Artykuł metodologiczny

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62670

⸱

14 października 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, National Institute for Health Research Cambridge Biomedical Research Centre, University of Cambridge School of Clinical Medicine, 2Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Opisana tutaj jest prosta metoda izolowania i fenotypowania mysich komórek limfoidalnych macicy grupy 1 (g1 uILC) z indywidualnej macicy ciężarnej za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół opisuje, jak ustawić krycie czasowe w celu uzyskania wielu synchronicznych matek, mechaniczne i enzymatyczne trawienie ciężarnej macicy, barwienie zawiesin pojedynczych komórek oraz strategię FACS do fenotypu i dyskryminacji g1 uILC. Chociaż metoda ta nieuchronnie traci informację przestrzenną o rozmieszczeniu komórkowym w tkance, protokół został z powodzeniem zastosowany do określenia heterogeniczności uILC, ich odpowiedzi na czynniki matczyne i płodowe wpływające na ciążę, profilu ekspresji genów i ich funkcji.

Wprowadzenie

Opisana tutaj jest prosta metoda uzyskania wysokiej wydajności limfocytów wrodzonych macicy z poszczególnych macic ciężarnych. Metoda ta zachowuje ekspresję powierzchni białka i funkcjonalność wrodzonych limfocytów macicy i nadaje się do kolejnych zastosowań, takich jak fenotypowanie FACS, RNAseq, proteomika lub testy funkcjonalne. W tym miejscu nacisk kładziony jest na fenotypowanie uILC grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Macica składa się z trzech warstw: endometrium, myometrium i perimetrium (Rysunek 1). Endometrium to błona śluzowa wyściełająca światło macicy. Progesteron, wytwarzany przez ciałko żółte, przekształca błonę śluzową macicy w decidua. Mięśniówka macicy składa się z dwóch warstw mięśni gładkich, które tworzą ścianę macicy. Perimetrium to błona surowicza, która owija macicę i łączy ją z otrzewną za pomocą szerokiego więzadła zwanego mezometrium. W przekroju poprzecznym macicy część przeciwna do światła nazywana jest stroną mesometrialną, podczas gdy część bliska światłu nazywana jest stroną antymesometrialną. Błona śluzowa macicy i jelito grube zasiedlają różne leukocyty matczyne, w tym kilka typów komórek, w których wrodzone komórki odpornościowe stanowią zdecydowaną większość komórek. Wrodzone komórki limfoidalne (ILC), makrofagi, komórki dendrytyczne (DC), a także limfocyty T CD4 + i CD8 +, limfocyty T regulatorowe (Treg) i rzadkie limfocyty B mogą odgrywać ważną rolę w regulacji środowiska macicy przez cały okres ciąży1,2. ILC w macicy znajdują się nie tylko w błonie śluzowej, ale także w mięśniówce macicy u myszy. Obejmując wszystkie trzy grupy ILC, macica jest rzeczywiście narządem najgęściej zaludnionym przez ILC grupy 1. Wraz z transformacją strukturalną tkanek macicy w trakcie ciąży zmienia się również liczba i proporcja leukocytów macicy (patrz Rysunek 2A dla przykładu zmian procentowych podzbiorów uILC grupy 1)3,4.

Gdy w tym artykule mowa jest o myszach, chodzi o szczep C57BL/6 myszy laboratoryjnych wsobnych. Myszy niekrewniacze (np. Myszy NMRI) są często wykorzystywane w badaniach reprodukcyjnych ze względu na ich wysoki wskaźnik reprodukcji. Jednak użycie szczepów wsobnych jest konieczne do uzyskania spójnych wyników, a ulubionym tłem genetycznym immunologa jest C57BL / 6, znany również jako B6.

Około 30% leukocytów macicy u matek B6 w połowie ciąży to uILC g1, które są definiowane przez cytometrię przepływową jako żywotne komórki CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ (Rysunek 2B): proangiogenne NK rezydentne w tkance (trNK), IFN-g wytwarzające konwencjonalne NK (cNK) i uILC14,5. Odsetek komórek uNK jest jeszcze wyższy u ludzi, osiągając około 70% w pierwszym trymestrze6. Jest więcej podobieństw niż różnic między człowiekiem a myszą uNK i uILC7,8. Chociaż ważne jest, aby pamiętać o różnicach, przydatne jest zintegrowanie dostępnych informacji na temat tych dwóch gatunków. Kiedy połączy się informacje uzyskane z badania uILC u ludzi i gryzoni laboratoryjnych, staje się jasne, że komórki NK pomagają w zmianach homeostatycznych niezbędnych dla biologii macicy, w tym w utrzymaniu integralności tętnic9 i przebudowie tętnic spiralnych10, a także inwazji trofoblastów11,12. Odgrywają również określone role w obronie przed patogenami13,14. U myszy i szczurów, oprócz wypełniania decidua wokół miejsca implantacji, komórki NK gromadzą się między dwiema warstwami mięśniówki macicy matek w przejściowej strukturze znanej jako agregat limfatyczny mesometrialu ciąży (MLAp)15 (Figura 1B), znana również w przeszłości jako gruczoł metrialny, której funkcja nie została jeszcze odkryta.

Opisany tutaj jest szczegółowy protokół metody stosowanej w laboratorium do izolowania limfocytów z macicy ciężarnych myszy przy użyciu kombinacji mechanicznej dezagregacji i trawienia enzymatycznego. Ponieważ w metodzie wykorzystuje się całą macicę, limfocyty wyizolowane z macicy podczas ciąży są mieszaniną komórek dziesiętnych i mięśniówek macicy. Możliwe jest dalsze wypreparowanie decidua ze ściany macicy i jego MLAp, co zostało opisane wcześniej16. Opisana tutaj metoda została opracowana w celu uzyskania limfocytów macicy przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji powierzchni białka, funkcjonalności komórkowej i żywotności. Rezultatem jest zawiesina pojedynczej komórki z minimalną ilością szczątkowych zanieczyszczeń komórkowych i wydajnością zwykle od 1 do 5 milionów komórek w połowie ciąży (10,5 dnia) dla macicy w ciąży. Zastosowania tej metody obejmują fenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej, sortowanie komórek do późniejszych badań transkryptomicznych lub proteomicznych, badania funkcjonalne, takie jak produkcja cytokin wewnątrzkomórkowych, degranulacja, ELISPOT lub testy cytotoksyczne. Przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na identyfikacji ILC grupy 1, ale może być dostosowany do innych typów komórek, takich jak inne ILC, limfocyty T, limfocyty B, DC lub makrofagi z niewielkimi modyfikacjami panelu przeciwciał używanego do analizy FACS. Protokół może być również stosowany do izolowania komórek z innych tkanek oraz do łączenia macic niebędących w ciąży.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) z 1986 roku na mocy PP2363781 wydanym przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych. Poniższy protokół składa się z kilku sekcji, zaczynając od hodowli myszy, a kończąc na barwieniu do analizy FACS. Rysunek 3 przedstawia główne kroki protokołu. Materiały użyte w protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Ogólna hodowla, kojarzenie i sekcja myszy

  1. Trzymaj 7-14 tygodniowe samice myszy w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) i w grupach (zwykle 4-6 samic w zależności od wielkości klatki i wagi zwierzęcia) przez 10-14 dni, aby wywołać efekt Lee-Boot, który powoduje synchronizację rui17.
  2. Trzymaj reproduktorów w warunkach SPF, w jednym pomieszczeniu i odpoczywaj przez co najmniej 48 godzin między każdym kryciem (czas na regenerację plemników). Zaleca się korzystanie z doświadczonych, sprawdzonych 3-4 miesięcznych samców, ponieważ są one zazwyczaj bardziej wydajne niż młode.
  3. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo zajścia w ciążę samic, należy wprowadzić zabrudzoną ściółkę z klatki samca do klatki samicy na 3 dni przed kryciem. Powoduje to efekt Whittena18 poprzez ekspozycję na męskie feromony moczu i skutkuje zsynchronizowaną rują, a także zwiększoną podatnością na krycie.
  4. W dniu 0 (D0) przygotuj myszy do krycia, używając jednego samca reproduktora na dwie samice; rozważ wskaźnik zatyczek około 20%-25%.
    UWAGA: Gody prawdopodobnie nastąpią w nocy, ponieważ myszy są zwierzętami nocnymi.
  5. Rano po kryciu (D0,5) sprawdź, czy nie ma czopa dopochwowego, który jest wskaźnikiem kopulacji (Ryc. 4). Czop dopochwowy jest agregatem męskiego ejakulatu i zwykle utrzymuje się do 8-24 godzin po kryciu. Sprawdź wtyczki wcześnie rano.
  6. Skonsoliduj zatkane samice w nowej klatce i przeznacz je na ten cel. Wróć samce do ich klatek na odpoczynek.
  7. W temperaturze D9,5 lub 10,5 po kryciu przygotować probówki o pojemności 5 ml z 1 ml sterylnego HBSS 1x (z Mg2+ i Ca2+) do pobrania tkanek i umieścić je na lodzie.
  8. Przejdź do eutanazji zwierząt przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie wykrwawienie w celu potwierdzenia śmierci.
  9. Pracuj w sterylnym środowisku, jeśli wymaga tego dalsza aplikacja. Bezpośrednio po eutanazji przetrzyj ciało myszy 70% etanolem i przystąp do sekcji pod szafką ze strumieniem laminarnym za pomocą sterylnych narzędzi.
  10. Wypreparuj macicę w ciąży bez tłuszczu mesometrialnego (Ryc. 5) i umieść całą macicę w przygotowanej i odpowiednio oznakowanej probówce o pojemności 5 ml. Trzymaj probówki na lodzie.

2. Mechaniczne i enzymatyczne trawienie macicy

  1. Aby przygotować roztwór do wytrawiania enzymatycznego, należy zmieszać 3 ml na macicę sterylnego HBSS 1x z 30 μg/ml DNAzy i 0,1 jednostki Wünscha (WU)/ml Liberazy DH lub 0,52 WU/ml Liberazy TM. Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Można stosować zarówno Liberase TM, jak i Liberase DH. Przy wyborze jednego z nich należy kierować się ich potencjalnym wpływem na epitopy rozpoznawane przez przeciwciała używane do późniejszej analizy cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Jeśli używasz liofilizowanych enzymów, pracuj pod maską.
  2. Przygotować 20 ml 5 mM EDTA w PBS (bez Ca2+/Mg2+). Umieścić połowę roztworu w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, a drugą połowę na lodzie.
  3. Pod szafką z topnikiem laminarnym delikatnie usuń tłuszcz otaczający ciężarną macicę za pomocą sterylnych narzędzi na sterylnej szalce Petriego. Nie dopuścić do wyschnięcia chusteczki.
  4. Wypreparuj każde miejsce implantacji sterylnymi narzędziami, aby usunąć płód (półprzezroczysta struktura w kształcie konika morskiego, około 1 mm długości) (Ryc. 6A). Wyrzuć płody.
  5. Umieść macicę z powrotem w pierwotnej probówce o pojemności 5 ml i zmiel tkankę za pomocą nożyczek bezpośrednio w probówce o pojemności 5 ml i pożywce do pobrania. Utrzymuj probówki na lodzie przez cały czas między zabiegami.
  6. Umieścić probówki o pojemności 5 ml zawierające tkankę mieloną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  7. Dodać 3 ml ciepłej mieszanki do trawienia enzymatycznego do każdej próbki, tak aby całkowita objętość płynu w probówce wynosiła 4 ml (1 ml pożywki zbiorczej z mieloną macicą i 3 ml roztworu do trawienia enzymatycznego). Inkubować probówki o pojemności 5 ml przez 30 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem w celu zwiększenia aktywności trawienia enzymatycznego.
  8. Zwiruj probówki o pojemności 5 ml i umieść je na lodzie, aby zahamować działanie enzymów. Następnie, następnie, przenieś zawartość do odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.
  9. Przepłucz wszystko z probówek o pojemności 5 ml do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml za pomocą 10 ml lodowatego roztworu 5 ml EDTA PBS.
  10. Odwirować probówki wirówkowe o pojemności 15 ml zawierające strawione tkanki przez 10 minut przy 400 x g.
  11. Odrzucić supernatant, delikatnie strzepnąć osad, a następnie ponownie zawiesić go w 10 ml ciepłego (37 °C) roztworu 5 mM EDTA PBS.
  12. Próbki inkubować w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml w temperaturze 37 °C z mieszaniem przez 15 minut w celu usunięcia resztek pożywki wytrawiającej i zmniejszenia zlepiania się komórek.
  13. Wiruj próbki na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby jeszcze bardziej ułatwić dysocjację tkanek.

3. Przetwarzanie macicy na zawiesinę jednokomórkową

  1. Za pomocą tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml przepchnąć strawioną tkankę przez sitko o pojemności 70 μm na odpowiednio oznakowaną i sterylną probówkę wirówkową o pojemności 50 ml w celu usunięcia grudek komórek i niezdysocjowanej tkanki.
  2. Umyj sitko kilka razy łącznie 10 ml zimnego PBS, aby zebrać wszystkie komórki.
  3. Wirować probówkę wirówkową o pojemności 50 ml przez 10 minut w temperaturze 400 x g.
    UWAGA: Wykonaj dalsze kroki, korzystając z opcji A lub opcji B. Opcja A pozwala na lepsze wzbogacenie limfocytów w mniej zanieczyszczeń i zanieczyszczeń komórek zrębu niż opcja B. Jednak opcja B daje wyższą wydajność komórek odpornościowych ze względu na mniejszą utratę komórek i mniejszą zmienność wydajności komórek między próbkami. Opcja B jest również łatwiejsza do wykonania pod względem technicznym. Dlatego, w zależności od preferencji, przejdź do opcji A lub opcji B.
    1. Kroki dla opcji A są następujące.
      1. Oznaczyć jedną sterylną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml na próbkę zawierającą 5 ml 80% (v/v) izotonicznego perkolu rozcieńczonego w PBS.
      2. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant z probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Użyj pipety chłopca, aby ponownie zawiesić każdą granulkę w 8 ml 40% (v/v) izotonicznego Percollu w PBS.
      3. Użyj pipety chłopca na niskiej prędkości, aby ostrożnie nałożyć osad zawieszony w 40% roztworze Percollu na 80% roztwór Percollu. Pipetować powoli i w sposób ciągły; trzymaj probówkę o pojemności 15 ml pod kątem 45° (Rysunek 6B).
      4. Nie naruszając nakładki, odwirować probówki wirówkowe o pojemności 15 ml przez 20 minut przy 850 x g, w temperaturze pokojowej (średnie przyspieszenie i minimalna przerwa).
      5. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki, nie naruszając warstw Percoll (Rysunek 6C).
      6. Nie naruszając pierścienia leukocytów na granicy dwóch roztworów Percollu, użyj sterylnej pipety Pasteura, aby wyrzucić wszystko, z wyjątkiem około 0,5-1 ml górnej warstwy Percolla.
      7. Próbując zassać minimalną ilość roztworu Percollu (łącznie do 4-5 ml), ostrożnie zbierz pierścień leukocytów i przenieś komórki do nowej, oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
      8. Uzupełnij każdą próbkę 10 ml sterylnego podłoża RMPI-1640 uzupełnionego 10% inaktywowanego termicznie FBS.
      9. Wirować przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze 4 °C.
      10. Odrzucić supernatant i przystąpić do lizy RBC.
    2. Kroki dla opcji B są następujące.
      1. Oznaczyć jedną sterylną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml na próbkę.
      2. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant z probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Użyj pipety chłopca, aby ponownie zawiesić każdą granulkę z 8 ml 35% (v/v) izotonicznego Percollu w pożywce RPMI-1640.
      3. Przenieść próbki do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.
      4. Odwirować próbki o masie 940 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej ze średnim przyspieszeniem i minimalną przerwaniem.
      5. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą aspiratora lub pipety (nie przez odwrócenie probówki).
      6. Zawiesić osad w 14 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS, a następnie odwirować próbkę przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      7. Odrzucić supernatant przez aspirację i przystąpić do lizy RBC.

4.Liza RBC

  1. Aby zlizować erytrocyty, ponownie zawiesić próbki w 3 ml 1x roztworu do lizy RBC i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 10 ml PBS do próbek, aby zatrzymać reakcję.
  3. Odwirować probówki o masie 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  4. Dodać 10 ml PBS i powtórzyć krok 4.3.
  5. Ponownie zawiesić każdą pastylkę w 1 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% inaktywowanego termicznie FBS.
  6. Przepuścić próbki przez sterylne sitka do komórek o wielkości 70 μm.
  7. Zliczanie komórek należy przeprowadzić za pomocą błękitu trypanowego i komory Neubauera zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do 1-2 milionów komórek w 100 μl PBS lub pożywki.

5. Strategia projektowania paneli i kontrole

UWAGA: Panel opisany w tym artykule nadaje się do dyskryminacji komórek uILC1, trNK i cNK i został zaprojektowany do użycia na 5-laserowym BD LSRFortessa. Można wprowadzić drobne modyfikacje w celu zbadania różnych populacji komórek i użycia alternatywnych fluorochromów. Zaleca się sprawdzenie konfiguracji urządzenia, użycie miareczkowanych przeciwciał w celu optymalnej separacji, zapoznanie się ze wskaźnikiem jasności producenta i użycie najjaśniejszych barwników dla antygenów o niskiej ekspresji, takich jak NKp46, oraz przestrzeganie ogólnych wytycznych19. Zaleca się włączenie kontroli Fluorescence Minus One (FMO) dla NKp46.

6. Barwienie wrodzonych komórek limfoidalnych do fenotypowania FACS

  1. Przenieś 1-2 miliony komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.
  2. Obracać płytkę w temperaturze 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant, wrzucając go do zlewu.
  3. Zawiesić granulki komórkowe w 100 μl PBS (bez białek i azydków) za pomocą pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Upewnij się, że PBS nie zawiera azydku sodu, Trisu ani żadnych białek do następnego etapu.
  4. Powtórz krok 6.2.
  5. Zawieś komórki w 50 μl możliwego do utrwalenia barwnika żywotności rozcieńczonego w PBS (bez białek i azydków) (1:1,000). Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
    UWAGA: Upewnij się, że PBS nie zawiera azydku sodu, Tris ani żadnych białek, takich jak FBS lub BSA, ponieważ może to spowodować zmniejszenie intensywności barwienia martwych komórek i/lub zwiększenie barwienia tła żywych komórek.
    UWAGA: Jeśli barwnik żywotności jest sproszkowany, użyj pod maską.
  6. Dodać 150 μl PBS, ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety wielokanałowej, a następnie powtórzyć krok 6.2.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 25 μl buforu FACS (PBS uzupełniony 1% BSA lub 2% FBS) zawierającego odczynnik blokujący receptor Fc. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Dodać 25 μl powierzchniowego koktajlu przeciwciał.
    UWAGA: Zawsze miareczkuj przeciwciała i optymalizuj panel przeciwciał przed eksperymentem.
  9. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.
  10. Dodać 150 μl buforu FACS do każdej studzienki, dokładnie wymieszać, a następnie powtórzyć krok 6.2.
  11. Powtórz krok 6.10.
    UWAGA: Wykonaj dalsze kroki, korzystając z opcji A lub opcji B. Użyj opcji A, aby zabarwić komórki znacznikami powierzchni. Użyj opcji B, aby zbadać markery wewnątrzkomórkowe za pomocą cytometrii przepływowej.
    1. Kroki dla opcji A są następujące.
      1. Zawiesić próbki w 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA) na studzienkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Użyj PFA pod maską. Zapoznaj się z kartą charakterystyki, aby bezpiecznie pozbyć się odpadów/przedmiotów PFA, które miały kontakt z PFA (np. pipet).
      2. Powtórz krok 6.2 dwa razy.
        UWAGA: Nie wyrzucaj, wrzucając do zlewu tutaj, ponieważ zawiera PFA. Odessać pipetą i wyrzucić odpady zgodnie z kartą bezpieczeństwa.
      3. Zawiesić próbki w 200 μl PBS.
      4. Przenieść próbki do oznakowanych probówek FACS i uzupełnić 100 μl PBS. Trzymaj probówki na lodzie lub w lodówce do czasu przetworzenia za pomocą analizy FACS. Pobrać próbki na cytometr przepływowy w ciągu 24 godzin.
    2. Kroki dla opcji B są następujące.
      1. Zawiesić próbki w 100 μl roztworu utrwalającego/permeabilacyjnego na studzienkę (zawierającego paraformaldehyd) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: Użyj PFA pod maską. Zapoznaj się z kartą charakterystyki, aby bezpiecznie pozbyć się odpadów/przedmiotów PFA, które miały kontakt z PFA (np. pipet).
      2. Powtórz krok 6.2.
        UWAGA: Nie wyrzucaj, wrzucając do zlewu tutaj, ponieważ zawiera PFA. Odessać pipetą i wyrzucić odpady zgodnie z kartą bezpieczeństwa.
      3. Dodać 200 μl 1x buforu do permeabilizacji / mycia, dobrze wymieszać, a następnie powtórzyć krok 6.2.
      4. Powtórz krok 6.11.2.3.
      5. Ponownie zawiesić utrwalone i permeabilizowane komórki w 50 μl 1x buforu permeabilizacyjnego/myjącego zawierającego mieszaninę przeciwciał do barwienia wewnątrzkomórkowego.
      6. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
      7. Dodać 200 μl 1x roztworu do permeabilizacji / mycia, dobrze wymieszać, a następnie powtórzyć krok 6.2.
      8. Powtórz krok 6.11.2.7.
      9. Zawiesić próbki w 200 μl PBS.
      10. Przenieść próbki do oznakowanych probówek FACS i uzupełnić 100 μl PBS. Trzymaj probówki na lodzie lub w lodówce do czasu przetworzenia za pomocą analizy FACS. Pobrać próbki na cytometr przepływowy w ciągu 24 godzin
        UWAGA: Po wykonaniu tego protokołu zawiesina komórek dziesiętnych jest gotowa do analizy FACS. Zaleca się rejestrowanie jak największej liczby zdarzeń na próbkę; Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy uzyskać co najmniej 1000-3000 zdarzeń w populacji rodzicielskiej.

Wyniki

Główne etapy metody opisanej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek leukocytów macicy przedstawiono w podsumowaniu na Rysunku 3. Na Rysunku 2B zaprezentowano podstawową strategię bramkowania FACS używaną do identyfikacji trzech podzbiorów g1 ILC u myszy B6: komórek uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) oraz cNK (CD49a-Eomes+). Dalsza analiza tych populacji może być przeprowadzona w celu zbadania różnych markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych g1 ILC. Przykładowo, koekspresję IFN-ɣ oraz receptorów self-MHC można ocenić w komórkach uILC1, trNK i cNK po stymulacji przeciwciałem anty-NK1.1 (Rysunek 7).

W zależności od pytania badawczego, zarówno protokół (Rysunek 3) i panel przeciwciał można dostosować. Co ważne, w celu bramkowania ILC grupy 1 zaleca się stosowanie zarówno przeciwciał anty-NK1.1, jak i anty-NKp46 w jednym panelu FACS (Rysunek 2B i Tabela 1). Należy zauważyć, że komórki ILC z grupy g1 uzyskane z krwi, śledziony lub wątroby wykazują wyższą ekspresję NKp46 na swojej powierzchni niż ich odpowiedniki maciczne (Rycina 8). Barwienie powierzchniowe dla NK1.1 zapewnia lepszą separację i umożliwia łatwe bramkowanie ILC grupy 1 z macicy (Rysunek 8). Podczas gdy NKp46 jest ekspresjowany przez wszystkie szczepy myszy, antygen NKR-P1C rozpoznawany przez przeciwciało anty-NK1.1 PK136 jest ekspresjowany tylko przez niektóre szczepy myszy, w tym C57BL/6 (tj. B6), FVB/N i NZB, ale nie przez AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL lub 129. Ponadto, jeśli badacz zamierza badać kluczowe receptory komórek NK, takie jak receptory MHC Ly49, ważne jest, aby mieć na uwadze zmienność alleliczną w laboratoryjnych szczepach myszy, która odzwierciedla wysoką zmienność ludzkich receptorów immunoglobulino-podobnych komórek zabójczych (KIR). Co więcej, jeśli komórki mają zostać stymulowane NK1.1 w celu przeprowadzenia testu funkcjonalnego, zgodnie z opisem w Kim, S. i wsp.20warto rozważyć barwienie komórek przeciwciałem anty-NKp46 zamiast anty-NK1.1, ponieważ antygen NKR-P1C może być zajęty przez sieciujące przeciwciało anty-NK1.1 lub stymulacji może towarzyszyć obniżenie poziomu ekspresji receptora (downregulacja). Zarówno zajęcie receptorów, jak i ich downregulacja mogą utrudnić barwienie tym samym przeciwciałem, którego użyto do stymulacji.

Powszechnym problemem przy enzymatycznej dysocjacji tkanek jest zmiana epitopów powierzchniowych na komórkach przez enzymy stosowane w medium do trawienia. Na przykład barwienie receptora MHC CD94:NKG2A jest słabe w przypadku użycia Liberase TM. Jednak trawienie za pomocą Liberase DH zachowuje rozpoznawanie NKG2A przez klon przeciwciała 16A11 (Rysunek 9). Zaleca się sprawdzenie wpływu enzymów na wszystkie epitopy w panelu FACS. W tym celu należy użyć zawiesiny splenocytów mysich uzyskanej poprzez dysocjację mechaniczną (przepuszczenie całej śledziony przez sito 70 µm). Próbkę dzieli się następnie na dwie lub więcej części, po czym inkubuje się je w medium z enzymem lub bez enzymu.

Jak wspomniano wcześniej, komórki pochodzenia krwi są obecne w próbkach dysocjowanych tkanek. W razie potrzeby zanieczyszczenia krwią można wyeliminować, stosując metodę barwienia donaczyniowego opracowaną w laboratorium Masopusta21. Rysunek 10 pokazuje, że około 6,5% ILC g1 obecnych w próbkach tkanki macicy w 8,5 dniu ciąży pochodzi z krwi. Przeciwciała anty-CD45 stosowane do barwienia donaczyniowego mogą być sprzężone z fluorochromem przeznaczonym do kanału dump; pozwoli to na wykluczenie zanieczyszczeń krwią bez konieczności wykorzystania dodatkowego kanału fluorescencji. Najczęstsze problemy i ich rozwiązania przedstawiono w Tabeli 2.

figure-results-1
Rycina 1: Przekrój poprzeczny macicy myszy. (A) Przekrój poprzeczny macicy myszy (nieciężarna), wskazujący na różne rodzaje leukocytów macierzyńskich bytujących w macicy. (B) Przekrój poprzeczny macicy myszy (8,5 dzień gestacji). (C) Przekrój poprzeczny macicy myszy (13,5 dzień gestacji). (D) Porównanie formowania łożyska u myszy i u człowieka od stadium blastocysty wzwyż. Obrazy stworzone za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Subpopulacje macicznych ILC1 z grupy 1. (A) Procentowy udział cNK, ILC1 i trNK w macicy myszy we wczesnym etapie życia oraz podczas ciąży. W – tygodnie, gd – dzień gestacji. Wykres zmodyfikowany na podstawie pracy Filipovic, I. et al.4. (B) Strategia bramkowania służąca do analizy podzbiorów macicznych ILC grupy 1 metodą cytometrii przepływowej. Limfocyty wyizolowano z tkanek macicy w 10,5 dniu gestacji. Trawienie tkanek przeprowadzono przy użyciu medium do trawienia zawierającego Liberase TM. Komórki bramkowano na podstawie ich zdolności do rozpraszania światła. Dublety wykluczono za pomocą wykresu FSC-A względem FSC-H, a do dalszej analizy zakwalifikowano jedynie żywe komórki CD45+CD3-CD19-. Wśród żywych komórek CD45+CD3-CD19- bramkę dla ILC grupy 1 zidentyfikowano jako komórki NK1.1+ NKp46+. W obrębie ILC grupy 1 można zidentyfikować trzy podzbiory: konwencjonalne komórki NK (cNK) CD49a-Eomes+, tkankowe komórki NK (trNK) CD49a+Eomes+ oraz uILC1 CD49a+Eomes-. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przewodnik wizualny po głównych etapach protokołu. (1) Wypreparuj ciążową macicę, usuwając tłuszcz mezometrialny. (2) Usuń płody; przenieś macicę z powrotem do probówki 5 mL i rozdrobnij tkankę. Przejdź do etapu trawienia enzymatycznego: dodaj 3 mL ciepłej mieszaniny do trawienia enzymatycznego do każdej próbki. Inkubuj probówki 5 mL przez 30 min w 37 °C przy wytrząsaniu. (3) (i) Po trawieniu wypłucz całą zawartość probówek 5 mL do probówek 15 mL, używając 10 mL lodowatego roztworu 5 mM EDTA PBS. (ii) Odwiruj probówki 15 mL zawierające strawione tkanki przez 10 min przy 400 x g. (iii) Odlej nadsącz; delikatnie stuknij osad i resuspenduj go w 10 mL ciepłego (37 °C) roztworu 5 mM EDTA PBS. (iv) Inkubuj próbki w probówkach 15 mL w 37 °C przy wytrząsaniu przez 15 min. (4) Używając tłoka sterylnej strzykawki 1 mL, przeciśnij strawioną tkankę przez sito 70 µm do odpowiednio oznakowanej i sterylnej probówki 50 mL, a następnie wiruj przez 10 min przy 400 x g. (5) Po wirowaniu zastosuj opcję A (przedstawioną tutaj na schematach) lub B. Opcja A: odlej nadsącz z probówki 50 mL i, używając automatycznej pipety, resuspenduj każdy osad w 8 mL 40% (v/v) izotonicznego Percollu w PBS. (6) (i) Kontynuacja opcji A: Używając automatycznej pipety z niską prędkością, ostrożnie nanieś osad resuspendowany w 40% roztworze Percollu na 5 mL 80% roztworu Percollu. Pipetuj powoli i w sposób ciągły; trzymaj probówkę 15 mL pod kątem 45°. (ii) Bez naruszania warstwy naddanej, wiruj probówki 15 mL przy 850 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej, przy średnim przyspieszeniu i powolnym hamowaniu. (7) Po wirowaniu, starając się pobrać minimalną ilość roztworu Percollu (łącznie do 4-5 mL), ostrożnie zbierz pierścień leukocytów. (8) Przeprowadź etapy lizy erytrocytów. (9) Policz komórki używając błękitu trypanu i komory Neubauera. (10) Przenieś 1-2 miliony komórek na dołek do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem. (11) Przejdź do barwienia barwnikiem żywotności i przeciwciałami. (12) Na koniec przenieś próbki do oznakowanych probówek FACS. Przechowuj probówki na lodzie lub w lodówce do czasu analizy FACS w ciągu 24 h. Grafiki opracowane w BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Czop pochwowy (A) oraz jego brak (B) u samic C57BL/6 w 0,5 doby po kopulacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Disekcja w celu wyodrębnienia macicy z ciężarnej myszy. (A) Samica zostaje przytwierdzona igłami do miękkiej podkładki w celu przetarcia ciała 70% etanolem. Wykonuje się dwa nacięcia pionowe, zaznaczone niebieskimi liniami przerywanymi. (B) Skóra zostaje uniesiona, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Pętle jelitowe są delikatnie odsuwane w górę, aby uwidocznić macicę. (C) Macicę pobiera się poprzez nacięcia w trzech punktach: obok jajników oraz w obrębie szyjki macicy, co zaznaczono odpowiednio dwiema niebieskimi liniami przerywanymi i niebieską strzałką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek. (A) Mechaniczne usuwanie embrionów z miejsca implantacji. (B) Nakładanie gradientu Percoll; górna warstwa zawiera zawiesinę pojedynczych komórek w 40% Percoll, a dolna warstwa 80% Percoll. (C) Formowanie pierścienia limfocytów po wirowaniu gradientu Percoll. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Reprezentatywna analiza FACS w teście funkcjonalnym z użyciem ILC grupy 1. Wykrywanie wewnątrzkomórkowego IFN-ɣ oraz powierzchniowego CD107a w ILC grupy 1 wykazujących ekspresję receptorów NK dla własnego MHC (Ly49C, Ly49I oraz NKG2A) w porównaniu do komórek ich niewykazujących, po sieciowaniu NK1.1 przeciwciałami związanymi z płytką. Komórki wyizolowano z tkanek macicy w 9,5 dniu ciąży. Trawienie tkanki przeprowadzono przy użyciu medium do trawienia zawierającego Liberase DH. Przedstawiono wartości surowe dla wszystkich czterech kwadrantów (rogów) oraz wzglutny procent komórek odpowiadających spośród komórek wykazujących ekspresję receptorów dla własnego MHC i komórek odpowiadających, które nie posiadają receptorów dla własnego MHC (liczby pogrubione). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Barwienie limfocytów śledzionowych i macicznych przeciwciałami anty-NKp46 oraz anty-NK1.1. (A) Zawiesiny komórkowe otrzymane ze śledziony myszy i (B) macicy w 10,5 dniu ciąży zostały podzielone na dwie części; jedną część barwiono NKp46-APC (czerwony), a drugą NK1.1-APC (niebieski). Należy zauważyć, że barwienie NKp46 limfocytów macicznych nie oddziela komórek NKp46+ i NKp46- tak wyraźnie, jak w przypadku limfocytów śledzionowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Spadek MFI dla NKG2A (klon przeciwciała: 16A11) po inkubacji w medium do trawienia. Zawiesinę komórkową z plamin myszy C56BL/6 podzielono na trzy części. Jedną część inkubowano w medium do trawienia Liberase DH (HBSS zawierający 0,13 WU/mL Liberase DH i 30 µg/mL DNAzy), a drugą część inkubowano w medium do trawienia Liberase TM (HBSS zawierający 0,52 WU/mL Liberase TM i 30 µg/mL DNAzy). Trzecią część traktowano samym HBSS przez 30 min w 37 °C. Ekspresję markera NKG2A na g1 ILCs oceniono metodą cytometrii przepływowej. Wykres pochodzi z pracy Shreeve N. The role of uterine NK-cell inhibition in pregnancy (Thesis); Promotor: Colucci F, 2020. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-10
Rycina 10: Barwienie intravitalne przeciwciałami anty-CD45 w celu wykluczenia g1 ILC pochodzenia krwi. Mysz matka szczepu C57BL/6 w 8,5 dniu ciąży została uśpiła 3 min po dożylnym wstrzyknięciu 3 µg CD45-AF647. Pobrano macicę, krew całkowitą i grasicę, a następnie poddano je analizie FACS. Oś X przedstawia sygnał z barwienia dożylnego CD45-AF647, a oś Y sygnał z barwienia in vitro CD45-BUV395. Procenty subpopulacji przedstawiono w kwadrantach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Przeciwciało / BarwnikKlonFluorochromLaser
1 (Kanał zrzutu)barwnik do oceny żywotności Zombie Violet Fixable Viability dyeFioletowy
CD191D3BV421
CD3145-2C11BV421
2CD4530-F11FITCNiebieski
3NK1.1PK136BV605Fioletowy
4NKp4629A1.4APCCzerwony
5CD49aHa31/8BUV395Ultrafiolet
6EOMESDan11magPEZielony

Tabela 1: Przykład panelu FACS dla konwencjonalnego cytometru 5-laserowego.

ProblemMożliwa przyczynaSugestia
Pierścień komórkowy nie jest widoczny na styku dwóch roztworów PercollNieprawidłowe nakładanie warstw roztworu Percoll lub zmieszanie dwóch warstw podczas manipulowania próbkąNależy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć poduszki z 80% Percoll podczas nakładania warstw. Należy uważać podczas manipulowania próbkami: nie wolno naruszać interfazy Percoll.
Niska liczba leukocytów (na przykład w przypadku użycia macicy nieciężarnej)Interfejs jest widoczny nawet wtedy, gdy liczba komórek w tej warstwie jest bardzo niska. Nawet jeśli pierścień nie jest widoczny, należy zebrać ciecz z obszaru między 40% a 80% roztworami percoll, ponieważ może w niej nadal znajdować się wystarczająca liczba komórek do dalszej obróbki.
Niepełna hemoliza erytrocytówKomórki nie zostały prawidłowo resuspendowane w buforze lizującymPipetować komórki w górę i w dół, aby rozbić skupiska i całkowicie resuspendować komórki w buforze lizującym.
Roztwór lizujący jest schłodzonyPrzed użyciem doprowadzić roztwór lityczny do temperatury pokojowej.
Wydłużyć czas inkubacji z roztworem lizującym do 15 min.
Krok lizy erytrocytów można powtórzyć
Niska wydajność komórkowaNiewystarczający trawienie enzymatyczneNależy sprawdzić, czy enzymy nie są przeterminowane i czy były przechowywane zgodnie z instrukcjami obsługi.
Utrata komórek podczas etapów płukaniaNależy sprawdzić osad komórkowy po każdym etapie przemywania: mętny osad na dnie dołka po wirowaniu. Zastosowanie płytek z dnem w kształcie litery V zamiast płytek z dnem w kształcie litery U, wirówki z rotorem kątowym oraz wydłużenie czasu wirowania może ograniczyć utratę komórek.
Próbka tkanki zawiera niewielką liczbę limfocytów (na przykład w przypadku użycia macicy nieciężarnej)Połączyć kilka macic, aby uzyskać wystarczającą liczbę zdarzeń do analizy. W celu izolacji komórek rozważyć zastosowanie opcji B protokołu.
Wysoka zmienność bezwzględnej liczby leukocytów uzyskanej od myszy z tej samej grupyNiejednorodna zbiórka komórek na styku roztworów Percoll o stężeniach 40% i 80%Należy upewnić się, że zebrano frakcję całych komórek z granicy faz Percoll. W celu izolacji komórek warto rozważyć zastosowanie opcji B protokołu.
Brak możliwości wykrycia oczekiwanych subpopulacji/markerów limfocytów lub nietypowo niska wartość MFI dla niektórych markerów powierzchniowych komórekTrawienie enzymatyczne wpływa na ekspresję powierzchniową niektórych epitopów lub ich degradacjęZoptymalizuj trawienie enzymatyczne poprzez zmianę: enzymu (np. na inny rodzaj liberazy lub kolagenazy) i/lub czasu inkubacji i/lub stężenia enzymu
Wysoki poziom szumu tła w cytometrze przepływowymWysoki udział szczątków komórkowych lub zanieczyszczenia erytrocytamiDostosuj parametr progowania FSC. Rozważ zastosowanie opcji A protokołu w celu izolacji komórek.

Tabela 2: Przewodnik rozwiązywania problemów.

Dyskusja

Metoda składa się z kilku krytycznych kroków omówionych poniżej. Pierwszym krytycznym krokiem jest uzyskanie ciąż synchronicznych mnogich, ponieważ względna częstość występowania populacji leukocytów zmienia się w czasie ciąży. Posiadanie wielu matek w tym samym dniu ciąży pozwala na powtórzenia biologiczne w tych samych eksperymentach lub łączenie limfocytów z poszczególnych matek w celu uzyskania większej liczby wymaganej do dalszych zastosowań. Krycie czasowe pozwala badaczowi określić poczęcie w ciągu 24 godzin. Chociaż myszy żyją około 2,5 roku, będą w wieku rozrodczym od 4-7 tygodni do 6-8 miesięcy. Ponieważ młodsze myszy zwykle produkują mniejsze młode, samice myszy na ogół nie są kojarzone, dopóki nie osiągną wieku 6-8 tygodni, a samce myszy do 8-10 tygodnia. Biorąc pod uwagę, że ruja trwa około 15 godzin u myszy i występuje co 4-5 dni, typowy wskaźnik krycia (ujawniony przez czop dopochwowy, patrz ryc. 4) wynosi około 25%. Dlatego ważne jest, aby wykorzystać myszy w rui i zaplanować wystarczającą liczbę, aby uzyskać wymaganą liczbę matek dla danego eksperymentu. Fazę cyklu rui można określić za pomocą cytologii wymazu z pochwy22. Szybkość korków można poprawić, odpoczywając samce na 48 godzin przed kryciem i wykorzystując efekt Whittena18. Alternatywnie można podać surowicę klaczy w ciąży, która naśladuje działanie endogennego hormonu folikulotropowego, indukującego dojrzewanie oocytów, a 42-50 godzin później ludzką gonadotropinę kosmówkową, która naśladuje działanie endogennego hormonu luteinizującego, wywołując owulację. To leczenie hormonalne omija wymóg rui i sprawia, że praktycznie wszystkie leczone samice są otwarte.

Drugim krytycznym krokiem jest zapewnienie jakości barwienia FACS. Przeciwciała stosowane w cytometrii przepływowej muszą być zawsze miareczkowane i stosowane w optymalnym stężeniu, a także konieczne jest sprawdzenie, czy trawienie enzymatyczne nie rozszczepia kluczowych epitopów antygenowych. Aby ocenić, czy enzym rozszczepi epitop, można równolegle wybarwić dwie frakcje tej samej próbki, z których jedna jest poddawana trawieniu enzymatycznemu, a druga mechanicznemu. Podobnie, zastosowanie odpowiednich kontroli i pojedynczych plam ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych. W rzadkich przypadkach koraliki mogą być używane do generowania pojedynczych próbek plam. Zaleca się, aby nie używać koralików do ustawiania napięć, ale raczej populacji komórek zawierających limfocyty i inne leukocyty, takie jak splenocyty. Jeśli używane są kulki, konieczne jest miareczkowanie przeciwciał do barwienia kulek, dzięki czemu intensywność fluorescencji barwionych kulek będzie porównywalna z intensywnością fluorescencji komórek. W przypadku trudności z oddzieleniem komórek dodatnich od ujemnych dla określonego markera, można również zastosować kontrolę FMO w celu ułatwienia bramkowania dla określonego markera. W przypadku markerów wewnątrzkomórkowych należy zastosować kontrolę izotypu, ponieważ barwienie wewnątrzkomórkowe może skutkować pozostałościami niezwiązanych przeciwciał, które mogą być nadal obecne w komórkach po etapach mycia, a tym samym zwiększać sygnał tła. Zaleca się przeprowadzenie próbek w ciągu 24 godzin od utrwalenia komórek, aby uzyskać najlepsze wyniki fenotypowania za pomocą analizy FACS, ponieważ autofluorescencja znacznie wzrasta w czasie, a intensywność fluorescencji niektórych przeciwciał może z czasem spadać.

Innym kluczowym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest dalsze zastosowanie zawiesiny jednokomórkowej uzyskanej za pomocą protokołu. W przypadku testów funkcjonalnych niezbędna jest praca w sterylnych warunkach. Podobnie w przypadku kolejnych badań omicznych ważne jest, aby pracować w sterylnych i wolnych od RNaz, DNaz i proteaz.

Przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na fenotypowaniu ILC grupy 1, ale może być dostosowany do fenotypowania innych typów komórek poprzez modyfikację panelu przeciwciał. Zaleca się, aby wszystkie przeciwciała były testowane w stosunku do strawionej i niestrawionej zawiesiny komórkowej w celu wykrycia utraty/zmiany epitopów powierzchniowych w wyniku leczenia enzymatycznego. Podobnie, różne enzymy mogą być używane do trawienia tkanki i zwiększania wydajności komórek, ale ich wpływ na kluczowe epitopy antygenowe musi być dokładnie zbadany. Podczas gdy NKp46 jest dobrym markerem komórek NK śledziony i działa we wszystkich szczepach myszy laboratoryjnych, ekspresja NKp46 na komórkach uNK u myszy C57BL / 6 jest znacznie niższa niż na komórkach NK śledziony. Najlepiej jest bejcować jednocześnie zarówno dla NK1.1, jak i NKp46. W przypadku bezpośredniego porównania wielu narządów zaleca się traktowanie wszystkich próbek jednakowo, nawet jeśli trawienie enzymatyczne nie jest wymagane w przypadku tkanek takich jak śledziona lub szpik kostny. Chociaż przedstawiona tutaj metoda ma zastosowanie do macicy niebędącej w ciąży, izolacja pierścienia limfocytów za pomocą dwufazowego gradientu Percoll będzie wyzwaniem, a wydajność izolowanych komórek może być zbyt niska dla wiarygodnej analizy FACS, a zatem będzie wymagała łączenia komórek wyizolowanych z macicy pojedynczych, nieciężarnych myszy23.

Istnieją ograniczenia dotyczące protokołu, które należy wziąć pod uwagę przy interpretacji danych. Podobnie jak w przypadku wszystkich tkanek, krążące limfocyty pochodzące z krwi zostaną wyizolowane wraz z komórkami rezydującymi w tkance. Jeśli wykluczenie krążących limfocytów ma zasadnicze znaczenie dla interpretacji danych, można przeprowadzić barwienie przyżyciowe w celu oznakowania krążących komórek. Co więcej, drugim ograniczeniem protokołu jest to, że niektóre komórki zostaną utracone, ponieważ nie wszystkie komórki można wyekstrahować z tkanki. Najczęstsze problemy i ich rozwiązywanie przedstawiono w tabeli 2.

Historycznie rzecz biorąc, badanie komórek w tkankach opierało się na badaniu histologicznym skrawków tkanek. Znakomita recenzja Sandry Peel24 podsumowuje pracę wykonaną przez ponad 100 lat, aż do późnych lat 80. Opisy komórek, znanych później jako komórki uNK, rzeczywiście pojawiają się w rękopisach opublikowanych ponad pół wieku przed odkryciem limfocytów. Tak więc, przed odkryciem komórek NK w 1975 roku, a komórki uNK zostały wskazane jako matczyne komórki glikogenu lub ziarniste komórki gruczołu oddechowego. Anne Croy wniosła znaczący wkład w tę dziedzinę25 i uprzejmie nauczyła zespół sekcji, którą zoptymalizowała3 i która jest obecnie używana. Chociaż ma zasadnicze znaczenie w opisie morfologii i lokalizacji tkanek komórek uNK, klasyczne badanie histologiczne ogranicza się do wykrycia tylko kilku markerów na interesujących komórkach. W 2008 roku opisano metodę opartą na cytometrii przepływowej do jednoczesnego wykrywania wielu markerów na limfocytach macicy26. Jest to zasadniczo metoda, która została opisana w tym artykule. Nowsze technologie, takie jak transkryptomika przestrzenna i obrazowanie za pomocą cytometrii masowej, łączą w sobie moc histologii i cytometrii przepływowej, umożliwiając zarówno jednoczesne wykrywanie wielu genów lub białek, jak i zachowanie prawidłowej architektury tkanki.

Zastosowania opisanej tutaj metody są wielorakie i obejmują fenotypowanie FACS, test funkcjonalny (taki jak ELISPOT, degranulacja lub testy cytotoksyczne), sortowanie komórek oraz późniejszą transkryptomikę lub proteomikę. Dalsze zastosowania, które można by rozwinąć w oparciu o tę metodę, obejmują hodowlę i ekspansję dziesiętnych komórek NK po sortowaniu komórek lub wzbogacaniu przez ujemne zubożenie. Obecnie nie ma protokołu hodowli i namnażania mysich komórek uNK oraz zachowania ich żywotności i funkcjonalności przez dłuższy czas, w podobny sposób jak w przypadku ludzkich komórek NK, które mogą być hodowane i ekspandowane przez 7-14 dni przez dodanie IL-2 lub kombinacji IL-12 i IL-15. Optymalizacja takiej metody dla mysich komórek uNK zapewniłaby większą elastyczność podczas wykonywania testów funkcjonalnych i pozwoliłaby na testowanie wielu warunków z większą liczbą komórek. Z drugiej strony, wiadomo, że warunki hodowli modyfikują unikalny fenotyp limfocytów, a potencjalnie także ich funkcję.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy poprzednim i obecnym członkom zespołu, którzy pomogli rozwinąć tę metodę, w tym Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic i Anita Qualls. Badania te zostały sfinansowane przez Wellcome Trust [numer grantu 200841/Z/16/Z ] oraz Radę ds. Badań Medycznych (MR/P001092/1). Dla celów otwartego dostępu autor zastosował publiczną licencję CC BY na podstawie praw autorskich do każdej wersji Manuskryptu zaakceptowanej przez Autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70 &mikro; Sitka do komórek m: Falcon352350
BSAPrzeciwciało SigmaA9647-100G
CD19Przeciwciało BD562701
CD3Przeciwciało BD562600
CD45 PrzeciwciałoBioLegend103108
CD49aPrzeciwciało BD740262
DNase IRoche (Sigma)10104159001
Przeciwciało EOMESeBioscience12-4875-82
Blok Fc Trustain fcxBioLegend101320
Surowica bydlęcapłodu Gibco10217-106
Bufor Fix/Perm (część zestawu do utrwalania/permeabilizacji BD Cytofix/Cytoperm)BD554714
HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejGibco14025092
Liberase DHRoche (Sigma)5401089001
Bufor do lizy PharmlyseBD555899
Przeciwciało NK1.1BioLegend108739
NKp46  PrzeciwciałoBioLegend137608
Paraformaldehyd 16% roztwór (bez metanolu)Agar ScientificAGR1026
PBS 10xGibco14030-048
PBS 1x (bez Ca2+ lub Mg2+)Thermo Scientific14190144
PercollVWR international17-0891-01
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichP5368-10PAK
Filtry do wstępnej separacjiMiltenyi130-095-823
RMPI-1640 medium + GlutaMAXGibco61870-010
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Scientific15575020
Zombie Violet Utrwalany barwnikżywotności BioLegend423113

Bibliografia

  1. Colucci, F. The immunological code of pregnancy. Science. 365 (6456), New York, N.Y. 862-863 (2019).
  2. Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. The unique immunological and microbial aspects of pregnancy. Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).
  3. Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , Elsevier, Academic Press. (2014).
  4. Filipovic, I., et al. Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus. Nature Communications. 9 (1), 4492(2018).
  5. Chen, Z., et al. DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression. Biology of Reproduction. 87 (4), 81(2012).
  6. Moffett, A., Colucci, F. Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).
  7. Gaynor, L. M., Colucci, F. Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice. Frontiers in Immunology. 8, 467(2017).
  8. Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M. Uterine natural killer cells. Frontiers in immunology. 10, 960(2019).
  9. Wilkens, J., et al. Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil. The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).
  10. Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).
  11. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  12. Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).
  13. Crespo, ÂC., et al. Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts. Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).
  14. Shmeleva, E. V., Colucci, F. Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity. Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).
  15. Kather, A., et al. Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus. Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).
  16. Croy, B. A., et al. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).
  17. Vander lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta Physiologica et Pharmacologica Neerlandica. 5 (2), 213-215 (1956).
  18. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
  19. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).
  20. Kim, S., et al. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules. Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).
  21. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  22. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).
  23. Doisne, J. -M., et al. Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells. Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).
  24. Peel, S. Fate of GMG Cells. Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, Springer. Berlin. (1989).
  25. Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones. Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).
  26. Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells. Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja limfocyt wtrawienie tkanki macicyfenotypowanie kom rekILC z grupy 1markery powierzchni kom rkowejlizowanie erytrocyt wtkankowe kom rki NKanaliza ekspresji gen w

Powiązane artykuły