Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae

Podsumowanie

Haemophilus influenzae wywołuje stan zapalny w drogach oddechowych. W tym artykule skupimy się na zastosowaniu cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej do określenia odpowiedzi immunologicznej fagocytów i limfocytów w odpowiedzi na tę bakterię.

Streszczenie

Haemophilus influenzae (Hi) to powszechna bakteria występująca w różnych chorobach układu oddechowego. Do oceny odpowiedzi immunologicznej/zapalnej układu oddechowego na tę bakterię można zastosować wiele różnych testów/technik. Cytometria przepływowa i mikroskopia konfokalna to technologie oparte na fluorescencji, które umożliwiają szczegółową charakterystykę odpowiedzi biologicznych. Można stosować różne formy antygenu Hi, w tym składniki ściany komórkowej, zabite/inaktywowane preparaty i żywe bakterie. Hi to wybredna bakteria, która wymaga wzbogaconej pożywki, ale na ogół jest łatwa w uprawie w standardowych warunkach laboratoryjnych. Próbki tkanek do stymulacji Hi można pobrać z krwi obwodowej, bronchoskopii lub wyciętego płuca (np. u pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym w leczeniu raka płuc). Funkcję makrofagów i neutrofili można kompleksowo ocenić za pomocą cytometrii przepływowej z mierzonymi różnymi parametrami, w tym fagocytozą, reaktywnymi formami tlenu i produkcją cytokin wewnątrzkomórkowych. Funkcja limfocytów (np. funkcja limfocytów T i komórek NK) może być specyficznie oceniana za pomocą cytometrii przepływowej, głównie do wewnątrzkomórkowego wytwarzania cytokin. Infekcja Hi jest silnym induktorem produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych, zarówno przez neutrofile (NET), jak i makrofagi (MET). Mikroskopia konfokalna jest prawdopodobnie najbardziej optymalnym sposobem oceny ekspresji NET i MET, która może być również wykorzystana do oceny aktywności proteazy. Odporność płuc na Haemophilus influenzae można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej.

Wprowadzenie

Haemophilus influenzae (Hi) to normalna bakteria komensalna obecna w gardle większości zdrowych dorosłych. Hi może mieć kapsułkę polisacharydową (typy A-F, np. typ B lub HiB) lub nie mieć kapsułki i być nietypowalny (NTHi)¹. Kolonizacja błony śluzowej tą bakterią rozpoczyna się we wczesnym dzieciństwie i następuje rotacja różnych szczepów kolonizujących². Bakteria ta jest również zdolna do inwazji zarówno górnych, jak i dolnych dróg oddechowych; W tym kontekście może indukować aktywację odpowiedzi immunologicznej i stan zapalny^3,4. Ta reakcja zapalna moż....

Protokół

Ta praca została zatwierdzona przez komisję etyki badań na ludziach Monash Health. Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach.

1. Preparat antygenowy

UWAGA: Trzy różne preparaty antygenowe mogą być użyte do oceny odpowiedzi immunologicznej na Hi. Są to: 1) składnik subkomórkowy (zwykle ze ściany komórkowej bakterii); 2) zabite i inaktywowane bakterie; oraz 3) żywe bakterie. Określić zastosowanie każdego preparatu antygenowego przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów.

1. Składniki subkomórkowe
   1. Pozyskiwanie składników subkomórkowych ze źródeł, w tym preparató....

Wyniki

Reprezentatywne wyniki pokazują, w jaki sposób odpowiedzi immunologiczne o charakterze zapalnym na NTHi mogą być oceniane/ilościowo określane za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej. Kluczowym elementem interpretacji wyników jest porównanie fluorescencji między próbkami kontrolnymi a stymulowanymi. Optymalizacja barwienia próbek zazwyczaj wymaga przeprowadzenia szeregu eksperymentów wstępnych. Liczba kolorów, które można badać jednocześnie, zależy od liczby kanałów dostępnych w cytometrze przepływowym.......

Dyskusja

Wymienione tutaj metody wykorzystują techniki cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji i mikroskopii konfokalnej, które można stosować w połączeniu w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat odpowiedzi zapalnej płuc na Hi.

Ustalenie odpowiedniej postaci antygenowej Hi, która ma być stosowana, ma kluczowe znaczenie i zaleca się uzyskanie specjalnego wkładu od mikrobiologa w tym zakresie. Live Hi indukuje silniejszą reakcję, podczas gdy zabite preparaty Hi i składniki Hi są bardz.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek amonu	Sigma Aldrich	213330
Brefeldin	Sigma Aldrich	B6542
CD28	Thermofisher	16-0289-81
CD49d	Thermofisher	534048
DAPI prolong złoty	Thermofisher	P36931
DHR123	Sigma Aldrich	109244-58-8
Filcon sterylna siatka nylonowa	Becton Dickinson	340606
Podłoże żelatynowe, Enzchek	Sondy molekularne	E12055
Obracacz rurki mieszającej MACS	Miltenyi Biotec	130-090-753
Medimachine	Becton Dickinson		Numer katalogowy niedostępny
Medicons 50 µ m	Becton Dickinson	340592
Pansorbin	Sigma Aldrich	507858
jodek propidium	Sigma Aldrich	P4170
Saponin	Sigma Aldrich	8047152
zjeżdżalnie Superfrost	Thermofisher	11562203