Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Veronica Ibarra-Lopez; Sangeeta Jayakar; Yeqing Angela Yang; Ciara Martin; Zora Modrusan; Sandra Rost

doi:10.3791/62651

Artykuł metodologiczny

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

DOI:

10.3791/62651

⸱

6 lipca 2022

Veronica Ibarra-Lopez¹ , Sangeeta Jayakar¹ , Yeqing Angela Yang² , Ciara Martin³ , Zora Modrusan² , Sandra Rost¹

¹Department of Pathology, Genentech, ²Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, ³NanoString Technologies

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipleksowanie umożliwia ocenę kilku markerów na tej samej tkance, zapewniając jednocześnie kontekst przestrzenny. Technologie Spatial Omics umożliwiają multipleksowanie zarówno białek, jak i RNA, wykorzystując odpowiednio fotorozszczepialne oligotagowane przeciwciała i sondy. Oligonukleotydy są rozszczepiane i oznaczane ilościowo z określonych regionów w tkance, aby wyjaśnić podstawową biologię. W tym przypadku badanie pokazuje, że zautomatyzowane niestandardowe protokoły wizualizacji przeciwciał mogą być wykorzystywane do kierowania wyborem ROI w połączeniu z przestrzennymi testami proteomicznymi. Ta konkretna metoda nie wykazała akceptowalnej wydajności w testach transkryptomiki przestrzennej. Protokół opisuje opracowanie testu immunofluorescencyjnego 3-plex (IF) do wizualizacji markerów na zautomatyzowanej platformie, wykorzystującego wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA) do wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego z danego docelowego białka i zwiększenia puli przeciwciał do wyboru. Protokół wizualizacji został zautomatyzowany przy użyciu dokładnie zwalidowanego testu 3-plex, aby zapewnić jakość i odtwarzalność. Ponadto oceniono wymianę DAPI na barwniki SYTO, aby umożliwić obrazowanie testów IF opartych na TSA na platformie profilowania przestrzennego. Dodatkowo przetestowaliśmy możliwość wyboru małych ROI za pomocą testu transkryptomiki przestrzennej, aby umożliwić badanie wysoce specyficznych obszarów zainteresowania (np. obszarów wzbogaconych o dany typ komórki). Zebrano ROI o średnicy 50 μm i 300 μm, co odpowiada odpowiednio około 15 i 100 ogniwom. Próbki umieszczono w bibliotekach i zsekwencjonowano w celu zbadania zdolności do wykrywania sygnałów z małych ROI i regionów tkanki specyficznych dla profilu. Ustaliliśmy, że technologie proteomiki przestrzennej czerpią duże korzyści ze zautomatyzowanych, ustandaryzowanych protokołów, które kierują wyborem zwrotu z inwestycji. Chociaż ten protokół automatycznej wizualizacji nie był kompatybilny z testami transkryptomiki przestrzennej, byliśmy w stanie przetestować i potwierdzić, że określone populacje komórek można z powodzeniem wykryć nawet w małych ROI za pomocą standardowego protokołu ręcznej wizualizacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w technikach multipleksowania nadal dostarczają lepszych narzędzi do charakteryzowania celów obecnych w nowotworach. Mikrośrodowisko nowotworu (TME) to złożony system komórek nowotworowych, naciekających komórki odpornościowe i zrębu, w którym informacje przestrzenne mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia i interpretacji mechanizmów interakcji między interesującymi biomarkerami¹. Dzięki nowym technikom, takim jak GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) i 10x Visium, wiele obiektów może być wykrywanych i określanych ilościowo jednocześnie w ich kontekście przestrzennym. Zastosowanie protokołów immunofluorescencyjnych, które ułatwi....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie ludzkie tkanki zostały pozyskane z komercyjnych biobanków lub akredytowanych banków tkanek pod gwarancją, że uzyskano odpowiednią zgodę i świadomą zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.

UWAGA: Protokół jest wykonywany przy użyciu Discovery Ultra i GeoMx Digital Spatial Profiler. Szczegółowe informacje na temat odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Protokół automatycznej wizualizacji dla przestrzennych testów proteomicznych

Zaprogramuj autostainer do stosowania przeciwciał fluorescencyjnych w....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół automatycznej wizualizacji do wyboru ROI
W tym artykule przedstawiamy wykorzystanie zautomatyzowanego, niestandardowego protokołu IF opartego na TSA do wizualizacji tkanki i wyboru określonych ROI. Opracowanie panelu wizualizacyjnego z wykorzystaniem czerniaka i normalnej skóry ludzkiej jako tkanek kontrolnych składało się z badania stabilności epitopów, dostrojenia intensywności markerów i oceny krwawienia poprzez kontrolę bez jednego z nich. Aby sprawdzić, czy na stabilność epitopową przec.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory bezpośrednio sprzężone przeciwciała fluorescencyjne w protokole ręcznym są najczęściej używane jako panele wizualizacyjne dla proteomiki przestrzennej lub przestrzennych testów transkryptomicznych ^9,10. Jednak zastosowanie bezpośrednio sprzężonych przeciwciał fluorescencyjnych może być wyzwaniem w przypadku mniej licznych markerów, co ogranicza wybór odpowiednich przeciwciał. Protokół ten pokazuje, że etykietowanie markerów wizualizacyjnych można zaut.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan i Sandra Rost są pracownikami i akcjonariuszami firmy Genentech, należącej do Grupy Roche. Inne firmy, które są częścią Roche, produkują odczynniki i instrumenty używane w tym manuskrypcie. Ciara Martin jest pełnoetatowym pracownikiem firmy NanoString Technologies Inc., która produkuje odczynniki i instrumenty użyte w tym manuskrypcie.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Thomasowi Wu za przetwarzanie plików NGS. Dziękujemy Jamesowi Ziai za dyskusję na temat wyników i recenzję manuskryptu oraz Meredith Triplet i Rachel Taylor za wewnętrzną korektę manuskryptu.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)	Technologie sygnalizacji komórkowej	12498S	Rozcieńczony do 1x TBS w wodzie uzdatnionej DEPC
Przeciwciało X (nieujawnione)			przeciwciało zaślepione ze względu na poufność
Woda uzdatniona DEPC	ThermoFisher	AM9922	Można użyć innego
Kondycjonowanie komórek DISCOVERY (CC1)	Ventana	950-500
DISCOVERY Cy5 Kit	Ventana	760-238	określany jako Cy5
DISCOVERY FAM Kit	Ventana	760-243	określany jako FAM
DISCOVERY Goat Ig Block	Ventana	760-6008	określany jako Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anty-Ms HRP	Ventana	760-4310	określany jako OMap anty-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anty-Rb HRP	Ventana	760-4311	Określany jako OMap anty-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit	Ventana	760-244	Określany jako Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automatyczny system przygotowania preparatów	Ventana	05 987 750 001 / N750-DISU-FS	Określany jako autostainer w rękopisie
FAP [EPR20021] Przeciwciało	Abcam	Ab207178
GeoMx Cyfrowy profiler przestrzenny NanoString		GMX-DSP-1Y	Określany jako platforma do profilowania przestrzennego na manuskrypcie
Komora wilgotnościowa	Simport	M920-2	Inny może być użyty
Przeciwciało Pan-cytokeratyny [AE1/AE3]	Abcam	Ab27988
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Python	Python		Analiza statystyczna
Bufor reakcyjny (10x)	Ventana	950-300
Oprogramowanie do analizy statystycznej	GraphPad	Prism 7	Analiza statystyczna
SYTO 64	ThermoFisher	S11346
Kondycjonowanie komórek ULTRA (ULTRA CC2)	Ventana	950-223
Rozcieńczalnik przeciwciał Ventana z kazeiną	Ventana	760-219	Określany jako określony rozcieńczalnik w manuskrypcie
Ventana Dozownik przeciwciał pierwotnych	Ventana		Numer katalogowy zależy od numeru dozownika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Omika przestrzenna proteomika przestrzenna transkryptomika przestrzenna obszar zainteresowania multipleksowa immunofluorescencja amplifikacja sygna u tyramidowego zautomatyzowany protok wizualizacji profilowanie ekspresji bia ek profilowanie ekspresji RNA utrwalone w formalinie i zalane w parafinie

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły