Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny

Podsumowanie

Przedstawione tutaj protokoły ilustrują trzy alternatywne sposoby oceny wydajności genetycznie modyfikowanych komarów przeznaczonych do kontroli wektorów w laboratoryjnych próbach z małymi klatkami. Każdy protokół jest dostosowany do konkretnej modyfikacji, jaką niesie ze sobą szczep komarów (napęd genowy lub nie-genowy) oraz rodzajów mierzonych parametrów.

Streszczenie

Kontrola patogenów przenoszonych przez komary za pomocą genetycznie zmodyfikowanych wektorów została zaproponowana jako obiecujące narzędzie uzupełniające konwencjonalne strategie kontroli. Systemy napędu genów naprowadzających oparte na CRISPR sprawiły, że technologie transgeniczne stały się bardziej dostępne w społeczności naukowej. Ocena wydajności komarów transgenicznych i porównania z ich odpowiednikami typu dzikiego w próbach klatkowych w małych laboratoriach dostarczają cennych danych do projektowania kolejnych eksperymentów w klatkach terenowych i ocen eksperymentalnych w celu udoskonalenia strategii zapobiegania chorobom. W tym miejscu przedstawiamy trzy różne protokoły stosowane w warunkach laboratoryjnych do oceny rozprzestrzeniania się transgenu w wektorach malarii komarów anophelina. Należą do nich uwolnienia zalewowe (brak systemu napędu genowego) oraz próby pokoleniowe nakładające się i nienakładające się na siebie. Trzy badania różnią się liczbą parametrów i mogą być dostosowane do pożądanych warunków eksperymentalnych. Co więcej, badania insektowe w małych klatkach są częścią stopniowego przechodzenia zmodyfikowanych owadów z laboratoriów do wypuszczania na otwarte pola. W związku z tym opisane tutaj protokoły stanowią nieocenione narzędzia dostarczające wartości empirycznych, które ostatecznie pomogą we wdrażaniu nowych technologii eliminacji malarii w terenie.

Wprowadzenie

Strategie oparte na genetycznie modyfikowanych komarach są realizowane w celu kontrolowania przenoszenia patogenów przenoszonych przez wektory, takich jak te, które powodują malarię¹. Należą do nich technologie: 1) mające na celu zmniejszenie liczby i zagęszczenia komarów Anopheles (tłumienie populacji) lub 2) mające na celu osłabienie zdolności wektorów do przenoszenia pasożytów odpowiedzialnych za choroby u ludzi (modyfikacja, zastąpienie lub zmiana populacji), w których szczepy wektorów są modyfikowane w celu ekspresji genów efektorowych, które zapobiegają przenoszeniu patogenów. Te podejścia genetyczne zostały wzmocnione przez pojawienie się napędów genowych opartych na CRISPR/Cas9, z dowodami na słuszność koncepcji komarów przenoszących pasożyty na skuteczne rozprzestrzenianie się cech ładunku, a także przeciwpasożytniczych cząsteczek efektorowych w populacjach zamkniętych w klatkach.

Próby w małych klatkach laboratoryjnych stanowią pierwszy krok do oceny charakterystyki szczepów transgenicznych jako część etapowego podejścia do ich dalszego rozwoju w kierunku zastosowań terenowych². Szczególne rozważania dotyczące wyników obejmują dziedziczność wprowadzonego DNA w konkurencyjnym środowisku, penetrację i ekspresję fenotypu oraz stabilność. Istotne cechy projektu doświadczalnego obejmują wielkość klatek, zagęszczenie komarów, liczbę kontrprób, nakładające się lub nienakładające się pokolenia, populacje docelowe o strukturze wiekowej, pojedyncze lub wielokrotne uwolnienia zmodyfikowanych szczepów, uwolnienia wyłącznie u samców, samic lub płci mieszanej, współczynniki uwalniania, źródła mączki z krwi (sztuczne lub żywe zwierzęta) oraz procedury przesiewowe.

Opisujemy tutaj protokoły używane do oceny szczepów komarów anopheline pod kątem uwalniania przez powódź (brak systemu genowego) oraz te, które posiadają autonomiczne systemy napędu genowego, w których pośredniczą endonukleazy Cas9 i przewodnikowe RNA (gRNA). Zastosowania tych protokołów pojawiają się w Pham i wsp. (2019)², Carballar-Lejarazú et al. (2020)³, oraz Adolfi et al. (2020)⁴.

Próby uwalniania zalewowego oceniają tempo rozprzestrzeniania się zaprojektowanego transgenu w ramach dziedziczenia mendlowskiego po wielokrotnym uwolnieniu dużej liczby transgenicznych komarów do dzikiej populacji. Bez przyłączenia transgenu do układu napędowego, dane z prób uwalniania zalewowego dostarczają informacji na temat dopasowania i dynamiki transgenu będącego przedmiotem zainteresowania w ustabilizowanej populacji.

Gdy populacje komarów zawierają autonomiczny system napędu genowego, próby z małymi klatkami są zaprojektowane w celu oceny dynamiki rozprzestrzeniania się pożądanego transgenu poprzez określenie tempa wzrostu dominującego markera po pojedynczym wprowadzeniu transgenicznych samców. Autonomiczne elementy napędu genowego przenoszą geny kodujące nukleazę Cas9, gRNA i marker dominujący połączone w taki sposób, aby były aktywne w kolejnych generacjach.

'Nakładające się' pokolenia odnoszą się do jednoczesnej obecności wielu pokoleń w tej samej klatce w celu stworzenia ciągłej populacji o strukturze wiekowej, podczas gdy 'nienakładające się' odnosi się do pojedynczych, odrębnych pokoleń w każdej kolejnej populacji klatkowej². Eksperymenty z klatkami z napędem genowym mogą zostać zakończone po ustaleniu początkowej dynamiki współczynnika popędu (konwersji) (8-10 pokoleń w zależności od konstrukcji) i chociaż dostarczają informacji na temat krótkoterminowej stabilności transgenu w populacji komarów, mogą nie ujawnić, co się stanie, gdy i czy dominujące częstotliwości markerów osiągną lub są bliskie pełnego wprowadzenia (każdy komar jest nosicielem co najmniej jednej kopii systemu napędu genowego).

Protokół

Oświadczenie etyczne dotyczące zwierząt
Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania Uniwersytetu Kalifornijskiego (numery gwarancji dobrostanu zwierząt A3416.01).

1. Próby uwolnienia komarów bez napędu genowego (Rysunek 1)

1. Konfiguracja i konserwacja koszyka
   1. Ustaw trzy zestawy potrójnych klatek o powierzchni 0,216 m³, dodając 60 larw typu dzikiego (WT) w każdym stadium rozwojowym przez trzy kolejne tygodnie.
      UWAGA: Nie jest możliwe określenie płci larw w drugim stadium rozwojowym za pomocą mikroskopii świetlnej, więc próbki dodawane do każdej klatki będą składać się zarówno z samców, jak i samic.
   2. Co tydzień podawaj dorosłym samicom w każdej klatce znieczulone myszy jako źródło mączki z krwi (Ryc. 2A) i pojemnik do składania jaj 3 dni po posiłku z krwi.
      UWAGA: Chociaż można zastosować alternatywne urządzenie do sztucznego karmienia, dostarczanie żywych, znieczulonych myszy do posiłków z krwi skutkuje lepszą wydajnością karmienia komarów w tych dużych (0,216 m³) formatach klatek. Wymaga to zatwierdzonego protokołu stosowania zwierząt i odpowiedniej zgody (np. Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania, IACUC) na stosowanie myszy.
      UWAGA: Poszczególne myszy są znieczulane mieszaniną 4 mg / mysi HCl ketaminy i 0,4 mg / mysiej ksylazyny. Zwierzętom wstrzykuje się od 0,1 do 0,5 ml tej mieszaniny.
   3. Co tydzień wykluwaj jaja z każdej klatki i wybieraj losowo 60 larw w drugim stadium rozwojowym (L2), które zostaną zwrócone do odpowiednich klatek, aby zrównoważyć śmiertelność (tygodnie 4-8).
      UWAGA: Kroki od 1.1.1 do 1.1.3 są niezbędne do ustanowienia stabilnej i rozproszonej populacji o strukturze wiekowej w klatkach - określane jako "faza wstępna".
   4. W 9. tygodniu przypisz klatki złożone w kroku 1.1.1 losowo w trzech egzemplarzach, aby uwolnić pożądane proporcje uwalniania samców.
      1. Wyznacz jeden zestaw potrójnych klatek jako kontrolę, aby ocenić spójność w całym eksperymencie.
      2. Oznacz jeden zestaw potrójnych prób dla każdego pożądanego współczynnika uwalniania (na przykład 1:1 lub 1:0,1 transgeniczne samce:WT).
         UWAGA: Ten punkt on jest określany jako "Faza eksperymentalna".
2. Repliki i współczynniki uwalniania
   1. Co tydzień dodawać 60 poczwarek WT (30 samców i 30 samic) do klatek kontrolnych.
   2. Aby utrzymać stosunek 1:1, dodaj co tydzień 30 transgenicznych poczwarek płci męskiej wraz z 60 (30 samców i 30 samic) poczwarek WT do każdej odpowiedniej klatki.
   3. Aby zachować stosunek 1:0,1, dodaj co tydzień 300 transgenicznych poczwarek płci męskiej wraz z 60 (30 samcami i 30 samicami) poczwarkami WT do każdej odpowiedniej klatki.
      UWAGA: Ciągłe dodawanie dzikich komarów do klatek utrzymuje zagęszczenie klatek, które ma się zmniejszać z tygodnia na tydzień ze względu na śmiertelność dorosłych związaną z wiekiem.
3. Badania przesiewowe fenotypów
   1. Wybierz losowo łącznie 300 larw z każdej klatki. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w filtry fluorescencyjne należy przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem ekspresji dominującego markera fluorescencyjnego w stadium larwalnym i poczwarkowym oraz ocenić płeć otrzymanych dorosłych osobników (Ryc. 3).
      UWAGA: Fenotypowe badania przesiewowe będą zależały od dominującego markera zawartego w konstrukcie transgenu zintegrowanego z komarami (na przykład Discosoma sp. czerwone białko fluorescencyjne [DsRed], białko cyjanu fluorescencyjnego [CFP], białko zielonej fluorescencji [GFP]) oraz od promotora napędzającego jego ekspresję (najczęściej stosowanym w transgenezie komarów jest promotor 3xP3 napędzający ekspresję w oczach i rdzeniu nerwowym).
   2. Postępuj zgodnie z tym protokołem przez tyle pokoleń, ile wymagają parametry wynikowe zdefiniowane w projekcie eksperymentalnym.
      UWAGA: Badanie jest zwykle przerywane, gdy wszystkie komary mają co najmniej jedną kopię transgenu (określoną przez obecność dominującego markera fluorescencyjnego) lub stosunek komarów transgenicznych do WT w klatce jest ustabilizowany i nie ulega znacznym wahaniom po kilku (3-5) pokoleniach.

2. Nakładające się próby pokoleniowe komarów napędzanych genami (Rysunek 4)

UWAGA: Komary przenoszące systemy napędu genowego wymagają pisemnych i sprawdzonych protokołów i powinny być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) lub równoważny, oraz inne, jeśli jest to wymagane. Ochrona przed komarami (poziom ACL 2⁺) powinna być zgodna z zalecanymi procedurami^5,6,7. W szczególności eksperymenty z napędem genowym powinny wykorzystywać dwie rygorystyczne strategie ograniczania. Pierwszą z nich są zwykle bariery fizyczne (Strategia Bariery) między organizmami a środowiskiem. Wymaga to posiadania bezpiecznego owadożery i standardowych procedur operacyjnych (w tym monitorowania) w celu zapewnienia, że komary nie mogą uciec. Drugą strategią uwięzienia może być molekularna, ekologiczna lub reprodukcyjna⁵.

1. Konfiguracja koszyka
   1. Ustaw dwa zestawy potrójnych klatek o długości 0,216 m³ dla każdego pożądanego współczynnika uwalniania samców transgenicznych: WT.
      1. Aby osiągnąć stosunek uwalniania samców 1:1, dodaj 120 transgenicznych samców, 120 samców WT i 120 samic WT na etapie poczwarki do każdej replikowanej klatki.
      2. Aby osiągnąć stosunek uwalniania 1:10, dodaj 12 transgenicznych samców, 120 samców WT i 120 samic WT w stadium poczwarki do każdej replikowanej klatki.
         UWAGA: Można testować różne proporcje uwalniania (1:1, 1:3, 1:10 itd.), a liczba komarów użytych do zainicjowania eksperymentów zmienia się odpowiednio. Należy jednak wziąć pod uwagę wpływ niskich liczb na statystyczną ocenę danych.
2. Utrzymanie populacji i badania przesiewowe
   1. Zapewnij 4-7-dniowym samicom w każdej klatce posiłek z krwią za pomocą znieczulonych myszy (Ryc. 2A).
   2. Trzy dni po posiłku z krwi umieścić pojemnik na składanie jaj w każdej klatce.
   3. Wykluwaj jaja w tacy na larwy, wybierz losowo ~240 larw pierwszego stadium rozwojowego (L1) z każdej klatki, wychowuj je do dorosłości i włóż z powrotem do odpowiednich klatek.
   4. Zapewnić dodatkowe (2-3) posiłki z krwi co 3-4 dni nowo pojawiającym się dorosłym osobnikom, jak opisano w kroku 2.2.1.
      UWAGA: W żadnym z kolejnych pokoleń nie dodaje się żadnych dodatkowych transgenicznych samców.
   5. Wybierz losowo łącznie 300 larw z każdej klatki i przebadaj je pod kątem obecności dominującego fenotypu markera w stadiach larwalnych i poczwarkowych za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego i oceń pojawiające się dorosłe osobniki pod kątem płci (Rysunek 3).
      UWAGA: Tak jak poprzednio, fenotypowe badania przesiewowe będą zależeć od dominującego markera i promotora zawartego w systemie napędu genowego i zintegrowanego z transgenicznymi komarami (np. DsRed, CFP lub GFP). Jeśli homozygotyczne lub heteroalleliczne zaburzenia docelowych genów skutkują widocznym fenotypem (na przykład geny związane z pigmentacją oczu), badania przesiewowe tej cechy będą zależeć od tego, na jakim etapie najłatwiej jest uwidocznić zmieniony fenotyp.
   6. Postępuj zgodnie z tym protokołem przez tyle pokoleń, ile wymagają parametry wynikowe zdefiniowane w projekcie eksperymentalnym.
      UWAGA: Każde pokolenie (ograniczone mączką z krwi) trwa ~trzy tygodnie. Badanie jest zwykle przerywane, gdy wszystkie komary zostaną uznane za homozygotyczne pod względem konstruktu napędu genowego lub populacje ustabilizują się przy maksymalnym odsetku komarów będących nosicielami co najmniej jednej kopii konstruktu napędu genowego.

3. Nienakładające się na siebie próby pokoleniowe komarów napędzanych genami (Rysunek 5).

1. Konfiguracja koszyka
   1. Ustaw potrójne populacje klatek o długości 0,005 m³ dla każdego określonego współczynnika uwalniania transgeników do samców WT, które mają być badane (na przykład trzy zestawy potrójnych klatek, z których każda ma proporcje uwalniania 1:1, 1:3, 1:10). Ustaw wszystkie klatki z równą łączną liczbą samców i samic.
      UWAGA: Plik uzupełniający to film przedstawiający budowę klatki dla kolonii o powierzchni 0,005^m3.
      1. Dodaj 50 transgenicznych samców, 50 samców WT i 100 samic WT do każdej z trzech replikowanych klatek, aby uzyskać stosunek uwalniania samców 1:1.
      2. Dodaj 25 transgenicznych samców, 75 samców WT i 100 samic WT do każdej z trzech replikowanych klatek, aby uzyskać stosunek uwalniania samców 1:3.
      3. Dodaj 9 transgenicznych samców, 90 samców WT i 100 samic WT do każdej z trzech replikowanych klatek, aby uzyskać stosunek uwalniania samców 1:10.
         UWAGA: Można testować różne współczynniki uwalniania, a liczba komarów użytych do zainicjowania eksperymentów może się odpowiednio różnić. Należy jednak wziąć pod uwagę wpływ małej liczby komarów na analizy statystyczne. Są to wydania pojedyncze; W żadnym kolejnym pokoleniu nie dodaje się żadnych dodatkowych transgenicznych samców.
2. Utrzymanie populacji i badania przesiewowe
   1. Zapewnij 4-7-dniowym samicom w każdej klatce posiłki z krwi za pomocą urządzenia do sztucznego karmienia (Rysunek 2B) przez dwa kolejne dni.
      UWAGA: Rutynowe posiłki z krwi dla samic składają się z dostępnego w handlu źródła krwi (np. krwi cielęcej) dostarczanego z urządzenia do karmienia. Żywe znieczulone myszy są używane wyłącznie do dostarczania posiłków krwiopochodnych w większych (0,216 m³) klatkach w celu uzyskania lepszej wydajności karmienia.
   2. Dodaj pojemnik do składania jaj 3 dni po drugim posiłku z krwi. Po trzech dniach wyjmij pojemniki do składania jaj.
      UWAGA: Na tym etapie można wybrać losowo 5-10 samic z każdej klatki i umieścić je pojedynczo w fiolkach, aby w razie potrzeby ocenić dodatkowe parametry przystosowania, takie jak płodność i płodność.
   3. Oceń według płci wszystkie dorosłe osobniki (martwe i żywe) pozostające w klatce i przechowuj je w temperaturze -80°C do analizy molekularnej.
   4. Wykluwaj się z jaj i losowo wybieraj 200 larw L1 z klatek o proporcjach 1:1 i 1:3, aby zaludnić nowe klatki dla następnego pokolenia.
      UWAGA: Ze względu na niską częstotliwość rozpoczynania transgenicznego osobnika w klatkach o stosunku 1:10, losowe pobieranie próbek może prowadzić do nadmiernej utraty transgenicznego potomstwa w następnym pokoleniu w celu kontynuowania populacji.
   5. Aby zapewnić dokładne pobieranie próbek z klatek w skali 1:10 i wystarczającą liczbę komarów transgenicznych, należy przebadać wszystkie larwy pod kątem markera dominującego i wybrać 200 larw odzwierciedlających obserwowaną częstość transgenu, aby wypełnić nowe klatki.
      UWAGA: Klatki 1:10 mogą być utrzymywane identycznie jak klatki 1:1 i 1:3, gdy osiągną częstotliwość transgenu ≥80%.
   6. Wybierz losowo 500 larw z każdej klatki w celu dogłębnej analizy. Badanie przesiewowe pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem oczekiwanych fenotypów markerowych w stadium larwalnym i poczwarkowym oraz ocena płci dorosłych (Ryc. 3).
      UWAGA: "Wyjątkowe" fenotypy można wybrać do dalszego krzyżowania i analizy molekularnej w celu monitorowania tworzenia odpornych alleli
   .
   7. Protokół ten może być stosowany przez tyle pokoleń, ile wymagają parametry wynikowe zdefiniowane w projekcie eksperymentalnym.
      UWAGA: Każde pokolenie jest ograniczone mączką z krwi i trwa ~ trzy tygodnie. Badanie jest zwykle przerywane, gdy wszystkie komary zostaną uznane za homozygotyczne pod względem konstruktu napędu genowego lub populacje ustabilizują się przy maksymalnym rozpowszechnieniu komarów transgenicznych. I tak jak poprzednio, badania przesiewowe pod kątem fenotypów będą zależały od dominujących markerów i promotora zintegrowanych z transgenicznymi komarami (na przykład DsRed, CFP, GFP) lub z docelowymi genami, jeśli prezentują one widoczny fenotyp (na przykład geny związane z pigmentacją oczu).

Wyniki

Transgeniczne komary anofelinowe, generowane w celu przenoszenia modyfikacji niezwiązanych z napędem genowym lub autonomicznych, są przystosowane do prób w klatkach, jak opisano w sekcji Protokoły. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki obrazują dynamikę fenotypu najlepiej działających powtórzeń każdego z eksperymentów klatkowych przeprowadzonych przez Pham i wsp. (2019)² dla komarów Anopheles stephensi. Trzy badania (1 - 3, odpowiednio: zalewowy napęd niegenowy, nakładający się napęd genowy i nienakładający się napęd genowy) różniły się różnymi parametrami, takimi jak wielkość klatki (0,216 m³ vs 0,005 m³), czy populacja docelowa była ustrukturyzowana pod względem wieku, źródło mączki z krwi (myszy lub sztuczny karmnik) i wskaźniki uwalniania. Jako sposób reprezentacji, Rysunek 6 wyświetla obserwowane dane wybrane z tego samego współczynnika uwalniania (1:1) dla wszystkich trzech używanych protokołów, w ciągu siedmiu pokoleń.

Wydanie 1:1 bez napędu osiąga >80% wprowadzenia transgenu w ciągu 6-7 pokoleń. W przypadku badań z transgenicznymi klatkami z napędem genowym, uwolnienia 1:1 zarówno w protokole nienakładającym się, jak i nakładającym się osiągają ten poziom w ciągu 3-4 pokoleń, potwierdzając w ten sposób oczekiwanie, że pojedyncze uwolnienie systemu napędu genowego może być bardziej wydajne niż uwolnienie zalewowe bez napędu w celu wprowadzenia transgenu. Szybsza trajektoria może być również potwierdzona przez nachylenie linii trendu. Oba protokoły napędu genowego, pomimo różnych konfiguracji, prezentują podobne kąty i trendy nachylenia. Pod koniec obserwacji, klatki bez napędu osiągają ~80% osobników będących nosicielami transgenu, podczas gdy klatki z osobnikami z napędem genowym osiągają pełne (lub prawie całkowite) wprowadzenie. Pełne dane i szczegóły przetwarzania poszczególnych wyników eksperymentów przy użyciu opisanych tutaj protokołów można znaleźć na rysunkach 1-3 Pham >i wsp. (2019)², Rysunki 2-3 Carballar-Lejarazú et al. (2020)³ i Rysunek 3 Adolfi et al. (2020)⁴.

Rysunek 1. Schemat próbny wydania zalewowego bez napędu.Ustawiono dziewięć klatek o powierzchni 0,216^m3, a do każdej z nich dodano 60 larw drugiego stadium rozwojowego (mieszanej płci) typu dzikiego. Począwszy od 3 tygodnia, samice otrzymują co tydzień mączkę z krwi, a jaja są zbierane i wykluwane. Do 8 tygodnia 60 larw jest losowo wybieranych i co tydzień wraca do odpowiednich klatek, aby stworzyć populację w klatkach o strukturze wiekowej (faza wstępna). Począwszy od 9 tygodnia, dziewięć klatek jest losowo przydzielanych w trzech egzemplarzach zgodnie z ich proporcjami uwalniania transgenicznych i dzikich samców (faza eksperymentalna). Klatki A (kontrolne) nie mają dodanych poczwarek transgenicznych. Samice otrzymują cotygodniowy posiłek z krwi, a jaja są zbierane, wykluwane i hodowane na poczwarki. 30 poczwarek płci męskiej i 30 żeńskich typu dzikiego dodaje się z powrotem do klatek. Klatki 1:1 mają dodane dodatkowe 30 transgenicznych poczwarek męskich. Klatki 1:0.1 mają dodane dodatkowe 300 transgenicznych poczwarek samców. 300 larw z każdej z 9 klatek jest wybieranych losowo i poddawanych badaniom przesiewowym pod kątem markera fluorescencyjnego. Procedurę tę powtarzano co tydzień, aż do utrwalenia transgenu (ustabilizowany stosunek komarów transgeniczno-dzikich po kilku pokoleniach). Na podstawie Pham et al. (2019)². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Karmienie krwią populacji klatek. (A) Znieczulone myszy lub (B) Podajniki krwi Hemotek są oferowane do karmienia krwią samic komarów odpowiednio w klatkach o długości 0,216 m³ lub małych klatkach o powierzchni 0,005 m³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Badania przesiewowe fenotypów pod kątem badań klatkowych bez napędu, nakładających się na siebie i nienakładających się na siebie genów.Fluorescencyjne obrazy larwy, poczwarki i osobnika dorosłego o fenotypach transgenicznych lub dzikich. W tym przykładzie osobniki An. stephensi zostały przebadane pod kątem markera DsRed napędzanego przez promotor 3xP3 w oczach (DsRed+ lub DsRed-), widocznego we wszystkich trzech etapach, a dorośli zostali przebadani pod kątem płci (♀ lub ♂ ). Zwróć uwagę na fluorescencję tła u larw typu dzikiego związaną z bolusem pokarmowym w jelicie środkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Schemat próbny klatki z napędem genowym nakładającym się. Sześć klatek o powierzchni 0,216 m³ jest ustawionych w trzech egzemplarzach zgodnie z ich współczynnikami uwalniania napędu genowego do samców typu dzikiego. Do każdej klatki dodano 120 samców typu dzikiego i 120 samic typu dzikiego. Do klatek ze stosunkiem uwalniania samców z napędem genowym 1:1 dodano dodatkowe 120 transgenicznych samców. Do klatek ze stosunkiem wypuszczania samców 1:10 dodano dodatkowe 12 transgenicznych samców. Do czasu pełnego wprowadzenia transgenu, co 3 tygodnie, dorosłe samice są zaopatrywane w mączki krwiopochodne, a jaja są zbierane i wykluwane. W sumie 240 larw zostało wybranych losowo i zwróconych do odpowiednich klatek. Trzysta (300) larw jest wybieranych losowo i przesiewanych pod kątem dominującego markera. Później są badane jako poczwarki i dorosłe osobniki pod kątem koloru oczu i płci. Do oryginalnych klatek nie dodaje się żadnych dodatkowych transgenicznych samców. Na podstawie Pham et al. (2019)². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Schemat próby klatki z nienakładającym się napędem genowym.Dziewięć małych klatek o powierzchni 0,005 m³ jest ustawionych w trzech egzemplarzach zgodnie ze współczynnikami uwalniania genów-napędu do samców typu dzikiego. Klatki ze stosunkiem uwalniania samców 1:1 mają dodanych 100 samic typu dzikiego, 50 samców typu dzikiego i 50 samców z napędem genowym. Klatki ze stosunkiem uwalniania samców 1:3 mają dodanych 100 samic typu dzikiego, 75 samców typu dzikiego i 25 samców z napędem genowym. Klatki o stosunku wypuszczenia samców 1:10 mają dodanych 100 samic typu dzikiego, 90 samców typu dzikiego i 9 samców z napędem genowym. Samice otrzymują mączkę z krwi oraz zbierane i wyklute jaja. W przypadku klatek 1:1 i 1:3 200 larw jest wybieranych losowo i wykorzystywanych do zaludnienia nowych klatek, oddzielnych od klatek ich rodziców, dla następnego pokolenia. Dodatkowe 500 larw jest wybieranych losowo i hodowanych na poczwarki, kiedy są one badane pod kątem dominującego genu markerowego. 500 poczwarek jest następnie wychowywanych do postaci dorosłych i ocenianych według płci. Wszystkie pozostałe larwy są przesiewane pod kątem markera. W przypadku klatek w skali 1:10 wszystkie larwy są oceniane w pokoleniach 1-12, a 200 larw odzwierciedlających istniejącą częstotliwość transgenu wykorzystuje się do zasiedlenia nowych klatek. Począwszy od generacji 13, klatki te są ustawione identycznie jak klatki 1:1 i 1:3. Na podstawie Pham et al. (2019)² oraz Carballar-Lejarazú et al. (2020)³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Przewidywana dynamika fiksacji transgenu dla różnych prób zamianowych klatek. Reprezentacja oczekiwanej dynamiki fenotypu najlepiej działających kontrprób dla każdego z eksperymentów klatkowych przeprowadzonych przez Pham i wsp. (2019)², monitorowane przez 7 pokoleń. Konfiguracja eksperymentów jest opisana w Protokołach. Przewidywania opierają się na danych ze wszystkich 9 eksperymentów na modelach uwalniania 1:1 (potrójne powtórzenia dla każdego z trzech różnych protokołów prób klatkowych). Oś X to liczba pokolenia po początkowym wprowadzeniu, a oś Y to odsetek larw wykazujących fenotyp markera DsRed (DsRed+) w czasie. Linie przerywane reprezentują liniowe linie trendu danych. Fenotyp DsRed+ wynika z posiadania co najmniej jednej kopii zmodyfikowanego allelu. W związku z tym wyniki odzwierciedlają rozprzestrzenianie się transgenu, przyspieszonego w układzie napędu genowego, osiągającego (prawie) pełne wprowadzenie pod koniec obserwacji. Zmienność między powtórzeniami i pełne szczegółowe dane z eksperymentów można znaleźć w Pham i wsp. (2019)², Carballar-Lejarazú R et al. (2020)³ oraz Adolfi A et al. (2020)⁴. Obrazy zaadaptowane z Pham TB et al. (2019) Eksperymentalna modyfikacja populacji komara wektora malarii, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A i in. (2020) Skuteczny system ratunkowy gene-drive modyfikacji populacji u komara malarii Anopheles stephensi. Nat Commun 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 oraz Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Napęd genowy nowej generacji do modyfikacji populacji komara wektora malarii, Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci USA 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający: Budowa klatki dla kolonii o powierzchni 0,005 m³. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Genetycznie modyfikowane komary, które mają zdolność blokowania patogenów lub geny bezpłodności niedźwiedzi, stanowią nowe narzędzia do zwalczania chorób przenoszonych przez wektory. Biorąc pod uwagę mnogość parametrów, które składają się na te alternatywne podejścia, krytycznym krokiem w ich badaniach są ograniczone laboratoryjnie oceny eksperymentalne, które pozwalają na szybkie i bezpieczne przewidywanie potencjalnych wyników uwalniania syntetycznego transgenu do celów kontrolnych¹.

Ponieważ monitorowanie dynamiki transgenów w populacjach trzymanych w klatkach może trwać kilka miesięcy, jednym z głównych aspektów protokołów jest spójność w projektowaniu eksperymentalnym między powtórzeniami (w tym hodowla komarów, wielkość klatki, populacje o strukturze wiekowej, stałe współczynniki uwalniania, stabilne źródła mączki z krwi i minimalnie inwazyjne procedury przesiewowe).

Wypuszczanie tylko samców jest uważane za idealne, ponieważ samce komarów nie przenoszą patogenów ani nie żywią się ludźmi, dlatego mogą bezpiecznie wprowadzać dziedziczne cechy do dzikich populacji. W eksperymentach laboratoryjnych z klatkami możliwe jest wykrycie szczepów transgenicznych o zmniejszonej konkurencyjności krycia samców i innych obciążeniach związanych z integracją transgenów. Jednak bezpośrednie i specyficzne eksperymenty, takie jak te przeprowadzone w dużych klatkach¹⁰, można przeprowadzić, aby właściwie przeanalizować konkurencyjność samców, a także płodność samic w bardziej naturalnym zagęszczeniu komarów². Co więcej, dane empiryczne z prób klatkowych mogą być wykorzystane do parametryzacji modeli dynamiki populacji klatkowej, w tym tworzenia opornych alleli, oraz dostarczają użytecznych informacji na temat skuteczności i możliwych dostosowań proponowanej technologii.

Opisane tutaj protokoły można łatwo dostosować do innych projektów eksperymentalnych w zależności od potrzeb, przy minimalnych wymaganiach dotyczących regularnej infrastruktury i warunków insektowych. Ponadto, z wyjątkiem komercyjnych klatek i mikroskopów, większość materiałów jest niedroga i pozwala na tanie wielokrotne powtórzenia i iteracje prób. Warto zauważyć, że pozwala to również na wstępne badanie przesiewowe wielu szczepów transgenicznych w próbach z małymi klatkami w celu nadania priorytetu najlepszym kandydatom, którzy zostaną przeniesieni do przodu w etapowej ścieżce testowania, oraz zawieszenia testów na tych, którzy wykazują nieoptymalne wyniki.

Wreszcie, obawy związane ze stosowaniem organizmów modyfikowanych genetycznie motywują do opracowania ram rozwoju, oceny i stosowania strategii genetycznych w celu zapobiegania chorobom przenoszonym przez komary ^5,8,9. Znaczenie i wykonanie zdefiniowanych tutaj protokołów jest zgodne z niniejszymi wytycznymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sztuczne karmniki	Hemotek	SP6W1-3	Pakiet startowy – 6 karmników ze zbiornikami 3ml
Klatka, komercyjna	BioQuip	1450D	, 24 x 24 x 24" - 0,216 m3 (60 cm3)
Wanna klatkowa (popcorn Amazon.com		VP170-0006	0,005 m3 (170 uncji)
Mikroskop preparacyjny ze światłem fluorescencyjnym i filtrami	Leica	M165FC
Klej w sztyfcie	Michaels	88646598807	Klej w sztyfcie 40 szt.,   0.4X4"
Pistolet do klejenia na gorąco	Woodwards Ace	2382513	Stanley, 40 W, GR20
Nylonowy ekran (siatka)	Joann.com	1102912	Tiul 108" szerokości x 50 jardów - ~35,6 cm2 (14 in2)
Miseczki do składania jaj	Fisher	259126	Zlewka PP grad 50 mL
Narzędzie do cięcia brzytwy	Office Depot	487899	Nożyki do pudełek
Nożyczki	Office Depot	978561	Scotch Precision Ultra Edge Tytanowe nożyczki nieprzywierające, 8-calowy
zszywacz	Office Depot	908194	Swingline Commercial Desk Stapler
Rękaw chirurgiczny (pończocha)	VWR	56612-664	~48 cm (19") wycięty ze ~15 cm (6") X ~23 m (25y)
Opaski zaciskowe	Home Depot	295715	Pk 100, 14-calowe opaski kablowe - 35,6 cm (14 cali)