Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny

Podsumowanie

Przedstawione tutaj protokoły ilustrują trzy alternatywne sposoby oceny wydajności genetycznie modyfikowanych komarów przeznaczonych do kontroli wektorów w laboratoryjnych próbach z małymi klatkami. Każdy protokół jest dostosowany do konkretnej modyfikacji, jaką niesie ze sobą szczep komarów (napęd genowy lub nie-genowy) oraz rodzajów mierzonych parametrów.

Streszczenie

Kontrola patogenów przenoszonych przez komary za pomocą genetycznie zmodyfikowanych wektorów została zaproponowana jako obiecujące narzędzie uzupełniające konwencjonalne strategie kontroli. Systemy napędu genów naprowadzających oparte na CRISPR sprawiły, że technologie transgeniczne stały się bardziej dostępne w społeczności naukowej. Ocena wydajności komarów transgenicznych i porównania z ich odpowiednikami typu dzikiego w próbach klatkowych w małych laboratoriach dostarczają cennych danych do projektowania kolejnych eksperymentów w klatkach terenowych i ocen eksperymentalnych w celu udoskonalenia strategii zapobiegania chorobom. W tym miejscu przedstawiamy trzy różne protokoły stosowane w warunkach laboratoryjnych do oceny rozprzestrzeniania się transgenu w wektorach malarii komarów anophelina. Należą do nich uwolnienia zalewowe (brak systemu napędu genowego) oraz próby pokoleniowe nakładające się i nienakładające się na siebie. Trzy badania różnią się liczbą parametrów i mogą być dostosowane do pożądanych warunków eksperymentalnych. Co więcej, badania insektowe w małych klatkach są częścią stopniowego przechodzenia zmodyfikowanych owadów z laboratoriów do wypuszczania na otwarte pola. W związku z tym opisane tutaj protokoły stanowią nieocenione narzędzia dostarczające wartości empirycznych, które ostatecznie pomogą we wdrażaniu nowych technologii eliminacji malarii w terenie.

Wprowadzenie

Strategie oparte na genetycznie modyfikowanych komarach są realizowane w celu kontrolowania przenoszenia patogenów przenoszonych przez wektory, takich jak te, które powodują malarię¹. Należą do nich technologie: 1) mające na celu zmniejszenie liczby i zagęszczenia komarów Anopheles (tłumienie populacji) lub 2) mające na celu osłabienie zdolności wektorów do przenoszenia pasożytów odpowiedzialnych za choroby u ludzi (modyfikacja, zastąpienie lub zmiana populacji), w których szczepy wektorów są modyfikowane w celu ekspresji genów efektorowych, które zapobiegają przenoszeniu patogenów. Te podejścia genetyczne zostały wzmocnione przez pojawienie się napędów genowych opartych na CRISPR/Cas9, z dowodami na słuszność koncepcji komarów przenoszących pasożyty na skuteczne rozprzestrzenianie się cech ładunku, a także przeciwpasożytniczych cząsteczek efektorowych w populacjach zamkniętych w klatkach.

Próby w małych klatkach laboratoryjnych stanowią pierwszy krok do oceny charakterystyki szczepów transgenicznych jako część etapowego podejścia do ich dalszego rozwoju w kierunku zastosowań terenowych². Szczególne rozważania dotyczące wyników obejmują dziedziczność wprowadzonego DNA w konkurencyjnym środowisku, penetrację i ekspresję fenotypu oraz stabilność. Istotne cechy projektu doświadczalnego obejmują wielkość klatek, zagęszczenie komarów, liczbę kontrprób, nakładające się lub nienakładające się pokolenia, populacje docelowe o strukturze wiekowej, pojedyncze lub wielokrotne uwolnienia zmodyfikowanych szczepów, uwolnienia wyłącznie u samców, samic lub płci mieszanej, współczynniki uwalniania, źródła mączki z krwi (sztuczne lub żywe zwierzęta) oraz procedury przesiewowe.

Opisujemy tutaj protokoły używane do oceny szczepów komarów anopheline pod kątem uwalniania przez powódź (brak systemu genowego) oraz te, które posiadają autonomiczne systemy napędu genowego, w których pośredniczą endonukleazy Cas9 i przewodnikowe RNA (gRNA). Zastosowania tych protokołów pojawiają się w Pham i wsp. (2019)², Carballar-Lejarazú et al. (2020)³, oraz Adolfi et al. (2020)⁴.

Próby uwalniania zalewowego oceniają tempo rozprzestrzeniania się zaprojektowanego transgenu w ramach dziedziczenia mendlowskiego po wielokrotnym uwolnieniu dużej liczby transgenicznych komarów do dzikiej populacji. Bez przyłączenia transgenu do układu napędowego, dane z prób uwalniania zalewowego dostarczają informacji na temat dopasowania i dynamiki transgenu będącego przedmiotem zainteresowania w ustabilizowanej populacji.

Gdy populacje komarów zawierają autonomiczny system napędu genowego, próby z małymi klatkami są zaprojektowane w celu oceny dynamiki rozprzestrzeniania się pożądanego transgenu poprzez określenie tempa wzrostu dominującego markera po pojedynczym wprowadzeniu transgenicznych samców. Autonomiczne elementy napędu genowego przenoszą geny kodujące nukleazę Cas9, gRNA i marker dominujący połączone w taki sposób, aby były aktywne w kolejnych generacjach.

'Nakładające się' pokolenia odnoszą się do jednoczesnej obecności wielu pokoleń w tej samej klatce w celu stworzenia ciągłej populacji o strukturze wiekowej, podczas gdy 'nienakładające się' odnosi się do pojedynczych, odrębnych pokoleń w każdej kolejnej populacji klatkowej². Eksperymenty z klatkami z napędem genowym mogą zostać zakończone po ustaleniu początkowej dynamiki współczynnika popędu (konwersji) (8-10 pokoleń w zależności od konstrukcji) i chociaż dostarczają informacji na temat krótkoterminowej stabilności transgenu w populacji komarów, mogą nie ujawnić, co się stanie, gdy i czy dominujące częstotliwości markerów osiągną lub są bliskie pełnego wprowadzenia (każdy komar jest nosicielem co najmniej jednej kopii systemu napędu genowego).

Protokół

Oświadczenie etyczne dotyczące zwierząt
Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania Uniwersytetu Kalifornijskiego (numery gwarancji dobrostanu zwierząt A3416.01).

1. Próby uwolnienia komarów bez napędu genowego (Rysunek 1)

1. Konfiguracja i konserwacja koszyka
   1. Ustaw trzy zestawy potrójnych klatek o powierzchni 0,216 m³, dodając 60 larw typu dzikiego (WT) w każdym stadium rozwojowym przez trzy kolejne tygodnie.
      UWAGA: Nie jest możliwe określenie płci larw w drugim stadium rozwojowym za pomocą mikroskopii świetlnej, więc próbki dodawane do każdej klatki będą składać się zarówno z samców, jak i samic.
   2. Co tydzień podawaj dorosłym samicom w każdej klatce znieczulone myszy jako źródło mączki z krwi (Ryc. 2A) i pojemnik do składania jaj 3 dni po posiłku z krwi.
      UWAGA: Chociaż można zastosować alternatywne urządzenie do sztucznego karmienia, dostarczanie żywych, znieczulonych myszy do posiłków z krwi skutkuje lepszą wydajnością karmienia komarów w tych dużych (0,216 m³) formatach klatek. Wymaga to zatwierdzonego protokołu stosowania zwierząt i odpowiedniej zgody (np. Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania, IACUC) na stosowanie myszy.
      UWAGA: Poszczególne myszy są znieczulane mieszaniną 4 mg / mysi HCl ketaminy i 0,4 mg / mysiej ksylazyny. Zwierzętom wstrzykuje się od 0,1 do 0,5 ml tej mieszaniny.
   3. Co tydzień wykluwaj jaja z każdej klatki i wybieraj losowo 60 larw w drugim stadium rozwojowym (L2), które zostaną zwrócone do odpowiednich klatek, aby zrównoważyć śmiertelność (tygodnie 4-8).
      UWAGA: Kroki od 1.1.1 do 1.1.3 są niezbędne do ustanowienia stabilnej i rozproszonej populacji o strukturze wiekowej w klatkach - określane jako "faza wstępna".
   4. W 9. tygodniu przypisz klatki złożone w kroku 1.1.1 losowo w trzech egzemplarzach, aby uwolnić pożądane proporcje uwalniania samców.
      1. Wyznacz jeden zestaw potrójnych klatek jako kontrolę, aby ocenić spójność w całym eksperymencie.
      2. Oznacz jeden zestaw potrójnych prób dla każdego pożądanego współczynnika uwalniania (na przykład 1:1 lub 1:0,1 transgeniczne samce:WT).
         UWAGA: Ten punkt on jest określany jako "Faza eksperymentalna".
2. Repliki i współczynniki uwalniania
   1. Co tydzień dodawać 60 poczwarek WT (30 samców i 30 samic) do klatek kontrolnych.
   2. Aby utrzymać stosunek 1:1, dodaj co tydzień 30 transgenicznych poczwarek płci męskiej wraz z 60 (30 samców i 30 samic) poczwarek WT do każdej odpowiedniej klatki.
   3. Aby zachować stosunek 1:0,1, dodaj co tydzień 300 transgenicznych poczwarek płci męskiej wraz z 60 (30 samcami i 30 samicami) poczwarkami WT do każdej odpowiedniej klatki.
      UWAGA: Ciągłe dodawanie dzikich komarów do klatek utrzymuje zagęszczenie klatek, które ma się zmniejszać z tygodnia na tydzień ze względu na śmiertelność dorosłych związaną z wiekiem.
3. Badania przesiewowe fenotypów
   1. Wybierz losowo łącznie 300 larw z każdej klatki. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w filtry fluorescencyjne należy przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem ekspresji dominującego markera fluorescencyjnego w stadium larwalnym i poczwarkowym oraz ocenić płeć otrzymanych dorosłych osobników (Ryc. 3).
      UWAGA: Fenotypowe badania przesiewowe będą zależały od dominującego markera zawartego w konstrukcie transgenu zintegrowanego z komarami (na przykład Discosoma sp. czerwone białko fluorescencyjne [DsRed], białko cyjanu fluorescencyjnego [CFP], białko zielonej fluorescencji [GFP]) oraz od promotora napędzającego jego ekspresję (najczęściej stosowanym w transgenezie komarów jest promotor 3xP3 napędzający ekspresję w oczach i rdzeniu nerwowym).
   2. Postępuj zgodnie z tym protokołem przez tyle pokoleń, ile wymagają parametry wynikowe zdefiniowane w projekcie eksperymentalnym.
      UWAGA: Badanie jest zwykle przerywane, gdy wszystkie komary mają co najmniej jedną kopię transgenu (określoną przez obecność dominującego markera fluorescencyjnego) lub stosunek komarów transgenicznych do WT w klatce jest ustabilizowany i nie ulega znacznym wahaniom po kilku (3-5) pokoleniach.

2. Nakładające się próby pokoleniowe komarów napędzanych genami (Rysunek 4)

UWAGA: Komary przenoszące systemy napędu genowego wymagają pisemnych i sprawdzonych protokołów i powinny być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) lub równoważny, oraz inne, jeśli jest to wymagane. Ochrona przed komarami (poziom ACL 2⁺) powinna być zgodna z zalecanymi procedurami^5,6,7. W szczególności eksperymenty z napędem genowym powinny wykorzystywać dwie rygorystyczne strategie ograniczania. Pierwszą z nich są zwykle bariery fizyczne (Strategia Bariery) między organizmami a środowiskiem. Wymaga to posiadania bezpiecznego owadożery i standardowych procedur operacyjnych (w tym monitorowania) w celu zapewnienia, że komary nie mogą uciec. Drugą strategią uwięzienia może być molekularna, ekologiczna lub reprodukcyjna⁵.

1. Konfiguracja koszyka
   1. Ustaw dwa zestawy potrójnych klatek o długości 0,216 m³ dla każdego pożądanego współczynnika uwalniania samców transgenicznych: WT.
      1. Aby osiągnąć stosunek uwalniania samców 1:1, dodaj 120 transgenicznych samców, 120 samców WT i 120 samic WT na etapie poczwarki do każdej replikowanej klatki.
      2. Aby osiągnąć stosunek uwalniania 1:10, dodaj 12 transgenicznych samców, 120 samców WT i 120 samic WT w stadium poczwarki do każdej replikowanej klatki.
         UWAGA: Można testować różne proporcje uwalniania (1:1, 1:3, 1:10 itd.), a liczba komarów użytych do zainicjowania eksperymentów zmienia się odpowiednio. Należy jednak wziąć pod uwagę wpływ niskich liczb na statystyczną ocenę danych.
2. Utrzymanie populacji i badania przesiewowe
   1. Zapewnij 4-7-dniowym samicom w każdej klatce posiłek z krwią za pomocą znieczulonych myszy (Ryc. 2A).
   2. Trzy dni po posiłku z krwi umieścić pojemnik na składanie jaj w każdej klatce.
   3. Wykluwaj jaja w tacy na larwy, wybierz losowo ~240 larw pierwszego stadium rozwojowego (L1) z każdej klatki, wychowuj je do dorosłości i włóż z powrotem do odpowiednich klatek.
   4. Zapewnić dodatkowe (2-3) posiłki z krwi co 3-4 dni nowo pojawiającym się dorosłym osobnikom, jak opisano w kroku 2.2.1.
      UWAGA: W żadnym z kolejnych pokoleń nie dodaje się żadnych dodatkowych transgenicznych samców.
   5. Wybierz losowo łącznie 300 larw z każdej klatki i przebadaj je pod kątem obecności dominującego fenotypu markera w stadiach larwalnych i poczwarkowych za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego i oceń pojawiające się dorosłe osobniki pod kątem płci (Rysunek 3).
      UWAGA: Tak jak poprzednio, fenotypowe badania przesiewowe będą zależeć od dominującego markera i promotora zawartego w systemie napędu genowego i zintegrowanego z transgenicznymi komarami (np. DsRed, CFP lub GFP). Jeśli homozygotyczne lub heteroalleliczne zaburzenia docelowych genów skutkują widocznym fenotypem (na przykład geny związane z pigmentacją oczu), badania przesiewowe tej cechy będą zależeć od tego, na jakim etapie najłatwiej jest uwidocznić zmieniony fenotyp.
   6. Postępuj zgodnie z tym protokołem przez tyle pokoleń, ile wymagają parametry wynikowe zdefiniowane w projekcie eksperymentalnym.
      UWAGA: Każde pokolenie (ograniczone mączką z krwi) trwa ~trzy tygodnie. Badanie jest zwykle przerywane, gdy wszystkie komary zostaną uznane za homozygotyczne pod względem konstruktu napędu genowego lub populacje ustabilizują się przy maksymalnym odsetku komarów będących nosicielami co najmniej jednej kopii konstruktu napędu genowego.

3. Nienakładające się na siebie próby pokoleniowe komarów napędzanych genami (Rysunek 5).

1. Konfiguracja koszyka
   1. Ustaw potrójne populacje klatek o długości 0,005 m³ dla każdego określonego współczynnika uwalniania transgeników do samców WT, które mają być badane (na przykład trzy zestawy potrójnych klatek, z których każda ma proporcje uwalniania 1:1, 1:3, 1:10). Ustaw wszystkie klatki z równą łączną liczbą samców i samic.
      UWAGA: Plik uzupełniający to film przedstawiający budowę klatki dla kolonii o powierzchni 0,005^m3.
      1. Dodaj 50 transgenicznych samców, 50 samców WT i 100 samic WT do każdej z trzech replikowanych klatek, aby uzyskać stosunek uwalniania samców 1:1.
      2. Dodaj 25 transgenicznych samców, 75 samców WT i 100 samic WT do każdej z trzech replikowanych klatek, aby uzyskać stosunek uwalniania samców 1:3.
      3. Dodaj 9 transgenicznych samców, 90 samców WT i 100 samic WT do każdej z trzech replikowanych klatek, aby uzyskać stosunek uwalniania samców 1:10.
         UWAGA: Można testować różne współczynniki uwalniania, a liczba komarów użytych do zainicjowania eksperymentów może się odpowiednio różnić. Należy jednak wziąć pod uwagę wpływ małej liczby komarów na analizy statystyczne. Są to wydania pojedyncze; W żadnym kolejnym pokoleniu nie dodaje się żadnych dodatkowych transgenicznych samców.
2. Utrzymanie populacji i badania przesiewowe
   1. Zapewnij 4-7-dniowym samicom w każdej klatce posiłki z krwi za pomocą urządzenia do sztucznego karmienia (Rysunek 2B) przez dwa kolejne dni.
      UWAGA: Rutynowe posiłki z krwi dla samic składają się z dostępnego w handlu źródła krwi (np. krwi cielęcej) dostarczanego z urządzenia do karmienia. Żywe znieczulone myszy są używane wyłącznie do dostarczania posiłków krwiopochodnych w większych (0,216 m³) klatkach w celu uzyskania lepszej wydajności karmienia.
   2. Dodaj pojemnik do składania jaj 3 dni po drugim posiłku z krwi. Po trzech dniach wyjmij pojemniki do składania jaj.
      UWAGA: Na tym etapie można wybrać losowo 5-10 samic z każdej klatki i umieścić je pojedynczo w fiolkach, aby w razie potrzeby ocenić dodatkowe parametry przystosowania, takie jak płodność i płodność.
   3. Oceń według płci wszystkie dorosłe osobniki (martwe i żywe) pozostające w klatce i przechowuj je w temperaturze -80°C do analizy molekularnej.
   4. Wykluwaj się z jaj i losowo wybieraj 200 larw L1 z klatek o proporcjach 1:1 i 1:3, aby zaludnić nowe klatki dla następnego pokolenia.
      UWAGA: Ze względu na niską częstotliwość rozpoczynania transgenicznego osobnika w klatkach o stosunku 1:10, losowe pobieranie próbek może prowadzić do nadmiernej utraty transgenicznego potomstwa w następnym pokoleniu w celu kontynuowania populacji.
   5. Aby zapewnić dokładne pobieranie próbek z klatek w skali 1:10 i wystarczającą liczbę komarów transgenicznych, należy przebadać wszystkie larwy pod kątem markera dominującego i wybrać 200 larw odzwierciedlających obserwowaną częstość transgenu, aby wypełnić nowe klatki.
      UWAGA: Klatki 1:10 mogą być utrzymywane identycznie jak klatki 1:1 i 1:3, gdy osiągną częstotliwość transgenu ≥80%.
   6. Wybierz losowo 500 larw z każdej klatki w celu dogłębnej analizy. Badanie przesiewowe pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem oczekiwanych fenotypów markerowych w stadium larwalnym i poczwarkowym oraz ocena płci dorosłych (Ryc. 3).
      UWAGA: "Wyjątkowe" fenotypy można wybrać do dalszego krzyżowania i analizy molekularnej w celu monitorowania tworzenia odpornych alleli
   .
   7. Protokół ten może być stosowany przez tyle pokoleń, ile wymagają parametry wynikowe zdefiniowane w projekcie eksperymentalnym.
      UWAGA: Każde pokolenie jest ograniczone mączką z krwi i trwa ~ trzy tygodnie. Badanie jest zwykle przerywane, gdy wszystkie komary zostaną uznane za homozygotyczne pod względem konstruktu napędu genowego lub populacje ustabilizują się przy maksymalnym rozpowszechnieniu komarów transgenicznych. I tak jak poprzednio, badania przesiewowe pod kątem fenotypów będą zależały od dominujących markerów i promotora zintegrowanych z transgenicznymi komarami (na przykład DsRed, CFP, GFP) lub z docelowymi genami, jeśli prezentują one widoczny fenotyp (na przykład geny związane z pigmentacją oczu).

Wyniki

Komesarze anofelesy transgeniczne stworzone w celu przenoszenia modyfikacji bez napędu genowego lub z autonomicznym napędem genowym są przygotowywane do prób w klatkach, zgodnie z opisem w sekcji Protokoły. Reprezentatywne wyniki przedstawione tutaj obrazują dynamikę fenotypową najlepiej rokujących powtórzeń z każdego z eksperymentów w klatkach przeprowadzonych przez Pham et al. (2019)² dla komarów Anopheles stephensi. Trzy próby (odpowiednio 1–3: inundacyjna bez napędu genowego, z nakładającym się napędem genowym i z nienakładającym się napędem genowym) różniły się parametrami, takimi jak wielkość klatki (0,216 m³ vs 0,005 m³), to, czy populacja docelowa miała strukturę wiekową, źródło posiłku z krwi (myszy lub sztuczny karmnik) oraz stosunki wypuszczeń. W ramach reprezentacji Rysunek 6 przedstawia dane obserwacyjne wybrane dla tego samego stosunku wypuszczeń (1:1) dla wszystkich trzech zastosowanych protokołów na przestrzeni siedmiu pokoleń.

Zasięg zwolnienia beznapędowego w stosunku 1:1 >Wprowadzenie transgenu na poziomie 80% w ciągu 6–7 pokoleń. W przypadku klatkowych prób transgenicznych z wykorzystaniem napędu genowego (gene drive), wypuszczenia w stosunku 1:1 w obu protokołach (niezakładających się i zakładających się) osiągają ten poziom w ciągu 3–4 pokoleń, co potwierdza oczekiwanie, że pojedyncze wypuszczenie systemu napędu genowego może być bardziej efektywne w wprowadzaniu transgenu niż nieoparte na napędzie wypuszczenia inundacyjne. Szybsza trajektoria może zostać potwierdzona również przez nachylenie linii trendu. Oba protokoły napędu genowego, mimo różnych konfiguracji, wykazują podobne kąty i trendy nachylenia. Pod koniec obserwacji w klatkach bez napędu genowego ok. 80% osobników posiada transgen, natomiast w klatkach z osobnikami z napędem genowym osiągnięto pełne (lub niemal pełne) wprowadzenie. Pełne dane i szczegóły przetwarzania wyników poszczególnych eksperymentów z wykorzystaniem opisanych tutaj protokołów znajdują się na rysunkach 1–3 w pracy Pham. i wsp. (2019)², Rysunki 2-3 pracy Carballar-Lejarazú i wsp. (2020)³ oraz rycina 3 Adolfi i wsp. (2020)⁴.

Rycina 1. Schemat próby inundacyjnego wypuszczenia bez napędu.  Przygotowano dziewięć klatek o objętości 0.216 m³, do każdej z których dodano 60 larw drugiego stadium typu dzikiego (obie płcie). Od 3. tygodnia samice otrzymują co tydzień posiłek krwi, a jaja są zbierane i inkubowane. Do 8. tygodnia co tydzień losowo wybierane jest 60 larw i przenoszonych z powrotem do ich odpowiednich klatek w celu utworzenia populacji o zróżnicowanej strukturze wiekowej w klatkach (faza początkowa). Od 9. tygodnia dziewięć klatek zostaje losowo przydzielonych w trzech powtórzeniach zgodnie z proporcjami wypuszczania samców transgenicznych do samców typu dzikiego (faza eksperymentalna). Do klatek A (Kontrola) nie dodaje się poczwarek transgenicznych. Samice otrzymują co tydzień posiłek krwi, a jaja są zbierane, inkubowane i hodowane do stadium poczwarki. Do klatek dodaje się z powrotem 30 samców i 30 samic poczwarek typu dzikiego. Do klatek 1:1 dodaje się dodatkowo 30 samców poczwarek transgenicznych. Do klatek 1:0.1 dodaje się dodatkowo 300 samców poczwarek transgenicznych. Z każdej z 9 klatek losowo wybieranych jest 300 larw, które są badane pod kątem obecności markeru fluorescencyjnego. Procedurę tę powtarzano co tydzień aż do utrwalenia transgenu (stabilizacja proporcji komarów transgenicznych do typu dzikiego po kilku pokoleniach). Adaptacja z Pham et al. (2019)². Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2. Karmienie krwią populacji w klatkach.  (A) Znieczulone myszy lub (B) karmniki do krwi Hemotek są udostępniane w celu karmienia krwią samic komarów odpowiednio w klatkach o objętości 0.216 m³ lub w małych klatkach o objętości 0.005 m³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3. Przesiewanie fenotypów w próbach klatkowych dla wariantów bez napędu genowego, z nakładającym się napędem genowym oraz z nienakładającym się napędem genowym.  Obrazy fluorescencyjne larwy, poczwarki i imago o fenotypach transgenicznych lub typu dzikiego. W tym przykładzie osobniki An. stephensi były przesiewane pod kątem obecności markera DsRed sterowanego przez promotor 3xP3 w oczach (DsRed+ lub DsRed-), widocznego we wszystkich trzech stadiach, a imago były przesiewane pod kątem płci (♀ lub ♂). Należy zwrócić uwagę na autofluorescencję w larwach typu dzikiego związaną z kłębkiem pokarmowym w jelicie środkowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Schemat badania w klatkach z nakładającymi się napędami genowymi.  Sześć klatek o objętości 0.216 m³ zostało przygotowanych w trzech powtórzeniach, zgodnie z proporcjami wypuszczania samców z napędem genowym do samców typu dzikiego. Do każdej klatki wprowadzono 120 samców typu dzikiego i 120 samic typu dzikiego. Do klatek z proporcją wypuszczania samców z napędem genowym 1:1 dodano dodatkowo 120 samców transgenicznych. Do klatek z proporcją wypuszczania samców 1:10 dodano dodatkowo 12 samców transgenicznych. Do czasu pełnego wprowadzenia transgenu, co 3 tygodnie, dorosłe samice otrzymywały posiłki z krwi, a jaja były zbierane i inkubowane. Łącznie 240 larw wybrano losowo i przeniesiono z powrotem do ich odpowiednich klatek. Trzysta (300) larw wybrano losowo i przebadano pod kątem markeru dominującego. Następnie, w stadium poczwarki i osobnika dorosłego, przebadano je pod kątem koloru oczu i płci. Do oryginalnych klatek nie dodawano żadnych dodatkowych samców transgenicznych. Adaptowano z Pham et al. (2019)². Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Schemat próby z klatkami gene-drive bez nakładania się populacji.  Dziewięć małych klatek o objętości 0,005 m³ zostaje przygotowanych w trzech powtórzeniach zgodnie z proporcjami wypuszczenia samców gene-drive do samców typu dzikiego. Do klatek z proporcją wypuszczenia samców 1:1 dodaje się 100 samic typu dzikiego, 50 samców typu dzikiego oraz 50 samców gene-drive. Do klatek z proporcją wypuszczenia samców 1:3 dodaje się 100 samic typu dzikiego, 75 samców typu dzikiego oraz 25 samców gene-drive. Do klatek z proporcją wypuszczenia samców 1:10 dodaje się 100 samic typu dzikiego, 90 samców typu dzikiego oraz 9 samców gene-drive. Samice otrzymują posiłek z krwi, a jaja są zbierane i inkubowane. W przypadku klatek 1:1 i 1:3, 200 larw jest wybieranych losowo i wykorzystywanych do zasiedlenia nowych klatek, oddzielnych od klatek rodziców, dla następnego pokolenia. Dodatkowe 500 larw jest wybieranych losowo i hodowanych do stadium poczwarki, w którym są one badane pod kątem dominującego genu markera. Następnie 500 poczwarek jest hodowanych do stadium imago i klasyfikowanych według płci. Wszystkie pozostałe larwy są badane pod kątem markera. W przypadku klatek 1:10 wszystkie larwy są klasyfikowane w pokoleniach 1–12, a 200 larw odzwierciedlających istniejącą częstotliwość transgenu jest wykorzystywanych do zasiedlenia nowych klatek. Począwszy od pokolenia 13, klatki te są przygotowywane identycznie jak klatki 1:1 i 1:3. Adaptowano z Pham et al. (2019)² oraz Carballar-Lejarazú et al. (2020)³. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Przewidywana dynamika utrwalania transgenu dla różnych prób zastąpienia populacji w klatkach.  Przedstawienie oczekiwanej dynamiki fenotypu dla najlepiej rokujących powtórzeń w każdym z eksperymentów w klatkach przeprowadzonych przez Pham et al. (2019)², monitorowanych przez 7 pokoleń. Układy eksperymentalne opisano w Protokołach. Przewidywania oparto na danych z wszystkich 9 eksperymentów w modelach uwalniania 1:1 (powtórzenia trzykrotne dla każdego z trzech różnych protokołów prób w klatkach). Oś X oznacza numer pokolenia po wstępnym wprowadzeniu, a oś Y oznacza proporcję larw wykazujących fenotyp markera DsRed (DsRed+) w czasie. Linie przerywane reprezentują liniowe trendy danych. Fenotyp DsRed+ wynika z obecności co najmniej jednej kopii zmodyfikowanego allelu. Zatem wyniki odzwierciedlają rozprzestrzenianie się transgenu, przyspieszone w systemie napędu genowego, osiągające (niemal) pełne wprowadzenie pod koniec obserwacji. W celu zapoznania się ze zmiennością między powtórzeniami oraz pełnymi szczegółowymi danymi z eksperymentów, należy odnieść się do Pham et al. (2019)², Carballar-Lejarazú R et al. (2020)³ oraz Adolfi A et al. (2020)⁴. Obrazy zaadaptowano z Pham TB et al. (2019) Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nat Commun 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 oraz Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci USA 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający: Konstrukcja klatki dla kolonii o objętości 0.005 m³.  Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Genetycznie modyfikowane komary, które mają zdolność blokowania patogenów lub geny bezpłodności niedźwiedzi, stanowią nowe narzędzia do zwalczania chorób przenoszonych przez wektory. Biorąc pod uwagę mnogość parametrów, które składają się na te alternatywne podejścia, krytycznym krokiem w ich badaniach są ograniczone laboratoryjnie oceny eksperymentalne, które pozwalają na szybkie i bezpieczne przewidywanie potencjalnych wyników uwalniania syntetycznego transgenu do celów kontrolnych¹.

Ponieważ monitorowanie dynamiki transgenów w populacjach trzymanych w klatkach może trwać kilka miesięcy, jednym z głównych aspektów protokołów jest spójność w projektowaniu eksperymentalnym między powtórzeniami (w tym hodowla komarów, wielkość klatki, populacje o strukturze wiekowej, stałe współczynniki uwalniania, stabilne źródła mączki z krwi i minimalnie inwazyjne procedury przesiewowe).

Wypuszczanie tylko samców jest uważane za idealne, ponieważ samce komarów nie przenoszą patogenów ani nie żywią się ludźmi, dlatego mogą bezpiecznie wprowadzać dziedziczne cechy do dzikich populacji. W eksperymentach laboratoryjnych z klatkami możliwe jest wykrycie szczepów transgenicznych o zmniejszonej konkurencyjności krycia samców i innych obciążeniach związanych z integracją transgenów. Jednak bezpośrednie i specyficzne eksperymenty, takie jak te przeprowadzone w dużych klatkach¹⁰, można przeprowadzić, aby właściwie przeanalizować konkurencyjność samców, a także płodność samic w bardziej naturalnym zagęszczeniu komarów². Co więcej, dane empiryczne z prób klatkowych mogą być wykorzystane do parametryzacji modeli dynamiki populacji klatkowej, w tym tworzenia opornych alleli, oraz dostarczają użytecznych informacji na temat skuteczności i możliwych dostosowań proponowanej technologii.

Opisane tutaj protokoły można łatwo dostosować do innych projektów eksperymentalnych w zależności od potrzeb, przy minimalnych wymaganiach dotyczących regularnej infrastruktury i warunków insektowych. Ponadto, z wyjątkiem komercyjnych klatek i mikroskopów, większość materiałów jest niedroga i pozwala na tanie wielokrotne powtórzenia i iteracje prób. Warto zauważyć, że pozwala to również na wstępne badanie przesiewowe wielu szczepów transgenicznych w próbach z małymi klatkami w celu nadania priorytetu najlepszym kandydatom, którzy zostaną przeniesieni do przodu w etapowej ścieżce testowania, oraz zawieszenia testów na tych, którzy wykazują nieoptymalne wyniki.

Wreszcie, obawy związane ze stosowaniem organizmów modyfikowanych genetycznie motywują do opracowania ram rozwoju, oceny i stosowania strategii genetycznych w celu zapobiegania chorobom przenoszonym przez komary ^5,8,9. Znaczenie i wykonanie zdefiniowanych tutaj protokołów jest zgodne z niniejszymi wytycznymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sztuczne karmniki	Hemotek	SP6W1-3	Pakiet startowy – 6 karmników ze zbiornikami 3ml
Klatka, komercyjna	BioQuip	1450D	, 24 x 24 x 24" - 0,216 m3 (60 cm3)
Wanna klatkowa (popcorn Amazon.com		VP170-0006	0,005 m3 (170 uncji)
Mikroskop preparacyjny ze światłem fluorescencyjnym i filtrami	Leica	M165FC
Klej w sztyfcie	Michaels	88646598807	Klej w sztyfcie 40 szt.,   0.4X4"
Pistolet do klejenia na gorąco	Woodwards Ace	2382513	Stanley, 40 W, GR20
Nylonowy ekran (siatka)	Joann.com	1102912	Tiul 108" szerokości x 50 jardów - ~35,6 cm2 (14 in2)
Miseczki do składania jaj	Fisher	259126	Zlewka PP grad 50 mL
Narzędzie do cięcia brzytwy	Office Depot	487899	Nożyki do pudełek
Nożyczki	Office Depot	978561	Scotch Precision Ultra Edge Tytanowe nożyczki nieprzywierające, 8-calowy
zszywacz	Office Depot	908194	Swingline Commercial Desk Stapler
Rękaw chirurgiczny (pończocha)	VWR	56612-664	~48 cm (19") wycięty ze ~15 cm (6") X ~23 m (25y)
Opaski zaciskowe	Home Depot	295715	Pk 100, 14-calowe opaski kablowe - 35,6 cm (14 cali)

składana klatka