Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62603

⸱

5 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University, 4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine, 6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.

Streszczenie

Isolevuglandins (IsoLGs) to wysoce reaktywne gamma-ketoaldehydy tworzone z H2-izoprostanów poprzez peroksydację lipidów i białka sieciujące, co prowadzi do stanów zapalnych i różnych chorób, w tym nadciśnienia. Wykrycie akumulacji IsoLG w tkankach ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia ich udziału w procesach chorobowych. Jednak pomiar IsoLG w tkankach jest niezwykle trudny, a obecnie dostępne narzędzia, w tym analiza spektrometrii mas, są pracochłonne i niezwykle kosztowne. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę wykrywania in situ IsoLG w tkankach przy użyciu sprzężonego z fosfatazą alkaliczną D11 ScFv i rekombinowanego przeciwciała fagowego wytwarzanego w E. coli za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Do walidacji barwienia użyto czterech kontroli: (1) barwienie z D11 i bez niego, (2) barwienie bakteryjnym ekstraktem perplazmatycznym z łącznikiem fosfatazy alkalicznej, (3) barwienie nieistotnymi przeciwciałami scFV oraz (4) kontrola konkurencyjna z IsoLG przed barwieniem. Wykazujemy skuteczność D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną zarówno w tkankach ludzkich, jak i mysich z nadciśnieniem tętniczym lub bez. Metoda ta prawdopodobnie posłuży jako ważne narzędzie do badania roli IsoLG w wielu różnych procesach chorobowych.

Wprowadzenie

Isolevuglandins (IsoLGs), znane również jako izoketale, są izomerami z rodziny 4-ketoaldehydów, które są produktami peroksydacji lipidów i reagują z aminami pierwszorzędowymi na białkach i do nich się przyłączają1,2. IsoLG są zaangażowane w wiele chorób, w tym choroby układu krążenia, chorobę Alzheimera, choroby płuc i wątroby oraz wiele rodzajów raka3. IsoLG zostały najszerzej przebadane pod kątem ich udziału w chorobach sercowo-naczyniowych (CVD), które stanowią poważne obciążenie zdrowotne i ekonomiczne na całym świecie, w tym w Stanach Zjednoczonych. Szacuje się, że 92,1 miliona dorosłych Amerykanów cierpi na co najmniej jeden rodzaj CVD, a szacunkowe prognozy na 2030 r. sięgają 43,9% dorosłej populacji USA4. Obniżenie ciśnienia krwi, poziomu cholesterolu i rzucenie palenia zmniejsza ogólne ryzyko wystąpienia zdarzeń sercowo-naczyniowych5.

Wysokie ciśnienie krwi lub nadciśnienie jest głównym czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych i dotyka około połowy populacji USA6. Wcześniejsze badania wykazały, że stan zapalny jest podstawową przyczyną nadciśnienia tętniczego i że IsoLG odgrywają pewną rolę7. Bodźce nadciśnieniowe, w tym angiotensyna II, katecholaminy, aldosteron i nadmiar soli w diecie, indukują akumulację IsoLG w komórkach prezentujących antygen, w tym w komórkach dendrytycznych (DC), które z kolei aktywują limfocyty T do proliferacji i produkcji cytokin zapalnych, które przyczyniają się do nadciśnienia8,9.

Poprzednio, IsoLGs były mierzone za pomocą immunohistochemii, spektrometrii mas, testu immunoenzymatycznego i cytometrii przepływowej10,11. Aby ułatwić pomiar IsoLGs, opracowano rekombinowane przeciwciało (D11) z jednołańcuchową zmienną fragmentową (scfv) przeciwko IsoLGs12. Początkowo to przeciwciało D11 zawierało znacznik E 11 aminokwasów i wymagało przeciwciała drugorzędowego do wykrywania immunohistochemicznego11. Trudno było jednak znaleźć wiarygodne przeciwciało drugorzędowe przeciwko E-znacznikowi po zaprzestaniu jego produkcji przez producenta. Dlatego opracowaliśmy niezawodny protokół barwienia immunofluorescencyjnego IsoLG przy użyciu D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną (D11-AP), który wykazaliśmy w tkankach myszy i ludzi z nadciśnieniem tętniczym i bez.

Protokół

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Vanderbilt zatwierdził wszystkie procedury opisane w tym manuskrypcie. Myszy są trzymane i pielęgnowane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed włączeniem się do badania, zgodnie z aprobatą Institutional Review Board Uniwersytetu Vanderbilt. Wszystkie zabiegi zostały wykonane zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Przygotowanie plazmidów kodujących białko fuzyjne fosfatazy alkalicznej D11 i wektory kontroli ujemnej

  1. Skonstruuj zmodyfikowaną wersję plazmidu pCANTAB5E class13,14, w której segment zmiennej pojedynczego fragmentu łańcucha (scFv) jest połączony na końcu 3' z sekwencją kodującą bakteryjną fosfatazę alkaliczną (AP).
    UWAGA: Bezpośrednio za miejscem ograniczenia NotI sekwencji scFv, zmodyfikowany plazmid nie zawiera już sekwencji kodującej znacznika E, a zamiast tego koduje sekwencję łącznika GGSGGHMGSGG, po której następuje sekwencja dla AP (numer dostępu GenBank AXY87039.1, T16-K464)15,16. Za AP plazmid zakoduje znaczniki 8xHis i DYKDDDDK. Na końcu 3' znaczników sekwencja kodowania kończy się bursztynowym kodonem stop. Zmodyfikowany plazmid nazywa się pCANTAB5-AP.
  2. Sklonuj D11 scFv (numer dostępu GenBank AAW28931.1) do pCANTAB5-AP z witrynami ograniczeń SfiI/NotI.
  3. Sklonuj D20 scFv do pCANTAB5-AP z witrynami ograniczeń SfiI/NotI.
    UWAGA: D20 scFv jest kontrolą ujemną przeznaczoną do oceny wzorca interakcji tkankowej nieistotnego scFv. Ten scFv został pierwotnie wybrany przez wyświetlacz fagowy ze względu na jego zdolność do interakcji z grupą glikanów znaną jako A2.
  4. Wygeneruj "pusty" wektor, całkowicie usuwając część scFv z plazmidu i zastępując ją sekwencją kodującą "AP linker" składającą się z aminokwasów GGGGSGRAGSGGGGS.
  5. Przekształć wszystkie plazmidy w kompetentne TG1 E. coli i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 30 °C, na 0,5% płytkach agarowych zawierających 2xYT uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny i 2% glukozy (2xYTAG) podłoże.
    UWAGA: Szczepy z genem supE (takie jak TG1 E. coli) nie tłumią w 100% bursztynowego kodonu stop. Szacunki wahają się od 0,8 do 20% czasu, więc nadal istnieje wiele produktów, które kończą się tuż za BAP, tak jak jest to przeznaczone dla tych eksperymentów17. TG1 E. coli są stosowane głównie ze względów praktycznych, takich jak redukcja czasu i kosztów, ich kompatybilność z systemem ekspresji białek pCANTAB oraz ich zastosowanie w wyświetlaniu fagów, które jest powszechnie przeprowadzane w laboratorium. Poniżej bursztynowego kodonu stop następującego po BAP znajduje się sekwencja genu III. Białka fuzyjne genu III muszą ulegać rzadkiej ekspresji, aby wyświetlanie fagów działało zgodnie z przeznaczeniem, ponieważ białka fuzyjne scFv-gen III zakłócają działanie tego konkretnego białka genu III, aby ponownie zainfekować naiwne bakterie. W związku z tym, wolne od fuzji białka genu III muszą istnieć podczas składania wirionu do wytworzenia funkcjonującego faga, tj. produkty białkowe scFv-geneIII są zwykle stosunkowo rzadkie wewnątrz bakterii. D11-AP, D20-AP, pusty wektor i wszystkie konstrukty użyte w tym artykule są podobnie dotknięte okazjonalną ekspresją białka fuzyjnego genu III. Nadal obserwuje się różnice w zachowaniu tych białek.
  6. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep świeże 5 ml kultury 2xYTAG. Pozostawić bakterie do rozwoju przez noc w temperaturze 30 °C i wstrząsnąć przy 150 obr./min.
  7. Granulować komórki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 85% 2xYTAG i 15% glicerolu.
  8. Utrzymuj zapasy glicerolu w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

2. Ekspresja białka i generacja ekstraktu peryplazmatycznego

UWAGA: Wytwarzanie ekstraktu peryplazmatycznego jest powszechnie stosowaną metodą ekspresji białek w wyświetlaczu fagowym, głównie dlatego, że tworzenie wiązań dwusiarczkowych jest ważne w scFv i wytwarzaniu przeciwciał. Metoda ta pozwala uniknąć konieczności wytwarzania lizatów (zwykle zawierających ciała inkluzyjne) i zapewnia prawidłowe fałdowanie białek. pCANTAB ma sekwencję sygnałową gIII przed częścią scFv białka fuzyjnego D11-BAP. Sekwencja sygnałowa zapewnia, że białko jest transportowane do przestrzeni peryplazmatycznej bakterii, a następnie sekwencja sygnałowa jest rozszczepiana. Przestrzeń peryplazmatyczna zapewnia środowisko utleniające, które ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego tworzenia mostków dwusiarczkowych. Szok osmotyczny jest używany do uzyskiwania ekstraktów peryplazmatycznych, ponieważ przerywa błonę zewnętrzną na tyle, aby uwolnić białka peryplazmatyczne do otaczającego środowiska, jednocześnie utrzymując bakterię w stanie nienaruszonym.

  1. Zaszczepić zapasy glicerolu TG1 E. coli zawierające odpowiednie plazmidy do 60 ml kultury 2xYTAG i hodować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
  2. Aby wywołać ekspresję białka, należy zawiesić kultury bakterii w osadach przy 3 000 x g przez 10 minut, ponownie zawiesić w 60 ml pożywki 2xYTA i hodować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
    UWAGA: Przejście z pożywki 2xTYAG na 2xYTA pomaga w wystarczającej indukcji ekspresji białka18. Gdy glukoza jest obecna w pożywce bakteryjnej, promotor lac jest tłumiony, ponieważ bakterie preferencyjnie spożywają glukozę i ignorują laktozę, ponieważ glukoza zużywa mniej energii do przetworzenia. Kiedy glukoza jest usuwana po przełączeniu pożywki, bakterie polegają na węglowodanach dostarczanych przez pożywkę 2xYT. Ekstrakt drożdżowy (składnik Y w 2xYT) zawiera węglowodany, w tym laktozę, dzięki czemu jest w stanie napędzać ekspresję białka przez promotor lak. IPTG nie jest konieczne w przypadku konstruktu pCANTAB i może powodować nadmierną ekspresję białka, wraz z ciałami inkluzyjnymi, które skutkują niefunkcjonalnym białkiem.
  3. Generuj ekstrakty peryplazmatyczne za pomocą szoku osmotycznego.
    1. Osadzanie kultur bakterii w ilości 3.000 x g przez 10 min.
    2. Zawiesić w 20 ml 1xTES (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M sacharozy) i inkubować przez 1 godzinę na lodzie.
    3. Ponownie osadzać w 3,000 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w 15 ml 0,05 M Tris, pH 7,6.
  4. Inkubować tę zawiesinę na lodzie przez 1 godzinę, a następnie sklarować przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 10 minut.
  5. Przenieść supernatanty do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne do oczyszczenia lub bezpośredniego użycia w eksperymentach.
  6. Oceń lizę komórek na podstawie obecności aktywnego D11-BAP w teście ELISA. Dodaj 3-5 μl ekstraktu peryplazmatycznego do jednego ml pNPP, a następnie obserwuj, czy w ciągu następnych 10 minut nastąpi zmiana koloru (kolor przechodzi od jasnożółtego do intensywnie żółtego).
    UWAGA: Kolor można porównać obok siebie z probówką pNPP, która nie otrzymała żadnego lizatu lub probówką pNPP, która otrzymała lizat naiwnych bakterii TG1. Określić ilościowo z absorbancją przy długości fali 405 nm.

4. Charakterystyka miana D11-AP w teście ELISA

  1. Pokryj 384-dołkową płytkę polistyrenową przez noc w temperaturze 4 °C 25 μl/basenik soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1,8 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl) zawierającej 5 μg/ml albuminy surowicy myszy (MSA) (kontrola ujemna) lub 5 μg/ml IsoLG/MSA (kontrola pozytywna).
  2. Opróżnij talerz i stuknij do sucha. Umyj raz za pomocą PBS + 0,1% Tween (PBS-T). Opróżnij talerz i stuknij do sucha.
  3. Napełnić płytkę PBS-T jako buforem blokującym (120 μl/studzienkę). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Opróżnij talerz i stuknij do sucha. Zastosować seryjne rozcieńczenia 1:2 ekstraktów peryplazmatycznych D11-AP w 25 μl/studzienkę i rozcieńczyć w PBS-T. Dołączyć jedną studzienkę zawierającą tylko PBS-T jako kontrolę ujemną.
    UWAGA: Typowe zakresy rozcieńczeń dla ekstraktów peryplazmatycznych to 1:8 - 1:4096. W przypadku objętości testu 25 μl należy rozpocząć od 50 μl początkowego stężenia "1:8": 6,25 μl ekstraktu peryplazmatycznego i 43,75 μl PBS-T. Następnie należy przeprowadzić 2-krotne rozcieńczenie, usuwając 25 μl tego roztworu i dodając go do następnego dołka zawierającego 25 μl PBS-T i pipetując w górę iw dół. Ta studzienka zawiera teraz rozcieńczenie "1:16". Powtarzaj 2-krotne rozcieńczenie, aby wygenerować opisaną serię rozcieńczeń 1:2.
  5. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Opróżnij talerz i stuknij do sucha. Umyj 5 razy za pomocą PBS-T. Opróżnij i wysusz.
  7. Przygotować roztwór pNPP, rozpuszczając 1 g pNPP w 1 l 930 mM dietanoloaminy (98% roztwór podstawowy rozcieńczony w stosunku 1:10 wH2O) w 0,5 mM MgCl2 i dostosowany do pH 9,5 za pomocą HCl.
  8. Zastosować 25 μl/dołek roztworu pNPP w celu wytworzenia AP. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i oznaczyć absorbancję przy 405 nm w każdym dołku za pomocą kompatybilnego czytnika płytek.
  9. Porównaj sygnał generowany z dołków IsoLG/MSA z szumem generowanym przez studnie MSA i znajdź zakres rozcieńczeń, w których sygnał jest co najmniej 5-krotnie wyższy niż szum.
  10. Narysuj tę serię rozcieńczeń sygnału D11-AP na wykresie, określ zakres liniowy krzywej i ustal rozcieńczenie, w którym można zaobserwować 50% sygnału.
    UWAGA: Jeśli to rozcieńczenie jest równoważne w przybliżeniu 1:1,000, wówczas roztwór D11-AP może być użyty w stężeniu 1:10 w IHC/IF.

5. Immunofluorescencja

  1. Wyciąć seryjne odcinki tkanek zatopionych w parafinie mysim i ludzkim (o grubości 5 μm) za pomocą mikrotomu i umieścić w ciepłej łaźni wodnej (37 °C). Zamontuj skrawki chusteczek higienicznych na szkiełkach podstawowych i pozostaw do wyschnięcia na noc.
    UWAGA: W tym badaniu aortę uzyskano od myszy. Wycinki jelita grubego u ludzi z normotensją i nadciśnieniem uzyskano z Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network.
  2. Zanurz szkiełka w ksylenie trzy razy na 5 minut w celu odparafinowania tkanek.
  3. Uwodnić tkanki w 2 płukaniach z 95%, 70% i 50% etanolu wH2O.
  4. Umyj szkiełka w roztworze soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) z 0,1% Tween20 (TBST) trzykrotnie z szybkimi płukaniami, napełniając uchwyt szkiełka TBST, a następnie wyrzucając TBST.
    UWAGA: Uwodnione szkiełka można przechowywać w TBST w temperaturze 4 °C nie dłużej niż tydzień przed pobraniem antygenu.
  5. Aby przeprowadzić indukowane ciepłem pobieranie szkiełek z antygenu, należy umieścić szkiełka we wstępnie podgrzanym (80-95 °C) buforze cytrynianu sodu (10 mM cytrynianu sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0) i inkubować w szybkowarze ustawionym na 4 minuty pod wysokim ciśnieniem, aby uzyskać całkowity czas pobierania antygenu wynoszący 20 minut.
  6. Wyjmij szkiełka z szybkowaru i pozwól im ostygnąć przez 20 minut do temperatury pokojowej.
  7. Umyj szkiełka w TBST trzy razy z szybkim praniem.
    UWAGA: Szkiełka mogą być przechowywane w TBST po pobraniu antygenu nie dłużej niż tydzień przed barwieniem.
  8. Dodaj 2% BSA rozpuszczonego w TBST, aby zablokować szkiełka. Przykryj szkiełka paskiem folii parafinowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  9. Odrzuć bufor blokujący ze slajdów.
  10. Dodaj 200 μl 1:10 D11-AP w TBST do szkiełek i przykryj paskiem folii parafinowej.
  11. Inkubować w wilgotnej komorze, aby zminimalizować parowanie roztworu przeciwciała przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  12. Umyj szkiełka trzy razy w TBST.
  13. Opracuj za pomocą kolorymetrycznego lub fluorescencyjnego wywoływacza fosfatazy alkalicznej odpowiednio do immunohistochemii lub immunofluorescencji. Umyj szkiełka raz za pomocą TBST, aby usunąć nadmiar wywoływacza i zapobiec dalszemu rozwojowi koloru.
  14. Preparaty do barwienia przeciwstawnego z barwnikiem jądrowym Hoechst o stężeniu 1 μg/ml w PBS do immunofluorescencji. Umyj szkiełka raz w TBST, aby usunąć nadmiar plam przeciwstawnych.
  15. Szkiełka nakrywkowe nakładać za pomocą podłoża montażowego.
  16. Obejrzyj szkiełka pod mikroskopem światła odwróconego do immunohistochemii lub konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym do immunofluorescencji.

6. Kontrole negatywne

UWAGA: Można przeprowadzić cztery eksperymenty kontroli ujemnej, aby potwierdzić specyficzność barwienia D11-AP dla IsoLG. Doświadczenia kontroli ujemnej powinny być przeprowadzane w tym samym zestawie do barwienia w tych samych warunkach.

  1. W pierwszym eksperymencie kontroli ujemnej inkubować tkanki z D11-AP rozcieńczonym w TBST lub samym TBST.
  2. Inkubować tkanki z rozcieńczonym D11-AP w TBST i bakteryjnym ekstraktem perplazmatycznym bez D11-AP (AP Linker) rozcieńczonym w TBST.
  3. Wykonaj test konkurencyjny z IsoLG/MSA lub nieaddukowanym MSA, jak opisano wcześniej12.
    1. Przygotuj IsoLG i IsoLG addukowane do albuminy surowicy myszy (MSA), jak opisano wcześniej19, w stosunku molowym 8 IsoLG: 1 MSA (8:1 IsoLG/MSA).
    2. Rozcieńczyć D11-AP w stosunku 1:10 w TBST.
    3. Rozcieńczony D11-AP inkubować z 50 μg/ml IsoLG/MSA lub nieaddukowanym MSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Dodaj D11-AP z IsoLG/MSA lub D11-AP z nieaddukowanym MSA do tkanek w celu barwienia.
  4. Użyć nieistotnego przeciwciała scFv, D20, do barwienia tkanek do końcowego zestawu kontroli ujemnej.

Wyniki

W reprezentatywnych eksperymentach scFv D11 sprzężony z fosfatazą alkaliczną (D11-AP) został wykorzystany w immunofluorescencji do wykrywania IsoLG obecnych u myszy traktowanych angiotensyną II w porównaniu do prawidłowych myszy kontrolnych oraz u ludzi z nadciśnieniem w porównaniu do ludzi normotensyjnych. Myszy otrzymywały angiotensynę II w dawce 490 ng/kg/min przez dwa tygodnie, a nadciśnienie potwierdzono poprzez wzrost ciśnienia skurczowego w porównaniu do myszy kontrolnych10. Aby zapewnić swoistość D11-AP, tkanki barwiono z zastosowaniem lub bez zastosowania D11-AP. Jak wykazało barwienie D11-AP, aorta myszy z nadciśnieniem wywołanym angiotensyną II wykazała podwyższone stężenie IsoLG w porównaniu do myszy kontrolnych (Rysunek 1). Barwienie tła lub autofluorescencja były ograniczone, co wykazały kontrole negatywne, których nie barwiono D11-AP.

D11-AP wykorzystano do wykrywania IsoLGs obecnych w tkankach jelitowych pacjentów z nadciśnieniem tętniczym (HTN) oraz u osób z ciśnieniem w normie (NTN). Status nadciśnienia ustalono na podstawie dokumentacji szpitalnej jako skurczowe ciśnienie krwi powyżej 140 i rozkurczowe ciśnienie krwi powyżej 80 mmHg. Badacze opracowujący protokół immunofluorescencji dla D11-AP nie znali statusu nadciśnienia w przypadku badanych tkanek ludzkich. Przekroje barwiono w obecności i w nieobecności D11-AP, aby zapewnić specyficzność przeciwciał oraz wykazać barwienie tła lub autofluorescencję. Jak pokazano na Rysunku 2, stwierdzono, że tkanki od pacjentów z HTN charakteryzowały się podwyższonym stężeniem IsoLGs w porównaniu do pacjentów z NTN. Barwienie bez użycia D11-AP wykazało również minimalne barwienie tła i autofluorescencję. Endogenna fosfataza alkaliczna jest ekspresjonowana przez nabłonek jelitowy, zatem ograniczona fluorescencja tkanek barwionych bez D11-AP świadczy o tym, że zastosowana w tym protokole metoda odsłaniania antygenu była wystarczająca do inaktywacji endogennej fosfatazy alkalicznej obecnej w tkankach. W połączeniu z wynikami uzyskanymi u myszy, dane te wykazują również, że protokół immunofluorescencji skutecznie obrazuje podwyższony poziom IsoLGs w nadciśnieniu w porównaniu do stanu normotensyjnego.

D11-AP został wyizolowany i przechowywany w ekstrakcie periplazmatycznym bakterii. Tkanki mysie i ludzkie barwiono D11-AP oraz ekstraktem periplazmatycznym zawierającym łącznik AP bez D11, aby upewnić się, że inne czynniki, które mogą występować w ekstrakcie periplazmatycznym, takie jak nadmiar lub nie sprzężona fosfataza alkaliczna, nie wpływają na barwienie obserwowane w tkankach traktowanych D11-AP (Rysunek 3). Tkanki barwione D11-AP wykazały intensywniejsze barwienie w porównaniu do tkanek barwionych ekstraktem periplazmatycznym. Wyniki te potwierdzają, że za barwienie tkanek odpowiada D11-AP, a nie nie sprzężona bakteryjna fosfataza alkaliczna, która potencjalnie może występować w ekstrakcie periplazmatycznym i prowadzić do fałszywego barwienia IsoLG lub przyczyniać się do barwienia tła.

Kontrolę konkurencyjną przeprowadzono poprzez preinkubację D11-AP z IsoLG przyłączonym do MSA lub MSA bez adduktu przed barwieniem tkanek, aby wykazać swoistość D11-AP względem IsoLG. Jeśli D11-AP jest swoiste dla IsoLG, przeciwciało zwiąże się z IsoLG-MSA, co spowoduje zmniejszenie dostępności D11-AP do barwienia tkanek, natomiast D11-AP inkubowane z MSA bez adduktu powinno wykazać barwienie podobne do prawidłowego D11-AP. W tkankach barwionych D11-AP po preinkubacji z konkurentem IsoLG zaobserwowano osłabione barwienie w porównaniu z tkankami barwionymi D11-AP bez żadnej preinkubacji (Rycina 4). W tkankach barwionych D11-AP po preinkubacji z MSA bez adduktu barwienie było podobne do barwienia obserwowanego w tkankach z D11-AP. Wyniki te wykazują swoistość D11-AP względem IsoLG ze względu na zredukowane barwienie tkanek w przypadku preinkubacji D11-AP z IsoLG/MSA, ale nie z MSA bez adduktu. W końcowej kontroli negatywnej tkankę myszy barwiono D11-AP lub nieistotnym przeciwciałem scFv, D20. Barwienie aorty myszy za pomocą D11-AP doprowadziło do silnego barwienia w porównaniu z D20, co wskazuje na swoistość D11-AP względem IsoLG w aortach nadciśnieniowych (Rycina 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Immunofluorescencja aorty u myszy z nadciśnieniem i normotensyjnych. Tętnice myszy poddanych infuzji angiotensyny II oraz grupy kontrolnej (sham) zabarwiono z użyciem D11-AP (D11) oraz bez niego, aby wykazać obecność IsoLG. (A) Tętnica myszy leczonej angiotensyną II znakowana D11-AP (zielony) i przeciwbarwienie jąder komórkowych (magenta), (B) Tętnica myszy z grupy kontrolnej (sham) znakowana D11-AP, (C) Tętnica myszy leczonej angiotensyną II bez D11-AP, (D) Tętnica myszy z grupy kontrolnej (sham) bez D11-AP (pasek skali = 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Immunofluorescencja tkanek jelitowych ludzi od pacjentów z nadciśnieniem tętniczym i bez nadciśnienia.Tkanki pobrane od pacjentów z nadciśnieniem tętniczym (HTN) oraz osób bez nadciśnienia (NTN) barwiono z użyciem i bez użycia przeciwciała D11-AP (D11), aby wykazać obecność IsoLG u pacjentów z HTN. (A) Tkanki HTN barwione D11-AP (zielony) i przeciwbarwienie jąder (magenta), (B) tkanki NTN barwione D11-AP, (C) tkanki HTN barwione bez D11-AP, (D) tkanki NTN barwione bez D11-AP (pasek skali = 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Tkanki mysie i ludzkie barwione ekstraktem periplazmatycznym z D11-AP i bez D11-AP. Tkanki mysie i ludzkie barwiono ekstraktami periplazmatycznymi z dodatkiem D11-AP oraz bez niego. Obrazy wykazują ograniczone barwienie tkanek ekstraktem periplazmatycznym bez D11-AP, co wskazuje, że barwienie wynika głównie z wiązania D11-AP, a nie innego składnika, który może występować w ekstrakcie periplazmatycznym. (A) aorta mysia Ang barwiona D11-AP (zielony) i przeciwbarwienie jąder komórkowych (magenta), (B) aorta mysia Ang barwiona ekstraktem periplazmatycznym, (C) aorta mysia Sham barwiona D11-AP, (D) aorta mysia Sham barwiona ekstraktem periplazmatycznym, (E) tkanka jelitowa ludzka nadciśnieniowa barwiona D11-AP, (F) tkanka jelitowa ludzka nadciśnieniowa barwiona ekstraktem periplazmatycznym, (G) tkanka jelitowa ludzka normotensyjna barwiona D11-AP, (H) tkanka jelitowa ludzka normotensyjna barwiona ekstraktem periplazmatycznym (pasek skali =100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Kontrola konkurencyjna w naczyniach myszy Ang i Sham. W tej kontroli konkurencyjnej D11-AP poddano preinkubacji z MSA sprzężonym z IsoLG lub MSA niesprzężonym. Jako kontrolę zastosowano D11-AP bez preinkubacji. Wyniki te wykazują swoistość D11-AP względem IsoLGs, ponieważ w przypadku zastosowania konkurenta IsoLG-MSA zaobserwowano zmniejszenie intensywności barwienia tkanek w porównaniu do D11-AP. Redukcja ta wynika z obecności IsoLG, a nie MSA, ponieważ preinkubacja z niesprzężonym MSA doprowadziła do barwienia podobnego do kontroli D11-AP. Aorty myszy Angiotensin II (A) i Sham (B) zabarwione D11-AP (zielony) oraz barwnikiem jądrowym (magenta), aorty myszy Angiotensin II (C) i Sham (D) zabarwione D11-AP po inkubacji z IsoLG-MSA, aorty myszy Angiotensin II (E) i Sham (F) zabarwione D11-AP po inkubacji z niesprzężonym MSA (pasek skali =100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Aorty mysie barwione D11 oraz nieistotnym scFv, D20. Tkanki mysie zabarwiono D11-AP i porównano z nieistotnym przeciwciałem kontrolnym, D20, które jest swoiste dla glikoproteiny A2. Barwienie tkanki D11-AP (zielony) i kontrast jądrowy (magenta) (A) doprowadziło do intensywnej immunofluorescencji w porównaniu do D20 (zielony) i kontrastu jądrowego (magenta) (B), co wskazuje na swoistość D11-AP względem IsoLGs (pasek skali =100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

D11 jest szeroko stosowany do wykrywania białek addukowanych przez IsoLG w komórkach lub tkankach jako marker stanu zapalnego lub stresu oksydacyjnego w chorobie 8,9,20. Wcześniej D11 zawierał znacznik E, a rozwój IHC wymagał użycia drugorzędowego przeciwciała anty-E sprzężonego z HRP 10,20,21. W tym miejscu opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokół wykrywania białek addukowanych przez IsoLG za pomocą przeciwciała D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną zamiast znacznika E, co eliminuje potrzebę wtórnej inkubacji przeciwciał.

Aby określić swoistość D11-AP, przeprowadzono cztery eksperymenty kontroli ujemnej. Wykonaliśmy protokół bez obecności D11 i mieliśmy minimalny rozwój. Wyniki te mają dwojakie wskazanie: endogenna fosfataza alkaliczna nie przyczynia się do rozwoju, a obserwowane barwienie jest spowodowane D11, a nie innym czynnikiem przyczyniającym się. Następnie poplamiliśmy slajdy łącznikiem AP bez D11. Eksperyment ten spowodował niewielkie zabarwienie, co wskazuje, że wolny AP lub inne czynniki w ekstrakcie peryplazmatycznym nie powodują plamy, którą obserwujemy w obecności D11. Aby zapewnić specyficzność D11 dla IsoLG, przed barwieniem szkiełek wstępnie inkubowaliśmy D11-AP z oczyszczonym IsoLG. Zaobserwowaliśmy spadek rozwoju, co wskazuje, że D11-AP był związany z białkiem IsoLG, wyczerpując w ten sposób ilość wolnego D11-AP do wiązania się z IsoLG obecnym w tkance. Wreszcie, aby upewnić się, że D11-AP wiąże się z IsoLG, a nie z białkiem MSA, z którym IsoLG był związany, wstępnie inkubowaliśmy D11-AP tylko z MSA. Nie zaobserwowano żadnych zmian w rozwoju, co wskazuje, że D11-AP nie wiązał się z MSA, ale z białkiem IsoLG. Wreszcie, naukowcy opracowujący protokół barwienia byli ślepi na stan nadciśnienia w ludzkiej tkance jelitowej. Różnice w barwieniu obserwowane między pacjentami z nadciśnieniem tętniczym a pacjentami z normociśnieniem nie wynikały z błędu systematycznego i zostały opisane wcześniej22,23.

Chociaż nasz protokół wykrywania białek addukowanych przez IsoLG przy użyciu przeciwciała D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną zamiast znacznika E jest rygorystyczny i solidny oraz eliminuje potrzebę wtórnej inkubacji przeciwciał, ma pewne ograniczenia. Jednym z ograniczeń jest to, że użyliśmy D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną w ekstrakcie peryplazmatycznym i może dojść do fałszywego zabarwienia endogennej fosfatazy alkalicznej w ekstrakcie peryplazmatycznym lub niektórych tkankach, takich jak jelito24. Jednak pierwszym krokiem do opracowania tego protokołu było wyłączenie endogennej fosfatazy alkalicznej, która może być obecna w tkankach25. Początkowo testowano zimny kwas octowy, BME i lewamizol26 pod kątem skuteczności. Żaden z nich nie zmniejszył całkowicie obecności aktywnej endogennej fosfatazy alkalicznej. Ciepło zostało użyte do dezaktywacji fosfatazy alkalicznej27, więc przetestowaliśmy dezaktywację termiczną fosfatazy alkalicznej w różnych. Odkryliśmy, że podgrzewane i uwodnione szkiełka w buforze cytrynianowym eliminowały większość endogennej fosfatazy alkalicznej. Preparaty zostały początkowo opracowane przy użyciu podłoża chemiluminescencyjnego/fluorescencyjnego, ale podczas obrazowania bez tego podłoża występowała duża ilość autofluorescencji. VectorRed jest substratem, który rozwija się w obecności fosfatazy alkalicznej w celu wytworzenia chromogenu, który można uwidocznić w zakresie kanałów Texas Red/TRITC. Korzystając z tego podłoża, byliśmy w stanie łatwiej zaobserwować sygnał powyżej autofluorescencji tła. Podczas procesu barwienia należy zachować ostrożność, aby zminimalizować sztuczne plamy. Wysuszenie tkanek na szkiełkach po nawodnieniu do czasu obrazowania spowodowało zwiększony rozwój. D11-AP należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C. Podczas pracy z D11-AP należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) może również wpływać na aktywność enzymatyczną fosfatazy alkalicznej i nie powinna być stosowana jako bufor do przemywania28. Podobnie jak w przypadku każdego podejścia opartego na przeciwciałach, należy przeprowadzić dokładne testy i optymalizację, aby upewnić się, że barwienie jest specyficzne i że sygnał nie jest nadmiernie lub niedostatecznie wzmocniony.

Podsumowując, opracowaliśmy potężny, rygorystyczny i solidny, zoptymalizowany protokół do wykrywania białek addukowanych przez IsoLG za pomocą przeciwciała D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną zamiast znacznika E. Protokół ten ma kilka zalet: po pierwsze, stosowanie D11 jako białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej jest tańsze. D11 pierwotnie pochodził z biblioteki przeciwciał fagowych, których nie można było skomercjalizować i których oczyszczanie było drogie. Chociaż D11 w ekstrakcie peryplazmatycznym E. coli może stanowić niedrogą alternatywę, był nieskuteczny w większości testów. Po drugie, podejście oparte na fuzji fosfatazy alkalicznej pozwala D11 scfv na fuzję użytecznego reportera15 (fosfatazy alkalicznej) i nie musiałaby być oczyszczana do stosowania w testach immunologicznych, ponieważ substraty są dostępne na rynku. Po trzecie, fosfataza alkaliczna E. coli tworzy dimery29. Tak więc D11 po fuzji z fosfatazą alkaliczną również tworzy dimery, a to zwiększa awidność przeciwciała i aktywność wiązania30. Wreszcie, D11 sprzężony z fosfatazą alkaliczną w ekstrakcie peryplazmatycznym można łatwo oczyścić za pomocą Cibacron Blue Sepharose. D11 ma wysoki punkt izoelektryczny (~9,2 pH). W związku z tym jest naładowany dodatnio i może wiązać się z błękitem Cibacron poprzez interakcje kationowe. Większość zanieczyszczeń w ekstrakcie peryplazmatycznym E. coli można wymyć z żywicy. D11 sprzężony z fosfatazą alkaliczną można następnie eluować przy użyciu wysokiej zawartości soli (~1,5 M NaCl) w wodzie. Eluowany D11 sprzężony z fosfatazą alkaliczną jest dość stabilny w temperaturze 4-8 °C w roztworze o wysokiej zawartości soli. W związku z tym opracowaliśmy protokół, który nie tylko sprawia, że przeciwciało D11 jest dostępne po niskich kosztach, ale także eliminuje dodatkowe etapy i potrzebę wtórnej inkubacji przeciwciał. Protokół ten ułatwia powtarzalny pomiar IsoLG, które gromadzą się w tkankach w wielu chorobach, w których rolę odgrywa zwiększony stres oksydacyjny.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 i R03HL155041 dla A.K. Dziękujemy Digital Histology Shared Resource - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 za wizualizację i skanowanie slajdów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml kolumna TALON HiTrap (Cobalt-CMA)Cytiva28953766
200 Proof EthanolPharmco111000200
2xYT w proszkuMP Biomedicals3012-032
384-dołkowe, przezroczyste, płaskodenne mikropłytki polistyrenoweThermoFisher (NUNC)242757
Sześciowodna sól disodowa fosforanu 4-nitrofenylu (pNPP)CarbosynthEN08508
Fosforan 5-bromo-4-chloro-3indoksylowy, sól p-toluidyny (BCIP)KarbosynterEB09335
Ampicylina, sól sodowaMiędzynarodowe Produkty Badawcze (RPI)A40040
Albumina surowicy bydlęcejRPIA30075
Chemicznie kompetentna TG1 E. coliAmid BiosciencesTG1-201
Dietanoloamina, >98%Sigma-AldrichD8885
EDTASigma-AldrichED
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Pożywka do wydobywania
glukozyMiędzynarodowe Produkty Badawcze Glukozy (RPI)G32045
GlicerolSigma-AldrichG7893
HistoclearNational DiagnosticsHS-200Alternatywa dla ksylenu
Hoechst 33342ThermoFisherH3570roztwór podstawowy = 10 mg/ml
Kwas solny (HCl), 30%, Macron Fine ChemicalsThermoFisherMK-2624-212
ImidazoleResearch Products International (RPI)I52000
MgCl2 (bezwodny)Sigma-AldrichM8266
Albumina surowicy myszy (MSA)Sigma-Aldrich/Calbiochem126674
Nitroniebieski chlorek tetrazolu (NBT)CarbosynthEN13587
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP4504
Fosforan potasu, monozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
SzybkowarCuisinartCPC-600
Slide-a-Lyzer, 10K MWCO, 3 mlThermoFisher66380
Chlorek sodu (NaCl)Research Products International (RPI)S23020
Cytrynian soduSigma-Aldrich1064461000
Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na2HPO4)Produkty badawcze Międzynarodowa (RPI)S23100
SacharozaProdukty Badawcze Międzynarodowe (RPI)S24065
Baza TrisProdukty Badawcze Międzynarodowe (RPI)T60040
Sól fizjologiczna buforowana TrisBoston Bio-Products25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4
Tris-HClProducts International (RPI)T60050
Tween20Sigma-AldrichP9416
Wektor CzerwonyVector LabsSK-5105
Kasety dializacyjne Research

Bibliografia

  1. Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
  2. Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
  3. May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
  4. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56(2019).
  5. Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650(2017).
  6. Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
  7. Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
  8. Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418(2020).
  9. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
  10. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
  11. Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
  12. Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
  13. Shen, Z., et al. Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors. Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).
  14. Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
  15. Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46(2006).
  16. Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
  17. Miller, J. Handbook for a short course in bacterial genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).
  18. Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
  19. Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
  20. Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
  21. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
  22. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241(2019).
  23. Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
  24. Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
  25. Millán, J. L. Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , John Wiley and Sons. (2006).
  26. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
  27. Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
  28. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  29. Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  30. Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 4/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Tagi

Wykrywanie izolevuglandynymikroskopia immunofluorescencyjnaperoksydacja lipid wbarwienie tkanekbia ko D11 scFvtkanki z nadci nieniem t tniczymmikroskopia konfokalnaods anianie antygenutkanki zatopione w parafinie

Powiązane artykuły