Artykuł metodologiczny

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

DOI:

10.3791/62651

⸱

6 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipleksowanie umożliwia ocenę kilku markerów na tej samej tkance, zapewniając jednocześnie kontekst przestrzenny. Technologie Spatial Omics umożliwiają multipleksowanie zarówno białek, jak i RNA, wykorzystując odpowiednio fotorozszczepialne oligotagowane przeciwciała i sondy. Oligonukleotydy są rozszczepiane i oznaczane ilościowo z określonych regionów w tkance, aby wyjaśnić podstawową biologię. W tym przypadku badanie pokazuje, że zautomatyzowane niestandardowe protokoły wizualizacji przeciwciał mogą być wykorzystywane do kierowania wyborem ROI w połączeniu z przestrzennymi testami proteomicznymi. Ta konkretna metoda nie wykazała akceptowalnej wydajności w testach transkryptomiki przestrzennej. Protokół opisuje opracowanie testu immunofluorescencyjnego 3-plex (IF) do wizualizacji markerów na zautomatyzowanej platformie, wykorzystującego wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA) do wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego z danego docelowego białka i zwiększenia puli przeciwciał do wyboru. Protokół wizualizacji został zautomatyzowany przy użyciu dokładnie zwalidowanego testu 3-plex, aby zapewnić jakość i odtwarzalność. Ponadto oceniono wymianę DAPI na barwniki SYTO, aby umożliwić obrazowanie testów IF opartych na TSA na platformie profilowania przestrzennego. Dodatkowo przetestowaliśmy możliwość wyboru małych ROI za pomocą testu transkryptomiki przestrzennej, aby umożliwić badanie wysoce specyficznych obszarów zainteresowania (np. obszarów wzbogaconych o dany typ komórki). Zebrano ROI o średnicy 50 μm i 300 μm, co odpowiada odpowiednio około 15 i 100 ogniwom. Próbki umieszczono w bibliotekach i zsekwencjonowano w celu zbadania zdolności do wykrywania sygnałów z małych ROI i regionów tkanki specyficznych dla profilu. Ustaliliśmy, że technologie proteomiki przestrzennej czerpią duże korzyści ze zautomatyzowanych, ustandaryzowanych protokołów, które kierują wyborem zwrotu z inwestycji. Chociaż ten protokół automatycznej wizualizacji nie był kompatybilny z testami transkryptomiki przestrzennej, byliśmy w stanie przetestować i potwierdzić, że określone populacje komórek można z powodzeniem wykryć nawet w małych ROI za pomocą standardowego protokołu ręcznej wizualizacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w technikach multipleksowania nadal dostarczają lepszych narzędzi do charakteryzowania celów obecnych w nowotworach. Mikrośrodowisko nowotworu (TME) to złożony system komórek nowotworowych, naciekających komórki odpornościowe i zrębu, w którym informacje przestrzenne mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia i interpretacji mechanizmów interakcji między interesującymi biomarkerami1. Dzięki nowym technikom, takim jak GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) i 10x Visium, wiele obiektów może być wykrywanych i określanych ilościowo jednocześnie w ich kontekście przestrzennym. Zastosowanie protokołów immunofluorescencyjnych, które ułatwiają wizualizację tkanek, może jeszcze bardziej poprawić możliwości tych technologii w zakresie profilowania przestrzennego.

Technologia Spatial Omiics, na której skupiliśmy się przy opracowywaniu tej metody, składa się z testów proteomiki przestrzennej i transkryptomiki, w których oligonukleotydy są przyłączane do przeciwciał lub sond RNA za pomocą światłoczułego łącznika światłoczułego na promieniowanie UV. Preparaty histologiczne są znakowane tymi oligo-sprzężonymi przeciwciałami lub sondami, a następnie obrazowane na platformie do profilowania przestrzennego. Następnie do oświetlenia wybierane są ROI o różnych rozmiarach i kształtach, a fotorozszczepione oligonukleotydy są odsysane i zbierane na 96-dołkowej płytce. Fotorozszczepione oligonukleotydy są przygotowywane do ilościowego oznaczania za pomocą systemu Nanostring nCounter lub sekwencjonowania nowej generacji (NGS)2,3 (Rysunek 1)4,5.

Rozmieszczenie komórek różni się w obrębie tkanek, a możliwość scharakteryzowania konkretnych lokalizacji komórek za pomocą wybranych markerów i różnych wielkości ROI jest bardzo ważna dla pełnego zrozumienia środowiska tkankowego i identyfikacji specyficznych cech. We wspomnianej tutaj technologii Spatial Omiics standardowy protokół wizualizacji wykorzystuje bezpośrednio sprzężone przeciwciała i jest protokołem ręcznym. Standardowymi markerami do rozróżnienia guza i zrębu są panCytokeratyna (panCK) i CD456,7, ale dodatkowe markery są niezbędne do celowania w określone populacje komórek będących przedmiotem zainteresowania. Co więcej, stosowanie bezpośrednio sprzężonych przeciwciał fluorescencyjnych nie ma amplifikacji, co ogranicza selekcję przeciwciał do licznych markerów. Ponadto testy ręczne podlegają większej zmienności niż zautomatyzowane przepływy pracy8. Dlatego pożądane jest posiadanie konfigurowalnego, zautomatyzowanego i wzmocnionego protokołu wizualizacji do wyboru zwrotu z inwestycji.

Tutaj badanie pokazuje, że do przestrzennych testów proteomicznych, technologia TSA może być używana do protokołów wizualizacji na zautomatyzowanej platformie, co skutkuje bardziej ukierunkowanym i ustandaryzowanym testem. Ponadto testy oparte na TSA umożliwiają stosowanie markerów o niskiej ekspresji, zwiększając zakres celów, które można wybrać do wizualizacji. Test 3-plex dla panCK, FAP i przeciwciała X został opracowany przy użyciu zautomatyzowanej platformy, na której wykorzystano panCK i FAP do rozróżnienia odpowiednio guza i zrębu. Przeciwciało X jest białkiem zrębu często spotykanym w nowotworach, ale jego biologia i wpływ na odporność przeciwnowotworową nie są w pełni poznane. Scharakteryzowanie tekstury immunologicznej w obszarach bogatych w przeciwciało X może wyjaśnić jego rolę w odporności przeciwnowotworowej i odpowiedzi terapeutycznej, a także jego potencjał jako celu dla leków.

Podczas gdy niestandardowe zautomatyzowane panele wizualizacji TSA okazały się skuteczne w testach proteomiki przestrzennej, zastosowanie tych testów do testów transkryptomicznych przestrzennych nie mogło zostać potwierdzone. Jest to najprawdopodobniej spowodowane odczynnikami i protokołem używanym w protokołach automatycznej wizualizacji, które wydają się zagrażać integralności RNA. Uznanie, że zautomatyzowany protokół etykietowania markerów wizualizacyjnych może być stosowany do przestrzennych testów proteomicznych, ale nie do przestrzennych testów transkryptomicznych, dostarcza ważnych wskazówek dotyczących projektów testów technologii Spatial Omics.

Dodatkowo, badanie pokazuje, że przestrzenny test transkryptomiczny może być używany do profilowania celów w regionach o średnicy 50 μm, czyli około 15 komórek. Wybrano dwa ROI o różnych rozmiarach, aby przetestować zdolność testu do wykrywania transkryptów w małych ROI. Dla każdego regionu zainteresowania zebrano oligonukleotydy odpowiadające 1800 celom mRNA i umieszczono je w bibliotekach zgodnie z protokołem platformy profilowania przestrzennego. Biblioteki były indywidualnie indeksowane, a następnie łączone w pule i sekwencjonowane. Pozwoliło to na ocenę zarówno wydajności łączenia, jak i zdolności do identyfikacji określonych populacji komórek w małych zwrotach z inwestycji.

Ten artykuł pokazuje, że dla przestrzennych testów proteomicznych, zautomatyzowany protokół do kierowania wyborem ROI na konkretnych markerach zainteresowania może być wykorzystany do selektywnego ukierunkowania badania odpowiednich obszarów tkanki i scharakteryzowania środowiska przestrzennego tkanki. Ponadto wykazujemy, że mniejsze ROI mogą być wykorzystywane do przestrzennych testów transkryptomicznych w celu wykrycia i scharakteryzowania określonych populacji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie ludzkie tkanki zostały pozyskane z komercyjnych biobanków lub akredytowanych banków tkanek pod gwarancją, że uzyskano odpowiednią zgodę i świadomą zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.

UWAGA: Protokół jest wykonywany przy użyciu Discovery Ultra i GeoMx Digital Spatial Profiler. Szczegółowe informacje na temat odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Protokół automatycznej wizualizacji dla przestrzennych testów proteomicznych

  1. Zaprogramuj autostainer do stosowania przeciwciał fluorescencyjnych wizualizacji
    1. W oprogramowaniu autostainer kliknij przycisk home i wybierz Protokoły. Następnie kliknij Utwórz/Edytuj protokoły i wybierz RUO DISCOVERY Universal jako procedurę.
    2. Kliknij Pierwsza sekwencja > Depafanizacja > Depar v2. W przypadku średniej temperatury wybierz 72 stopnie C, a następnie kliknij Obróbka wstępna i wybierz Kondycjonowanie komórek i Zbiornik CC1. W przypadku bardzo wysokiej temperatury wybierz 100 stopni C, a następnie kliknij CC1 8 min i kontynuuj klikanie, aż zostanie wybrana CC1 64 min.
    3. Kliknij Inhibitor > Inhibitor DISCOVERY, a w polu Czas inkubacji wybierz 8 minut. Następnie kliknij Przeciwciało > inkubacji w wysokiej temperaturze Ab; dla niskiej temperatury wybierz 37 stopni C; W polu Przeciwciało wybierz numer przeciwciała z etykiety dozownika (w tym przykładzie Przeciwciało 6); dla Plus Incubation Time (Czas inkubacji Plus) wybierz 32 Minutes.
      UWAGA: Ten protokół ma trzy różne liczby przeciwciał. Pierwszym przeciwciałem jest FAP, drugim Pan-Cytokeratyna, a trzecim przeciwciało X.
    4. Kliknij Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz 4 minuty. Następnie, w odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap anty-Rb HRP, a w polu Czas inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij Cy5 i dla Długi czas inkubacji wybierz 0 godz. 8 min.
    5. Kliknij Podwójna sekwencja i wybierz Denaturacja przeciwciał, a następnie wybierz Przeciwciało denaturacja CC2-1, a dla Bardzo wysoka temperatura wybierz 100 stopni C. Upewnij się, że czas inkubacji wynosi 8 minut. Następnie kliknij DS Inhibitor i wybierz Neutralizuj.
    6. Kliknij na DS Antibody, a dla Very Low Temperature wybierz 37 Deg C. Następnie w polu Przeciwciało wybierz numer przeciwciała z etykiety dozownika (w tym przykładzie Przeciwciało 3), a w polu Plus Czas inkubacji wybierz opcję 32 minuty.
    7. Kliknij na DS Multimer HRP i wybierz DS Multimer HRP Blocker. Następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz opcję Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz opcję 4 minuty. Następnie, na odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap anty-Ms HRP, a dla czasu inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij DS Rhodamine 6G i dla Długi czas inkubacji wybierz 0 Hr 8 Min.
    8. Kliknij Potrójne barwienie i wybierz Denaturacja przeciwciał TS, a następnie wybierz Denaturacja przeciwciał CC2-2, a dla Bardzo wysoka temperatura wybierz 100 stopni C. Upewnij się, że czas inkubacji wynosi 8 minut. Następnie kliknij TS Inhibitor i wybierz TS Neutralize.
    9. Kliknij na TS Antibody, a dla Very Low Temperature (Bardzo niska temperatura) wybierz 37 Deg C. Następnie w polu Przeciwciało wybierz numer przeciwciała z etykiety dozownika (w tym przykładzie przeciwciało 7), a następnie w polu Plus Incubation Time (Czas inkubacji Plus) wybierz opcję 32 minuty.
    10. Kliknij na TS Multimer HRP i wybierz TS Multimer HRP Blocker. Następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz opcję Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz opcję 4 minuty. Następnie, w odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap anty-Rb HRP, a w polu Czas inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij TS FAM i dla Długi czas inkubacji wybierz 0 godz. 8 min.
    11. Dodaj tytuł do protokołu. Wybierz numer protokołu, dodaj komentarz i kliknij Aktywny, a następnie Zapisz.
  2. Przygotuj slajdy, wydrukuj etykiety i uruchom autostainer
    1. Sprzedawca wypieków zakupił skrawki tkanek ludzkich FFPE (utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie) w piecu ustawionym na 70 °C na 20-60 minut. Podczas pieczenia slajdów drukuj etykiety, klikając Utwórz etykietę w oprogramowaniu automatycznego stainera. Następnie kliknij Protokoły, wybierz numer protokołu i kliknij Zamknij/Drukuj. Dodaj odpowiednie informacje na etykiecie slajdu i kliknij Drukuj.
    2. Wyjmij szkiełka z piekarnika i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej (RT). Zastosuj poprzednio wydrukowane etykiety protokołu do odpowiednich slajdów.
    3. Załadować dozowniki przeciwciał wielokrotnego napełniania przeciwciałami zgodnie z numerem etykiety przeciwciała przypisanym w kroku 1.1. W tym protokole należy użyć przeciwciała 6 dla FAP w stężeniu 1 μg/ml, przeciwciała 3 dla pan-cytokeratyny w stężeniu 0,1 μg/ml i przeciwciała 7 dla przeciwciała X w stężeniu 2,5 μg/ml. Rozcieńczyć każde przeciwciało w określonym rozcieńczalniku i zalać dozowniki przeciwciał wielokrotnego napełniania.
    4. Zbierz wspomniane powyżej wstępnie napełnione dozowniki odczynników blokujących, wykrywających i wzmacniających i umieść je na tacy na odczynniki. Załaduj slajdy do tac na slajdy (do 30 slajdów na przebieg) i kliknij Bieganie, a następnie Tak. Należy pamiętać, że DAPI nie jest używany do barwienia jądrowego.
    5. Potwierdź rozpoczęcie cyklu, sprawdzając czas trwania w oprogramowaniu autostainera. Wykonanie protokołu zajmuje ~11 godzin i może działać w nocy.
    6. Następnego dnia upewnij się, że przebieg został zakończony, obserwując zielone światła na szczelinach tacy na slajdy. Następnie zdejmij szkiełka z instrumentu i energicznie przepłucz szkiełka w 1x buforze reakcyjnym, aż płynny roztwór szkiełka nakrywkowego zostanie całkowicie usunięty.
  3. Protokół platformy profilowania przestrzennego do oznaczania proteomiki
    1. Postępuj zgodnie z protokołem proteomiki przestrzennej wskazanym w poniższej uwadze. Uwzględnij następujące zmiany w protokole, aby umożliwić procedurę automatycznego etykietowania 3-plex.
    2. Wykonaj kroki 1.2.1-1.2.6 dzień przed rozpoczęciem protokołu proteomiki przestrzennej i przejdź bezpośrednio do etapu pobierania antygenu protokołu proteomiki przestrzennej po wykonaniu kroku 1.2.6. Pomiń procedurę wizualizacji opisaną w protokole proteomiki profilowania przestrzennego.
    3. Zastąp SYTO 13 SYTO 64 przy 5000 nM, aby umożliwić integrację fluoroforu. Rozcieńczyć SYTO 64 w 1x TBS i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 15 min.
    4. Podczas ustawiania parametrów skanowania na platformie profilowania przestrzennego należy wybrać filtry i kanały ostrości zgodnie z fluoroforami używanymi w panelu wizualizacji, aby umożliwić integrację 3-plex. Użyj FITC dla DISCOVERY FAM i ustaw ekspozycję na 200 ms, użyj Cy3 dla DISCOVERY Rhodamine 6G i ustaw ekspozycję na 200 ms, użyj Texas Red dla SYTO 64 i ustaw ekspozycję na 50 ms (określ to jako kanał ostrości), a na koniec użyj Cy5 dla DISCOVERY Cy5, ustaw ekspozycję na 200 ms, i zapisz zmiany.
      UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące protokołu proteomiki profilowania przestrzennego znajdują się na oficjalnej stronie internetowej zakładka Wsparcie po wybraniu Dokumentacja > Podręczniki użytkownika. Tutaj poszukaj protokołu białkowego dla nCounter przy użyciu Bond RX.

2. Wybór ROI dla przestrzennych testów transkryptomicznych

  1. Sekcje granulek komórek FFPE piec w piekarniku nastawionym na 70 °C przez 20-60 min. Postępuj zgodnie z protokołem NGS platformy do profilowania przestrzennego wskazanym w poniższej notatce i skanuj slajdy na platformie do profilowania przestrzennego, wybierając rozmiary 50 μm i 300 μm. Podkreślono następujące zalecenie dotyczące testu transkryptomiki przestrzennej:
    1. Przygotowując bibliotekę, jeśli wybrano różne rozmiary ROI, zsumuj ROI o podobnych rozmiarach, aby utworzyć jedną bibliotekę na rozmiar. Ma to na celu zapewnienie, że dla wszystkich zwrotów z inwestycji zostaną osiągnięte wystarczające głębokości sekwencjonowania bez odchyleń od rozmiaru.
      UWAGA: Szczegółowa instrukcja obsługi platformy do profilowania przestrzennego znajduje się na oficjalnej stronie internetowej w zakładce Wsparcie po wybraniu opcji Dokumentacja > Instrukcje obsługi. Tutaj poszukaj protokołu RNA dla aplikacji NGS przy użyciu Bond RX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół automatycznej wizualizacji do wyboru ROI
W tym artykule przedstawiamy wykorzystanie zautomatyzowanego, niestandardowego protokołu IF opartego na TSA do wizualizacji tkanki i wyboru określonych ROI. Opracowanie panelu wizualizacyjnego z wykorzystaniem czerniaka i normalnej skóry ludzkiej jako tkanek kontrolnych składało się z badania stabilności epitopów, dostrojenia intensywności markerów i oceny krwawienia poprzez kontrolę bez jednego z nich. Aby sprawdzić, czy na stabilność epitopową przec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory bezpośrednio sprzężone przeciwciała fluorescencyjne w protokole ręcznym są najczęściej używane jako panele wizualizacyjne dla proteomiki przestrzennej lub przestrzennych testów transkryptomicznych 9,10. Jednak zastosowanie bezpośrednio sprzężonych przeciwciał fluorescencyjnych może być wyzwaniem w przypadku mniej licznych markerów, co ogranicza wybór odpowiednich przeciwciał. Protokół ten pokazuje, że etykietowanie markerów wizualizacyjnych można zaut...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan i Sandra Rost są pracownikami i akcjonariuszami firmy Genentech, należącej do Grupy Roche. Inne firmy, które są częścią Roche, produkują odczynniki i instrumenty używane w tym manuskrypcie. Ciara Martin jest pełnoetatowym pracownikiem firmy NanoString Technologies Inc., która produkuje odczynniki i instrumenty użyte w tym manuskrypcie.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Thomasowi Wu za przetwarzanie plików NGS. Dziękujemy Jamesowi Ziai za dyskusję na temat wyników i recenzję manuskryptu oraz Meredith Triplet i Rachel Taylor za wewnętrzną korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)Technologie sygnalizacji komórkowej12498SRozcieńczony do 1x TBS w wodzie uzdatnionej DEPC
Przeciwciało X (nieujawnione)przeciwciało zaślepione ze względu na poufność
Woda uzdatniona DEPCThermoFisherAM9922Można użyć innego
Kondycjonowanie komórek DISCOVERY (CC1)Ventana950-500
DISCOVERY Cy5 KitVentana760-238określany jako Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243określany jako FAM
DISCOVERY Goat Ig BlockVentana760-6008określany jako Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anty-Ms HRPVentana760-4310określany jako OMap anty-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anty-Rb HRPVentana760-4311Określany jako OMap anty-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244Określany jako Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automatyczny system przygotowania preparatówVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSOkreślany jako autostainer w rękopisie
FAP [EPR20021] PrzeciwciałoAbcamAb207178
GeoMx Cyfrowy profiler przestrzenny NanoStringGMX-DSP-1YOkreślany jako platforma do profilowania przestrzennego na manuskrypcie
Komora wilgotnościowaSimportM920-2Inny może być użyty
Przeciwciało Pan-cytokeratyny [AE1/AE3]AbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonPythonAnaliza statystyczna
Bufor reakcyjny (10x)Ventana950-300
Oprogramowanie do analizy statystycznejGraphPadPrism 7Analiza statystyczna
SYTO 64ThermoFisherS11346
Kondycjonowanie komórek ULTRA (ULTRA CC2)Ventana950-223
Rozcieńczalnik przeciwciał Ventana z kazeinąVentana760-219Określany jako określony rozcieńczalnik w manuskrypcie
Ventana Dozownik przeciwciał pierwotnychVentanaNumer katalogowy zależy od numeru dozownika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
  3. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
  4. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
  5. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
  6. McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
  7. McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
  8. Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  9. Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783(2020).
  10. Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
  11. Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
  12. Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
  13. Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448(2020).
  14. Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
  15. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
  16. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  17. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  18. Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
  19. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456(2021).
  20. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
  21. Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Omika przestrzennaproteomika przestrzennatranskryptomika przestrzennaobszar zainteresowaniamultipleksowa immunofluorescencjaamplifikacja sygna u tyramidowegozautomatyzowany protok wizualizacjiprofilowanie ekspresji bia ekprofilowanie ekspresji RNAutrwalone w formalinie i zalane w parafinie

Powiązane artykuły