Method Article

Nieinwazyjna metoda generowania modelu uszkodzenia chrząstki stawowej w kolanie szczura wywołanego cyklicznym obciążeniem

DOI:

10.3791/62660

⸱

July 5th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Development and Rehabilitation of Motor Function, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 2Department of Motor Function Analysis, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy model uszkodzenia chrząstki śródstawowej w kolanie szczura wywołany cyklicznym obciążeniem, generowany przez 60 cyklicznych uciśnięć powyżej 20 N, skutkujących uszkodzeniem chrząstki kłykciowej kości udowej u szczurów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patofizjologia pierwotnej choroby zwyrodnieniowej stawów (OA) pozostaje niejasna. Jednak specyficzna podklasyfikacja choroby zwyrodnieniowej stawów w stosunkowo młodszych grupach wiekowych jest prawdopodobnie skorelowana z historią uszkodzenia chrząstki stawowej i zwichnięcia więzadła. Chirurgiczne modele zwierzęce choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego odgrywają ważną rolę w zrozumieniu początku i postępu pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów oraz pomagają w opracowywaniu nowych terapii tej choroby. Jednak ostatnio rozważano modele niechirurgiczne, aby uniknąć urazowego stanu zapalnego, który mógłby wpłynąć na ocenę interwencji.

W tym badaniu opracowano model szczura uszkodzenia chrząstki wewnątrzstawowej wywołany cyklicznym obciążeniem kompresyjnym in vivo, co pozwoliło badaczom (1) określić optymalną wielkość, prędkość i czas trwania obciążenia, które mogłoby spowodować ogniskowe uszkodzenie chrząstki; (2) ocenić pourazowe czasoprzestrzenno-patologiczne zmiany w żywotności chondrocytów; oraz (3) ocenić ekspresję histologiczną destrukcyjnych lub ochronnych cząsteczek, które biorą udział w mechanizmach adaptacji i naprawy przeciwko obciążeniom ściskającym stawy. W niniejszym raporcie opisano protokół eksperymentalny dla tej nowej zmiany chrząstki w modelu szczurzym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjnie, przecięcie więzadła krzyżowego przedniego (ACL) lub destabilizacja łąkotki przyśrodkowej była uważana za optymalną do badania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA) u małych zwierząt. W ostatnich latach do badania PTOA wykorzystano nieinwazyjne modele kompresji cyklicznej. Model ten został pierwotnie zaprojektowany do zbadania reakcji kości gąbczastej na obciążenie mechaniczne1, a następnie został zmodyfikowany jako niechirurgiczny model zwierzęcy do badań PTOA2,3,4,5,6. Uzasadnieniem jest zderzenie chrząstki stawowej poprzez zastosowanie okresowej siły zewnętrznej, która wyzwala szereg reakcji zapalnych. Jednak model ten został zastosowany tylko do myszy, a odpowiednia wielkość obciążenia większych zwierząt nie została omówiona.

Innym problemem poprzedniego modelu jest to, że protokół dużej objętości zawierał zbyt wiele cykli, co powodowało nadmierne pogrubienie kości podchrzęstnej, co było niepożądanym efektem ubocznym, w kilku próbkach7. W związku z tym opracowano nowatorską metodę cyklicznej kompresji o odpowiedniej wielkości dla dużych zwierząt i niższym obciążeniu efektu ubocznego8. Ogólnym celem niniejszego artykułu jest opisanie protokołu nieinwazyjnego modelu cyklicznej kompresji u szczurów oraz obserwacja reprezentatywnych wyników degeneracji chrząstki. Obecny protokół pomógłby czytelnikom zainteresowanym zastosowaniem nieinwazyjnego modelu kompresji cyklicznej na szczurach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zatwierdzony przez Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu w Kioto (numer zatwierdzenia: Med kyo 17616).

1. Wykonaj in vivo cykliczne uciskanie kolana szczura

  1. Wywołaj eksperymentalne znieczulenie zwierząt
    1. Wywołać znieczulenie u 12-tygodniowego szczura rasy Wistar (256,8 ± 8,7 g) poprzez inhalację 5% roztworu izofluranu w pudełku anestezjologicznym.
    2. Dootrzewnowo wstrzyknąć mieszaninę trzech środków znieczulających9, w tym medetomidynę, midazolam i butorfanol, w dawce 2 mg/kg masy ciała szczura i ogolić obszar wokół prawego stawu kolanowego. Potwierdź wystarczające znieczulenie przez brak odruchu pedałowania do uszczypnięcia palca.
  2. Zamontuj znieczulonego szczura na urządzeniu mocującym.
    1. Umieść znieczulonego szczura leżącego na brzuchu na płytce podstawy (Rysunek 1), z prawym kolanem przymocowanym do małego kawałka żywicy z wklęsłym rowkiem. Umieść prawą tylną kończynę w pozycji wyprostu bioder, zgięcia kolana i wyprostu kostki, z kolanem zgiętym pod kątem około 140°. Dopasuj piętę szczura do rowka w kształcie klina na ruchomym uchwycie.
    2. Przesunąć urządzenie mocujące do przyrządu do prób naprężeń/rozciągania (patrz Tabela materiałów). Po upewnieniu się, że nie ma styków z ogniwem obciążnikowym, otwórz oprogramowanie sterujące przyrządu do prób naprężeniowych/rozciągania (Tabela materiałów) i kliknij przycisk Kalibracja. Po kalibracji ostrożnie przymocuj górną część ramy do ogniwa obciążnikowego. Aby staw kolanowy był ściśle przymocowany do ramy, powoli włączaj pokrętło na ruchomym głównym panelu operacyjnym, aż obciążenie wstępne osiągnie 5 N.
  3. Zbuduj metodę ładowania i skonfiguruj test ściskania.
    1. W menu głównym kliknij Utwórz nową metodę | Etykieta systemu. Ustaw Tryb testowy na Cykl, a Typ testu na Kompresja. Kliknij etykietę czujnika i wybierz zakładkę Test, aby sprawdzić, czy limit mieści się w granicach 60 N. Ponadto wybierz kartę Skok i sprawdź, czy limit mieści się w zakresie 500 mm.
      UWAGA: Powyższy krok spowoduje natychmiastowe zatrzymanie operacji, jeśli w punkcie naprężenia występuje duże przemieszczenie.
    2. Pod etykietą Testowanie kontrolki wybierz Pochodzenie wzrostu, aby uruchomić program główny z 0,3%/pełną skalą. Spośród czterech sekcji w cyklu ładowania, ustaw kontrolowaną prędkość skoku w sekcjach 1i 3 na 1 mm/s. Ustaw maksymalną siłę testową w 2. sekcji na 20 N, a minimalną siłę testową w 4. sekcji na 5 N. Ustaw "Czas utrzymywania" na 0,5 s dla obciążenia szczytowego i 10 s dla minimalnego obciążenia (Rysunek 2).
      UWAGA: Ponieważ ten krok definiuje każdy cykl, upewnij się, że powierzchnie stawów stykają się ze sobą i poruszają się z rozsądną prędkością oraz że ruch jest utrzymany.
    3. Na karcie Wstępne ładowanie u dołu strony upewnij się, że zaznaczona jest opcja Włącz, prędkość usuwania ugięcia jest ustawiona na 100 mm/min, a maksymalna siła to 5 N. Na etykiecie Próbka ustaw Materiał jako Metal.
      UWAGA: Te szczegółowe ustawienia mogą być specyficzne dla każdego producenta.
    4. W menu głównym, w sekcji Wybierz metodę i test, wybierz metodę, która została właśnie utworzona, a następnie kliknij Start, aby rozpocząć test.
      UWAGA: Tabela na dole przedstawia rzeczywiste pomiary obciążenia szczytowego i przemieszczenia.
    5. Ustaw liczbę cykli na 60.
      UWAGA: Cała sesja ładowania obejmuje 60 cykli, które trwają około 12 minut. W grupie kontrolnej szczury były poddawane wstępnemu obciążeniu 5 N przez 12 minut wstępnego obciążenia w tych samych warunkach.
  4. Po załadowaniu włóż szczura z powrotem do klatki i monitoruj, aż do pełnego wyzdrowienia. Utrzymuj 12-12 godzin światła i ciemności w klatce z wystarczającą ilością miejsca i pokarmem ad libitum. Po wymaganych okresach doświadczalnych należy złożyć szczury w ofierze z przedawkowaniem mieszaniny trzech środków znieczulających wstrzykniętych dootrzewnowo lub inhalacji dwutlenkiem węgla w celu analizy (1 godzina-8 tygodni).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano reprezentatywny wynik krótkoterminowych zmian (1 h i 12 h) w żywotności chondrocytów w próbkach poddanych cyklicznemu obciążeniu 20 N. Jak pokazano w Rysunek 3, liczba martwych chondrocytów (czerwona fluorescencja) wzrosła po 12 godzinach od urazu. I odwrotnie, liczba żywych chondrocytów (zielona fluorescencja) nadal spadała, a niektóre próbki nie zawierały żywych chondrocytów w dotkniętym obszarze.

Histologia wykazała, że chrząstka stawowa kolan szczura,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po raz pierwszy obecny protokół pokazuje, jak ustalić model uszkodzenia chrząstki wywołanej obciążeniem na bocznym kłykciu kości udowej u szczurów, podobny do modelu uszkodzenia śródstawowego u mniejszych gryzoni, takich jak mysz2. Jednak protokół ładowania u myszy spowodował poważne tworzenie się osteofitów i uszkodzenia więzadła krzyżowego, co nie było idealne do oceny skutków cyklicznej kompresji. Obecny protokół stworzył ogniskową zmianę chrząstki u szczurów o znacznie mniejszej sile obciążeni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez grant JSPS KAKENHI (numery JP18H03129 i JP18K19739).
Badania te otrzymały również finansowanie od Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), który jest wspierany przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver (NICHD), Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) oraz Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (NIBIB) Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer P2CHD086843. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aparatura anestezjologiczna dla małych zwierzątSHINANO MFG CO., LTD.SN-487-0T
Autograph AG-XShimadzu CorpN.A.Precyzyjny tester uniwersalny / rozciągający
Mikroskop Fluoview FV10iOlympus CorpN.A.W pełni zautomatyzowany konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop
ISOFLURAN roztwór do inhalacjiPfizer Japan Inc.(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity KitThermo Fisher Scientific Japan IncL3224Szybki i łatwy dwukolorowy test do określania żywotności komórek
Oprogramowanie TRAPEZIUM XShimadzu CorpN.A.Oprogramowanie do przetwarzania danych dla Autograph AG-X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
  2. Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
  3. Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
  4. Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
  5. Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
  6. Adebayo, O. O., et al. Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).
  7. Ko, F. C., et al. In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae. Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).
  8. Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
  9. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
  10. Iijima, H., et al. Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model. Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cyclic LoadingCartilage Lesion ModelRat KneeIntra Articular CartilageOsteoarthritis ModelNon Invasive MethodChondrocyte ViabilityMechanical LoadingCompression TestingPost Traumatic Osteoarthritis

Related Articles