Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62620

⸱

14 sierpnia 2021

 ,  , 
1Developmental Biology Laboratory, Histology and Embryology Department, Faculty of Medicine, Universidad de la República, 2Cell and Molecular Neurobiology Laboratory, Clemente Estable Biology Research Institute (IIBCE), Ministerio de Educación y Cultura

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Streszczenie

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest wyspecjalizowanym punktem kontaktu między nerwem ruchowym a mięśniem szkieletowym. Ta synapsa obwodowa wykazuje wysoką plastyczność morfologiczną i funkcjonalną. W wielu zaburzeniach układu nerwowego NMJ jest wczesnym patologicznym celem powodującym niewydolność neuroprzekaźnictwa, osłabienie, atrofię, a nawet śmierć włókien mięśniowych. Ze względu na swoje znaczenie, możliwość ilościowej oceny niektórych aspektów relacji między komponentami NMJ może pomóc w zrozumieniu procesów związanych z jego montażem/demontażem. Pierwszą przeszkodą podczas pracy z mięśniami jest zdobycie wiedzy technicznej, aby szybko zidentyfikować i przeanalizować bez uszkadzania ich włókien. Drugim wyzwaniem jest wykorzystanie wysokiej jakości metod detekcji w celu uzyskania obrazów NMJ, które można wykorzystać do przeprowadzenia analizy ilościowej. W artykule przedstawiono krok po kroku protokół preparowania mięśni prostownika długiego palca i płaszczkowatego mięśni grzbietowych szczurów. Wyjaśnia również zastosowanie immunofluorescencji do wizualizacji elementów pre i postsynaptycznych NMJ z całą górą. Uzyskane wyniki pokazują, że technika ta może być wykorzystana do ustalenia mikroskopowej anatomii synapsy i identyfikacji subtelnych zmian w stanie niektórych jej składników w warunkach fizjologicznych lub patologicznych.

Wprowadzenie

Połączenie nerwowo-mięśniowe ssaków (NMJ) to duża cholinergiczna trójdzielna synapsa składająca się z zakończenia nerwowego neuronu ruchowego, błony postsynaptycznej na włóknie mięśnia szkieletowego i końcowych komórek Schwanna1,2,3. Synapsa ta wykazuje wysoką plastyczność morfologiczną i funkcjonalną4,5,6,7,8, nawet w wieku dorosłym, kiedy NMJ mogą ulegać dynamicznym modyfikacjom strukturalnym. Na przykład, niektórzy badacze wykazali, że zakończenia nerwów ruchowych nieustannie zmieniają swój kształt w skali mikrometrowej9. Doniesiono również, że morfologia NMJ reaguje na wymagania funkcjonalne, zmienione użytkowanie, starzenie się, ćwiczenia lub zmiany aktywności lokomotorycznej4,10,11,12,13,14,15. Tak więc trening i brak użycia stanowią niezbędny bodziec do modyfikacji niektórych cech NMJ, takich jak jego rozmiar, długość, dyspersja pęcherzyków synaptycznych i receptorów, a także rozgałęzienie zakończeń nerwowych14,16,17,18,19,20.

Ponadto, wykazano, że jakakolwiek zmiana strukturalna lub degeneracja tego ważnego połączenia może spowodować śmierć komórek neuronu ruchowego i zanik mięśni21. Uważa się również, że zmieniona komunikacja między nerwami i mięśniami może być odpowiedzialna za fizjologiczne zmiany NMJ związane z wiekiem i prawdopodobnie za jego zniszczenie w stanach patologicznych. Demontaż połączeń nerwowo-mięśniowych odgrywa kluczową rolę w wystąpieniu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), choroby neurodegeneracyjnej, która stanowi jeden z najlepszych przykładów upośledzonej interakcji mięśniowo-nerwowej3. Pomimo licznych badań przeprowadzonych nad dysfunkcją neuronu ruchowego, nadal toczy się dyskusja, czy pogorszenie obserwowane w ALS występuje z powodu bezpośredniego uszkodzenia neuronu ruchowego, a następnie rozciąga się na projekcje korowo-rdzeniowe22; lub czy należy to uznać za dystalną aksonopatię, w której zwyrodnienie zaczyna się w zakończeniach nerwowych i postępuje w kierunku neuronu ruchowego somas23,24. Biorąc pod uwagę złożoność patologii ALS, logiczne jest uznanie, że zachodzi mieszanka niezależnych procesów. Ponieważ NMJ jest głównym graczem w fizjopatologicznej interakcji między mięśniami a nerwami, jego destabilizacja stanowi kluczowy punkt w pochodzeniu choroby, który jest istotny do analizy.

Układ nerwowo-mięśniowy ssaków jest funkcjonalnie zorganizowany w odrębne jednostki motoryczne, składające się z neuronu ruchowego i włókien mięśniowych, które są unerwione wyłącznie przez jego zakończenie nerwowe. Każda jednostka motoryczna ma włókna o podobnych lub identycznych właściwościach strukturalnych i funkcjonalnych25. Selektywna rekrutacja neuronów ruchowych pozwala zoptymalizować reakcję mięśni na wymagania funkcjonalne. Teraz jasne jest, że mięśnie szkieletowe ssaków składają się z czterech różnych typów włókien. Niektóre mięśnie są nazwane zgodnie z cechami ich najliczniejszego rodzaju włókna. Na przykład mięsień płaszczkowaty (mięsień tylny kończyny biorący udział w utrzymaniu postawy ciała) ma większość jednostek wolnokurczliwych (typ 1) i jest rozpoznawany jako mięsień wolny. Zamiast tego prostownik długi palca (EDL) składa się zasadniczo z jednostek o podobnych właściwościach szybkokurczliwych (włókna typu 2) i jest znany jako szybki mięsień wyspecjalizowany w ruchach fazowych potrzebnych do poruszania się. Innymi słowy, chociaż dorosłe mięśnie są z natury plastyczne ze względu na wpływy hormonalne i nerwowe, ich skład włókien determinuje zdolność do wykonywania różnych czynności, co widać u mięśnia płaszczkowatego, który doświadcza ciągłej aktywności o niskiej intensywności i EDL, który wykazuje szybszy pojedynczy skurcz. Inne cechy, które są zmienne między różnymi typami włókien mięśniowych, są związane z ich budową (zawartość mitochondriów, wydłużenie retikulum sarkoplazmatycznego, grubość linii Z), zawartość ATPazy miozyny i skład łańcucha ciężkiego miozyny26,27,28,29.

Dla gryzoni NMJ istnieją znaczące różnice między mięśniami28,29. Analizy morfometryczne przeprowadzone w mięśniu płaszczkowatym i EDL od szczurów wykazały dodatnią korelację między obszarem synaptycznym a średnicą włókien (tj. obszar synaptyczny w wolnych włóknach płaszczkowatych jest większy niż w szybkich włóknach EDL), ale stosunek między powierzchnią NMJ a rozmiarem włókien jest podobny w obu mięśniach30,31. Ponadto, w odniesieniu do zakończeń nerwowych, bezwzględne obszary płytki końcowej we włóknach typu 1 były niższe niż we włóknach typu 2, podczas gdy normalizacja przez średnicę włókien sprawiła, że obszary zakończeń nerwowych we włóknach typu 1 były największe32.

Jednak bardzo niewiele badań skupia się na analizie morfometrycznej, aby pokazać dowody zmian w niektórych składnikach NMJ33,34. Tak więc, ze względu na znaczenie NMJ w funkcjonowaniu organizmu, którego morfologia i fizjologia są zmieniane w różnych patologiach, ważne jest, aby zoptymalizować protokoły preparacji różnych typów mięśni o jakości wystarczającej do umożliwienia wizualizacji całej struktury NMJ. Konieczna jest również ocena występowania zmian pre lub postsynaptycznych w różnych sytuacjach lub warunkach eksperymentalnych, takich jak starzenie się lub ćwiczenia35,36,37,38. Ponadto pomocne może być udowodnienie bardziej subtelnych zmian w składnikach NMJ, takich jak zmieniona fosforylacja neurofilamentów w końcowych zakończeniach nerwowych, jak opisano w ALS39.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Ustawy Narodowej nr 18611 o opiece nad zwierzętami wykorzystywanymi do celów doświadczalnych. Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Etyczną (CEUA IIBCE, Protokół nr 004/09/2015).

1. Rozwarstwienie mięśni (Dzień 1)

UWAGA: Zanim zaczniesz, przygotuj 40 ml 0,5% paraformaldehydu (PFA), pH 7,4 w soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS). Opcjonalnie przygotuj 20 ml 4% PFA. Przygotować 5 ml porcji i zamrozić w temperaturze -20 °C. W dniu rozbioru rozmrozić 4% podwielokrotność i dodać 35 ml DPBS, aby uzyskać 40 ml 0,5% PFA.

  1. Izolacja EDL (mięsień szybkokurczliwy)
    1. Poddaj szczura eutanazji. Ułóż zwierzę z brzuchem skierowanym do góry. Wykonaj wstępne nacięcie za pomocą ostrza chirurgicznego między palcami u nóg w kierunku kończyny tylnej.
      UWAGA: W tym przypadku podano dootrzewnowe wstrzyknięcie 90:10 mg/kg ketaminy:ksylazyny w celu eutanazji szczura, ale dozwolone są również inne opcje znieczulenia.
    2. Zdejmij skórę, ciągnąc ją do góry, aż kolano szczura zostanie odsłonięte.
    3. Aby znaleźć EDL, podążaj za ścięgnami stopy aż do więzadła pierścieniowego. To więzadło okrąża dwa ścięgna. Przetnij więzadło między dwoma ścięgnami za pomocą nożyczek jednopasmowych (lub podobnych). Zidentyfikuj ścięgno EDL, unosząc oba i wybierz ten, który sprawia, że palce u nóg poruszają się w górę.
    4. Przetnij ścięgno nożyczkami uniband. Następnie, trzymając ścięgno delikatną pęsetą biologiczną, zacznij powoli oddzielać mięsień EDL od mięśnia piszczelowego przedniego, strzałkowego brevis i mięśnia strzałkowego długiego class<="xref">40 (patrz Rysunek 1A).
      UWAGA: Upewnij się, że mięsień jest oddzielony bez żadnych uszkodzeń. Zrób to, przecinając resztę mięśni bocznych, aby otworzyć drogę między nimi (EDL nie ma powierzchownej lokalizacji), jednocześnie trzymając i podnosząc mięsień EDL.
    5. Aby całkowicie odizolować mięsień, przetnij ścięgno przyczepione do kolana szczura za pomocą nożyczek uniband.
    6. Zanurzyć wypreparowany mięsień w 5 ml 0,5% PFA i pozostawić na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Opcjonalnie zszyć mięsień w kawałku tektury i obrócić go mięśniem skierowanym w dół. Następnie zanurz go całkowicie w 8 ml roztworu utrwalającego. Ten krok pomaga w utrzymaniu wydłużonego mięśnia podczas procesu utrwalania.
  2. Izolacja mięśnia płaszczkowatego (mięsień wolnokurczliwy)
    1. Odwróć zwierzę (brzuch jest teraz skierowany w dół). Przez skórę przetnij ścięgno piętowe za pomocą ostrza chirurgicznego.
    2. Za pomocą pęsety biologicznej i nożyczek uniband oddziel mięsień brzuchaty łydki od kości, tworząc "muskularną pokrywę". Płaszczkowaty będzie znajdował się po wewnętrznej stronie muskularnej powieki. Można go zidentyfikować, ponieważ ma czerwony kolor i płaską morfologię.
    3. Za pomocą pęsety biologicznej dosięgnij i unieś ścięgno płaszczkowate, które leży nad mięśniem brzuchatym łydki (patrz Rysunek 1B).
    4. Przetnij ścięgno nożyczkami uniband. Podnieś cały mięsień, jednocześnie przecinając niektóre słabe punkty przyczepu (tj. elementy nerwowo-naczyniowe). Na koniec, aby całkowicie uwolnić mięsień płaszczkowaty, przetnij pęczek płaszczkowaty, który tworzy ścięgno piętowe, za pomocą nożyczek uniband.
    5. Powtórz krok 1.1.6, aby naprawić wycięty mięsień płaszczkowaty.

2. Przygotowanie drażnionego błonnika (Dzień 2)

  1. Po 24 godzinach utrwalenia przepłukać mięśnie 6 ml roztworu DPBS 3x po 10 minut przed wyizolowaniem włókien mięśniowych.
  2. Aby wyizolować włókna, umieść mięsień na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego delikatnie przytrzymaj jedno ze ścięgien jedną parą pęsety biologicznej. Następnie, za pomocą innej pęsety biologicznej, zacznij powoli szczypać ścięgno, aby oddzielić włókna mięśniowe. Następnie powoli pociągnij uszczypniętą tkankę w górę w kierunku przeciwległego ścięgna mięśniowego. Konieczne będzie powtórzenie tej czynności kilka razy, aż do uzyskania wielu małych, izolowanych wiązek.
  3. Umieść je ostrożnie na wstępnie przygotowanym szkiełku (silanizowanym). Konieczne jest utrzymanie wszystkich włókien w porządku, aby nie zachodziły na siebie. W tym momencie susz włókna na powietrzu przez 24 godziny.

3. Immunofluorescencja

  1. Inkubacja przeciwciał pierwotnych (dzień 3)
    UWAGA: Wszystkie kroki zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Najskuteczniejszym sposobem usunięcia różnych roztworów bez odrywania włókien od szkiełka jest użycie strzykawki insulinowej.
    1. Aby rozpocząć proces barwienia immunologicznego, należy otoczyć wysuszone izolowane włókna mięśniowe pisakiem, aby stworzyć wodoodporną barierę.
    2. Aby nawodnić włókna mięśniowe, dodaj 200 μl wody destylowanej przez 5 minut, a następnie zmień wodę na 200 μl DPBS na kolejne 5 minut inkubacji. W tym momencie rozpocznij znakowanie immunofluorescencyjne.
    3. Inkubować włókna z 300 μl buforu blokującego (BB) zawierającego 50 mM glicyny, 1% BSA i 1% Triton X-100 przez 30 minut.
    4. Zastąp BB przeciwciałem pierwszorzędowym w stężeniu sugerowanym przez producentów. Użyj kulki, aby rozcieńczyć przeciwciało. W tym eksperymencie użyto 400 μl SMI 32 lub SMI 31, które rozpoznawały niefosforylowany (Nf) lub fosforylowany (Phos-Nf) neurofilament H w rozcieńczeniu 1/800 w celu wykrycia składnika presynaptycznego NMJ.
      UWAGA: Decydując się na rozpoznanie całego elementu presynaptycznego zamiast oceny fosforylacji neurofilamentów, wybierz przeciwciała przeciwko synapsynie, synaptofizynie lub SV2a, które były wcześniej z powodzeniem stosowane.
    5. Inkubować włókna z pierwotnym rozcieńczeniem przeciwciała w temperaturze 4 °C przez noc (opcjonalnie inkubację można przeprowadzić w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę). W obu przypadkach ważne będzie wykonanie inkubacji w wilgotnej komorze.
  2. Immunofluorescencja: Drugorzędowa inkubacja przeciwciał (dzień 4)
    1. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przepłucz włókna 3x po 10 minut 500 μL DPBS i ostatni raz BB.
    2. Usuń to ostatnie płukanie i dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w BB. W tym eksperymencie użyto 500 μl koziego anty-mysiego Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu 1/1000 w BB. Aby wyświetlić element postsynaptyczny NMJ, do drugorzędowego rozcieńczenia przeciwciała dodano koniugat biotyny 1:300 ><α-bungarotoksyny (Btx) biotyny-XX. UWAGA: Dodatek Btx-biotyny XX pozwala na uzyskanie lepszych obrazów stosunku sygnału do szumu po wykryciu za pomocą streptawidyny, która wzmacnia sygnał. Ponadto koniugacja streptawidyny z różnymi fluoroforami zwiększyła kombinacje kolorów w testach wspólnego znakowania. Alternatywnie, znakowane fluorescencyjnie Btx pozwala na uzyskanie obrazów o podobnej jakości.
    3. Inkubować przeciwciało drugorzędowe i Btx przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 1 godzinę w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.
    4. Usunąć przeciwciało drugorzędowe i Btx. Przemyć 3x po 10 minut 500 μL DPBS i ostatnie płukanie BB.
    5. Inkubować z 500 μl streptawidyny Alexa Fluor 555 w rozcieńczeniu 1:1000 z BB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W tym momencie, jeśli jest to pożądane, dodaj sondę, aby przeciwdziałać barwieniu jąder, taką jak diaminofenylindol o końcowym stężeniu 1 μg/ml.
    6. Usunąć roztwór inkubacyjny i przemyć włókna 3x po 10 minut 500 μl DPBS. Następnie zamontuj włókna.
  3. Montażu
    1. Umieść 4 kropki przezroczystego lakieru do paznokci na szkiełku mikroskopowym tak, jakby były wierzchołkami kwadratu. Pozostaw do wyschnięcia na 1-2 minuty. Będą to punkty, w których szkiełka nakrywkowe będą spoczywać, co pomoże uniknąć zgniecenia tkanki.
    2. Usuń ostatnie pranie DPBS i dodaj wystarczającą ilość materiału montażowego (~ 200 μL), aby pokryć włókna; unikać suszenia.
      UWAGA: Aby przygotować 10 ml mieszanki pożywek montażowych, użyj Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerol w proporcji 4:1 (v:v).
    3. Użyj końcówki do pipety o pojemności 200 μl, aby ostrożnie rozprowadzić materiał montażowy na włóknach, aby zapewnić całkowite zanurzenie ich wszystkich. Przed umieszczeniem szkła nakrywkowego usuń pęcherzyki powietrza.
    4. Umieścić szkiełko nakrywkowe na próbkach, starając się zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Ten ruch można wykonać za pomocą kleszczy.

4. Mikroskopia i analiza morfometryczna

  1. Zobrazuj drażnione preparaty włókien za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej.
  2. Wykonaj serię odcinków optycznych (stosy Z 30 μm) w całej synapsie w odstępie jednego mikrometra. Aby ustawić stos, użyj sygnału Btx. Wyobraź sobie co najmniej 15-20 NMJ dla każdego stanu mięśni w rozdzielczości 2048 x 2048 px. Metoda ta została wybrana w celu uzyskania obrazów o wystarczającej jakości optycznej i rozdzielczości do analizy morfometrycznej.
  3. Aby wykonać pomiary, użyj obrazów projekcyjnych stosów z dowolnym oprogramowaniem analitycznym.
    UWAGA: Chociaż wyjaśniona analiza morfometryczna została przeprowadzona ręcznie, istnieją dwa niedawno opracowane narzędzia oparte na obrazie J do badania wielu różnych aspektów pre i postsynaptycznej morfologii NMJ33,34.
  4. Aby uzyskać wartości całkowitego obszaru NMJ, wybierz zewnętrzną krawędź (zewnętrzny kontur zabarwionego obszaru, patrz Rysunek 2) płyty końcowej za pomocą narzędzia Photoshop Magnetic lasso i określ liczbę wybranych pikseli w oknie Histogramu. Następnie obszary pikseli można przekonwertować na mikrometry kwadratowe przy użyciu skali określonej przez oprogramowanie konfokalne.
  5. Za pomocą tego samego narzędzia lasso wybierz wewnętrzną krawędź (kontury poplamionego obszaru w obrębie płyty końcowej, patrz Rysunek 2) i określ niepoplamiony obszar w całej strukturze (lub pusty obszar), jak opisano powyżej (krok 4.4.). Wartości obszaru postsynaptycznego zostaną uzyskane po odjęciu całkowitej powierzchni od pustego obszaru każdego NMJ.
  6. Uzyskaj obszar presynaptyczny, który definiuje się jako obszar z immunofluorescencją anty-neurofilamentową, w podobny sposób, jak całkowity obszar NMJ.
    UWAGA: Wszystkie te parametry wykorzystano do określenia wskaźnika gęstości postsynaptycznej (obszar postsynaptyczny/obszar całkowity) oraz pokrycia NMJ (obszar presynaptyczny/obszar postsynaptyczny). Wyższy wskaźnik gęstości postsynaptycznej oznacza gęstszą - lub bardziej zwartą - płytkę końcową, podczas gdy mniejsze pokrycie NMJ odzwierciedla znacznie gorszą interakcję między zakończeniem nerwowym a płytką końcową (obie zgodne z procesem denerwacji). W przedstawionym przypadku, ponieważ uodpornione i nieufosforylowane formy neurofilamentów wykryto na poziomie zakończeń nerwowych, obliczono stosunek fosforylowanych/niefosforylowanych sygnałów presynaptycznych oraz stosunek pokrycia fosforylowanego/niefosforylowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia prostą metodę izolacji i immunostainowania włókien mięśniowych pochodzących z dwóch różnych typów mięśni (mięśni szybkokurczliwych i wolnokurczliwych, patrz Rycina 1). Wykorzystując odpowiednie markery i/lub sondy, można wykrywać i oceniać komponenty połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) z punktu widzenia ilościowego, aby ocenić niektóre zmiany morfologiczne, które mogą wystąpić w następstwie postępu choroby lub specyficznego leczenia farmakologicznego. W niniej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół preparacji dwóch mięśni szkieletowych szczura (jednego wolnokurczliwego, a drugiego szybkokurczliwego), izolacji mięśni włóknistych oraz immunofluorescencyjnego wykrywania markerów pre i postsynaptycznych w celu ilościowej oceny zmian NMJ oraz procesów składania/demontażu. Ten rodzaj protokołu może być przydatny w modelach gryzoni41,42 do oceny NMJ podczas procesów fizjologicznych lub patologicznych, czego przykła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wielkie podziękowania dla CSIC i PEDECIBA za wsparcie finansowe udzielone tej pracy; dla Natalii Rosano za jej poprawki w rękopisie; dla Marcelo Casacuberta, który stworzył film i dla Nicolása Bolatto za użyczenie swojego głosu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowy z chłodnym oświetleniem świetlnymNikonSMZ-10A
Platforma bujanaBiometra (WT 16)042-500
Szkła nakrywkowe (24 x 32 mm)Preparaty mikroskopowe DeltalabD102432
Premium (Plus)Pęseta PORLABPC-201-16
FST11253-20
Uniband LA-4C Nożyczki 125mmE.M.S77910-26
Jednorazowe ostrza chirurgiczne #10Sakira Medical1567
Jednorazowa sterylna strzykawka (1 ml)Sakira Medical1569
Super PAP długopisE.M.S71310
100 μ l lub 200 μ l pipetaFinnpipette9400130
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H szczuryTaconic2148-M
1X PBS (Dulbecco)Gibco21600-010
ParaformaldehydSigma158127
Triton X-100SigmaT8787
GlicynaAmresco167
BSABio Basic INC.9048-46-8
GlicerolMallinckrodt5092
TrisAmresco497
Oczyszczony anty-neurofilament H (NF-H), Fosforylowane przeciwciałoBioLegend801601Poprzednio Covance # SMI 31P
Oczyszczony anty-neurofilament H (NF-H), niefosforylowane przeciwciałoBioLegend801701poprzednio Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 koza anty-mysia IgG (H+L)Thermo ScientificA11029
α-Bungarotoxin, koniugat biotyny-XXInvitrogenB1196
Streptawidyna, Alexa Fluor 555 koniugatInvitrogenS32355
Diaminophenylindol (DAPI)SigmaD8417

Bibliografia

  1. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
  2. Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
  3. Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
  4. Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
  5. Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
  6. Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
  7. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
  8. Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
  9. Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
  10. Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
  11. Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
  12. Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
  13. Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
  14. Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
  15. Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
  16. Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
  17. Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
  18. Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
  19. Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
  20. Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
  21. Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
  22. Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
  23. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
  24. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
  25. Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
  26. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  27. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  28. Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
  29. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240(2016).
  30. Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
  31. Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
  32. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
  33. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
  34. Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
  35. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482(2018).
  36. Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948(2014).
  37. Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460(2013).
  38. Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162(2014).
  39. Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
  40. Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
  41. Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072(2018).
  42. Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
  43. Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

złącze neuromięśniowesekcja włókna mięśniowegoanaliza immunofluorescencyjnaanaliza morfometrycznapreparaty całych tkanekmikroskopia konfokalnaelementy presynaptyczneelementy postsynaptycznetransgeniczne modele zwierzęce
Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.