Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62671

⸱

21 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Integrative Omics, Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Bioproducts Sciences and Engineering Laboratory, Department of Biological Systems Engineering, Washington State University

W tym artykule

Podsumowanie

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Streszczenie

Odwracalne modyfikacje oksydacyjne tioli białkowych stały się ostatnio ważnymi mediatorami funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisano szczegółową procedurę ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą (RAC) w połączeniu z tandemowym znakowaniem masowym (TMT) izobarycznym i chromatografią cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS / MS), aby umożliwić multipleksowaną stochiometryczną kwantyfikację utlenionych tioli białkowych na poziomie proteomu. Specyficzne dla danego miejsca informacje ilościowe na temat utlenionych reszt cysteiny dostarczają dodatkowego wglądu w funkcjonalne skutki takich modyfikacji.

Przepływ pracy można dostosować do wielu typów próbek, w tym hodowanych komórek (np. ssaków, prokariotów) i całych tkanek (np. serca, płuc, mięśni), które są początkowo poddawane lizie/homogenizacji, a wolne tiole są alkilowane, aby zapobiec sztucznemu utlenianiu. Utlenione tiole białkowe są następnie redukowane i wychwytywane przez żywicę o powinowactwie do tioli, co usprawnia i upraszcza etapy pracy, umożliwiając przeprowadzenie procedur trawienia, znakowania i mycia bez dodatkowego transferu białek/peptydów. Na koniec znakowane peptydy są eluowane i analizowane przez LC-MS / MS w celu ujawnienia kompleksowych zmian stechiometrycznych związanych z utlenianiem tiolu w całym proteomie. Metoda ta znacznie poprawia zrozumienie roli regulacji zależnej od redoks w stanach fizjologicznych i patofizjologicznych związanych z utlenianiem tiolu białek.

Wprowadzenie

W warunkach homeostazy komórki wytwarzają reaktywne formy tlenu, azotu lub siarki, które ułatwiają procesy, takie jak metabolizm i sygnalizacja1,2,3, co obejmuje zarówno prokariota, jak i eukarionty. Fizjologiczne poziomy tych reaktywnych gatunków są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania komórek, znanych również jako 'eustress'1,4. W przeciwieństwie do tego, wzrost utleniaczy, który prowadzi do braku równowagi między utleniaczami a przeciwutleniaczami, może powodować stres oksydacyjny, czyli 'niepokój'1, co prowadzi do uszkodzenia komórek. Utleniacze przekazują sygnały do szlaków biologicznych poprzez modyfikację różnych biomolekuł, w tym białek, DNA, RNA i lipidów. W szczególności reszty cysteinowe białek są wysoce reaktywnymi miejscami podatnymi na utlenianie ze względu na grupę tiolową na cysteinie, która jest reaktywna w stosunku do różnych typów utleniaczy5. Prowadzi to do powstania różnorodnego zakresu odwracalnych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) cysteiny opartych na redoks, w tym nitrozylacji (SNO), glutationylonacji (SSG), sulfenylacji (SOH), persiarczkowania (SSH), polisiarczku (SSnH), acylacji i dwusiarczków. Nieodwracalne formy utleniania cysteiny obejmują sulfinylację (SO2H) i sulfonylację (SO3H).

Odwracalne modyfikacje oksydacyjne reszt cysteiny mogą pełnić funkcje ochronne, zapobiegając dalszemu nieodwracalnemu utlenianiu lub służyć jako cząsteczki sygnałowe dla dalszych szlaków komórkowych6,7. Odwracalność niektórych tiolowych redoks PTM pozwala miejscom cysteiny funkcjonować jako "przełączniki redoks"8,9, przy czym zmiany w stanie redoks tych miejsc zmieniają funkcję białka, regulując ich rolę w procesach przejściowych. Modulacyjne efekty redoks PTMs10 zaobserwowano w wielu aspektach funkcji białek11, w tym w katalizie12, interakcje białko-białko13, zmiana konformacji14, koordynacja jonów metali15, lub wiązanie inhibitorów farmakologicznych16. Dodatkowo, redoks PTM są zaangażowane w miejsca cysteinowe białek, które regulują szlaki, takie jak transkrypcja17, translation18 lub metabolism19. Biorąc pod uwagę wpływ, jaki redoks PTM wywierają na funkcję białek i procesy biologiczne, ważne jest ilościowe określenie zakresu utlenienia, jakiemu ulega miejsce cysteiny w odpowiedzi na zaburzenie stanu redoks.

Identyfikacja miejsc cysteiny ze zmienionymi stanami redoks skupia się na porównaniu stopnia utlenienia na poziomie specyficznym dla danego miejsca między warunkami normalnymi i zaburzonymi. Pomiary zmian fałdowania są często wykorzystywane do określenia, które miejsca są znacząco zmienione, ponieważ pomaga to użytkownikom zinterpretować, które miejsca cysteiny mogą być fizjologicznie istotne dla badania. Alternatywnie, pomiary stechiometryczne odwracalnego utleniania tiolu w określonym typie próbki dają ogólny obraz stanu fizjologicznego w odniesieniu do utleniania komórkowego, ważnego pomiaru, który jest często pomijany i niedostatecznie wykorzystywany. Modyfikacja stechiometrii opiera się na ilościowym określeniu procentu zmodyfikowanego tiolu jako stosunku do całkowitego tiolu białkowego (zmodyfikowanego i niezmodyfikowanego)20,21. W rezultacie pomiary stechiometryczne oferują bardziej precyzyjny pomiar niż zmiana zagięcia, zwłaszcza w przypadku korzystania ze spektrometrii mas. Znaczenie wzrostu utleniania można łatwiej ustalić, stosując stechiometrię w celu określenia zajętości PTM w określonym miejscu cysteiny. Na przykład 3-krotny wzrost utleniania tiolu może wynikać z przejścia od 1% do 3% lub nawet od 30% do 90%. 3-krotny wzrost utlenienia w miejscu, które jest zajęte tylko w 1%, może mieć niewielki wpływ na funkcję białka; Jednak 3-krotny wzrost w przypadku obiektu z 30% obłożeniem w stanie spoczynku może mieć bardziej znaczący wpływ. Pomiary stechiometryczne, gdy są wykonywane między całkowitymi utlenionymi tiolami a specyficznymi modyfikacjami oksydacyjnymi, w tym glutationylacją białek (SSG) i nitrozylacją (SNO), mogą ujawnić proporcje i informacje ilościowe w odniesieniu do określonych typów modyfikacji.

Ponieważ odwracalne utlenianie tiolowe jest zazwyczaj modyfikacją potranslacyjną o niskiej obfitości, opracowano wiele podejść do wzbogacania białek zawierających te modyfikacje z próbek biologicznych. Wczesne podejście opracowane przez Jaffreya i innych, nazwane techniką zmiany biotyny (BST)22, obejmuje wiele etapów, w których niezmodyfikowane tiole są blokowane przez alkilację, odwracalnie zmodyfikowane tiole są redukowane do powstających wolnych tioli, powstające wolne tiole są znakowane biotyną, a znakowane białka są wzbogacane przez zmniejszenie powinowactwa streptawidyny. Technika ta została wykorzystana do profilowania SNO i SSG w wielu badaniach i może być dostosowana do sondowania innych form odwracalnego utleniania tiolu23,24. Podczas gdy BST został wykorzystany do sondowania różnych form odwracalnego utleniania tiolu, jednym z problemów związanych z tym podejściem jest to, że na wzbogacenie wpływa niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek ze streptawidyną. Alternatywne podejście opracowane w naszym laboratorium, nazwane wychwytywaniem wspomaganym żywicą (RAC)25,26 (Rysunek 1), omija problem wzbogacania grup tiolowych za pomocą układu biotyna-streptawidyna.

Po redukcji odwracalnie utlenionych tioli, białka z powstającymi wolnymi tiolami są wzbogacane przez żywicę o powinowactwie tiolowym, która kowalencyjnie wychwytuje wolne grupy tiolowe, co pozwala na bardziej specyficzne wzbogacenie białek zawierających cysteinę niż BST. Sprzężenie RAC z multipleksującą mocą najnowszych osiągnięć w znakowaniu izobarycznym i spektrometrii mas tworzy solidny i czuły przepływ pracy do wzbogacania, identyfikacji i kwantyfikacji odwracalnie utlenionych reszt cysteiny na poziomie całego proteomu. Ostatnie postępy w spektrometrii mas umożliwiły znacznie głębsze profilowanie tiolowego proteomu redoks, zwiększając zrozumienie zarówno przyczyny, jak i skutków utleniania tiolowego białek27. Informacje uzyskane z danych ilościowych specyficznych dla danego miejsca pozwalają na dalsze badania mechanistycznych skutków i dalszych skutków odwracalnych modyfikacji oksydacyjnych28. Wykorzystanie tego przepływu pracy zapewniło wgląd w fizjologiczne skutki odwracalnego utleniania cysteiny w odniesieniu do normalnych zdarzeń fizjologicznych, takich jak starzenie się, w których poziomy SSG różniły się w zależności od wieku. Wpływ starzenia się na SSG został częściowo odwrócony za pomocą SS-31 (elamipretydu), nowego peptydu, który poprawia funkcję mitochondriów i zmniejsza poziom SSG u starszych myszy, powodując, że mają one profil SSG bardziej podobny do młodych myszy29.

Wykazano, że stany patofizjologiczne przypisywane ekspozycji na nanocząstki obejmują SSG w mysim modelu makrofagowym. Korzystając z RAC w połączeniu ze spektrometrią mas, autorzy wykazali, że poziomy SSG były bezpośrednio skorelowane ze stopniem stresu oksydacyjnego i upośledzeniem funkcji fagocytarnej makrofagów. Dane ujawniły również różnice specyficzne dla szlaku w odpowiedzi na różne zmodyfikowane nanomateriały, które indukują różne stopnie stresu oksydacyjnego30. Metoda ta dowiodła również swojej przydatności u gatunków prokariotycznych, gdzie została zastosowana do badania wpływu cykli dobowych na fotosyntetyczne sinice w odniesieniu do utleniania tiolu. Zaobserwowano szerokie zmiany w utlenianiu tiolu w kilku kluczowych procesach biologicznych, w tym w transporcie elektronów, wiązaniu węgla i glikolizie. Ponadto, dzięki walidacji ortogonalnej, potwierdzono, że kilka kluczowych miejsc funkcjonalnych zostało zmodyfikowanych, co sugeruje rolę regulacyjną tych modyfikacji oksydacyjnych6.

Tutaj opisujemy szczegóły ustandaryzowanego przepływu pracy (Rysunek 1), demonstrując użyteczność podejścia RAC do wzbogacania całkowitych utlenionych tioli cysteinowych białek oraz ich późniejszego znakowania i stechiometrycznej kwantyfikacji. Ten przepływ pracy został zaimplementowany w badaniach stanu redoks w różnych typach próbek, w tym w hodowlach komórkowych27,30 i całych tkanek (np. mięśni szkieletowych, serca, płuc)29,31,32,33. Chociaż nie jest to tutaj uwzględnione, protokół RAC można również łatwo dostosować do badania określonych form odwracalnych modyfikacji redoks, w tym SSG, SNO i S-acylacji, jak wspomniano wcześniej25,29,34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w protokole dotyczące próbek/tkanek zwierzęcych lub ludzkich zostały zatwierdzone i przestrzegały wytycznych instytucjonalnych komisji etycznej ds. badań na ludziach i zwierzętach.

1. Homogenizacja/liza próbki

  1. Zamrożone próbki tkanek
    1. Zmielić zamrożoną tkankę (~30 mg) na szklanym szkiełku mikroskopowym na suchym lodzie za pomocą wstępnie schłodzonej żyletki i kleszczyków. Przenieść zmieloną tkankę do wstępnie schłodzonej probówki z polistyrenu okrągłodennego o pojemności 5 ml zawierającej 700 μl buforu A (patrz tabela 1) i inkubować na lodzie przez 30 minut, chroniąc przed światłem.
    2. Rozbijaj tkankę przez 30 sekund lub do całkowitej homogenizacji za pomocą ręcznego homogenizatora tkankowego. Umieścić próbki na lodzie i pozostawić pianę do opadnięcia na kolejne 10 minut
      UWAGA: Aluminiowa blacha do pieczenia umieszczona na suchym lodzie zapewnia stabilną powierzchnię roboczą i platformę do wstępnej obróbki/mielenia tkanki.
  2. Alternatywnie jako materiał wyjściowy należy użyć przylegających kultur komórkowych w szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm.
    1. Utrzymuj komórki na lodzie i za pomocą pipety serologicznej przepłucz komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego PBS zawierającego 100 mM NEM.
    2. Poddać komórki lizie, dodając 1 ml zimnego buforu do homogenizacji/lizy i energicznie skrobając sztywnym skrobakiem do komórek. Przenieść lizat do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml za pomocą mikropipety.
      UWAGA: Bufor płuczący i bufor do lizy mogą być odpowiednio skalowane do naczyń hodowlanych o różnych rozmiarach. Zazwyczaj wymagane jest 2-5 milionów komórek; Różni się to jednak w zależności od wydajności lizy i wydajności białka dla określonych typów komórek. Bufor homogenizacyjny może być przygotowany bez NEM dla próbek analizowanych na zawartość tioli ogółem.
  3. Otrzymany homogenat (etap 1.1.2 lub 1.2.2) przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml za pomocą mikropipety i odwirować z pełną prędkością (≥16 000 × g) w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  4. Przenieść supernatant (~700 μl lub ~1 ml w przypadku hodowli komórkowej) za pomocą mikropipety do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml i inkubować przez 30 minut w temperaturze 55 °C w ciemności, wytrząsając przy 850 obr./min.
  5. Za pomocą szklanej pipety serologicznej dodać do próbek 4 ml lodowatego acetonu i inkubować w temperaturze -20 °C przez noc w celu wytrącenia białka i usunięcia nadmiaru N-etylomaleimidu.

2. Wychwyt wspomagany żywicą

  1. Przepłukać wytrącone granulki białka dwukrotnie acetonem, odwirowując w temperaturze 20 500 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, dekantując aceton, usuwając pozostały aceton za pomocą mikropipety i dodając 3 ml świeżego, lodowatego acetonu za pomocą szklanej pipety serologicznej. Odwróć kilka razy, aby wymieszać. Po drugim praniu pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu przez 1-2 minuty, uważając, aby nie przesuszyć się, ponieważ ponowne zawieszenie może stać się trudne.
  2. Za pomocą mikropipety dodać 1 ml buforu B (patrz Tabela 1) i rozpuścić białko, powtarzając sonikację przez 15-30 s za każdym razem, używając sonikatora kąpielowego o mocy wyjściowej 250 W i krótkiego wirowania. Zmierz stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z protokołem producenta.
  3. Aby ustandaryzować stężenia białek w próbkach do dalszego przetwarzania i zapewnić całkowite usunięcie NEM, należy przenieść 500 μg białka do filtra odśrodkowego o pojemności 0,5 ml i 10 kDa za pomocą mikropipety i dostosować do końcowej objętości 500 μl z buforem do rezaspensji.
  4. Odwirować przy 14 000 × g w temperaturze pokojowej do momentu, gdy objętość w filtrze odśrodkowym będzie mniejsza niż 100 μl. Próbki należy zebrać, odwracając filtr w probówce zbiorczej. Odwirować przy 1 000 × g przez 2 minuty i dostosować do końcowej objętości 500 μl przy użyciu buforu C (patrz tabela 1).
  5. Zredukować tiole białkowe, dodając 20 μl 500 mM ditiotreitolu (DTT) za pomocą mikropipety do końcowego stężenia 20 mM i inkubując próbki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 850 obr./min.
  6. Po rozdrobnieniu przenieść próbki za pomocą mikropipety do 0,5 ml filtrów odśrodkowych o stężeniu 10 kDa i odwirowywać przez 15 minut przy 14 000 × g w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy objętość w filtrze odśrodkowym będzie mniejsza niż 100 μl. Dodać bufor D (patrz tabela 1), aby uzupełnić objętość filtra odśrodkowego do 500 μl.
    1. Powtórzyć trzykrotnie odwirowywanie i dodanie do 500 μl w kroku 2.6, a po czwartym odwirowaniu zebrać próbki, odwracając filtr w probówce zbiorczej i odwirowując przy 1 000 × g przez 2 minuty.
  7. Zmierz stężenie białka za pomocą testu BCA zgodnie z protokołem producenta.
  8. Podczas tej wymiany buforowej należy przygotować żywicę o powinowactwie tiolowym, ważąc odpowiednią ilość żywicy (30 mg/próbkę) za pomocą mikrowagi i przenosząc ją do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie, za pomocą pipety serologicznej, dodaj wodę do końcowego stężenia 30 mg/ml żywicy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z mieszaniem w celu prawidłowego nawodnienia żywicy.
    UWAGA: Wspomniana powyżej żywica o powinowactwie tiolowym została wycofana przez producenta. Możliwy zamiennik tej żywicy o powinowactwie do tiolu jest dostępny na rynku. Jednak ten zamiennik ma prawie 5-krotnie mniejszą zdolność wiązania (patrz Informacje uzupełniające). Alternatywnie, żywica o powinowactwie do tiolu może być syntetyzowana przy użyciu chlorowodorku 2-(pirydyloditio) etyloaminy i żywicy aktywowanej N-hydroksysukcynimidem (patrz Informacje uzupełniające).
    1. Po uwodnieniu żywicy umieść kolumny wirujące na kolektorze próżniowym i przenieś 500 μl zawiesiny żywicy za pomocą mikropipety do każdej kolumny. Zastosuj próżnię do usunięcia wody; Powtórz ten krok raz, aby uzyskać łącznie 30 mg żywicy na kolumnę. Alternatywnie, należy odwirować przy 1 000 × g przez 2 minuty zamiast używać kolektora próżniowego do tego i wszystkich etapów płukania żywicy i elucji.
      UWAGA: Przecięcie końcówki pipety o pojemności 1000 μl w celu zwiększenia rozmiaru otworu pomaga w przenoszeniu żywicy. Ważne jest, aby rozcierać między pipetowaniami, aby upewnić się, że żywica pozostaje zawieszona, a jednorodne i równe ilości żywicy są przenoszone do każdej kolumny.
    2. Przemyć żywicę, dodając 500 μl ultraczystej wody za pomocą mikropipety i stosując podciśnienie w celu usunięcia wody; powtórz to 5 razy. Następnie przemyć żywicę 5 razy 500 μl buforu E (patrz Tabela 1).
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować wirowanie przy 1 000 x g przez 2 minuty zamiast kolektora próżniowego dla wszystkich kolejnych etapów mycia. Wszystkie kolejne etapy mycia wykonywane są z objętością 500 μl. Podczas dodawania płuczących do kolumny, ostrożnie dodawać z wystarczającą siłą, aby całkowicie zawiesić żywicę, unikając rozpryskiwania i utraty żywicy; Pozwala to na całkowite i skuteczne mycie żywicy.
  9. Za pomocą mikropipety przenieść 150 μg białka z każdej zredukowanej próbki do nowej probówki i dostosować do końcowej objętości 120 μl buforu C (patrz tabela 1). Przenieść roztwór białkowy za pomocą mikropipety do zatkanej kolumny wirowej zawierającej żywicę, umieścić nakrętkę na kolumnie i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 850 obr./min.
  10. Przemyć żywicę pięć razy 25 mM HEPES, pH 7,0; 8 M mocznika; następnie pięć razy 2 M NaCl; następnie pięć razy 80% acetonitrylem (ACN) z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA); a na koniec pięć razy 25 mM HEPES, pH 7,7, jak opisano w kroku 2.8.2 i wymienić wtyczkę.
    UWAGA: W tym miejscu próbki mogą być eluowane do analizy na poziomie białka (np. elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE), western blot), jak opisano w kroku 4.1.

3. Trawienie tryptyczne na żywicy i etykietowanie TMT

  1. Przygotować wystarczającą ilość zmodyfikowanego roztworu trypsyny do sekwencjonowania na 6-8 μg na próbkę, rozpuszczając go w stężeniu 0,5 μg/μl w buforze C (patrz Tabela 1), tak aby końcowa objętość pozwalała na co najmniej 120 μl na próbkę. Za pomocą mikropipety dodać 120 μl roztworu trypsyny do próbek i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 850 obr./min.
    UWAGA: Aby zwiększyć wydajność trawienia, następnego dnia można dodać dodatkowy etap trawienia, usuwając roztwór trypsyny i zastępując go świeżym roztworem i kontynuując trawienie przez 2 godziny.
  2. Płukać żywicę pięć razy 25 mM HEPES, pH 7,0; następnie pięć razy 2 M NaCl; następnie pięć razy 80% ACN z 0,1% TFA; a następnie trzy razy 25 mM HEPES, pH 7,7. Na koniec umyj żywicę dwukrotnie 50 mM buforem wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) i wymień korek.
  3. Przygotuj odczynniki do etykietowania TMT, najpierw pozwalając im ogrzać się do temperatury pokojowej, a następnie krótko odwirować za pomocą wirówki o masie 16 000 × g. Dodać 150 μl bezwodnego ACN do każdej fiolki odczynnika do znakowania TMT za pomocą mikropipety. Inkubować fiolki w temperaturze pokojowej na termomikserze ustawionym na 850 obr./min przez 5 minut, aby całkowicie rozpuścić odczynnik. Krótko zwiruj i odwiruj z prędkością 16 000 × g, aby zebrać odczynnik.
  4. Za pomocą mikropipety dodać 40 μl 100 mM TEAB do przemytej żywicy, następnie dodać 70 μl rozpuszczonego odczynnika TMT i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem z prędkością 850 obr./min. Pozostały odczynnik TMT należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Zwróć uwagę na indywidualne etykiety TMT przypisane do każdej próbki biologicznej (Rysunek 1).
  5. Umyj żywicę pięć razy 80% ACN z 0,1% TFA, trzy razy 100 mM buforem wodorowęglanu amonu (ABC) o pH 8,0 i dwa razy wodą, jak opisano wcześniej i wymień korek.

4. Elucja peptydów

  1. Eluować znakowane peptydy, dodając 100 μl 20 mM DTT w 100 mM ABC, pH 8,0, do każdej kolumny za pomocą mikropipety i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut na termomikserze ustawionym na 850 obr./min.
    UWAGA: Po dodaniu naziemnej telewizji cyfrowej żywica będzie się zbrylać. Żywicę można rozbić za pomocą końcówki pipety, aby rozbić grudki i zapewnić całkowitą eliminację peptydów.
  2. Po tej inkubacji umieścić kolumnę na kolektorze próżniowym przeznaczonym do ekstrakcji do fazy stałej (SPE), zastosować próżnię i wymyć próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 5 ml. Powtórz ten krok raz.
  3. Na koniec dodać 100 μl 80% ACN z 0,1% TFA, inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i eluować do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml. Zebrać wszystkie frakcje w tej samej probówce do mikrowirówki o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Aby zapobiec utracie próbki, do elucji należy używać probówek o niskim stopniu wiązania, a objętości muszą być utrzymywane na poziomie lub poniżej objętości 4,0 ml dla pojedynczej probówki o pojemności 5 ml.
  4. Uwolnione próbki umieścić w koncentratorze próżniowym do momentu wyschnięcia. Suche peptydy należy przechowywać w temperaturze -80 °C i ponownie zawiesić później.
    UWAGA: Próbki mogą być również eluowane oddzielnie, a podwielokrotność może być usunięta i przeanalizowana przez SDS-PAGE w celu analizy na poziomie peptydu przed połączeniem próbek.

5. Alkilowanie peptydów i odsalanie/oczyszczanie

  1. Ponownie zawiesić wysuszone peptydy, dodając niewielką objętość 100 mM buforu ABC o pH 8,0 (nie więcej niż 500 μl) za pomocą mikropipety. Stosować wielokrotną sonikację przez 15-30 s za każdym razem, używając sonikatora kąpielowego o mocy wyjściowej 250 W i wirować do solubilizacji i przeniesienia do probówki o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Objętość 100 mM ABC, pH 8,0, która ma zostać dodana, zależy od objętości potrzebnej do ponownego zawieszenia DTT przy molowości 150 mM. Użytkownicy będą musieli określić ilość naziemnej telewizji cyfrowej obecnej w ich próbce na podstawie tego, co zostało pierwotnie dodane w kroku 4.1.
  2. Dodać wystarczającą ilość stężonego roztworu podstawowego (600 mM) jodoacetamidu (IAA) rozpuszczonego w ABC za pomocą mikropipety, aby uzyskać stosunek molowy DTT:IAA 1:4 i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wytrząsaniem przy 850 obr./min.
  3. Zakwasić próbki do pH < 3 poprzez dodanie stężonego TFA (10%) za pomocą mikropipety i przeprowadzić odsalanie próbki przy użyciu czyszczenia w odwrotnej fazie zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Umieść czyste peptydy w koncentratorze próżniowym, aż wyschną. Przechowywać suche peptydy w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

6. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas

  1. Ponownie zawiesić wysuszone peptydy przez wielokrotną sonikację przez 15-30 s za każdym razem za pomocą sonikatora do kąpieli o mocy 250 W i wirowania w 20-40 μl wody zawierającej 3% ACN. Określ stężenie peptydu, wykonując test BCA zgodnie z protokołem producenta.
  2. Rozdziel próbki według odwróconych faz LC i MS/MS, jak opisano wcześniej6 i zapisz widma MS1 w zakresie m/z 400-2000. Upewnij się, że wysokoenergetyczna dysocjacja kolizyjna (HCD) jest wykorzystywana do uzyskania informacji o intensywności jonów reporterowych do analizy peptydów znakowanych izobarycznie. Więcej informacji na temat warunków pracy instrumentu można znaleźć w sekcjach metod w poprzednich raportach27,30 oraz analizie danych MS27,31.
    UWAGA: Do analizy próbek peptydów można używać różnych systemów lub ustawień LC-MS/MS. Zasięg i czułość identyfikacji peptydów będzie zależeć od konkretnego systemu i używanych ustawień.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zakończenie protokołu pozwoli na uzyskanie wysokospecyficznego wzbogacenia peptydów zawierających uprzednio utlenione cysteiny, często ze specyficznością >95%27,35,36. Niemniej jednak kilka kluczowych etapów protokołu wymaga szczególnej uwagi, np. wstępne blokowanie wolnych grup tiolowych przed lizą/homogenizacją próbki, co zapobiega sztucznemu utlenianiu i niespecyficznemu wzbogaceniu sztucznie utlenionych tioli

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wychwytywanie wspomagane żywicą zostało wykorzystane w różnych typach próbek i systemach biologicznych do badania oksydacyjnych modyfikacji reszt cysteiny 25,29,30. Metoda ta pozwala na ocenę próbek na wielu poziomach i odczyty, w tym białek i peptydów za pomocą SDS-PAGE i analizy western blot, a także poszczególnych miejsc cysteiny za pomocą spektrometrii mas. Niezależnie od rodzaju próbki lub końcowego punktu końcowego, metoda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Podziękowania

Część pracy była wspierana przez NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 i U24 DK112349

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek 2-(Pirydylo)etyloaminyMed Chem ExpressHY-101794Odczynnik do własnej syntezy żywicy
2,0 ml probówki wirówkowe LoBindEppendorf22431048
5,0 mlFalcon352054
AcetonFisher ScientificA949-1
AcetonitrylSigma Aldrich34998
Aktywowany tiol– Sefroza  4BSigma AldrichT8512Potencjalny zamiennik żywicy o powinowactwie do tiolu
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra 0,5 mlMillipore SigmaUFC5010BK
Wodorowęglan amonuSigma Aldrich09830
Kwas bicynowy (BCA)Thermo Scientific23227Odczynnik do oznaczania białek
Eppendorf5810R
WirówkaEppendorf5415R
Ditiothreitol (DTT)Thermo Scientific20291
EDTASigma AldrichE5134
Bufor HEPESHomogenizator Sigma AldrichH4034
BioSpec Products985370
Jodoacetymid (IAA)Sigma AldrichI1149
N-etylomaleimidSigma Aldrich4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast FlowCytiva17-0906-01Odczynnik do własnej syntezy żywic
QIAvac 24 Plus kolektor próżniowyQiagen19413
Chlorek soduSigma AldrichS3014
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma AldrichL6026
SonicatorBranson1510R-MT
Kolumny wirująceThermo Scientific69705
Kolumny z odwróconą fazą Strata C18-EPhenomenex8B-S001-DAKTermomikser do odsalania peptydów
Eppendorf5355
Sefaroza tiopropylowa 6BGE Healthcare17-0420-01Żywica o powinowactwie do tiolu; *Produkcja żywicy Thiopropyl Sepharose 6B została zakończona przez producenta (szczegóły w protokole).
Etykiety izobaryczne TMT (16 plex)Thermo ScientificA44522Odczynnik do znakowania peptydów; dostępny w wielu formatach
Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB)Sigma AldrichT7408
Kwas trifluorooctowy (TFA)Sigma AldrichT6508
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TrypsynaPromegaV5820
MocznikSigma AldrichU5378
Vacufuge Plus speedvacEppendorf22820001koncentrator próżni
Mieszalnik wirowy ScientificIndustriesSI-0236
5,0 ml Probówki wirówkowe LoBind Eppendorf 30108310

Bibliografia

  1. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  2. Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
  3. Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824(2021).
  4. Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867(2021).
  5. Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
  6. Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
  7. Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051(2020).
  8. Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167(2017).
  9. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  10. Go, Y. M., Jones, D. P. The redox proteome. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).
  11. Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
  12. Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997(2015).
  13. Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486(2019).
  14. Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -P., Dietz, K. -J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515(2020).
  15. Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
  16. Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173(2014).
  17. Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
  18. Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324(2018).
  19. Gao, X. -H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
  20. Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
  21. Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
  22. Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
  23. Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
  24. Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
  25. Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  26. Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
  27. Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649(2020).
  28. Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
  29. Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
  30. Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
  31. Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758(2020).
  32. Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
  33. Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513(2020).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
  36. Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
  37. Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354(2020).
  38. Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
  39. Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315(2020).
  40. Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
  41. Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
  42. Hsu, M. -F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
  43. Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
  44. Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
  45. Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proteomika redoksywica powinowata do tiolianaliza LC MS MStrawienie trypsynWestern blotSDS PAGEutlenianie cysteiny
Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.