Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podłużna obserwacja zakażeń dróg moczowych i ich leczenie u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62614

⸱

14 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Ion Channel Research (LICR), VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, Leuven, Belgium & Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven, 2Biomedical MRI, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven, 3Belgium & KU Leuven Centre of Microbial and Plant Genetics, VIB-KU Leuven Center for Microbiology, Leuven, 4Laboratory of Experimental Urology, Department of Development and Regeneration, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje dopęcherzowe podawanie bakterii uropatogennych za pomocą operonu luksa w celu wywołania infekcji dróg moczowych u myszy i późniejszą podłużną analizę in vivo obciążenia bakteryjnego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Streszczenie

Infekcje dróg moczowych (UTI) należą do najczęstszych infekcji bakteryjnych u ludzi i są rutynowo leczone empirycznymi antybiotykami. Jednak ze względu na rosnącą oporność drobnoustrojów skuteczność najczęściej stosowanych antybiotyków spadła. Aby znaleźć alternatywne opcje leczenia, istnieje ogromna potrzeba lepszego zrozumienia patogenezy ZUM i mechanizmów, które decydują o podatności na ZUM. Aby zbadać to na modelu zwierzęcym, niezbędny jest powtarzalny, nieinwazyjny test do badania przebiegu ZUM.

Przez lata, złotym standardem w liczeniu obciążenia bakteryjnego było wyznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) dla określonej objętości próbki. Technika ta wymaga pośmiertnych homogenatów narządów i seryjnych rozcieńczeń, co ogranicza wydajność danych i odtwarzalność. Alternatywnie, obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) zyskuje na popularności w celu określenia obciążenia bakteryjnego. Znakowanie patogenów za pomocą operonu luksa pozwala na czułe wykrywanie i kwantyfikację w nieinwazyjny sposób, umożliwiając w ten sposób długotrwałą obserwację. Jak dotąd, zastosowanie BLI w badaniach nad ZUM pozostaje ograniczone.

Ten manuskrypt opisuje praktyczną implementację BLI w modelu infekcji dróg moczowych u myszy. Tutaj znajduje się przewodnik krok po kroku dotyczący hodowli bakterii, wkraplania dopęcherzowego i obrazowania. Badana jest korelacja in vivo z CFU i dostarczany jest dowód słuszności koncepcji, porównując obciążenie bakteryjne nieleczonych zakażonych zwierząt ze zwierzętami leczonymi antybiotykami. Ponadto omówiono zalety, ograniczenia i względy charakterystyczne dla wdrożenia BLI w modelu ZUM in vivo. Wdrożenie BLI w dziedzinie badań nad ZUM znacznie ułatwi badania nad patogenezą ZUM oraz odkrycie nowych sposobów zapobiegania i leczenia ZUM.

Wprowadzenie

Infekcje dróg moczowych (ZUM) należą do najczęstszych infekcji bakteryjnych u ludzi. Prawie połowa wszystkich kobiet doświadczy objawowego ZUM w ciągu swojego życia1. Infekcje ograniczone do pęcherza moczowego mogą powodować objawy ze strony układu moczowego, takie jak zwiększenie częstotliwości oddawania moczu, parcie na moczenie, krwiomocz, nietrzymanie moczu i ból. Kiedy infekcja przenosi się do górnych dróg moczowych, u pacjentów rozwija się odmiedniczkowe zapalenie nerek ze złym samopoczuciem, gorączką, dreszczami i bólem pleców. Co więcej, do 20% pacjentów z ZUM cierpi na nawracające infekcje, co powoduje dramatyczny spadek wrażliwości na antybiotyki2,3,4. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie nowatorskimi terapiami w leczeniu i profilaktyce nawrotów ZUM. Pomimo lepszego zrozumienia wrodzonej i adaptacyjnej odporności dolnych dróg moczowych oraz czynników wirulencji bakterii niezbędnych do inwazji i kolonizacji, żadne radykalne zmiany w reżimie leczenia nie zostały przełożone na codzienną praktykę urologiczną2. W celu zbadania patogenezy i podatności ZUM in vivo niezbędny jest powtarzalny i nieinwazyjny test.

Opisano wiele zwierzęcych modeli UTI, od nicieni po naczelne, ale najczęściej używany jest model mysi5,6. Model ten polega na przezcewkowym cewnikowaniu (samic) myszy, a następnie wkropleniu zawiesiny bakteryjnej, najczęściej uropatogennej Escherichia coli (UPEC), bezpośrednio do pęcherza moczowego lumen7. Po inokulacji obciążenie bakteryjne tradycyjnie określa się ilościowo poprzez określenie jednostek tworzących kolonie (CFU). Technika ta wymaga składania zwierząt w ofierze w celu uzyskania pośmiertnych homogenatów narządów i seryjnych rozcieńczeń, co ogranicza wydajność danych i odtwarzalność. Ponadto przy użyciu tej techniki nie jest możliwe długotrwałe monitorowanie obciążenia bakteryjnego u poszczególnych zwierząt.

W 1995 roku Contag et al. zasugerowali użycie patogenów oznaczonych bioluminescencyjnie do monitorowania procesów chorobowych u żywych zwierząt8,9. Od tego czasu obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) zostało zastosowane do wielu modeli infekcji, takich jak zapalenie opon mózgowych, zapalenie wsierdzia, zapalenie kości i szpiku, infekcje skóry i tkanek miękkich itp.10,11,12. W mysim modelu UTI można użyć szczepu UPEC z kompletnym operonem luksowym (luxCDABE) firmy Photorhabdus luminescens13. Reakcja enzymatyczna jest katalizowana przez lucyferazy bakteryjne, która jest zależna od utleniania aldehydów długołańcuchowych reagujących ze zredukowanym mononukleotydem flawinowym w obecności tlenu, dając utlenioną flawinę, długołańcuchowy kwas tłuszczowy i light12. Operon luksowy koduje lucyferazy i inne enzymy wymagane do syntezy substratów. W związku z tym wszystkie metabolicznie aktywne bakterie będą w sposób ciągły emitować niebiesko-zielone (490 nm) światło bez konieczności wstrzykiwania egzogennego substratu12. Fotony emitowane przez bakterie oznaczone luksem mogą być rejestrowane za pomocą bardzo czułych, chłodzonych kamer ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).

Użycie bakterii bioluminescencyjnych w modelu UTI pozwala na podłużną, nieinwazyjną kwantyfikację obciążenia bakteryjnego, pomijając potrzebę składania ofiar ze zwierząt w ustalonych punktach czasowych podczas obserwacji oznaczania CFU. Pomimo szerokiego wachlarza możliwości, gromadzenia dowodów na solidność tej techniki BLI w innych dziedzinach i jej przewagę nad klasycznymi modelami ZUM, nie została ona szeroko wdrożona w badaniach UTI. Przedstawiony tutaj protokół zawiera szczegółowy przewodnik krok po kroku i podkreśla zalety BLI dla wszystkich przyszłych badań nad ZUM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Rady Wspólnoty Unii Europejskiej i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt KU Leuven (P158/2018).

1. Hodowla bakterii (na podstawie7,13,14)

  1. preparat
    1. Wybierz luminescencyjną odmianę UPEC, która najlepiej odpowiada potrzebom eksperymentalnym.
      UWAGA: W tym przypadku wybrano kliniczny izolat zapalenia pęcherza moczowego, UTI89 (E. coli), ze względu na jego zdolność uropatogenną zarówno u ludzi, jak i gryzoni oraz jego powszechne stosowanie w mysich modelach ZUM5,7,15. Bioluminescencyjny szczep izogeniczny przenoszący kompletny operon luksowy (luxCDABE) jest dalej określany jako UTI89-lux. Ten operon przenosi również geny oporności na siarczan kanamycyny (Km). W związku z tym Km może być używane do wybierania kolonii bioluminescencyjnych13.
    2. Wykonaj krzywą korelacji dla CFU i gęstości optycznej przy 600 nanometrach (OD 600 nm) dla wybranego szczepu bakteryjnego7.
      1. Aby to zrobić, posadź bakterie (korzystając z poniższego protokołu) i wykonaj 8 różnych rozcieńczeń w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Zmierzyć OD przy 600 nm dla wszystkich tych rozcieńczeń i umieścić je na płytkach Luria-Bertani (LB) w celu wyznaczenia CFU.
      2. Wykreślić wartości OD 600 nm i wartości CFU, aby określić korelację i uzyskać krzywą standardową.
        UWAGA: W przyszłych eksperymentach zmierz OD przy 600 nm i użyj tej krzywej standardowej, aby uzyskać natychmiastowe oszacowanie CFU w roztworze bakteryjnym.
        UWAGA: UPEC to bakterie chorobotwórcze, należy upewnić się, że pomieszczenia są odpowiednio wyposażone i stosować środki ochrony osobistej.
  2. Trzy dni przed wkropleniem
    1. Otrzymać pojedyncze kolonie poprzez rozpylenie glicerolu bakterii za pomocą pętli inokulacyjnej na płytkach LB uzupełnionych 50 μg/ml Km i hodowlę przez noc w temperaturze 37 °C. Uszczelnić te płytki folią parafinową do przechowywania w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
  3. Dwa dni przed zakropleniem
    1. Napełnij sterylną probówkę z okrągłym dnem o pojemności 14 ml polistyrenu z dwupozycyjnymi zatrzaskami 5 ml bulionu LB uzupełnionego 50 μg/ml Km. Wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną za pomocą pętli inokulacyjnej i dodaj ją do bulionu LB. Wiruj przez 10 sekund, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
    2. Hodowla statyczna z nasadką zatrzaskową w pozycji otwartej w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Statyczny wzrost E. coli sprzyja ekspresji pilusów typu 1, które mają kluczowe znaczenie dla przylegania i inwazji komórek nabłonka moczu.
    3. Przygotować sterylną kolbę Erlenmeyera lub kolbę hodowlaną.
  4. Dzień przed zakropleniem
    1. Po inkubacji wirować probówkę przez 10 s, aby zapewnić prawidłową homogenizację kultury bakteryjnej. Wykonać subkulturę w pożywce Erlenmeyera, dodając 25 μl zawiesiny bakteryjnej do 25 ml świeżej pożywki LB bez antybiotyków.
    2. Zamknąć Erlenmeyera i hodowlę statycznie w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. W dniu wrzepienia
    1. Wirować Erlenmeyera przez 10 sekund, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
    2. Wlać kulturę z Erlenmeyera do probówki hodowlanej o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 3 000 x g i 4 °C przez 5 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 10 ml sterylnego PBS i ponownie wirować przez 10 s.
    3. Wybrać eksperymentalne stężenie inokulum (CFU) i użyć krzywej wzorcowej otrzymanej w kroku 1.1.2 w celu wyznaczenia odpowiedniego OD 600 nm.
    4. Dodać 1 ml zawieszonej kultury bakteryjnej do 9 ml sterylnego PBS i sprawdzić OD przy 600 nm. Dostosuj dalej, dodając sterylny PBS lub stężony roztwór bakteryjny, aż do osiągnięcia pożądanej średnicy zewnętrznej 600 nm7.
      UWAGA: Na przykład dla UTI89-lux dostosuj kulturę, dodając PBS, aż OD 600 nm osiągnie 0,45, co odpowiada 2 x 107 CFU/50 μL. Aby sprawdzić liczbę żywotnych CFU, należy wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia i płytkę 50 μl piątego i szóstego 10-krotnego rozcieńczenia na płytkach LB w trzech powtórzeniach, aby uzyskać mniej niż 300 kolonii. Policz otrzymane kolonie następnego dnia po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C. OD 600 nm daje natychmiastowy odczyt, ale użyj CFU jako kontroli jakości.

2. Szczepienie zwierząt (na podstawie7,16)

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Wybierz żądaną odmianę myszy w zależności od pytania badawczego i dostępności linii nokautujących, szczegółów eksperymentalnych i różnic w podatności na ZUM5,17. Należy pamiętać, że cewnikowanie przezcewkowe jest łatwiejsze u samic myszy. Nie należy używać zwierząt w wieku poniżej 8 tygodni, ponieważ są one niedojrzałe immunologicznie. W tym przypadku wykorzystano 12-tygodniowe samice myszy C57Bl/6J.
    2. Zamów zwierzęta z dużym wyprzedzeniem i pozwól im się zaaklimatyzować, najlepiej na 7 dni. Grupuj zwierzęta domowe w indywidualnie wentylowanych klatkach, w standardowych 12-godzinnych warunkach światła/ciemności.
    3. Ogol okolice brzucha zwierząt, aby ograniczyć utratę sygnału. Nie używaj kremu do depilacji, ponieważ może on szybko poparzyć skórę zwierząt. Skrępuj zwierzę, mocno trzymając kark i tylne kończyny ręką niedominującą, jednocześnie goląc się ręką dominującą. Alternatywnie należy golić się w znieczuleniu izofluranowym.
      UWAGA: Zwierzęta zostały ogolone 2 dni przed obrazowaniem, biorąc pod uwagę, że zwierzęta będą jeszcze bardziej pielęgnować ogolony obszar.
    4. Zapewnij wodę i standardowe jedzenie ad libitum przez cały czas trwania eksperymentu. Należy jednak pozbawić zwierzęta wody na 2 godziny przed wkropleniem, aby zminimalizować objętość pęcherza podczas wkraplania.
    5. Zamontować sterylną końcówkę angioctiwa 24 G na strzykawce o pojemności 100 μl i napełnić strzykawkę roztworem bakteryjnym przygotowanym w kroku 1.5.3.
      UWAGA: Aby określić luminescencję tła, przed wkropleniem uzyskaj obraz linii bazowej (patrz krok 3 poniżej).
  2. Wciąganie zwierząt
    1. Umieścić zwierzęta w komorze indukcyjnej i znieczulić je za pomocą inhalacji izofluranu z czystym tlenem jako gazem nośnym (indukcja w stężeniu 3% i utrzymanie w stężeniu 1,5%).
    2. Umieścić jedno zwierzę na powierzchni roboczej w pozycji leżącej na plecach i utrzymywać stabilne znieczulenie izofluranem za pomocą stożka nosowego podczas wkraplania. Nałóż maść do oczu.
    3. Wydal zalegający mocz, stosując delikatny ucisk i wykonując okrężne ruchy w okolicy nadłonowej. Przed wkropleniem oczyść dolną część brzucha 70% etanolem.
    4. Nasmaruj końcówkę cewnika zwykłą solą fizjologiczną. Połóż palec wskazujący ręki niedominującej na brzuchu i delikatnie popchnij go do góry. Rozpocznij cewnikowanie cewki moczowej pod kątem 90° (w pionie), a po napotkaniu oporu przechyl ją w poziomie przed włożeniem jej dalej (0,5 cm).
      UWAGA: Nigdy nie wciskaj cewnika na siłę, ponieważ spowoduje to uszkodzenie cewki moczowej. Delikatne ruchy obrotowe mogą być pomocne we wprowadzaniu cewnika. Z drugiej strony brak oporu zwykle wskazuje na błędne wprowadzenie do pochwy.
    5. Wykonać powolne (5 μl/s) wkraplanie 50 μl inokulum bakteryjnego (2 x 107 CFU).
      UWAGA: Większe objętości lub szybsze wkraplanie mogą powodować refluks do nerek. Podczas praktyki tej techniki niebieski atrament może być używany do oceny refluksu.
    6. Po wkropleniu należy przytrzymać strzykawkę i cewnik na miejscu jeszcze przez kilka sekund, a następnie powoli wycofać, aby zapobiec wyciekowi. Rejestruj wszelkie nieprawidłowości, takie jak duża ilość wycieku lub krwawy ujści, i w razie potrzeby wyklucz zwierzęta.
    7. Ułożyć zwierzę w pozycji leżącej na stożku nosowym komory obrazowania i powtórzyć poprzednie czynności 2.1.1–2.1.6 dla wszystkich pozostałych zwierząt. Użyj jednego cewnika na grupę eksperymentalną. Upewnij się, że znieczulenie jest kontynuowane i zminimalizuj czas między pierwszym a ostatnim zwierzęciem.
    8. W razie potrzeby należy podać antybiotyki lub leki eksperymentalne przed lub po obrazowaniu (krok 3). Na przykład, aby podać enrofloksacynę, dodaj 40 μl roztworu enrofloksacyny (100 mg/ml) do 3,96 ml soli fizjologicznej, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100. Wstrzyknąć 100 μl/10 g podskórnie o godz. 9 rano i 17 po południu, aby podawać 10 mg/kg enrofloksacyny dwa razy na dobę przez 3 dni.

3. Obrazowanie bioluminescencyjne

  1. Przygotowanie i dobór parametrów obrazowania
    1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji BLI (patrz Tabela materiałów) i kliknij Inicjalizuj w urządzeniu do obrazowania (patrz Tabela materiałów), aby przetestować kamerę i system kontrolera stage oraz schłodzić kamerę CCD do -90 °C.
      UWAGA: Podczas tego procesu drzwi są zablokowane, a postęp inicjalizacji można śledzić na panelu sterowania. Zielone światło oznacza, że osiągnięto temperaturę -90 °C. Ostrzeżenie pojawi się, jeśli próba obrazowania zostanie podjęta przed zakończeniem inicjalizacji.
    2. Upewnij się, że dane są zapisywane automatycznie: Kliknij akwizycję Automatycznie zapisz w i wybierz odpowiedni folder.
    3. Wybierz Luminescencja i Zdjęcie. Sprawdź domyślne ustawienia luminescencji: Ustaw filtr wzbudzenia na Blok, a filtr emisji na Otwarty.
    4. Ustaw czas ekspozycji na Auto podczas robienia pierwszego zdjęcia, zwłaszcza gdy spodziewasz się przyciemnionego sygnału, aby zapewnić odpowiednią liczbę fotonów. W przypadku pomiarów in vivo i jasnych sygnałów ustaw czas ekspozycji na ~30 s. Jeśli obraz jest nasycony, pojawi się ostrzeżenie. Jeśli tak się stanie, skróć czas ekspozycji.
    5. Wybierz średnie Binning, F/stop 1 i wybierz odpowiednie pole view (FOV) (D dla 5 zwierząt).
    6. Ustaw wysokość obiektu na 1 cm podczas obrazowania myszy.
    7. Kliknij przycisk Dodaj trzy razy w Panelu sterowania pobieraniem, aby uzyskać sekwencję trzech obrazów w miarę replikacji technicznych.
  2. Obrazowania
    1. Umieść myszy w komorze obrazowania w pozycji leżącej na plecach i użyj stożka nosowego kolektora, aby utrzymać znieczulenie (izofluran 1,5%) przez cały czas trwania eksperymentu. Zobrazuj do 5 myszy jednocześnie i oddziel zwierzęta za pomocą przegrody świetlnej, aby zapobiec odbiciom.
    2. Zamknij drzwi i kliknij Pobierz, aby rozpocząć sekwencję obrazowania.
    3. Uzupełnij szczegółowe informacje o eksperymencie (zwierzęta typu dzikiego i nokautowego, zabiegi, dzień obrazowania itp.). Ustawienia obrazowania, takie jak czas ekspozycji, są zapisywane automatycznie.
    4. Wyjmij myszy z komory obrazowania i umieść je z powrotem w klatce. Sprawdź, czy po znieczuleniu nastąpiła pełna rekonwalescencja. W ciągu kilku minut zwierzęta powinny być w pełni przytomne i eksploracyjne. Nie podawaj analgezji, ponieważ może to zakłócić kurs UTI 18.
    5. Umieść klatki z powrotem w wentylowanych stojakach do następnego cyklu obrazowania. Po zakończeniu eksperymentu poddać zwierzęta eutanazji przez uduszenie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy. Należy to zrobić przed przywróceniem do zdrowia po znieczuleniu izofluranem, aby zminimalizować stres.
  3. Analiza obrazów
    1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania i załaduj plik eksperymentalny, klikając przycisk Przeglądaj.
    2. Użyj palety narzędzi, aby dostosować skalę kolorów obrazu. Ustandaryzuj wizualny aspekt wyników, używając tych samych ustawień dla wszystkich obrazów, tj. użyj skali logarytmicznej z minimum 104 do maksimum 107 fotonów. Korekty te nie mają wpływu na dane surowe, a jedynie na prezentację graficzną.
    3. Użyj narzędzi ROI, aby narysować obszar zainteresowania (ROI) na obrazie. Upewnij się, że zwrot z inwestycji jest wystarczająco duży, aby pokryć cały obszar i użyj tych samych wymiarów dla wszystkich obrazów. W tym przypadku kwadratowy ROI o wymiarach 3,5 cm x 4,5 cm został umieszczony nad dolną częścią brzucha.
    4. Kliknij pomiar ROI, aby określić ilościowo natężenie światła (liczby lub całkowity strumień fotonów). Wyeksportuj te dane i użyj średniej z kontrprób technicznych.
      UWAGA: Liczby reprezentują liczbę fotonów wykrytych przez kamerę i powinny być używane wyłącznie do kontroli jakości obrazu. Aby raportować dane, użyj całkowitego strumienia fotonów. Całkowity strumień fotonów jest bardziej istotny fizjologicznie, ponieważ reprezentuje światło emitowane z powierzchni i jest skalibrowaną jednostką, która jest korygowana o czas ekspozycji (na sekundę).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

In vivo BLI koreluje z liczbą CFU inokulum w momencie podania.
Aby ocenić granicę wykrywalności BLI in vivo oraz korelację z liczbą CFU inokulum, myszy zainfekowano różnymi stężeniami UTI89-lux oraz PBS jako kontrolą negatywną. Przed podaniem preparatu zainfekowane zwierzęta poddano skanowaniu w celu określenia luminescencji tła. Kolejne obrazy uzyskano bezpośrednio po podaniu (Rycina 1A). Po podaniu UTI89-lux biolumin...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zalety BLI w porównaniu z liczeniem CFU
Dane dotyczące zmian w czasie
Główną wadą tradycyjnej metody liczenia CFU w celu ilościowego określenia obciążenia mikrobiologicznego jest wymóg stosowania pośmiertnych homogenatów narządów, dostarczających tylko jeden punkt danych przekroju poprzecznego na zwierzę. Z drugiej strony, BLI umożliwia nieinwazyjną obserwację podłużną zakażonych zwierząt. Zwierzęta mogą być obrazowane 2 do 3 razy dziennie, co zapewnia szczegółowy wgląd w kinetykę infe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Badawczej - Flandria (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Rada Naukowa KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. i W.E.) oraz VIB (do T.V.). W.E. jest starszym badaczem klinicznym Fundacji Badawczej we Flandrii (FWO Vlaanderen). Szczep UTI89-lux był hojnym prezentem od laboratorium prof. Seeda13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa płaska płytka polistyrenowaCorning3925do obrazowania in vitro
Trymer do włosów Aesculap ISISAesculapGT421, z nasadką GT608
Waporyzator anestezjologicznyAparat Harvard ograniczonyNie dotyczyhttps://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mlBayerNie dotyczyEnrofloksacyna
BD Insyte Autoguard 24 GABD382912Żółty angiocewnik, użyj sterylnej plastikowej końcówki do wkraplania
myszy C57Bl/6JJanvierN/A
5804REppendorfEP022628146
Dropsense 16Unchained LabsTrineando pomiaru OD 600nm
buforowany fosforanem Dulbecco Sól fizjologiczna, GibcoThermoFisher ScientificREF 14040-083
Etanol 70% denaturowany 5LVWR international85825360
Falcon 14ml Probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, zatrzaskCorning352057
Falcon 50ml cellstartGreiner227285
Hamilton GASTIGHT, PTFE Luer lock, 100 µ LSigma-Aldrich26203zapewniający powolne wkraplanie bakteryjne 50 &mikro; L
Uchwyt pętli inokulacyjnejRoth6174.1: Art. Nr 6189.1
Iso-Vet 1000mg/gDechra Produkty weterynaryjneN/AIsoflurane
IVIS Spectrum In Vivo System obrazowaniaPerkinElmerREF 124262Urządzenie do obrazowania
Roztwór kanamycyny 50 mg / mlSigma-AldrichCAS 25389-94-0
Żywe oprogramowanie do obrazowaniaPerkinElmerN/ABLI, wersja 4.7.3
Luria Bulion BertaniSigma-AldrichREF L3022alternatywnie można przygotować
bulion Luria Bertani z agaremSigma-AldrichREF L2897alternatywnie można przygotować
szalkę Petriego Sterilin 90mmThermoFisher Scientific101VR20do napełnienia agarem LB uzupełnionym
kolbą Km Pyrex Culture 250 mlSigma-AldrichSLW1141/08-20EA
Slide 200 TrineanUnchained Labs701-2007do pomiaru OD 600nm
UTI89-luxN/AN/AHojny prezent od prof. Seed
VortexVWR international444-1372
Wirówka Oprogramowanie do akwizycji

Bibliografia

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
  2. O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128(2016).
  3. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
  6. Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
  7. Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
  8. Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
  9. Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
  10. Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
  11. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  12. Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
  13. Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
  14. Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257(2018).
  15. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  16. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
  17. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798(1998).
  18. Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
  19. Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123(2019).
  20. Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
  21. Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
  22. Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
  23. Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
  24. Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239(2015).
  25. Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zakażenie dróg moczowychmodel zakażenia dróg moczowych u myszyoznaczanie ilości bakteriijednostki tworzące kolonieleczenie antybiotykamiobrazowanie in vivokinetyka zakażeniainstylacja do pęcherza moczowego
Podłużna obserwacja zakażeń dróg moczowych i ich leczenie u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.