Artykuł metodologiczny

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

DOI:

10.3791/62667

⸱

25 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne rzęski (PC) to nieruchome, dynamiczne organelle oparte na mikrotubulach, które wystają z powierzchni większości komórek ssaków. Wyłaniają się ze starszej centrioli podczas fazy G1/G0 cyklu komórkowego, podczas gdy rozkładają się, gdy komórki ponownie wchodzą w cykl komórkowy na granicy faz G2/M. Działają jako węzły sygnałowe, wykrywając i przekazując sygnały zewnątrzkomórkowe kluczowe dla wielu procesów komórkowych. Podobnie jak w przypadku większości typów komórek, wykazano, że wszystkie neuronalne komórki macierzyste i progenitorowe (NSPC) kory nowej są wyposażone w PC, co pozwala im wyczuwać i przekazywać określone sygnały wymagane do prawidłowego rozwoju kory mózgowej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły do generowania i charakteryzowania dwuwymiarowych (2D) i trójwymiarowych (3D) modeli komórkowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) w celu dalszej analizy udziału PC podczas rozwoju kory nowej. W szczególności przedstawiamy protokoły do badania biogenezy i funkcji PC w NSPC pochodzących z rozety neuronalnej 2D, w tym transdukcji szlaku Sonic Hedgehog (SHH). Aby wykorzystać trójwymiarową (3D) organizację organoidów mózgowych, opisujemy prostą metodę obrazowania 3D organoidów mózgowych barwionych in toto immuno. Po oczyszczeniu optycznym, szybka akwizycja całych organoidów pozwala na wykrycie zarówno centrosomów, jak i PC na przodkach kory nowej i neuronach całego organoidu. Na koniec szczegółowo opisujemy procedurę barwienia immunologicznego i oczyszczania grubych, swobodnie unoszących się skrawków organoidów, zachowując znaczny stopień informacji przestrzennej 3D i umożliwiając akwizycję w wysokiej rozdzielczości wymaganą do szczegółowej analizy jakościowej i ilościowej biogenezy i funkcji PC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne rzęski (PC) to organelle oparte na mikrotubulach, które wyczuwają i przekazują mnóstwo chemicznych i mechanicznych sygnałów ze środowiska zewnątrzkomórkowego. W szczególności PC jest centralną organellą dla transdukcji szlaku sygnałowego Hedgehog u kręgowców1,2. Podczas gdy od dawna wykazano, że większość komórek nerwowych posiada PC, wkład tych organelli w kształtowanie ośrodkowego układu nerwowego był długo niedoceniany. Badania nad rozwojem kory nowej doprowadziły do odkrycia wielu nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NSPC), z których wszystkie zawierają PC, których lokalizacja została zaproponowana jako kluczowa dla określenia losu progenitora3, 4,5,6,7. Wykazano, że PC ma kluczowe znaczenie dla mechanizmów komórkowych, które są wymagane do prawidłowego rozwoju kory mózgowej, w tym ekspansji i zaangażowania NSPC8,9,10,11,12 a także apicobasal polaryzacja radialnego rusztowania glejowego wspierającego migrację neuronów13. Ponadto PC są wymagane podczas migracji stycznej interneuronów do płytki korowej14,15. Na koniec zaproponowano rolę PC w tworzeniu połączeń synaptycznych neuronów w korze mózgowej16,17. Reasumując, odkrycia te przemawiają za kluczową rolą PC na głównych etapach rozwoju kory mózgowej18,19 i wskazują na potrzebę zbadania ich udziału w patologicznych mechanizmach leżących u podstaw anomalii rozwoju kory mózgowej.

Ostatnie badania znacznie poszerzyły nasze zrozumienie istotnych różnic komórkowych i molekularnych między rozwojem kory mózgowej w modelach ludzkich i zwierzęcych, podkreślając potrzebę rozwoju systemów modeli ludzkich. Z tego punktu widzenia, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hIPSC) stanowią obiecujące podejście do badania patogenezy choroby w odpowiednim kontekście genetycznym i komórkowym. Adherentne dwuwymiarowe (2D) modele komórkowe lub rozety neuronalne zawierają NSPC podobne do tych obserwowanych w rozwijającej się korze mózgowej, które organizują się w struktury w kształcie rozety, wykazując prawidłową polaryzację apikobasalną20,21,22. Co więcej, trójwymiarowy (3D) system hodowli pozwala na generowanie organoidów grzbietowej przodomózgowia, które podsumowują wiele cech rozwoju kory mózgowej człowieka23,24,25,26. Te dwa uzupełniające się podejścia do modelowania opartego na komórkach oferują ekscytujące perspektywy do analizy udziału PC w normalnym i patologicznym rozwoju kory mózgowej.

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki rozet nerwowych i pochodnych NSPC, a także organoidów grzbietowej przodomózgowia. Zapewniamy również szczegółowe protokoły do analizy biogenezy i funkcji PC obecnego na NSPC, testując transdukcję szlaku Sonic Hedgehog i analizując dynamikę kluczowych cząsteczek zaangażowanych w ten szlak. Aby wykorzystać organizację 3D organoidów mózgowych, opracowaliśmy również prostą i opłacalną metodę obrazowania 3D organoidów mózgowych barwionych in toto immuno, co pozwala na szybkie pobranie, dzięki mikroskopowi świetlnemu, całego organoidu, z wysoką rozdzielczością umożliwiającą wizualizację PC na wszystkich typach progenitorów kory nowej i neuronów całego organoidu. Na koniec dostosowaliśmy immunohistochemię na swobodnie pływających odcinkach 150 μm, a następnie oczyściliśmy i akwizycję za pomocą rezonansowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, co umożliwiło akwizycję obrazu o wysokiej rozdzielczości, co jest wymagane do szczegółowej analizy biogenezy i funkcji PC. W szczególności oprogramowanie do obrazowania 3D umożliwia rekonstrukcję 3D PC z późniejszą analizą parametrów morfologicznych, w tym długości, liczby i orientacji PC, a także pomiar intensywności sygnału składników rzęskowych wzdłuż aksonemu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie modeli rozwoju kory nowej opartych na komórkach 2D hIPS

  1. Tworzenie rozety neuronalnej
    1. Zacznij od kultur hIPSC zawierających duże regularne kolonie, wykazujące mniej niż 10% zróżnicowania i nie więcej niż 80% zbieżności.
    2. Przepłukać hIPSC 2 ml PBS.
    3. Dodać 2 ml pożywki indukcyjnej NSPC uzupełnionej inhibitorem Rock (NIM + 10 μM Y-27632).
    4. Ręcznie wypreparuj każdą kolonię hIPSC z jednej szalki o średnicy 35 mm za pomocą igły, aby precyzyjnie przeciąć każdą kolonię w kierunku poziomym i pionowym, aby stworzyć wzór szachownicy dzielący każdą kolonię na równe skupiska.
    5. Odłącz kolonię za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je na szalkę o bardzo niskim mocowaniu 35 mm.
    6. Pozwól im unosić się na wodzie przez noc (ON) w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby mogły utworzyć ciała zarodkowe (EBs).
      UWAGA: Ciała zarodkowe (EB) definiuje się jako pływające sferoidalne klastry lub agregaty hIPSC.
    7. Przenieść EB do szalek 35 mm pokrytych poli-L-ornityną/lamininą (PO/lam) w 2 ml NIM + 10 μM Y-27632.
    8. Codzienne odświeżanie pożywki indukcyjnej NSPC (NIM bez Y-27632) aż do powstania rozet nerwowych, co trwa około 12 do 14 dni. Sprawdź pod mikroskopem.
      UWAGA: Po tym etapie rozety nerwowe można rozetkować, zróżnicować i przetworzyć do analizy immunologicznej lub zdysocjować w celu uzyskania izolowanych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NSPC).
  2. Ekspansja rozety neuronalnej i wczesne różnicowanie
    1. Wytnij rozety neuronowe w siatkę za pomocą igły i usuń klastry za pomocą skrobaka do komórek.
    2. Przenieść rozety na 4-dołkową płytkę zawierającą szkiełko nakrywkowe ze szkła powlekanego PO/lam (4-5 rozet/dołek) w 0,5 ml pożywki konserwacyjnej NSPC (NMM).
    3. Inkubować płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Odświeżaj NMM co drugi dzień aż do 20 dnia.
    5. Od 20 dnia hodowla rozet nerwowych w 0,5 ml cytokin zubożała NMM, aby umożliwić różnicowanie. Odświeżaj podłoże co 2-3 dni.
    6. W dniu 30 i 40 (10 lub 20 dni różnicowania) utrwal rozety 0,5 ml 4% PFA, 20 min, RT.
  3. Biogeneza i analiza funkcji PC na izolowanych NSPC
    1. Dysocjacja NSPC
      1. Wytnij rozety neuronowe z kroku 1.1.8 w siatkę za pomocą igły i usuń klastry za pomocą skrobaka do komórek. Przenieść komórki do szalek o średnicy 35 mm pokrytych PO/lam w 2 ml NMM i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
      2. Odświeżaj NMM co drugi dzień aż do zbiegu (około 5-7 dni).
      3. Po zeskrobaniu dużych, przezroczystych komórek otaczających rozety nerwowe, zbierz je ręcznie i przenieś na świeże szalki o średnicy 35 mm pokryte PO/lam, aby wzbogacić je o NSPC i zubożyć typy komórek nienerwowych.
      4. Po jednym lub dwóch ręcznych przejściach (w razie potrzeby powtórzyć krok 1.3.1.3) wymaganych do usunięcia wszystkich typów komórek zanieczyszczających, usunąć pożywkę i spłukać PBS.
      5. Dodać 300 μl 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aż większość komórek się odłączy.
      6. Dodać 2 ml pożywki zawierającej 10% FBS (DMEM + 10% FBS), aby dezaktywować trypsynę. Zawiesinę komórkową należy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół trzy razy, aby rozbić grudki komórek.
      7. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
      8. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w NMN.
      9. Zasiać zdysocjowane NSPC jako pojedyncze komórki (1 x 10 5 komórek/cm2) w NMM na szalkach pokrytych PO/lam i inkubować je w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
      10. Rozwiń NSPC w NMM, zmieniając medium co drugi dzień.
        UWAGA: NSPC są wysiewane w dużej gęstości, aby uniknąć zróżnicowania.
    2. Analiza biogenezy komputera
      1. Nasiona dysocjowały NSPC w 100 000 komórek/cm2 i inkubowały je w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w NMM przez 2 dni.
      2. Odessać pożywkę i zagłodzić NSPC w pożywce zubożonej w cytokiny (pożywka głodowa NSPC, tabela uzupełniająca 1) przez 48 godzin.
      3. Napraw NSPC z 4% PFA przez 20 minut w czasie RT.
      4. Przemyć dwukrotnie PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej przed barwieniem immunologicznym.
    3. Analiza funkcji komputera: Szlak sygnałowy SHH
      1. Zdysocjowane NSPC z nasionami w 100 000 komórek/cm2 na 8-dołkowych szkiełkach komorowych pokrytych PO/lam (300 μl) lub szalkach T25 (5 ml) i inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w NMM przez 2 dni.
      2. Zagłodzić NSPC w pożywce głodowej NSPC (300 μl na studzienkę 8-dołkowego szkiełka komorowego i 5 ml w kolbie T25) przez 48 godzin.
      3. Aby indukować szlak SHH, inkubować NSPC z pożywką głodową uzupełnioną rekombinowanym SHH (100 ng / ml) lub SAG (500 nM); (150 μl na studzienkę z 8-dołkowego szkiełka podstawowego i 2 ml w kolbie T25) przez 24 godziny.
      4. Utrwalić NSPC hodowane na 8-dołkowych szkiełkach komorowych w 250 μL 4% PFA na studzienkę przez 20 minut w RT i przemyć je dwukrotnie 250 μl PBS przez 5 minut w RT przed analizą immunostainingu.
      5. Usuń pożywkę i umyj NSPC hodowane w naczyniach T25 za pomocą PBS.
      6. Dodać 500 μl 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą.
      7. Dodać 2 ml pożywki zawierającej 10% FBS (DMEM + 10% FBS), aby dezaktywować trypsynę i zebrać zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      8. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ostrożnie zasysać supernatant w celu uzyskania granulek NSPC, które można kriokonserwować w temperaturze -80 °C przed ekstrakcją RNA i analizą RT-PCR.

2. Generowanie organoidów grzbietowej przodomózgowia

  1. Hodowla jednokomórkowa hIPSC
    1. Zacznij od kultur hIPSC, w których znajdują się duże regularne kolonie wykazujące mniej niż 10% zróżnicowania i które zostały pasażowane prawie raz. Upewnij się, że komórki nie zlewają się w więcej niż 80%.
    2. Umyj kolonie 2 ml PBS.
    3. Dodać 500 μl odczynnika do delikatnej dysocjacji komórek (GCDR) i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Odessać GCDR i dodać 2 ml pożywki mTeRS1 uzupełnionej 5 μM Y-27632.
    5. Delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół 10 razy, aby zdysocjować wszystkie kolonie na pojedyncze komórki.
    6. Przenieść komórki na szalkach pokrytych witronektyną i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Przed eksperymentem różnicowania należy wykonać co najmniej 1 pasaż hIPSC za pomocą GCDR, aby dostosować hIPSC do warunków hodowli jednokomórkowej.
  2. W dniu 0 pozwól hIPSC na wytworzenie ciał embrionalnych w pożywce EB zawierającej niskie stężenie FGF2 i wysokie stężenie inhibitora skał wymagane do przeżycia hIPSC. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Umyj kolonie 2 ml PBS.
    2. Dodać 500 μl odczynnika do delikatnej dysocjacji komórek (GCDR) i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Odessać GCDR i dodać 1 ml pożywki EB uzupełnionej 50 μM Y-27632; Za pomocą pipety o pojemności 1 ml delikatnie odłącz komórki i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Przepłukać ponownie 2 ml pożywki EB uzupełnionej 50 μM Y-27632, przenieść pozostałe komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Natychmiast dodać 3 ml pożywki EB uzupełnionej 50 μM Y-27632 do stożkowej probówki i delikatnie homogenizować roztwór za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
    5. Odwirować zdysocjowane komórki przy 100 x g przez 5 minut.
    6. Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 6 ml pożywki EB uzupełnionej 50 μM Y-27632.
    7. Odwirować komórki przy 100 x g przez 5 minut.
    8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki EB uzupełnionej 50 μM Y-27632. Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby delikatnie zdysocjować komórki do zawiesiny jednokomórkowej.
    9. Natychmiast po ponownym wymieszaniu komórek należy je rozcieńczyć i policzyć.
    10. Rozcieńczyć odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej (zawierającej 900 000 komórek) w 30 ml pożywki EB uzupełnionej 50 μM Y-27632 i 4 ng/ml bFGF i delikatnie wymieszać roztwór.
    11. Umieść 9 000 komórek / studzienkę na płytce 96U o bardzo niskim mocowaniu (300 μL / dołek). Aby uniknąć zakłóceń w tworzeniu się EB, należy inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do dnia 3 bez zmiany podłoża.
  3. Indukcja neuronalna (podwójne hamowanie SMAD)
    1. W dniu 3 upewnij się, że EB mierzą 300-400 μm i mają regularne granice. Jeśli oba kryteria zostaną spełnione, zastąp połowę pożywki (150 μl) pożywką indukcyjną-1 zawierającą podwójne inhibitory SMAD, co prowadzi do pojaśniejenia konturu EB do dnia 6 do dnia 7, wskazując na różnicowanie neuroektodermalne (Tabela uzupełniająca 2).
    2. W dniu 4 zastąp 3/4 pożywki (225 μl) pożywką indukcyjną-1.
    3. W dniu 6 i dniu 8: Odśwież połowę pożywki indukcyjnej-1 (150 μl).
  4. Osadzanie organoidów w macierzy błony podstawnej (dzień 10)
    1. W dniu 10 należy osadzić EB w matrycy błony podstawnej zmniejszonej o czynnik wzrostu (BMM).
      UWAGA: Na tym etapie należy zawsze używać sterylnych nożyczek do przecinania otworu końcówek pipet, aby uniknąć uszkodzenia organoidów przez wielokrotne pipetowanie.
    2. Najpierw przenieś około 15-17 organoidów w stożkowych probówkach. Pozwól EB osiąść i usuń pożywkę. Dodać 50 μl pożywki indukcyjnej-2 i przenieść je do probówki mikrowirówkowej zawierającej 100 μl BMM.
    3. Rozprowadź mieszaninę matrycy-EB na środku studzienki płytki o bardzo niskim przyczepie i oddziel EB, aby zapobiec ich fuzji.
    4. Pozostawić BMM do zestalenia się w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
    5. Dodać 3 ml pożywki indukcyjnej-2 do każdej studzienki i umieścić płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Upewnij się, że ta procedura została wykonana tak szybko, jak to możliwe, ponieważ BMM zestala się w temperaturze pokojowej.
  5. Stacjonarna hodowla organoidów osadzonych w macierzy błony podstawnej
    1. Dzień 12, 14: Odśwież pożywkę indukcyjną-2.
    2. Dzień 16: Odśwież pożywkę indukcyjną-2 i sprawdź pod mikroskopem rozszerzanie się pętli neuronabłonkowych.
  6. Dysocjacja i hodowla macierzy błony podstawnej na wytrząsarce orbitalnej
    1. W dniu 17 należy oddzielić organoidy od BMM, pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml i przenieść je do pożywki różnicującej-1 (bez witaminy A). Inkubować na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 80 obr./min w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu poprawy wchłaniania składników odżywczych.
      UWAGA: Użyj innego inkubatora do hodowli stacjonarnej i hodowli na wytrząsarce orbitalnej, aby uniknąć wibracji szkodliwych dla wzrostu przylegających komórek hIPS.
    2. Dzień 19: Odśwież pożywkę różnicową-1.
    3. Dzień 21: Zmień pożywkę różnicującą-1 na pożywkę różnicującą-2 (z witaminą A).
    4. Od 23 do 35 dnia: Odświeżaj pożywkę z pożywką różnicującą-2 co 2-3 dni.
    5. Od 35 do 70 dnia: Odśwież różnicowanie średnie-2 z 1% BMM i odświeżaj co 2-3 dni.
    6. Zebrać organoidy po 28, 42 i 70 +/- 2 dniach różnicowania i utrwalić je przez noc w temperaturze 4 °C, w 5 ml 4% PFA na stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    7. W celu dalszej analizy barwienia immunologicznego w całości lub w swobodnym przepływie, organoidy są następnie dwukrotnie płukane w PBS i konserwowane w temperaturze 4 °C w PBS + 0,05% azydku sodu.
    8. W celu analizy barwienia immunologicznego na zamrożonych skrawkach zanurzyć 4% organoidy utrwalone PFA w 10 ml 30% sacharozy w temperaturze +4 °C ON (lub do momentu, gdy organoidy opadną). Zanurz je w zamrożonej matrycy do zatapiania i przechowuj w temperaturze -80°C do kriosekcji.

3. In toto immunoznakowanie, oczyszczanie i akwizycja lightsheet organoidów grzbietowej przodomózgowia

  1. Utrwalenie
    1. Zebrać organoidy na płytkach 6-dołkowych, usunąć pożywkę i utrwalić je 2 ml 4% PFA, w temperaturze 4 °C, przez noc.
    2. Wykonaj trzy prania w 2 ml PBS w temperaturze pokojowej.
    3. Przenieść organoidy do probówek o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C w 2 ml PBS + 0,05% azydku sodu.
  2. Przepuszczalność
    1. Inkubować organoidy w 1 ml PBS zawierającego 0,2% Triton X100 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zrób to dwa razy.
    2. Inkubować w 1 ml PBS zawierającego 0,2% Triton X100 i 20% DMSO, w temperaturze 37 °C, przez noc.
    3. Inkubować w 1 ml PBS zawierającego 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% Deoxycholate, 0,1% NP40 i 20% DMSO, w temperaturze 37 °C, przez noc.
    4. Inkubować w 1 ml PBS zawierającego 0,2% Triton-X100, w temperaturze pokojowej, przez 1 godzinę. Zrób to dwa razy.
  3. Blokowanie i znakowanie immunologiczne
    1. Zablokować w 1 ml roztworu blokującego (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Surowica osła, 10% DMSO), w temperaturze 37 °C, WŁ.
    2. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 250 μl PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/ml heparyny, 5% DMSO i 3% surowicy osła, w temperaturze 37 °C, przez 2 dni.
    3. Myć w 1 ml PBS zawierającego 0,2% Tween20 i 0,1 μg/ml heparyny przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zrób to cztery razy.
    4. Umyć w 1 ml PBS zawierającego 0,2% Tween20 i 0,1 μg/ml heparyny, przez noc, w temperaturze 37 °C.
    5. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 250 μl PBS zawierającego 0,2% Tween 20, 0,1 μg/ml heparyny i 3% surowicy osła, w temperaturze 37 °C, przez 2 dni.
    6. Myć w 1 ml PBS zawierającego 0,2% Tween 20 i 0,1 μg/ml heparyny, przez 1 godzinę, na kółkach, w temperaturze pokojowej. Zrób to cztery razy.
    7. Przemyć w 1 ml PBS zawierającego 0,2% Tween 20 i 0,1 μg/ml heparyny, przez noc, na kółku, w temperaturze pokojowej stężenia.
    8. Myć w 1 ml PBS przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
    9. Przechowywać w temperaturze +4 °C w 1 ml PBS i 0,05% azydku sodu aż do oczyszczenia.
  4. Oczyszczanie w TDE (2,2′-tiodieetanol)
    1. Inkubować organoidy w 1 ml 30% TDE (3 ml TDE + 7 ml PBS) przez 24 godziny, w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubować w 1 ml 60% TDE (6 ml TDE + 4 ml PBS) przez 24 godziny, w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować w 1 ml 80% TDE (8 ml TDE + 2 ml PBS) przez 24 godziny, w temperaturze pokojowej.
  5. Osadzanie organoidów przed pozyskaniem arkuszy świetlnych
    UWAGA: Użyj systemu wykonanego na zamówienie; wykonane za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z końcówką naciętą skalpelem.
    1. Przygotuj 100 ml 4% niskotopliwej agarozy w 60% roztworze TDE i podwielokrotność w probówkach o pojemności 2 ml. Przechowywać w temperaturze +4 °C.
    2. Przed zatopieniem organoidu podgrzej jedną probówkę zawierającą 1,5 ml 4% niskotopliwej agarozy w 60% TDE w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż do upłynnienia.
    3. W międzyczasie przygotuj niestandardowy system formowania wykonany ze strzykawki o pojemności 1 ml, której końcówkę odcina się za pomocą skalpela.
    4. Wpompować do strzykawki 600 μl roztworu żelu za pomocą tłoka.
    5. Umieścić próbkę za pomocą powiększonej końcówki pipety, której otwór został wycięty za pomocą sterylnych nożyczek.
    6. Napełnić strzykawkę 400 μl roztworu żelu tak, aby próbka znalazła się w dolnej jednej trzeciej strzykawki.
    7. Pozostawić żel do polimeryzacji i przechowywać w 80% roztworze TDE w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do momentu nabycia.
    8. Do akwizycji lekkiego arkusza użyj obiektywu 20x zanurzonego w 80% roztworze TDE dodanym do komory próbki, aby umożliwić dokładne dostosowanie do współczynnika załamania światła metody oczyszczania.
    9. Włożyć strzykawkę zawierającą organoid zatopiony w agarozie do największego uchwytu na próbkę przeznaczonego do umieszczenia strzykawki o pojemności 1 ml, której tłok może być obsługiwany w celu umieszczenia organoidu przed obiektywem.
      UWAGA: Akwizycja całego organoidu z arkusza świetlnego trwa około 5 do 10 minut.

4. Barwienie immunologiczne i oczyszczanie swobodnie unoszących się odcinków organoidów grzbietowej przodomózgowia

  1. Utrwalanie, osadzanie agarozy i dzielenie organoidów
    1. Zebrać organoidy po 28, 42 i 70 +/- 2 dniach różnicowania na płytce 6-dołkowej i utrwalić przez noc w temperaturze 4 °C w 2 ml 4% PFA.
    2. Przepłukać dwukrotnie w 2 ml PBS i zakonserwować w temperaturze 4 °C w 2 ml PBS + 0,05% azydku sodu.
    3. Osadzone organoidy należy zatopić w 4% niskotopliwej agarozie w plastikowej formie do zatapiania (7 x 7 mm). Ostrożnie wyjmij blok agarozy z plastikowej formy i przyklej go do etapu wibratomu.
    4. Osadzone organoidy należy podzielić za pomocą wibratomu w celu uzyskania swobodnie pływających skrawków o wielkości 150 μm przeniesionych do studzienki na 24-dołkowej płytce zawierającej 500 μl PBS za pomocą pędzla, aby uniknąć uszkodzenia skrawków.
      UWAGA: Zalecana jest agaroza niskotopliwa, ponieważ jej temperatura topnienia wynosi tylko około 60 °C. Przygotuj 4% niskotopliwą agarozę w roztworze PBS i pozostaw ją do ostygnięcia w łaźni wodnej nieco powyżej 37 °C przed zatopieniem organoidów.
  2. Przepuszczalność, blokowanie i barwienie immunologiczne
    1. Inkubować skrawki w 500 μl PBS zawierającego 0,3% Triton X100, w temperaturze pokojowej, pod mieszaniem, przez 20 minut. Zrób to trzy razy.
    2. Inkubować skrawki w 500 μl PBS zawierającego 0,3% Triton X100 i 5% mleka beztłuszczowego, w temperaturze pokojowej, pod mieszaniem, przez 2 godziny.
    3. Inkubować skrawki w 250 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% mleka beztłuszczowego), pod mieszaniem, w temperaturze +4 °C, przez noc.
    4. Przemyć skrawki w 500 μl PBS, w temperaturze pokojowej, pod mieszaniem, przez 20 minut. Zrób to cztery razy.
    5. Inkubować skrawki w 250 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% mleka beztłuszczowego) w temperaturze pokojowej, pod mieszaniem, przez 2 godziny.
    6. Przemyć skrawki w 500 μl PBS, w temperaturze pokojowej, pod mieszaniem, przez 20 minut. Zrób to cztery razy.
    7. Skrawki należy przechowywać w 500 μl PBS w temperaturze +4°C do momentu oczyszczenia.
  3. Oczyszczanie w TDE (2,2′-tiodieetanol)
    1. Inkubować sekcje w 500 μl 30% i 60% TDE przez 1 godzinę każda w temperaturze pokojowej, a następnie w 500 μl 80% TDE przez noc, w temperaturze pokojowej.
    2. Oczyszczone skrawki należy przechowywać w 500 μl 80% TDE do momentu nabycia w temperaturze +4 °C.
  4. Montaż sekcji swobodnie pływających przed akwizycją z rezonansowym skaningiem konfokalnym
    1. Zamontuj sekcję swobodnie pływającą w szczelnej komorze, która umożliwia utrzymanie próbki w 80% roztworze TDE i jest przystosowana do adaptacji na zmotoryzowanym stoliku XY mikroskopów konfokalnych.
    2. Umieść jedno okrągłe szkiełko nakrywkowe w systemie studzienek.
    3. Ostrożnie przenieś oczyszczony fragment zabarwiony immunologicznie za pomocą pędzla.
    4. Napełnij komorę 80% roztworem TDE.
    5. Dodaj dwa standardowe szkiełka nakrywkowe oraz jedno drugie okrągłe szkiełko nakrywkowe i silikonową uszczelkę.
    6. Przykręć pierścień przykręcający komory, aby idealnie uszczelnić system.

5. Arkusz świetlny i rezonansowa skaningowa analiza konfokalna

  1. Przetwarzanie akwizycji arkuszy świetlnych i skanowania rezonansowego za pomocą oprogramowania, które umożliwia wizualizację 3D i analizę całej próbki barwionej immunologicznie.
    UWAGA: Takie oprogramowanie pozwala szybko otwierać ogromne dane, aby łatwo tworzyć migawki i animacje. Pozwala na przesuwanie próbki w różnych orientacjach i generowanie widoków 2D dzięki narzędziu do slicera 2D w różnych orientacjach, na przykład XY i YZ.
  2. Do automatycznego wykrywania zarówno centrosomów, jak i rzęsek pierwotnych należy użyć kreatora plamek, który umożliwia ilościowe określenie ich liczby w warunkach patologicznych i kontrolnych.
  3. Aby zrekonstruować 3D komputer PC umożliwiający precyzyjny pomiar ich długości, użyj kreatora filamentów, aby ręcznie ustalić punkt początkowy komputera, a oprogramowanie wykorzystuje sygnał fluorescencyjny do precyzyjnej rekonstrukcji komputera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2D modele komórkowe hIPS do badania pierwotnej biogenezy i funkcji rzęsek
Opisany tutaj protokół został zaadaptowany z wcześniej opublikowanych badań20,21,22. Protokół ten pozwala na generowanie struktur rozety nerwowej, które zawierają przodki kory nowej i neurony podobne do tych obserwowanych w rozwijającej się korze nowej. Szczegółową walidację można przeprowadzić za pomocą konwencjonalnej analizy barwien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PC są obecnie uważane za kluczowe organelle regulujące kluczowe etapy podczas normalnego rozwoju kory mózgowej 18,19,31, w tym ekspansję i zaangażowanie NSPC 8,9,10,11,12, a także migrację neuronów 13,14 i syn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Agence Nationale de la Recherche (ANR) dla S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) i N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 i ANR-19-CE16-0002-01). LB jest wspierany przez ANR w ramach programu Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) oraz Fondation Bettencourt Schueller (program MD-PhD). Imagine Institute jest wspierany przez państwo w ramach programu Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, projekty CrossLab) oraz w ramach drugiego programu Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-Mercapto i ostry; tanol (50 mM)ThermoFisher Scientific 31350010
6-dołkowy, przezroczysty, płaski, z ultraniskim nasadką, wielodołkowe płytkiCorning3471
96-dołkowa przezroczysta płytka z okrągłym dnem i ultraniską nasadkąSuplement Corning7007
B-27 (50X), bez witaminy ASuplement ThermoFisher Scientific12587010
B-27 (50X), bez surowicyThermoFisher Scientific17504044
Bufor rozcieńczający CellAdhereStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25&mikro; gTermofischerPHG0315
FGF2 , 25&mikro; gThermofischerPHG0264
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekStemCell Technologies7174
InsulinaThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Termofischerpodłożem neuronowym21103049
Wytrząsarka orbitalnaDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Mikroskopia elektronowa Sciences15714
Poli-L-ornityna (PO)SigmaP4957
Rekombinowany ludzki BDNF 10 i mikro; gStem Cell Technologies78005
Rekombinowany ludzki FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR& D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
StemBeads FGF2StemCultureSB500
SacharozaSigma AldrichS7903-250G
Prowadnice adhezyjne Superfrost PlusThermo ScientificJ1800AMNZ
Suppl&ostry; ment N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2'-tiodieetanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Przeciwciała
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R& D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-kadherynaBD Transdukcja Lab6109211/500e
P-wimentynaMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R& Systemy DMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γ TUBULINASigma AldrichT65571/500e
Przeciwciała wtórne
Donkey anty-królik AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Kozia anty-mysz AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Kozia anty-mysz AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Kozia przeciw szczurom AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e
z podstawowym

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161(2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294(2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495(2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236(2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8(2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959(2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33(2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141(2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Indukowane pluripotencjalne kom rki macierzysteorganoidy m zgurozety neuronalnepodw jna inhibicja SMADanaliza immunobarwieniamikroskopia konfokalnaciliogenezaszlak Sonic Hedgehog

Powiązane artykuły