Artykuł metodologiczny

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62672

⸱

8 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Streszczenie

Rozwiązanie niejednorodności konformacyjnej wielu stanów białkowych, które współistnieją w roztworze, pozostaje jedną z głównych przeszkód w charakterystyce terapii białkowej i określaniu konformacyjnych szlaków przejściowych krytycznych dla funkcji biologicznych, począwszy od rozpoznawania molekularnego po katalizę enzymatyczną. Reakcja wymiany wodor/deuter (HDX) w połączeniu z analizą spektrometrii mas (MS) od góry do dołu umożliwia scharakteryzowanie struktur i dynamiki białek wyższego rzędu w sposób specyficzny dla konformisty. Konformacyjna zdolność rozdzielcza tej techniki jest w dużym stopniu zależna od skuteczności rozdzielania stanów białkowych na poziomie nienaruszonego białka i minimalizacji resztkowej zawartości niedeuterowanego protonu podczas reakcji HDX.

Tutaj opisujemy wariant metody HDX MS oparty na elektroforezie kapilarnej (CE), który ma na celu poprawę rozdzielczości konformacyjnej. W tym podejściu białka ulegają reakcjom HDX podczas migracji przez deuterowany roztwór elektrolitu tła (BGE) podczas kapilarnej separacji elektroforetycznej. Różne stany białek lub proteoformy, które współistnieją w roztworze, można skutecznie rozdzielić na podstawie ich różnych stosunków ładunku do wielkości. Różnica w ruchliwości elektroforetycznej między białkami a cząsteczkami rozpuszczalnika protycznego minimalizuje pozostałości rozpuszczalnika niedeuterowanego, co skutkuje prawie całkowitym środowiskiem deuteracji podczas procesu HDX. Przepływowy interfejs mikrofiolki CE-MS umożliwia wydajną jonizację elektronatryskową eluowanych form białek po szybkim zmieszaniu z roztworem modyfikatora hartującego i denaturującego na wylocie opryskiwacza. Odgórna analiza stwardnienia rozsianego online mierzy globalny poziom deuteracji elutulowanych nienaruszonych form białek, a następnie deuterację ich fragmentów w fazie gazowej. W niniejszej pracy przedstawiono to podejście w różnicowym HDX dla układów, w tym naturalnych wariantów białek współistniejących w mleku.

Wprowadzenie

Rozróżnianie gatunków białek w różnych stanach konformacji, wiązania lub modyfikacji oraz charakteryzowanie ich różnic strukturalnych jest ważne dla monitorowania ścieżek przejść między tymi gatunkami zaangażowanymi w zdarzenia biologiczne, począwszy od rozpoznawania molekularnego po katalizę enzymatyczną, oraz zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw tych zdarzeń. Konwencjonalne techniki biofizyczne nie zapewniają kompletnego rozwiązania ze względu na ograniczenia, takie jak niewystarczająca rozdzielczość i utrata dynamicznych informacji w roztworze. Wymiana wodór/deuter sprzężona ze spektrometrią mas (HDX MS) to technika znakowania cech strukturalnych i konformacyjnych białek deuterem (2H) poprzez wymianę między labilnymi atomami wodoru białek i 2H z celowo wprowadzonego roztworu 2H2O. Protony biorące udział w wiązaniach wodorowych lub sekwestrowane z rozpuszczalnika we wnętrzu białka nie wymieniają się łatwo1. Tak więc, ponieważ kurs wymiany w miejscu wymiennym jest w dużym stopniu zależny od jego udziału w strukturach wyższego rzędu, struktury białkowe mogą zostać ujawnione w wysokiej rozdzielczości przestrzennej przez MS, który bada zakres i szybkość wychwytu 2H w oparciu o różne masy atomowe między 1H a 2H. W ciągu ostatnich dziesięcioleci HDX MS stał się niezwykle skuteczną techniką badania konformacji i dynamiki białek2.

W klasycznym podejściu oddolnym HDX MS, zespół gatunków białek w różnych stanach konformacji, wiązania lub modyfikacji jest proteolizowany bez separacji na nienaruszonym poziomie białka, co sprawia, że niemożliwe jest scharakteryzowanie poszczególnych gatunków poprzez analizę powstałych fragmentów proteolitycznych o zawiłej zawartości deuteru. W przeciwieństwie do tego, w podejściu odgórnym, różne stany białek lub proteoformy, które zawierają różną zawartość deuteru, powodują wielokrotne rozkłady nienaruszonych mas białkowych w skanowaniu stwardnienia rozsianego. Pozwala to na rozdzielenie poszczególnych gatunków poprzez selekcję masową jonów odpowiadających każdemu rozkładowi masy przy użyciu odpowiedniego filtra masowego (takiego jak kwadrupol) i scharakteryzowanie ich różnic konformacyjnych w późniejszej tandemowej analizie MS3,4,5,6. Jednak skuteczność rozdzielania stanów białkowych lub proteoform w tej strategii jest ograniczona przez zakres różnic w odpowiadających im rozkładach masy.

Elektroforeza kapilarna (CE) umożliwia rozdzielanie form białek na podstawie ich różnych ładunków i rozmiarów hydrodynamicznych w fazie roztworu z wysoką wydajnością7. Połączenie CE z HDX zapewnia dodatkową separację stanów białkowych lub proteoform w fazie roztworu. Ponadto niewielka objętość kapilary CE pozwala na wykorzystanie w pełni zdeuterowanego roztworu jako roztworu elektrolitu tła (BGE), tj. bufora bieżącego, dzięki czemu kapilara staje się reaktorem HDX dla próbek białkowych. Ze względu na różnicę w ruchliwości elektroforetycznej między białkami a odczynnikami protonowymi w procesie elektroforezy, prowadzenie HDX podczas CE skutkuje prawie całkowitym środowiskiem deuteracyjnym dla analitów białkowych z minimalną resztkową zawartością niedeuterowaną, zwiększając w ten sposób czułość analizy strukturalnej przy użyciu danych HDX. W związku z tym opracowaliśmy oparte na CE różnicowe podejście HDX w połączeniu z odgórnym MS, aby scharakteryzować struktury białek wyższego rzędu w sposób specyficzny dla stanu lub proteozy8.

Ten artykuł opisuje protokoły dla tego podejścia, szczegółowo opisując etapy przygotowania materiału, procedury eksperymentalnej i analizy danych. Czynniki, które mogą mieć wpływ na wydajność metody lub jakość danych, są wymienione w krótkich notatkach. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki obejmują zróżnicowane dane HDX mieszanin różnych białek i naturalnych wariantów bydlęcej β-laktoglobuliny (β-lg), głównego białka serwatkowego obecnego w klasie milk9. Wykazujemy skuteczność separacji, odtwarzalność i wydajność znakowania 2H dwóch licznych wariantów β-lg, tj. A i B10,11 podczas HDX opartej na CE i specyficznej dla wariantu charakterystyki ich konformacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: W miarę możliwości należy stosować odczynniki klasy HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa) lub klasy MS, aby zminimalizować ilość zanieczyszczeń, które mogą zakłócać analizę MS. Podczas pomiaru nie wolno dotykać interfejsu CE-MS gołymi rękami, aby uniknąć ryzyka porażenia prądem spowodowanego napięciem elektroforetycznym lub napięciem rozpylania elektrycznego.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Modyfikacja kapilary z topionego kwarcu do CE
    1. Przygotować 5% (w/w) roztwór hydroksypropylocelulozy (HPC), rozpuszczając proszek HPC (masa cząsteczkowa [MW]: 100 kDa) w wodzie przy ciągłym mieszaniu w temperaturze pokojowej za pomocą mieszadła magnetycznego przez ok. 12 h lub do całkowitego zniknięcia cząsteczek stałych12. Usunąć widoczne pęcherzyki powietrza za pomocą sonikatora.
    2. Zamontować kapilary z topionego szkła kwarcowego (średnica wewnętrzna [ID]: 50 µm, średnica zewnętrzna [OD]: 360 µm) o długości około 85 cm w urządzeniu CE. Przepłukać kapilarę poprzez ciągłe wprowadzanie rozpuszczalnika organicznego, takiego jak aceton13, przy użyciu autopróbnika CE pod ciśnieniem 40 psi przez 10-15 min.
    3. Wypełnić oczyszczoną kapilarę roztworem HPC za pomocą autopróbnika pod ciśnieniem 40 psi (co zazwyczaj zajmuje ok. 40 min). Wprowadzić powietrze do wypełnionej HPC kapilary pod ciśnieniem 40 psi, aby zapewnić swobodny przepływ powietrza w kapilarze, co potwierdza wydostawanie się pęcherzyków powietrza z kapilary po zanurzeniu w wodzie.
    4. Wypalić kapilarę powleczoną HPC w piecu z programowalną temperaturą (idealnie w termostacie kolumny chromatografu gazowego z programowaniem temperatury) przy przepływie azotu (25 psi) przez kapilarę, zgodnie z programem temperaturowym przedstawionym na Rysunku 1.
    5. Ostudzić piec do temperatury pokojowej przed wyjęciem kapilary. Użyć tak zmodyfikowanej kapilary HPC do rozdziału CE.

Wykres temperatury w funkcji czasu przedstawiający fazę grzania, wzrost od 70°C do 140°C, a następnie stabilizację.
Rycina 1: Zalecany program temperatury dla wypiekania kapilar. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Roztwór elektrolitu tła (BGE) i roztwór modyfikatora8
    1. Przygotować 1-10 mL BGE o żądanym stężeniu (np. 10 mM), rozpuszczając odpowiednią ilość octanu amonu w 2H2O. Rozdzielić BGE w 200 µL-alikwotach do osobnych fiolek BGE i szczelnie zamknąć fiolki parafilmem, aby zminimalizować reakcję HDX między BGE a parą wodną w powietrzu.
    2. Przygotować 10 mL roztworu modyfikatora składającego się z 75% (v/v) metanolu i 25% (v/v) wody, z pH dostosowanym do 2,5 przy użyciu kwasu mrówkowego.
      UWAGA: Do przygotowania roztworu modyfikatora należy użyć 2H2O oraz deuterowanego metanolu, jeżeli atomy deuteru w łańcuchach bocznych i niechronionych amidach szkieletowych powinny zostać zachowane w celu detekcji przez MS.
  2. Odsalanie próbek białek
    1. Przygotować roztwór octanu amonu w wodzie niedeuterowanej o żądanym stężeniu.
      UWAGA: Zaleca się stężenie poniżej 100 mM, aby uniknąć wysokiego natężenia prądu podczas elektroforezy i wynikającego z tego efektu grzania Joule'a.
    2. W razie potrzeby dostosować pH roztworu octanu amonu do pożądanego poziomu, używając kwasu mrówkowego (dla pH < 6,8) lub wodorotlenku amonu (dla pH > 6,8).
    3. Zastąpić pierwotne bufory roztworu białka roztworem octanu amonu (przygotowanym w wodzie niedeuterowanej o żądanym stężeniu; pH dostosowane do 7,5 wodorotlenkiem amonu) poprzez co najmniej pięć sekwencyjnych etapów zagęszczania i rozcieńczania w 4 °C, używając filtra wirowego o odpowiednim odcięciu MW.
      UWAGA: Próbki białek do odsalania mogą pochodzić z wcześniejszych procedur produkcyjnych (np. oczyszczania lub formulacji) lub zostać przygotowane poprzez rozpuszczenie liofilizowanego proszku białka. „Sole”, które należy usunąć z roztworów próbek na tym etapie, odnoszą się ogólnie do wszystkich małych jonów lub cząsteczek nielotnych. Chociaż gatunki te mogą być efektywnie oddzielone od białek podczas procesu elektroforezy, zaleca się ten etap, aby uniknąć pogorszenia rozdzielczości elektroforetycznej i tym samym zminimalizować zanieczyszczenie spektrometru mas. Jeśli anality białkowe wymagają stabilizacji specyficznymi solami lub dodatkami, należy włączyć je do BGE.
    4. Wyznaczyć stężenie białka za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis.

2. Zasada działania analizy HDX MS opartej na CE

UWAGA: Spektrometr mas użyty w tym podejściu powinien być wyposażony w analizator mas o ultrawysokiej rozdzielczości, taki jak Fourier-transform ion cyclotron resonance (FTICR) lub orbitrap, filtr mas, taki jak quadrupol, który umożliwia selekcję mas jonów prekursorowych do fragmentacji, oraz funkcje dysocjacji przez transfer elektronów (ETD) lub dysocjacji przez wychwyt elektronów (ECD), aby przeprowadzić analizę top-down z wiarygodnymi danymi tandemowej spektrometrii mas (idealnie z sygnałami jonów fragmentowych o rozdzielczości izotopowej).

  1. Optymalizacja ustawień CE i MS
    1. Przeprowadź pomiar pilotażowy MS przy użyciu standardowego źródła jonizacji elektrorspray (ESI), rozpylając albo wcześniej napełnioną próbkę z kapilary borokrzemianowej powlekanej metalem (schemat „statycznej” nanoESI), albo próbkę w sposób ciągły z emitera metalowego, aby zoptymalizować ustawienia MS dla pomiaru nienaruszonych białek (MS1) oraz ich fragmentów w fazie gazowej (MS2). Przeprowadź fragmentację interesujących gatunków białek poprzez selekcję masy zespołu jonów o pojedynczym stanie ładunku, a następnie zastosuj ETD lub ECD jonów prekursorowych.
      UWAGA: Kluczowe ustawienia obejmują parametry wpływające na desolwatację, selekcję masy jonów prekursorowych (aby uniknąć interferencji z innymi gatunkami) oraz wydajność fragmentacji. Zarówno centrum, jak i szerokość okna selekcji masy powinny zostać zwiększone, aby odpowiadały wynikowemu rozkładowi masy jonów analitycznych po HDX. Ponieważ okno elucji gatunku białka w CE zazwyczaj wynosi od 0,5 min do 2 min, oceń wydajność fragmentacji na podstawie skanów MS2 zgromadzonych w porównywalnym oknie czasowym. Optymalne wartości tych parametrów są specyficzne dla każdego białka; w celu uzyskania przykładowych ustawień należy odnieść się do wcześniej opublikowanych raportów8,14.
    2. Przeprowadź pomiar pilotażowy CE przy użyciu instrumentu CE wyposażonego w detektor optyczny, tj. detektor z matrycą fotodiod (PDA) lub detektor UV, aby zoptymalizować ustawienia CE dla rozdziału gatunków białek oraz czasy migracji, które są równoważne czasom reakcji HDX.
      UWAGA: Krok ten jest opcjonalny i zależy od dostępności detektora optycznego w urządzeniu CE. W przypadku braku detektora optycznego ustawienia CE można zoptymalizować za pomocą CE-MS po zakończeniu sekcji 2.2, zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 2.3. Kluczowe ustawienia obejmują parametry wpływające na wydajność rozdziału, kształty pików na elektroforegramach oraz czasy elucji.
  2. Wstępne przygotowanie układu CE-HDX
    1. Oczyść przepływowy interfejs CE-MS w mikrofialce mieszaniną 50% metanolu, 49% wody i 1% kwasu mrówkowego (v/v) przy użyciu ultradźwięków przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej.
    2. Po zamontowaniu kapilary modyfikowanej HPC w urządzeniu CE, przemyj kapilarę buforem BGE za pomocą aut samplerem przez 10 min i pozostaw kapilarę wypełnioną BGE.
    3. Odciśnij odpowiedni odcinek niemodyfikowanej kapilary z topionego szkła kwarcowego (ID: 50 µm, OD: 360 µm) jako przewód do infuzji roztworu modyfikatora. Połącz przewód modyfikatora z gazoszczelną strzykawką szklaną z tępym końcem za pomocą złączki i odpowiedniej tulei, a następnie przemyj przewód roztworem modyfikatora za pomocą pompy infuzyjnej przez co najmniej 10 min.
    4. Wprowadź wyloty kapilary CE powlekanej HPC oraz przewodu modyfikatora, które zostały napełnione odpowiednimi roztworami, do oczyszczonego interfejsu CE-MS, zgodnie z ilustracją na Rysunku 2.
    5. Przesuń tłok strzykawki do infuzji modyfikatora ręcznie lub za pomocą pompy infuzyjnej, aby upewnić się, że roztwór modyfikatora dotarł do końcówki interfejsu. Zamontuj złożony interfejs CE-MS w obudowie źródła nanoESI spektrometru mas.

Schemat elektroforezy kapilarnej sprzężonej ze spektrometrią mas, układ ESI-MS, proces detekcji tandemowej MS.
Rysunek 2: Schematyczny rysunek układu HDX MS opartego na CE. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie źródła8. Skróty: BGE = roztwór elektrolitu tła; CE = elektroforeza kapilarna; MS = spektrometria mas; HDX = wymiana wodór/deuter; ESI = jonizacja przez rozpylanie elektryczne; FTICR = rezonans cyklotronowy jonów z transformacją Fouriera; ETD = dysocjacja z przeniesieniem elektronu; ECD = dysocjacja przez wychwyt elektronu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Jednoczesna rozdział CE, reakcja HDX i analiza MS
    UWAGA: Zaleca się, aby zdeuterowany BGE był użyty w ciągu 1 dnia od otwarcia opakowania.
    1. Przyłożyć napięcie rozpylania od 3 do 5 kV do interfejsu CE-MS.
    2. Rozpocząć wprowadzanie roztworu modyfikatora za pomocą pompy infuzyjnej z szybkością przepływu od 0,1 do 10 µL/min i zapewnić stabilny elektrospray na końcówce interfejsu CE-MS.
    3. Umieścić w autoprobniku fiolkę z BGE i użyć jej w kroku 2.3.4 w celu pozyskania pustych elektroferogramów i pustych widm masowych.
    4. Wstrzyknąć roztwór próbki za pomocą autoprobnika przy ciśnieniu 2 psi i w odpowiednim czasie, aby umożliwić wstrzyknięcie pożądanej ilości próbki. Objętość wstrzyknięcia należy oszacować na podstawie zależności między objętością wstrzyknięcia a parametrami wstrzykiwania15 zdefiniowanej w równaniu (1).
      Równanie dynamiki płynów: V_inj=Δp×d_c^2×A×t_inj/32ηγL, formuła używana w analizie przepływu. (1).
      Gdzie Vinj to objętość wstrzyknięcia, Δp to ciśnienie wstrzykiwania, dc to średnica wewnętrzna kapilary, A to przekrój poprzeczny kapilary, tinj to czas wstrzykiwania, η to lepkość cieczy w kapilarze, a L to długość kapilary.
    5. Rozpocząć rozdział CE, przyłożone napięcie elektroforetyczne wynoszące 30 kV i ciśnienie infuzji od 0 do 2 psi, a następnie zarejestrować elektroferogram. Jednocześnie rozpocząć akwizycję danych MS w trybie chromatograficznym, w którym wykres prądu jonowego jest rejestrowany jako funkcja czasu, a odpowiadające mu skany MS nie są automatycznie łączone w jedno widmo.
      UWAGA: Białka ulegają spontanicznej reakcji HDX w momencie kontaktu z cząsteczkami 2H2O w BGE podczas ich migracji elektroforetycznej w tym kroku. Detekcja optyczna w CE może być stosowana dodatkowo do detekcji MS. Ponieważ detekcja na kolumnie wymaga usunięcia odpowiedniego odcinka powłoki polimidowej na końcu wylotowym kapilary kwarcowej, należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia kapilary podczas montażu interfejsu CE-MS.
    6. Zapisać pusty elektroferogram i widma masowe jako referencje.
      UWAGA: Dane puste powinny być używane do rozwiązywania problemów, a nie do odejmowania linii bazowej.
    7. Umieścić w autoprobniku fiolki z roztworami próbek białek o pożądanych stężeniach. Pozyskać elektroferogramy i widma masowe dla próbek białek zgodnie z krokami 2.3.4-2.3.5. Zebrać odpowiednią liczbę skanów MS, aby uzyskać widma MS1 elektroforetycznie rozdzielonych i znakowanych 2H gatunków białek.
    8. Przeprowadzić pomiary MS w tandemie dla interesujących gatunków albo po pozyskaniu widm MS1 w tym samym przebiegu, albo w kolejnym, osobnym przebiegu.
    9. W razie potrzeby skorygować czasy migracji/czasy reakcji HDX poprzez zmianę ciśnienia infuzji lub długości kapilary CE. Jeśli czas reakcji HDX musi być krótszy niż czas migracji, należy zastosować podejście opisane wcześniej8, w którym podczas procesu CE w kapilarze stosuje się zarówno zdeuterowany, jak i niezdeuterowany BGE.
    10. Przepłukać kapilarę CE za pomocą BGE pod ciśnieniem 20 psi przez co najmniej 10 min po każdym pomiarze.
    11. Po zakończeniu eksperymentów wyczyścić interfejs CE-MS oraz wszystkie przewody przed przechowywaniem.
    12. Pozyskać zestaw danych próbki „punktu końcowego” HDX (którą można przygotować zgodnie z metodami opisanymi wcześniej6,16) za pomocą MS w trybie bezpośredniej infuzji.
      ​UWAGA: Ten krok jest wymagany tylko wtedy, gdy do HDX opartego na CE stosowany jest zdeuterowany roztwór modyfikatora.

3. Analiza danych

  1. Analiza danych CE
    1. Użyć jednego z poniższych wykresów jako elektroforelogramu w celu określenia charakterystyki elektroforetycznej, w tym liczby pików, czasów migracji i wydajności rozdziału: (a) absorbancji UV w funkcji czasu migracji, uzyskanej za pomocą detektora optycznego instrumentu CE (jeśli jest dostępny); (b) wykresu całkowitego prądu jonowego (TIC) uzyskanego metodą MS; (c) wykresu wyekstrahowanego prądu jonowego (EIC/XIC) uzyskanego metodą MS.
      UWAGA: EIC/XIC zapewnia zazwyczaj optymalny stosunek sygnału do szumu (S/N) spośród wyżej wymienionych formatów elektroforelogramów. Należy zauważyć, że nawet przy braku błędów instrumentalnych, podczas gdy absorbancja UV jest proporcjonalna do stężenia masowego białka, sygnał MS jest proporcjonalny do stężenia molowego. W związku z tym różnice w obrazach pików między elektroforelogramami pochodzącymi z CE i MS są zjawiskiem naturalnym.
    2. Do półilościowego oznaczenia należy wykorzystać pole pod krzywą (AUC) pików widocznych na elektroforelogramach. W przypadku próbek zawierających kompleksy białkowe należy zastosować podejście opisane wcześniej17, aby wywieść dane o stężeniu masowym z elektroforelogramów TIC/EIC.
  2. Analiza danych MS
    1. Uzyskać widma MS1 i MS2 poprzez odpowiednie połączenie skanów MS1 i MS2 zarejestrowanych w odpowiadających im oknach elucji.
    2. Wyznaczyć masy nienaruszonego białka (M (nienaruszone białko)) i fragmentów za pomocą jednej z dwóch poniższych metod:
      1. Obliczyć średnie masy jonów tworzących izotopowo rozdzielone klastry sygnałów.
      2. Wykorzystać środek krzywych o kształcie gaussowskim, wynikających z dopasowania odpowiednich obwiedni izotopowych6.
    3. Użyć oprogramowania takiego jak Biopharma Finder, ProSight18 lub MASH Suite19 w celu wygenerowania listy mas jonów fragmentacyjnych i ich identyfikacji.
  3. Analiza danych HDX
    1. Wyznaczyć całkowity poziom deuteracji nienaruszonego gatunku białka, korzystając z równania (2).
      Równanie deuteracji białka; metoda statyczna; schemat analizy; obliczenia biochemiczne. (2)
      gdzie M (2H) lub M (1H) to masy atomowe 2H lub 1H. Gwiazdka oznacza dane z próbki znakowanej 2H.
    2. Wyznaczyć kumulatywną ochronę lub kumulatywną deuterację amidów szkieletu konkretnego segmentu.
      1. Dla danych uzyskanych z użyciem zdeuteryzowanego roztworu modyfikatora, zastosować równania (3) i (4) w celu wyznaczenia poziomu kumulatywnej ochrony.
        Równanie rozkładu izotopowego w analizie spektrometrii mas, pokazujące formułę prawdopodobieństwa. (3)
        Równanie równowagi Σ reprezentujące różnicę masy izotopowej w analizie chemicznej. (4)
        Gdzie P(Sk(N)) jest całkowitą ochroną segmentu N-końcowego obejmującego reszty od 1 do k, P(Sm(C)) jest całkowitą ochroną segmentu C-końcowego składającego się z m reszt, M (2H) lub M (1H) to masy atomowe 2H lub 1H, a M (ci) lub M (zi) to masy cząsteczkowe jonów ci lub zi.
        ​UWAGA: Podwójna gwiazdka oznacza dane z próbki HDX „punktu końcowego” (endpoint).
      2. Dla danych uzyskanych z użyciem niezdeuteryzowanego roztworu modyfikatora, zastosować równania (5) i (6) w celu wyznaczenia poziomu kumulatywnej deuteracji.
        Równanie efektu izotopowego równowagi; formuła związana z analizą spektrometrii mas. (5)
        Formuła równania znakowania izotopowego dla analizy konwersji deuteru; metodologia badawcza. (6)
        ​Gdzie D(Sk(N)) jest kumulatywnym poborem deuteru dla segmentu N-końcowego obejmującego reszty od 1 do k; D(Sm(C)) jest kumulatywnym poborem deuteru dla segmentu C-końcowego składającego się z m reszt.
    3. Wyznaczyć poziom deuteracji w lokalnej grupie amidowej szkieletu
      1. Dla danych uzyskanych z użyciem zdeuteryzowanego roztworu modyfikatora, zastosować równania (7), (8), (9), (10) i (11) w celu wyznaczenia lokalnego poziomu ochrony.
        dla danych wyznaczonych z jonów c
        Formuła prawdopodobieństwa, \( P(R_i) = P(S_i(N)) - P(S_{i-1}(N)) \), analiza równania matematycznego. (7)
        dla danych wyznaczonych z jonów z
        Równanie modelu probabilistycznego, P(R_i)=P(S_total+1-i(C))-P(S_total-i(C)), stosowane w analizie statystycznej. (8)
        Gdzie P(Ri) to ochrona amidu szkieletu w reszcie i, a indeks „total” oznacza całkowitą liczbę reszt białka.
        Dla pozycji reszt, w których brakowało kolejnych jonów fragmentacyjnych, przypisać P(Ri) korzystając z równań (9) i (10).
        dla danych wyznaczonych z jonów c
        Równanie funkcji prawdopodobieństwa; formuła matematyczna ilustrująca statyczny rozkład równowagi. (9)
        dla danych wyznaczonych z jonów z
        Równanie matematyczne pokazujące formułę prawdopodobieństwa statystycznego stosowaną w obliczeniach analizy danych. (10)
        Następnie wyznaczyć poziom deuteracji D(Ri) w lokalnej grupie amidowej szkieletu za pomocą równania (11).
        Równanie różnicy prawdopodobieństwa D(Ri)=1−P(Ri); formuła do analizy statystycznej. (11)
      2. Dla danych uzyskanych z użyciem niezdeuteryzowanego roztworu modyfikatora, zastosować równania (12), (13), (14) i (15) w celu wyznaczenia lokalnego poziomu ochrony.
        dla danych wyznaczonych z jonów c
        Równanie dla obliczeń dynamicznych; wyjaśnienie symboli; istotne dla analizy modelowania matematycznego. (12)
        dla danych wyznaczonych z jonów z
        Równanie matematyczne dla metody przetwarzania danych; formuła D(R,i); schemat analizy procesu.    (13)
        Gdzie D(Ri) to ochrona amidu szkieletu w reszcie i, a indeks „total” oznacza całkowitą liczbę reszt białka.
        Dla pozycji reszt, w których brakowało kolejnych jonów fragmentacyjnych, przypisać D(Ri) korzystając z równań (14) i (15).
        dla danych wyznaczonych z jonów c
        Równanie analizy serii D(R_i) w sekwencji matematycznej; reprezentacja formuły. (14)
        dla danych wyznaczonych z jonów z
        Równowaga statyczna; równania formuły D(Ri), D(Ri+1); koncepcja matematyczna; zastosowanie edukacyjne. (15)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zmiana ciśnienia infuzji BGE pozwala na regulację zarówno wydajności rozdzielania, jak i czasu migracji, który jest równoważny czasowi reakcji HDX białek poddawanych rozdzielaniu (Rysunek 3). Niższe ciśnienie infuzji skutkuje lepszym rozdzieleniem piku CE kosztem czasu trwania eksperymentu (Rysunek 3A). Dłuższy czas migracji/reakcji HDX prowadzi do wyższego poziomu deuteracji analitów białkowych (Rysunek 3B-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Cele pokrycia wewnętrznej ścianki kapilary CE obejmują minimalizację przepływu elektroosmotycznego i absorpcji białek podczas procesu CE13. Chociaż przepływ elektroosmotyczny jest korzystny dla konwencjonalnej analizy CE małych cząsteczek ze względu na jego zdolność do kierowania neutralnych lub przeciwnie naładowanych gatunków do detektora, pogarsza on skuteczność separacji form białek o podobnych rozmiarach i ładunkach netto w roztworze. Pokrycie kapilary HPC minimalizuje przepływ elektroosmotyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

D. D. Y. Chen jest jednym z założycieli Instytutu Wiedzy dla Zdrowia (Knowledge for Health Institute for Biomolecules), który zajmuje się komercjalizacją przepływowego interfejsu CE-MS z mikrofiolkami. Inni autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 21974069). Autorzy otrzymali również wsparcie od Instytutu Analizy Komórkowej, Shenzhen Bay Laboratory, Chiny; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; oraz Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials na Nanjing Normal University w Chinach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
octan amonuFisher ChemicalA/3446/50≥ 99%
CESI 8000 plus system elektroforezy kapilarnejSciex, USA
WirówkaEppendorf5406000097
filtr odśrodkowyMerckUFC20102410 kDa odcięcie
tlenku deuteruEnergia chemicznaE09000199,9 % D
kwas mrówkowyAcros Organics 
kapilara ze szkła krzemionkowegoPolymicro Technologies1068150017ID 50μ m, OD 360μ m
chromatografia gazowaAgilentGC6890N
kwas solnySigma Aldrich258148
hydroksypropylocelulozaAladdinH113415MW 100000
mieszadła magnetyczneDLAB8030101212
metanolFisher ChemicalA456-4MS klasa
mikroobjętość UV-Vis spektrofotometrDeNovix84677JK7731
mioglobinaSigma AldrichM1882
Spektrometr masowy Orbitrap Fusion LumosThermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Analiza farmaceutyczna System CEBeckman Coulter, USA
Exactive Spektrometr masowy UHMRThermo Fisher Scientific, Niemcy
sód  wodorotlenekSigma AldrichS5881
ubikwitynaSigma AldrichU6253
ultrasonografSCIENTZSB-5200
β-laktoglobulinaSigma AldrichL0130
270480250 Q

Bibliografia

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Konformacja bia ekleki bia kowerozdzia elektroforetycznyznakowanie deuteremjonizacja z rozpylaniem elektrycznymwarianty bia ekanaliza jon w fragmentowych

Powiązane artykuły