna Agilent
DB-624	Agilent	122-1364E	60 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm, grubość warstwy 1,40 mikrona, w GC-MS
Tlenek deuteru	Sigma-Aldrich	151882-1L
Oprogramowanie Dexsi	Dexsi (open source)
GC-MS (7890A GC i 5975C obojętny XL MSD z detektorem trójosiowym)	Agilent		7890A GC i 5975C obojętny XL MSD z trzema osiami detektor
Headspace Bundle HS-B01, 120VA	Entech Instruments	SP-HS-B01	Elementy do uruchamiania ekstrakcji headspace zawarte w zestawie
Długopis sorbentowy Headspace (HSP) - blank	Entech Instruments	SP-HS-0
Długopis sorbentowy Headspace (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)	Entech Instruments	SP-HS-T3560
Probówki do mikrowirówek (2 mL)	VWR	53550-792
O-ringi	Entech Instruments	SP-OR-L024
Przygotowanie próbki Rail	Entech Instruments
Kondycjoner termiczny w piórze sorbentowym	Entech Instruments	3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) media	Sigma	T1438-500G