Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

Podsumowanie

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Streszczenie

Odwracalne modyfikacje oksydacyjne tioli białkowych stały się ostatnio ważnymi mediatorami funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisano szczegółową procedurę ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą (RAC) w połączeniu z tandemowym znakowaniem masowym (TMT) izobarycznym i chromatografią cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS / MS), aby umożliwić multipleksowaną stochiometryczną kwantyfikację utlenionych tioli białkowych na poziomie proteomu. Specyficzne dla danego miejsca informacje ilościowe na temat utlenionych reszt cysteiny dostarczają dodatkowego wglądu w funkcjonalne skutki takich modyfikacji.

Przepływ pracy można dostosować do wielu typów próbek, w tym hodowanych komórek (np. ssaków, prokariotów) i całych tkanek (np. serca, płuc, mięśni), które są początkowo poddawane lizie/homogenizacji, a wolne tiole są alkilowane, aby zapobiec sztucznemu utlenianiu. Utlenione tiole białkowe są następnie redukowane i wychwytywane przez żywicę o powinowactwie do tioli, co usprawnia i upraszcza etapy pracy, umożliwiając przeprowadzenie procedur trawienia, znakowania i mycia bez dodatkowego transferu białek/peptydów. Na koniec znakowane peptydy są eluowane i analizowane przez LC-MS / MS w celu ujawnienia kompleksowych zmian stechiometrycznych związanych z utlenianiem tiolu w całym proteomie. Metoda ta znacznie poprawia zrozumienie roli regulacji zależnej od redoks w stanach fizjologicznych i patofizjologicznych związanych z utlenianiem tiolu białek.

Wprowadzenie

W warunkach homeostazy komórki wytwarzają reaktywne formy tlenu, azotu lub siarki, które ułatwiają procesy, takie jak metabolizm i sygnalizacja^1,2,3, co obejmuje zarówno prokariota, jak i eukarionty. Fizjologiczne poziomy tych reaktywnych gatunków są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania komórek, znanych również jako 'eustress'^1,4. W przeciwieństwie do tego, wzrost utleniaczy, który prowadzi do braku równowagi między utleniaczami a przeciwutleniaczami, może powodować stres oksydacyjny, czyli 'niepokój'

Protokół

Wszystkie procedury opisane w protokole dotyczące próbek/tkanek zwierzęcych lub ludzkich zostały zatwierdzone i przestrzegały wytycznych instytucjonalnych komisji etycznej ds. badań na ludziach i zwierzętach.

1. Homogenizacja/liza próbki

1. Zamrożone próbki tkanek
   1. Zmielić zamrożoną tkankę (~30 mg) na szklanym szkiełku mikroskopowym na suchym lodzie za pomocą wstępnie schłodzonej żyletki i kleszczyków. Przenieść zmieloną tkankę do wstępnie schłodzonej probówki z polistyrenu okrągłodennego o pojemności 5 ml zawierającej 700 μl buforu A (patrz tabela 1) i inkubować na lodzie przez 30 minut, chroniąc przed ....

Wyniki

Zakończenie protokołu pozwoli na uzyskanie wysokospecyficznego wzbogacenia peptydów zawierających uprzednio utlenione cysteiny, często ze specyficznością >95%^27,35,36. Niemniej jednak kilka kluczowych etapów protokołu wymaga szczególnej uwagi, np. wstępne blokowanie wolnych grup tiolowych przed lizą/homogenizacją próbki, co zapobiega sztucznemu utlenianiu i niespecyficznemu wzbogaceniu sztucznie utlenionych tioli

Dyskusja

Wychwytywanie wspomagane żywicą zostało wykorzystane w różnych typach próbek i systemach biologicznych do badania oksydacyjnych modyfikacji reszt cysteiny 25,29,30. Metoda ta pozwala na ocenę próbek na wielu poziomach i odczyty, w tym białek i peptydów za pomocą SDS-PAGE i analizy western blot, a także poszczególnych miejsc cysteiny za pomocą spektrometrii mas. Niezależnie od rodzaju próbki lub końcowego punktu końcowego, metoda.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorowodorek 2-(Pirydylo)etyloaminy	Med Chem Express	HY-101794	Odczynnik do własnej syntezy żywicy
2,0 ml probówki wirówkowe LoBind	Eppendorf	22431048
5,0 ml	Falcon	352054
Aceton	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitryl	Sigma Aldrich	34998
Aktywowany tiol– Sefroza  4B	Sigma Aldrich	T8512	Potencjalny zamiennik żywicy o powinowactwie do tiolu
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra 0,5 ml	Millipore Sigma	UFC5010BK
Wodorowęglan amonu	Sigma Aldrich	09830
Kwas bicynowy (BCA)	Thermo Scientific	23227	Odczynnik do oznaczania białek
	Eppendorf	5810R
Wirówka	Eppendorf	5415R
Ditiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
Bufor HEPES	Homogenizator Sigma Aldrich	H4034
	BioSpec Products	985370
Jodoacetymid (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-etylomaleimid	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Odczynnik do własnej syntezy żywic
QIAvac 24 Plus kolektor próżniowy	Qiagen	19413
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S3014
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Kolumny wirujące	Thermo Scientific	69705
Kolumny z odwróconą fazą Strata C18-E	Phenomenex	8B-S001-DAK	Termomikser do odsalania peptydów
	Eppendorf	5355
Sefaroza tiopropylowa 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Żywica o powinowactwie do tiolu; *Produkcja żywicy Thiopropyl Sepharose 6B została zakończona przez producenta (szczegóły w protokole).
Etykiety izobaryczne TMT (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Odczynnik do znakowania peptydów; dostępny w wielu formatach
Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Kwas trifluorooctowy (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsyna	Promega	V5820
Mocznik	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	koncentrator próżni
Mieszalnik wirowy Scientific	Industries	SI-0236

5,0 ml Probówki wirówkowe LoBind Eppendorf 30108310