Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62572

⸱

29 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University Department of Medicine, Monash Medical Centre, 3Flow Cytometry Science Technology Platform, Francis Crick Institute, 4Clinical Immunology, Monash Medical Centre, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

Haemophilus influenzae wywołuje stan zapalny w drogach oddechowych. W tym artykule skupimy się na zastosowaniu cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej do określenia odpowiedzi immunologicznej fagocytów i limfocytów w odpowiedzi na tę bakterię.

Streszczenie

Haemophilus influenzae (Hi) to powszechna bakteria występująca w różnych chorobach układu oddechowego. Do oceny odpowiedzi immunologicznej/zapalnej układu oddechowego na tę bakterię można zastosować wiele różnych testów/technik. Cytometria przepływowa i mikroskopia konfokalna to technologie oparte na fluorescencji, które umożliwiają szczegółową charakterystykę odpowiedzi biologicznych. Można stosować różne formy antygenu Hi, w tym składniki ściany komórkowej, zabite/inaktywowane preparaty i żywe bakterie. Hi to wybredna bakteria, która wymaga wzbogaconej pożywki, ale na ogół jest łatwa w uprawie w standardowych warunkach laboratoryjnych. Próbki tkanek do stymulacji Hi można pobrać z krwi obwodowej, bronchoskopii lub wyciętego płuca (np. u pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym w leczeniu raka płuc). Funkcję makrofagów i neutrofili można kompleksowo ocenić za pomocą cytometrii przepływowej z mierzonymi różnymi parametrami, w tym fagocytozą, reaktywnymi formami tlenu i produkcją cytokin wewnątrzkomórkowych. Funkcja limfocytów (np. funkcja limfocytów T i komórek NK) może być specyficznie oceniana za pomocą cytometrii przepływowej, głównie do wewnątrzkomórkowego wytwarzania cytokin. Infekcja Hi jest silnym induktorem produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych, zarówno przez neutrofile (NET), jak i makrofagi (MET). Mikroskopia konfokalna jest prawdopodobnie najbardziej optymalnym sposobem oceny ekspresji NET i MET, która może być również wykorzystana do oceny aktywności proteazy. Odporność płuc na Haemophilus influenzae można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej.

Wprowadzenie

Haemophilus influenzae (Hi) to normalna bakteria komensalna obecna w gardle większości zdrowych dorosłych. Hi może mieć kapsułkę polisacharydową (typy A-F, np. typ B lub HiB) lub nie mieć kapsułki i być nietypowalny (NTHi)1. Kolonizacja błony śluzowej tą bakterią rozpoczyna się we wczesnym dzieciństwie i następuje rotacja różnych szczepów kolonizujących2. Bakteria ta jest również zdolna do inwazji zarówno górnych, jak i dolnych dróg oddechowych; W tym kontekście może indukować aktywację odpowiedzi immunologicznej i stan zapalny3,4. Ta reakcja zapalna może powodować chorobę kliniczną i przyczyniać się do wielu ważnych chorób układu oddechowego, w tym zapalenia zatok, zapalenia ucha środkowego, zapalenia oskrzeli, mukowiscydozy, zapalenia płuc i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP). Większość z tych warunków jest spowodowana przez szczepy NTHi2. W tym artykule zostaną opisane metody oceny odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Hi za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej.

Metody opisane poniżej zostały zaadaptowane z dobrze znanych technik, które zostały zmodyfikowane w celu oceny odpowiedzi zapalnej na Hi. Wybór odpowiedniej formy antygenowej Hi jest kluczowym elementem tej oceny. Preparaty antygenowe obejmują zarówno składniki ściany komórkowej, jak i żywe bakterie. Aby ustalić i ustandaryzować testy, początkowo bardzo pomocne może być użycie próbek krwi obwodowej.

Cytometria przepływowa umożliwia pomiar różnych parametrów i testów funkcjonalnych z jednej próbki na poziomie komórkowym. Technika ta ma tę zaletę, że można ocenić specyficzne odpowiedzi komórkowe (np. produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) lub produkcję cytokin wewnątrzkomórkowych) w porównaniu z innymi, bardziej ogólnymi metodami, takimi jak test immunoenzymatyczny (ELISA) lub ELISspot.

Pułapki zewnątrzkomórkowe są wyrażane przez neutrofile (NETs)5,6,7 oraz przez inne komórki, takie jak makrofagi (METs)8. Są one coraz częściej uznawane za kluczową reakcję zapalną, szczególnie w infekcji płuc9. Można je ocenić za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala na ostateczną identyfikację NET/MET i odróżnia ich ekspresję od innych form śmierci komórki6.

Zarówno cytometria przepływowa, jak i mikroskopia konfokalna są testami opartymi na fluorescencji. Ich sukces zależy od optymalnych protokołów naprężania próbek biologicznych. Nauczenie się tych metod zajmuje trochę czasu i wymaga odpowiedniej wiedzy specjalistycznej. Instrumenty, które się z tym wiążą, są również drogie zarówno w zakupie, jak i eksploatacji. Optymalnym miejscem do ich stosowania są duże uniwersytety i szpitale trzeciego stopnia referencji.

Metody użyte w tym protokole można przenieść do badania innych podobnych organizmów związanych z chorobami układu oddechowego (np. Moxarella catarrhalis i Streptococcus pneumoniae). NTHi wchodzi również w interakcje z innymi powszechnymi bakteriami układu oddechowego10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ta praca została zatwierdzona przez komisję etyki badań na ludziach Monash Health. Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach.

1. Preparat antygenowy

UWAGA: Trzy różne preparaty antygenowe mogą być użyte do oceny odpowiedzi immunologicznej na Hi. Są to: 1) składnik subkomórkowy (zwykle ze ściany komórkowej bakterii); 2) zabite i inaktywowane bakterie; oraz 3) żywe bakterie. Określić zastosowanie każdego preparatu antygenowego przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów.

  1. Składniki subkomórkowe
    1. Pozyskiwanie składników subkomórkowych ze źródeł, w tym preparatów komercyjnych, składników opracowanych przez nas i/lub od innych badaczy.
      UWAGA: Można stosować składniki subkomórkowe zwykle pochodzące ze ściany komórkowej bakteryjnej i obejmują białka błony zewnętrznej, takie jak P6 i lipooligosacharyd (LOS)11,12. Te subkomórkowe składniki są zwykle pozyskiwane w wyspecjalizowanych ośrodkach. Opis tego, jak są wykonane, wykracza poza zakres tego artykułu. W celu uzyskania tych składników zaleca się bezpośredni kontakt z ekspertami w tej dziedzinie.
  2. Bakterie zabite/inaktywowane
    1. Pobrać bakterie z odpowiedniej próbki (np. plwociny lub bronchoskopii). Potwierdzić szczep jako H. influenzae za pomocą odpowiedniego laboratorium mikrobiologicznego. Wykonaj typowanie próbek H. influenzae, aby potwierdzić, że nie nadają się do pisania (przez specjalistyczne laboratorium mikrobiologiczne).
    2. Aby uzyskać reprezentatywny antygen, należy użyć wielu szczepów NTHi (co najmniej 5, każdy w przybliżeniu tej samej ilości) w celu wytworzenia połączonego antygenu. Szczepy należy przechowywać w temperaturze -70 °C w bulionie glicerolowym w probówkach do mikrowirówek.
      UWAGA: W tym eksperymencie użyto dziesięciu różnych szczepów.
    3. Rozmrozić szczepy (po jednej probówce mikrowirówkowej na raz) na czekoladowych płytkach agarowych i hodować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Dodaj bakterie do 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i umyj je dwukrotnie (wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut). Użyj standardowego miernika MacFarland10 lub spektrofotometru13, aby podsycić NTHi do stężenia 10-8 ml (przy użyciu pojemnika o pojemności 5 ml lub równoważnego).
    4. Ciepło dezaktywuje bakterie, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C na 10 minut.
    5. Sonikuj bakterie za pomocą ciągłego ustawienia sonikacji z prędkością od niskiej do średniej przez 30 s.
    6. Podwielokrotność odpowiedniej objętości próbek należy rozmieścić w probówkach do mikrowirówek. Dla próbki o objętości 108 ml należy użyć podwielokrotności 50 μl (tj. 20 próbek na ml), zamrozić je w temperaturze -70 °C, aż będzie to wymagane14.
  3. Żywe bakterie
    1. Najpierw scharakteryzuj żywe bakterie, jak wspomniano w kroku 1.2.1. Użyj jednego dobrze scharakteryzowanego szczepu. Upewnij się, że szczep jest również przechowywany w bulionie glicerolowym w temperaturze -70 °C jako rezerwa.
    2. Hoduj bakterie na wzbogaconych podłożach, takich jak czekoladowe talerze agarowe lub w bulionie.
      1. Aby użyć czekoladowych talerzy agarowych, rozprowadzaj bakterie co najmniej co 3-4 dni za pomocą sterylnych rozsiewaczy.
      2. Alternatywnie użyj bulionu Brain Heart Infusion (BHI) wzbogaconego w czynniki X (hemina) i V (dinukleotyd adeninowy β-nikotynamidu) do hodowli bakterii. Zaszczepić NTHi z nocnych szalek w 5-10 ml bulionu BHI uzupełnionego dinukleotydem heminy i β-nikotynamidoadeniny (oba 10 μg/ml) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
        UWAGA: Ma to tę zaletę, że jest odtwarzalny, ma wyższą liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) i wszystkie bakterie są w podobnej fazie wzrostu logarytmicznego (na płytkach żywotność bakterii może być większa w zależności od pozycji w kulturze)13,15.
    3. Użyj wielokrotności infekcji (MOI) 100 bakterii w jednej komórce, aby wywołać silną odpowiedź immunologiczną przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. Użyj MacFarland Standard10 lub spectrophotometer13, aby ocenić liczbę bakterii.
    4. Upewnij się, że pożywka używana do testów NTHi na żywo jest wolna od jakiejkolwiek ludzkiej surowicy, ponieważ spowoduje to zabicie bakterii16. Próbki surowicy zwierzęcej (np. płodowa surowica cielęca) na ogół nie sprawiają żadnych problemów.
      UWAGA: Metody opisane poniżej należy stosować do analizy standardowych próbek tkanek, takich jak krew obwodowa, próbki bronchoskopowe (w szczególności płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BAL)) oraz wycięta tkanka płucna. Próbki należy inkubować z antygenem Hi przez 10 minut do 24 godzin lub dłużej.

2. Ocena funkcji fagocytarnej za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Ten test wymaga komórek w roztworze i zazwyczaj jest wykonywany w pełnej krwi lub przy użyciu płynu BAL. Test ten jest modyfikowany w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu opartego na użyciu inaktywowanego preparatu Staphylococcus aureus i Pansorbin17. Inaktywowana krew pełna i utrwalona H. influenzae jest podstawiona przez Pansorbin17.

  1. Zmieszać zabity, inaktywowany NTHi (1.2) z jodkiem propidyny (PI) w stężeniu 100 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w stosunku 1:1 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 450 x g przez 5 minut, a następnie przemyć w 500 μl PBS. Wirować w temperaturze 450 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić granulat w 500 μl PBS.
  2. Inkubować 450 μl krwi obwodowej (z nakłucia żyły człowieka) z 50 μl inaktywowanego PI znakowanego H. influenzae przez 20 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 5 ml.
  3. Wyjąć próbki z łaźni wodnej i dodać 5 μl dihydrorodaminy-1,2,3 (DHR). Wiruj przez 10 s, a następnie umieść go z powrotem w łaźni wodnej na kolejne 10 minut.
  4. Wyjąć próbki z łaźni wodnej i poddać erytrocyty lizie (500 μl objętości, jak podano powyżej w kroku 2.2) roztworem 10:1 (tj. 5 ml) 0,8% chlorku amonu (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 i 0,1 mM EDTA).
    UWAGA: Alternatywnie można użyć zautomatyzowanego systemu, takiego jak Q-prep.
  5. Przeanalizować próbki na cytometrze przepływowym w ciągu godziny. Przeanalizuj co najmniej 3 000-5 000 komórek (z każdego podzbioru zainteresowania) z każdej próbki, aby uzyskać reprezentatywne wyniki (Rysunek 1).
    1. Aby przeanalizować próbki pod kątem fagocytozy, określ proporcję komórek, które zostały połknięte znakowane bakterie (zmierz proporcję komórek z barwnikiem fluorescencyjnym).
    2. Określ ilościowo ROS przez utlenianie DHR, w wyniku czego powstaje sygnał fluorescencyjny (zmiana mediany fluorescencji jest porównywana między próbkami wyjściowymi i stymulowanymi).
      UWAGA: Neutrofile są bardziej ziarniste i mają więcej rozproszenia bocznego, podczas gdy makrofagi są większe i mają większe rozproszenie do przodu.
    3. Odróżniaj neutrofile i makrofagi morfologicznie od siebie na podstawie ich wielkości (makrofagi są większe) i ziarnistości (neutrofile są bardziej ziarniste).
      UWAGA: Specyficzne markery dla neutrofili i makrofagów nie są powszechnie stosowane, chociaż CD14 może być używany do znakowania monocytów krwi. Cytometria przepływowa może być potencjalnie wykorzystana do rozróżnienia różnych funkcjonalnych form monocytów i makrofagów (np. podzbiorów M1 i M2)18.
  6. W razie potrzeby zmodyfikuj test (np. użyj żywego, nieznakowanego NTHi do stymulacji fagocytów i zmierz ekspresję ROS przez rozszczepienie DHR).
    1. Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej przez wirowanie w gradiacji gęstości. Warstwę krwi na wyznaczonym polimerze w celu odwirowania w gradiacji gęstości i wirować z prędkością 2300 x g przez 30 minut. Usunąć warstwę jednojądrzastą za pomocą pipety, przemyć ją dwukrotnie PBS i ponownie zawiesić komórki w PBS w stężeniu10-6 komórek na ml.
    2. Alternatywnie użyj makrofagów BAL.
    3. Zawiesić monocyty/makrofagi w stężeniu 10-6 komórek/ml w pożywce hodowlanej (RPMI). Zainfekuj je żywym NTHi przy MOI 100:1 przez 1 godzinę, jak opisano w kroku 1.3.
    4. Dodać DHR do zawiesiny zgodnie z opisem w kroku 2.3 przez 10 minut. Przeprowadzić analizę ROS za pomocą cytometrii przepływowej.

3. Ocena funkcji limfocytów we krwi obwodowej

  1. Do testów cytometrii przepływowej należy używać preparatów krwi pełnej lub komórek jednojądrzastych14.
  2. Pobieraj próbki od każdego obiektu przez nakłucie żyły. Zebrać 4 ml krwi z żyły obwodowej w probówce z heparyną litową i podzielić próbki na podwielokrotności w celu kontroli i stymulacji antygenu.
  3. Dodać przeciwciała kostymulujące (anty-CD28 i CD49d, 1 μL/ml) do obu próbek. Dodać NTHi do próbki antygenu i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę. W przypadku zabitego preparatu NTHi dodać 200 μl antygenu do 2 ml krwi. W przypadku żywych NTHi dodaj żywe komórki NTHi o MOI 100:1 do białych krwinek (mierzonych hemocytometrem).
  4. Dodać do próbek środek blokujący Golgiego Brefeldin A (10 μl/ml) i inkubować je przez kolejne 5 godzin
    UWAGA: Zablokowanie aparatu Golgiego zapobiega eksportowi cytokin na zewnątrz komórki.
  5. Jeśli używana jest krew pełna, należy poddać erytrocyty lizie 0,8% chlorku amonu (krok 2.4), aby w roztworze pozostały tylko leukocyty. Utrwal leukocyty za pomocą 500 μl 1%-2% paraformaldehydu przez 1 godzinę.
  6. Policz komórki za pomocą hemocytometru, przepuszczaj 106 komórek 100 μl 0,1% saponiny przez 15 minut i inkubuj komórki z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Umyj komórki i przeanalizuj je za pomocą cytometru przepływowego.
    UWAGA: Ilość przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie będzie specyficzna dla każdej cytokiny. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj 106 komórek w 100 μl roztworu będzie barwionych przez 1 godzinę. Większość komercyjnie uzyskanych przeciwciał wystarczy do wykonania 25-100 testów.
  7. Określ proporcję komórek reagujących na antygen poprzez bramkowanie odpowiedniej populacji limfocytów (komórki są bramkowane przez CD45, następnie przez CD3, a później przez ekspresję CD4 lub CD8), jak pokazano na Rysunek 2. Wykonaj barwienie tła na niestymulowanych komórkach dla wszystkich cytokin, które mają być analizowane. Przebadaj 100 000 komórek, aby przeanalizować każdą cytokinę zarówno pod kątem stymulowanych komórek, jak i kontroli.

4. Ocena funkcji limfocytów/mediatorów stanu zapalnego w tkance płucnej

  1. Zwykle nie jest możliwe uzyskanie wystarczającej liczby limfocytów z bronchoskopii, dlatego należy użyć tkanki płucnej z próbek po lobektomii. Optymalizacja próbek tkanki płucnej wymaga ścisłej współpracy ze służbą patologii anatomicznej. Upewnij się, że tkanka ma margines co najmniej 3 cm od guza i jest tkanką komórkową bez znaczącej rozedmy płuc (zgodnie z ustaleniami patologa).
  2. Rozbij tkankę płucną na zawiesinę komórkową, zanim będzie można ją wykorzystać do testów cytometrii przepływowej. Tkankę płucną trawić chemicznie (np. za pomocą kolagenazy) lub dezagregować mechanicznie.
    UWAGA: Mechaniczna dezagregacja tkanki może być preferowana, ponieważ wiąże się to z lepszym barwieniem powierzchni komórek (np. znakowanie CD3/4)19.
    1. Uzyskaj próbki lobektomii od patologa (zwykle uzyskiwane od pacjentów poddawanych leczeniu raka płuc). Pokrój około 20-40 g próbki na3-5 mm 3 sekcje. Umieść je w sterylnej komorze o pojemności 50 μl, a następnie poddaj je mechanicznemu rozdrobnieniu za pomocą odpowiedniego deagregatora.
    2. Po dezagregacji tkanek należy poddać lizie czerwone krwinki za pomocą 0,8% NH4Cl, jak wspomniano w kroku 2.4.
    3. Ponownie zawiesić komórki w sterylnym RPMI (objętość będzie zależeć od liczby komórek i zwykle wynosi 10-20 ml), a następnie przefiltruj je przez sterylną siatkę nylonową o wielkości 100 μm. Policz liczbę żywotnych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego.
  3. Test zakażenia NTHi
    1. Zawiesić komórki płuc do końcowego stężenia komórek 4 x 106 komórek/ml na probówkę (próbki kontrolne i stymulowane).
    2. Użyj zawiesiny 4 x 106-6 x 106 komórek w 1 ml RPMI dla probówki kontrolnej (ujemnej). Tę samą ilość należy zastosować do probówki NTHi (każda dodatkowa próbka może być użyta jako kontrola pozytywna z SEB). Zainfekuj komórki w probówce NTHi przy MOI 100 bakterii na komórkę. Poluzuj nasadkę o pół obrotu, aby umożliwić przepływ gazu w rurkach.
    3. Umieścić komórki w rotatorze probówkowym i inkubować je w temperaturze 37 °C, obracając się z prędkością 12 obr./min.
    4. Aby zapobiec zewnątrzkomórkowemu eksportowi cytokin, należy dodać bloker Golgiego (Brefeldin A) do zawiesin komórkowych 1 godzinę po stymulacji do końcowego stężenia 10 μg/ml. Zawiesiny komórek należy zwrócić na kolejne 16-22 godziny inkubacji na zmianę (etap 4.3.3).
    5. Przepłukać zawiesinę komórkową 500 μl PBS zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,01% NaN3. Napraw i przepuszczalność komórek zgodnie z opisem odpowiednio w kroku 3.5 i kroku 3.6.
    6. Dodać przeciwciała do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin (wybór przeciwciał jest określany przez badacza, jak wymieniono w UWAGA w kroku 3.6). Wybarwić zawiesinę komórkową pod kątem określonych markerów powierzchniowych ludzkich limfocytów (np. CD45, CD3 itp.) przez 1 godzinę. Umyj komórki PBS, utrwal je i przepuszczaln zgodnie z opisem w krokach 3.5-3.6.
    7. Inkubować komórki z wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami barwiącymi cytokiny (np. IFN-γ i TNF-α lub IL-13 i IL-17A) przez 1 godz.
      UWAGA: Zaleca się najpierw wybarwienie markerów powierzchniowych, a następnie wewnątrzkomórkowych, ponieważ utrwalenie może powodować zmiany konformacyjne w białkach powierzchniowych, z którymi wiążą się przeciwciała.
    8. Przemyć komórki 500 μl PBS i ponownie zamieszać w 100 μl PBS przed pobraniem danych na cytometrze przepływowym.
  4. Test z matrycą kulek może być stosowany w połączeniu do analizy supernatantu opisanego w kroku 3.2 (należy to wykonać bez Brefeldina A). Pozwala to na analizę szerokiej gamy różnych mediatorów stanu zapalnego (potencjalnie do 40-50 mediatorów). Zebrać supernatant w podwielokrotnościach 100 μl i przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu przygotowania do analizy. Alternatywnie można użyć multipleksowych testów chemiluminescencyjnych20.
    1. Użyj matryc wielopoziomowych do analizy rozmrożonych próbek. Przechowywać w supernatancie należy wykorzystać do analizy produkcji cytokin zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wykonaj akwizycję matrycy koralików multipleksowych na cytometrze przepływowym. Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby przeprowadzić dalszą analizę danych.
      UWAGA: Ten test z matrycą kulek można również przeprowadzić na supernatantze z krwi obwodowej i/lub próbek BAL.

5. Ocena proteolizy płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna jest uzupełnieniem cytometrii przepływowej i może być używana do oceny reakcji zapalnych proteazy i ROS. Pułapki zewnątrzkomórkowe, takie jak NET i MET, składają się z chromatyny zewnątrzkomórkowej (DNA) z innymi mediatorami stanu zapalnego, w szczególności proteazami, takimi jak elastaza neutrofilowa (NE) i metaloproteinazy macierzy (MMP). Można je ocenić w BAL i tkance płucnej za pomocą mikroskopii konfokalnej, co zostało wcześniej opisane przez Sharma, R. et al.21.

  1. Oceń bezpośrednią ekspresję proteazy w tkance płucnej (zgodnie z opisem w kroku 4.2.1) za pomocą mikroskopii konfokalnej i zymografii in situ15,17.
    1. Użyć świeżej lub mrożonej, nieutrwalonej tkanki płucnej. Zamontuj sekcje przycięte do grubości 4 μm na szkiełkach superfrost/adhezyjnych. Wstępnie podgrzej sekcje w 1x buforze reakcyjnym przez 5 minut.
    2. Dodać znakowany fluoresceiną substrat żelatynowy (30 μg/ml na sekcję) bezpośrednio na poszczególne szkiełka, aby zmierzyć proteolizę poprzez działanie metaloproteinaz.
    3. Umieścić szkiełka w pozycji poziomej i inkubować w osłonie przed światłem, nawilżonej komorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    4. Przepłukać sekcje w 1x buforze reakcyjnym przed zamontowaniem.
    5. Jako kontrolę ujemną dodać do skrawków tylko bufor reakcyjny bez żelatyny fluorescencyjnej.
    6. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby oznaczyć lizę substratu przez badanie. Użyj ImageJ, aby określić obszar płuc z dowodami proteolizy. W tym celu należy zmierzyć obszar płuc, w którym występują przebarwienia powyżej tła stłumionej próbki. Jako kolejną kontrolę użyj tkanki płucnej bez dodatku fluorescencyjnej żelatyny15.
      UWAGA: Wykonaj to na co najmniej 10 polach widzenia o dużej mocy (FOV) dla każdej próbki.
  2. Zmierz zewnątrzkomórkową ekspresję ROS w tkance płucnej za pomocą immunoreaktywności 3-nitrotyrozyny (toksycznego produktu stresu oksydacyjnego)13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki pokazują, w jaki sposób odpowiedzi immunologiczne o charakterze zapalnym na NTHi mogą być oceniane/ilościowo określane za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej. Kluczowym elementem interpretacji wyników jest porównanie fluorescencji między próbkami kontrolnymi a stymulowanymi. Optymalizacja barwienia próbek zazwyczaj wymaga przeprowadzenia szeregu eksperymentów wstępnych. Liczba kolorów, które można badać jednocześnie, zależy od liczby kanałów dostępnych w cytometrze przepływowym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wymienione tutaj metody wykorzystują techniki cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji i mikroskopii konfokalnej, które można stosować w połączeniu w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat odpowiedzi zapalnej płuc na Hi.

Ustalenie odpowiedniej postaci antygenowej Hi, która ma być stosowana, ma kluczowe znaczenie i zaleca się uzyskanie specjalnego wkładu od mikrobiologa w tym zakresie. Live Hi indukuje silniejszą reakcję, podczas gdy zabite preparaty Hi i składniki Hi są bardz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować personelowi Immunologii Klinicznej w Monash Health za pomoc w tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek amonuSigma Aldrich213330
BrefeldinSigma AldrichB6542
CD28Thermofisher16-0289-81
CD49dThermofisher534048
DAPI prolong złotyThermofisherP36931
DHR123Sigma Aldrich109244-58-8
Filcon sterylna siatka nylonowaBecton Dickinson340606
Podłoże żelatynowe, EnzchekSondy molekularneE12055
Obracacz rurki mieszającej MACSMiltenyi Biotec130-090-753
MedimachineBecton DickinsonNumer katalogowy niedostępny
Medicons 50 µ mBecton Dickinson340592
PansorbinSigma Aldrich507858
jodek propidiumSigma AldrichP4170
SaponinSigma Aldrich8047152
zjeżdżalnie SuperfrostThermofisher11562203

Bibliografia

  1. Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
  2. Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
  3. King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376(2015).
  4. Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9(2017).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
  8. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
  9. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1(2013).
  10. Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
  11. Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
  12. Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
  13. Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
  14. King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
  15. Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
  16. King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
  17. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371(2015).
  18. Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
  19. King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
  20. Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
  21. Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459(2017).
  22. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36(2015).
  23. Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
  24. Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
  25. Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69(2011).
  26. Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
  27. Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
  28. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
  29. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606(2016).
  30. Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odpowiedź immunologiczna dróg oddechowychcytometria przepływowamikroskopia konfokalnawewnątrzkomórkowa produkcja cytokinpozakomórkowe pułapki neutrofilipozakomórkowe pułapki makrofagówanaliza tkanki płucnejfunkcja fagocytówaktywność proteaz
Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.